Sekcja i odizolowanie klastrów czuciowych rdzenia kręgowego myszy

Podsumowanie

Czubki korzeniowe grzbietowe (DRG) zawierają pierwotne ciała komórkowe neuronów czuciowych i przekazują obwodowe sygnały czuciowe do rdzenia kręgowego. Niniejszy protokół opisuje metodę rozpinania czupczyków korzeniowych grzbietowych u myszy, która wspiera standaryzowaną izolację strukturalnie nietkniętych czupczyków, identyfikację anatomiczną segmentów, intuicyjną instrukcję dla początkujących użytkowników oraz zmniejszone uszkodzenie tkanki podczas procedury.

Streszczenie

Gałki nerwowe grzbietowe (DRG), które zawierają ciała komórkowe pierwotnych neuronów czuciowych, służą jako kluczowe struktury przekaźnikowe dla transmisji sygnałów czuciowych z tkanek obwodowych do rdzenia kręgowego. Odgrywają one istotne role w badaniach nad boleścią, uszkodzeniami nerwów i chorobami neurodegeneracyjnymi. Uzyskiwanie nienaruszonego tkanki DRG jest kluczowe dla badania właściwości funkcyjnych, ekspresji molekularnej i zmian patologicznych neuronów czuciowych. Jednak ze względu na ich niewielką wielkość i głębokie położenie w kanale kręgowym, dokładne zidentyfikowanie i odizolowanie DRG stanowią znaczące wyzwania techniczne. W niniejszym badaniu opracowałeśmy standaryzowany protokół odizolowania DRG mysich. Metoda ta zapewnia szczegółowy opis lokalizacji anatomicznej DRG, ekspozycji kanału kręgowego i kluczowych kroków związanych z odizolowaniem zwojów. Cały proces jest zilustrowany za pomocą reprezentatywnych obrazów i nagrań wideo. To podejście wspiera uzyskanie strukturalnie nienaruszonych DRG z przewodnictwem anatomicznym do identyfikacji segmentalnej i nadaje się do barwienia H&E oraz analizy immunofluorescencyjnej. W porównaniu z poprzednimi metodami dysekcji DRG, ta metoda umożliwia standaryzowane odzyskiwanie segmentalnie zidentyfikowanych zwojów, zapewnia intuicyjne przewodnictwo anatomiczne dla początkujących użytkowników i zmniejsza uraz tkankowy podczas procedury.

Wprowadzenie

Czubki rdzeniowe grzbietowe (DRG), które zawierają ciała komórek neuronów sensorycznych pierwotnych, są istotnymi strukturami do przekazywania peryferyjnych sygnałów sensorycznych—w tym bodźców mechanicznych, cieplnych i nocyceptywnych—do rdzenia kręgowego^1,2,3. Chociaż obecnie dostępne są wysokiej jakości zasoby opisujące DRG, nadal wymagana jest szczegółowa procedura, aby wspierać dokładne identyfikowanie i izolację DRG od segmentów piersiowych do krzyżowych w jednym okazye, minimalizując jednocześnie ryzyko uszkodzenia DRG podczas pobierania tkanki.

Neurony DRG są kluczowymi elementami obwodowej ścieżki sensorycznej. Ich aksony rozgałęziają się, przy czym jedna gałąź rozciąga się do tkanek obwodowych, a druga rzutuje się do grzbietowego rogowca rdzenia kręgowego, odgrywając w ten sposób krytyczne role w przekazie bólu, urazach nerwów, reakcjach zapalnych i patogenezie różnych zaburzeń neurologicznych⁴. Ponadto DRG przyciągnęły znaczną uwagę w obszarach badań takich jak naprawa uszkodzeń nerwów, mechanizmy przewlekłego bólu, plastyczność neuronów sensorycznych i regulacja neuroimmunologiczna^5,6. Szeroki zakres badań eksperymentalnych wymaga nienaruszonego tkanki DRG dla zastosowań, w tym barwienia immunohistochemicznego, analizy sekwencjonowania RNA, kultury pierwotnych neuronów i badań elektro fizjologicznych⁷. Dlatego też, uzyskanie strukturalnie nienaruszonego i dokładnie zidentyfikowanego segmentowo tkanki DRG jest podstawą badań obwodowych obwodów neuronowych, charakterystycznych cech molekularnych neuronów i zmian patologicznych.

DRG znajdują się w pobliżu kanałów międzykręgowych i są połączone z rdzeniem kręgowym za pośrednictwem korzeni grzbietowych. Ze względu na ich niewielką wielkość, osłonięcie w strukturach kostnych i złożoność okolicznych anatomii, nienaruszona izolacja stanowi znaczne wyzwania techniczne. Ponadto brak jasnych punktów orientacyjnych anatomicznych i standaryzowanych procedur zwiększa ryzyko uszkodzenia strukturalnego lub błędnej identyfikacji segmentalnej podczas pobierania tkanki.

W porównaniu z istniejącymi metodami rozcięcia DRG myszy, metoda ustanowiona w niniejszym badaniu ma kilka zalet. Po pierwsze, wcześniej zgłaszane metody izolacji DRG myszy wymagają ogólnie usunięcia kręgosłupa od zwierzęcia, po czym segmentacji i otwarcia linii środkowej odizolowanego kręgosłupa, po czym DRG są rozcinane z kanałów międzykręgowych. W trakcie tego procesu, przecięcie kręgosłupa i powtarzające się cięcia mogą łatwo powodować mechaniczne uszkodzenie DRG, a także mogą prowadzić do pominięcia niektórych segmentów lub niejasnej identyfikacji segmentalnej⁸. W przeciwieństwie do tego, nasza metoda jest wykonywana bezpośrednio in situ u myszy, bez wcześniejszego izolowania lub przecinania kręgosłupa, zmniejszając w ten sposób ryzyko utraty DRG podczas pobierania tkanki. Przez cały proces, narzędzia są stosowane głównie do struktur kostnych i tkanek łącznych otaczających DRG, a nie bezpośrednio chwytając lub ciągnąc za sam ganglion, zachowując w ten sposób jego integralność.

Po drugie, istniejące metody często nie mają jasnych, stabilnych punktów orientacyjnych anatomicznych do identyfikacji różnych segmentów DRG. Ponieważ nerwy połączone z DRG są często przecinane podczas usuwania kręgosłupa, staje się trudno dokładnie określić segmentalne pochodzenie pojedynczych DRG na podstawie przebiegu i wzorców rozgałęziania nerwów. W przeciwieństwie do tego, nasza metoda jest wykonywana bezpośrednio in situ u myszy i dlatego zachowuje naturalne relacje anatomiczne między DRG, połączonymi nerwami i otaczającymi strukturami, pozwalając na identyfikację różnych segmentów DRG według połączeń nerwowych i lokalnych punktów orientacyjnych anatomicznych. Proponujemy użycie cech morfologicznych L2 i L3 jako kluczowych punktów odniesienia anatomicznego, wraz z relacją anatomiczną między L3–L5 a nerwem kulszowymi, po czym sekwencyjną identyfikację sąsiednich segmentów zarówno w kierunku rostralnym, jak i kaudalnym.

Poza tym, ta metoda zapewnia stosunkowo systematyczny opis kluczowych kroków, w tym ekspozycję kręgosłupa i kanału kręgowego, otwarcie kanału kręgowego z następującym ekspozycją rdzenia kręgowego, ekspozycję DRG i lokalizacja oraz rozcinanie prowadzone stereomikroskopowo. Przepływ pracy jest jasny, a punkty orientacyjne anatomiczne są dobrze określone, co może poprawić standaryzację i reprodukowalność procedury, szczególnie dla początkujących. DRG uzyskane tą metodą zachowują dobrą integralność tkanki i są zatem dobrze przystosowane do dalszych analiz, w tym immunofluorescencji i barwienia H&E.

W niniejszym badaniu ustaliliśmy standaryzowaną metodę rozcinania i izolacji DRG myszy i dostarczyliśmy schematycznych ilustracji do lokalizacji anatomicznej, wraz z reprezentatywnymi obrazami i dokumentacją wideo postępowania próbkowania. Ta metoda wspiera izolację DRG od poziomu pier

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono ściśle zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Zastosowania w Szpitalu Shanghai East. Opisane w niniejszym badaniu procedury sekccji zostały przeprowadzone na dorosłych myszach C57BL/6 (samce lub samice, 12 tygodni życia, 25–30 g). Rysunek 1 przedstawia instrumenty sekccyjne użyte w tym protokole.

1. Przygotowanie

UWAGA: W przypadku próbek utrwalonych perfuzyjnie, przyjmij odpowiednie środki ochronne, aby uniknąć narażenia na utrwalacz. Przeprowadzaj sekcję w wyciągu laboratoryjnym lub na dobrze wentylowanej ławce i noś odpowiednie osobiste środki ochrony przez cały czas trwania procedury, w tym rękawice, odzież ochronną i gogle ochronne.

1. Utrzymuj myszy w cyklu 12 h światła/12 h ciemności w temperaturze otoczenia około 24 °C i wilgotności względnej 55%, z ad libitum dostępem do pokarmu i wody.
2. Przed rozpoczęciem sekcji wykonaj eutanazję myszy w komorze z dwutlenkiem węgla, aż do całkowitego ustania oddechu. Potwierdź śmierć, a następnie ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach na deskach sekccyjnych i zamocuj kończyny kołkami, aby utrzymać stabilną pozycję.
3. Sprskaj sierść na obszarze klatki piersiowo-brzusznej 70% etanolem, aby zmniejszyć zanieczyszczenie sierścią i utrzymać czyste pole operacyjne.
4. Użyj nożyczek do otwarcia skóry wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej i brzucha. Przedłuż nacięcie w kierunku głowowym wzdłuż linii środkowej brzucha, aby w pełni ujawnić klatkę piersiową. Podnieś dolny koniec mostka i przetnij ścianę klatki piersiowej po obu stronach łuku żebrowego, aby otworzyć jamę klatki piersiowej i odsłonić serce. W razie potrzeby usuń część mostka i żeber, aby uzyskać jasny widok serca.
5. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku nożyczkami, aby stworzyć wyjście dla krwi i perfuzyjnego roztworu. Nalej 20 ml przechłodzonego PBS (4 °C) do strzykawki i powoli włóż igłę do lewej komory serca, w pobliżu szczytu serca. Ustabilizuj igłę i unikaj przebicia ściany komory.
6. Przeprowadź powolną i równomierną perfuzję przechłodzonego PBS, aż wątroba stanie się blada, a wypływ stanie się przezroczysty, a większość krwi zostanie spłukana. Następnie, zastąp PBS 20 ml przechłodzonego 4% paraformaldehydu (4 °C) i kontynuuj perfuzję z powolną, stałą szybkością, aż kończyny staną się sztywne, ogon się zwinie, a tkanki zmienią kolor z czerwonego na blady, co wskazuje, że utrwalenie jest w dużej mierze zakończone.
7. Po perfuzji wycofaj igłę, usuń wszelkie pozostałości płynu z jamy klatki piersiowej i natychmiast przystąp do pobierania tkanek. Jeśli nieutrwalona tkanka jest wymagana do dalszych analiz, przeprowadź perfuzję tylko przechłodzonym PBS i pomiń krok utrwalania 4% paraformaldehydem.
   UWAGA: Utrzymuj powolną, stałą i jednolitą szybkość perfuzji przez cały czas trwania procedury, aby uniknąć pęknięcia serca lub obrzęku tkanek spowodowanego nadmiernym ciśnieniem. Przeprowadzaj wszystkie powyższe procedury w temperaturze pokojowej.

2. DRG i przyległe nerwy (Rysunek 2)

1. Ujawnienie kręgosłupa i kanału kręgowego (3–5 min)
   1. Ułóż mysz w pozycji brzusznej i zamocuj ją na deskach sekccyjnych. Wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry grzbietowej nożyczkami, przedłużając nacięcie od ogona w kierunku szyi.
   2. Użyj nożyczek, aby oddzielić skórę grzbietową od tkanki łącznej podstawowej i odsuń skórę bocznie po obu stronach, aby w pełni ujawnić mięśnie grzbietowe. Usuń włosy przywierające do powierzchni tkanki łącznej za pomocą papieru ściernego lub spłucz pole operacyjne roztworem fizjologicznym, aby utrzymać czystość obszaru operacyjnego.
   3. Wykonaj podłużne nacięcie mięśni grzbietowych i tkanki łącznej po obu stronach kręgosłupa, aby w pełni ujawnić struktury kręgowe.
      ​UWAGA: Unikaj przenikania nożyczek zbyt głęboko do jamy klatki piersiowej lub brzusznej podczas nacięcia tkanek grzbietowych, ponieważ może to wpłynąć na dalsze procedury sekccyjne.
   4. Zastąp tkankę łączną i resztkowe mięśnie pokrywające kręgosłup za pomocą kleszczy kości. Jeśli resztkowa tkanka zakłóca widzialność, przytnij ją nożyczkami, aby osiągnąć pełne ujawnięcie kręgosłupa. Następnie, przetnij kręgi szyjne od strony grzbietowej za pomocą nożyczek, aby oddzielić końcówkę grzbietową kręgosłupa od głowy i ułatwić następne kroki.
2. Otwarcie kanału kręgowego i ujawnięcie rdzenia krę

Wyniki

Sukcesywna izolacja nerwów kręgowych wymaga zachowania integralności zwojów, bez oczywistej kompresji, stłuczenia lub rozerwania. Delikatnie podnosić włókna nerwowe połączone bocznie, stopniowo uwalniać zwój z otaczających tkanek i przecinać połączone włókna nerwowe dopiero po całkowitym uwolnieniu zwojów, tak aby można je było usunąć bez uszkodzeń. Unikać bezpośredniego naciągania ciała zwojów narzędziami podczas zabiegu. Po izolacji, zachować jak najbardziej natywną morfologię nerwów kręgowych w wyjściu międzykręgowym....

Dyskusja

DRG, jako kluczowe komponenty obwodowego układu nerwowego sensorycznego, odgrywają krytyczną rolę w przekazywaniu informacji mechanicznych, termicznych i nocyceptywnych do ośrodkowego układu nerwowego^9,10,11. Neurony DRG wykazują charakterystyczną pseudounipolarną morfologię, z jednym procesem biegnącym do tkanek obwodowych, a drugim wprost do rogu grzbietowego rdzenia kręgowego, tym samym odgrywając kluczowe role w przekazywani...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.5 mL centrifuge tube	Nie określono	Nie określono	Używane do przechowywania DRG
20 mL strzykawka	Nie określono	Nie określono	Używane do perfuzji serca
30% roztwór sacharozy	Nie określono	Nie określono	Używane do odwadniania tkanki przed osadzaniem OCT
4% paraformaldehyd	Servicebio	G1101
5% BSA	Solarbio	SW3015
70% etanol	Nie określono	Nie określono	Używane do zmniejszenia zanieczyszczenia sierści przed sekcją
Papier absorbujący	Nie określono	Nie określono	Używane do usuwania sierści z tkanki łącznej
dorosłe myszy C57BL/6	Vital River	Nie określono	samce lub samice; 12 tygodni życia; 25–30 g
Alexa Fluor 488-koniugowany kozi przeciwciało anty-królicze IgG	Servicebio	GB25303
Przeciwciało przeciw TUBB3	Proteintech	CL488-66375	Używane do immunofluorescencji TUBB3
Komora z dwutlenkiem węgla	Nie określono	Nie określono	Używane do eutanazji
DAPI	Servicebio	G1012
Deska do sekcji	Nie określono	Nie określono	Używane do mocowania myszy podczas sekcji
Mikroskop fluorescencyjny	Nie określono	Nie określono	Używane do obrazowania sekcji barwionych immunofluorescencyjnie
Nożyczki krzywe do mikrochirurgii	RWD	S21022-14	Wyciągnięte z manuskryptu: nożyczki do kości (RWD, S21022-14)
Mikrochirurgiczne kleszcze	ASSI	SDCT16R8	Wyciągnięte z manuskryptu: mikrochirurgiczne kleszcze (ASSI, SDCT16R8)
Mikrochirurgiczne kleszcze	Fine Science Tools	11254-20	Wyciągnięte z manuskryptu: mikrochirurgiczne kleszcze (FST, 11254-20)
Związek OCT	Sakura Finetek	No. 4583
PBS	Servicebio	G2156
Szpilki	Nie określono	Nie określono	Używane do mocowania kończyn na desce do sekcji
Salina	Nie określono	Nie określono	Używane do płukania pola operacyjnego
Nożyczki	Fine Science Tools	14060-09	Wyciągnięte z manuskryptu: nożyczki (FST, 14060-09)
Stereomikroskop	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	10447197	Wyciągnięte z manuskryptu: stereomikroskop (Leica, 10447197)
Roztwór do reaktywacji antygenów Tris-EDTA	Solarbio	C1038