FTY720 zwiększa wrażliwość doksorubicyny w opornych komórkach ostrej białaczki szpikowej

Podsumowanie

Ten protokół ocenia, w jaki sposób FTY720 zwiększa wrażliwość na doksorubicynę w komórkach opornej ostrej białaczki szpikowej poprzez ocenę żywotności komórek, apoptozy, wewnątrzkomórkowego nagromadzenia doksorubicyny, ekspresji transporterów odpływowych leków oraz sygnalizacji białkowej kinazy B/mechanistycznego celu rapamykinu.

Streszczenie

Oporność na chemioterapię pozostaje główną przeszkodą w skutecznym leczeniu ostrej białaczki szpikowej, częściowo ze względu na to, że odporne komórki białaczki zmniejszają narażenie na leki wewnątrzkomórkowe i unikają apoptozy. FTY720, modulator receptora sfingozyny-1-fosforanu, wykazał działanie przeciwproliferacyjne i chemosensybilizujące w kilku modelach nowotworów. Jednakże, czy FTY720 zwiększa wrażliwość na doksorubicynę w opornych na doksorubicynę komórkach ostrej białaczki szpikowej oraz czy ten efekt jest związany ze zmianami w transporterach wydalających leki i sygnalizacji białka kinazy B/mechanistycznego celu rapamacyny, pozostaje niedostatecznie określone. Niniejsze badanie oceniło działanie FTY720 samodzielnie oraz w połączeniu z doksorubicyną w liniach komórek ostrej białaczki szpikowej (HL60 i K562) oraz ich opornych na doksorubicynę pochodnych (HL60/A i K562/A). Wykonano ocenę żywotności komórek za pomocą zestawu do liczenia komórek Cell Counting Kit-8, oznaczono apoptozę za pomocą cytometru przepływowego Annexin V/jodek propidu, wyznaczono gromadzenie doksorubicyny wewnątrzkomórkowej za pomocą cytometru przepływowego, a także zbadano P-glikoproteinę, białko związane z opornością na wiele leków 1, białka szlaku białka kinazy B/mechanistycznego celu rapamacyny i białka związane z apoptozą za pomocą cytometru przepływowego i techniki Western blotting. FTY720 wykazywał zależną od dawki cytotoksyczność i zwiększało wrażliwość na doksorubicynę w opornych komórkach białaczki. Połączone leczenie zmniejszało żywotność komórek, zwiększało ułamek komórek ulegających apoptozie, zwiększało gromadzenie doksorubicyny wewnątrzkomórkowej i zmniejszało ekspresję P-glikoproteiny i białka związanego z opornością na wiele leków 1. Leczenie FTY720 wiąże się również ze zmniejszoną fosforylacją białka kinazy B i mechanistycznego celu rapamacyny, podczas gdy aktywator białka kinazy B SC79 częściowo odwrócił obserwowane zmiany w sygnalizacji, ekspresji transporterów i apoptozie. Te ustalenia wskazują, że FTY720 zwiększa wrażliwość na doksorubicynę w komórkach HL60/A i K562/A, a efekt ten wiąże się ze zmniejszoną sygnalizacją białka kinazy B/mechanistycznego celu rapamacyny, zmniejszoną ekspresją transporterów wydalających leki, zwiększonym gromadzeniem doksorubicyny wewnątrzkomórkowej i zwiększoną apoptozą. Ponieważ niniejsze badanie ograniczyło się do in vitro modeli linii komórkowych, przed wyciągnięciem terapeutycznych wniosków wymagana jest dalsza walidacja na pierwotnych próbkach białaczki i systemach in vivo.

Wprowadzenie

Ostra białaczka szpikowa jest niejednorodną złościwą chorobą hematologiczną, powstającą w wyniku złośliwej transformacji komórek macierzystych i prądtników krwiotwórczych. Jest to najczęstsza postać ostrej białaczki u dorosłych i nadal wiąże się z niskim przeżyciem długoterminowym. Choć strategie leczenia się poprawiły, chemioterapia indukcyjna oparta na cytozarynie połączona z antracykliną pozostaje filarem leczenia. Jednak wielu pacjentów rozwija oporność pierwotną lub nabytą, prowadząc do nawrotu, choroby refraktarnej i złych wyników klinicznych^1,2,3. Zrozumienie mechanizmów, które zmniejszają wrażliwość na doksorubicynę, pozostaje zatem ważnym celem badań nad ostrym szpikowączkiem szpikowączkiem limfoblastycznym.

Oporność na doksorubicynę jest wieloczynnikowym procesem. Oporne komórki białaczki mogą zmniejszyć narażenie na lek wewnątrzkomórkowe poprzez zwiększoną ekspresję lub aktywność transporterów wydalających leki związanych z kaskadem adenozynotrifosforanowym, w tym P-glikoproteiny, kodowane przez adenozynotrifosforanową podrodzinę kaskadową B, element 1 i białko związane z wielolekowym oporem, kodowane przez adenozynotrifosforanową podrodzinę kaskadową C, element 1⁴. Aktywacja białkowej kinazy B i mechanizmu docelowego rapamykinu może również promować przeżycie komórek białaczki, hamować apoptozę i przyczyniać się do oporu na leczenie⁵. Razem, te mechanizmy zmniejszają gromadzenie doksorubicyny wewnątrzkomórkowej i zmniejszają efekt cytotoksyczny. Bezpośrednie farmakologiczne ukierunkowanie na transportery wielolekowego oporu było wyzwaniem z powodu toksyczności, ograniczonej skuteczności i mechanizmów kompensacyjnego oporu⁶. Podobnie, inhibitory białkowej kinazy B i mechanizmu docelowego rapamykinu stoją przed wyzwaniami translacyjnymi związanymi z toksycznością zależną od dawki, ograniczoną skutecznością i adaptacją szlaku^7,8.

FTY720, znany również jako fingolimod, jest modulatorem receptora sfingozyny-1-fosforanu zatwierdzonym przez United States Food and Drug Administration do leczenia stwardnienia rozsianego i przyciągnął zainteresowanie jako potencjalny środek przeciwnowotworowy⁹. Poza swoją immunomodulującą aktywnością, FTY720 wykazał działanie przeciwnowotworowe, proapoptotyczne i zwiększające wrażliwość na leczenie w kilku preklinicznych modelach nowotworów, w tym raku prostaty, raku wątrobowokomórkowym, raku płuc, raku okrężnicy, mnogu rakiem sutka, rakiem jajnika, białaczką, chłoniakiem i glioblastomem^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}. Poprzednie badania wykazały, że FTY720 może zwiększać aktywność doksorubicyny w raku piersi, zwiększać wrażliwość na cysplatinę w komórkach raka płuc nieziarniczego odpornych na cysplatinę i ponownie zwiększać wrażliwość na cysplatinę w komórkach melanomu odpornego na cysplatinę poprzez modulację sygnałową fosfoinozytyd 3-kinazy^20,21,22. Te odkrycia sugerują, że FTY720 może wpływać zarówno na sygnał przetrwania, jak i mechanizmy zatrzymywania leku w oporny komórkach nowotworowych. Jednak to, czy FTY720 zwiększa wrażliwość na doksorubicynę w oporny na doksorubicynę komórkach ostrej białaczki szpikowej i czy ten efekt wiąże się z skoordynowanymi zmianami w gromadzeniu doksorubicyny wewnątrzkomórkowej, ekspresji transporterów wydalających leki, apoptozie i sygnalizacji białkowej kinazy B/mechanizm docelowego rapamykinu, pozostaje niedostatecznie zdefiniowane.

Niniejsze badanie zostało zaprojektowane, aby wypełnić tę lukę, stosując modele komórek białaczki szpikowej odpornych na doksorubicynę HL60/A i K562/A, wraz z ich rodzicielskim odpowiednikami. Założono, że FTY720 może zwiększać wrażliwość na doksorubicynę poprzez zmniejszenie ekspresji transporterów wydalających leki, zwiększenie gromadzenie doksorubicyny wewnątrzkomórkowej i zwiększenie apoptozy, z zaangażowaniem sygnalizacji białkowej kinazy B/mechanizm docelowego rapamykinu jako powiązanej ścieżki regulacyjnej. Aby ocenić tę hipotezę, oceniono żywotność komórek, wartości półmaksymalnego stężenia hamującego, apoptozę, gromadzenie doksorubicyny wewnątrzkomórkowej, ekspresję transporterów i zmiany białek sygnałowych po leczeniu FTY720 samodzielnie lub w połączeniu z doksorubicyną. Ponieważ wszystkie eksperymenty przeprowadzono na modelach linii komórkowych, wyniki interpretowane są jako dowód in vitro na mechanizm zamiast

Protokół

To study this, we used established human acute myeloid leukemia cell lines and their doxorubicin-resistant derivatives. This study did not involve any human participants, animals, or primary patient-derived samples. Therefore, approval from the institutional review board for human-subject research and animal ethics was not required. The cell lines were obtained from the Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China, and maintained at the Fujian Institute of Hematology, Fujian Medical University Union Hospital. The identity of the cells was confirmed by karyotype and morphological assessment before the experiments, and all cell cultures were tested for mycoplasma contamination. The chemicals, equipment, and software used in the protocol are listed in the Table of Materials.

1. Cell culture and confirmation of the resistant phenotype

Human HL60 and K562 acute myeloid leukemia cells and their doxorubicin-resistant derivatives, HL60/A and K562/A, were obtained from the Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China. Cells were cultured in Roswell Park Memorial Institute 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin at 37 °C in a humidified incubator containing 5% carbon dioxide.

HL60/A cells were maintained in complete medium containing 1 µg/mL doxorubicin, and K562/A cells were maintained in complete medium containing 5 µg/mL doxorubicin to preserve the resistant phenotype. Doxorubicin was removed from the culture medium 1 month before experimental testing to avoid acute drug-selection effects during treatment assays.

Before the experiments, the resistant phenotype was reconfirmed by comparing doxorubicin half-maximal inhibitory concentration values between parental and resistant cells. Resistance stability after 1 month of drug-free culture was assessed by repeating the doxorubicin-sensitivity assay and examining basal P-glycoprotein and multidrug resistance-associated protein 1 expression. Cultures were used for experiments only when the resistant derivatives retained higher doxorubicin half-maximal inhibitory concentration values and higher transporter expression than their parental counterparts.

2. Drug preparation and treatment design

FTY720, doxorubicin, and SC79 were prepared as stock solutions according to the manufacturers' instructions. FTY720 and SC79 were dissolved in dimethyl sulfoxide, and doxorubicin was prepared in the recommended solvent and protected from light during handling. Working solutions were freshly diluted in complete culture medium before treatment. The final dimethyl sulfoxide concentration was kept identical across treatment groups and did not exceed 0.1%.

Vehicle-control groups received the same final dimethyl sulfoxide concentration as the corresponding treatment groups. For combination-treatment experiments, 5 µM FTY720 was used as the sensitizing concentration. Doxorubicin was used at 4 µM for HL60/A cells and 8 µM for K562/A cells in apoptosis and intracellular doxorubicin accumulation assays, unless otherwise stated.

3. Cell viability assay and half-maximal inhibitory concentration calculation

Cells were seeded into 96-well plates at 1 × 10⁴ cells per well in 100 µL complete medium. For FTY720 single-drug testing, HL60, K562, HL60/A, and K562/A cells were treated with 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 µM FTY720 for 48 h. For doxorubicin-sensitivity testing, HL60/A and K562/A cells were treated with serial concentrations of doxorubicin in the presence or absence of 5 µM FTY720 for 48 h.

Cell viability was measured using the Cell Counting Kit-8 assay according to the manufacturer's instructions. After treatment, Cell Counting Kit-8 reagent was added to each well, and the plate was incubated at 37 °C for 2 h. Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader.

Relative cell viability was calculated as follows: relative cell viability = [(absorbance of treated wells - absorbance of blank wells) / (absorbance of vehicle-control wells - absorbance of blank wells)] × 100%

Half-maximal inhibitory concentration values were calculated using nonlinear regression with a four-parameter logistic dose-response model in GraphPad Prism, version 9.5. Each experiment included three independent biological replicates, with three technical wells per treatment condition.

4. Drug-combination analysis

The effects of FTY720 on doxorubicin sensitivity were evaluated by comparing doxorubicin dose-response relationships in the presence or absence of FTY720. HL60/A and K562/A cells were treated with serial concentrations of doxorubicin alone or doxorubicin combined with FTY720 for 48 h.

Cell viability was assessed using the Cell Counting Kit-8 assay, and half-maximal inhibitory concentration values were calculated using nonlinear regression with a four-parameter logistic dose-response model. Changes in doxorubicin sensitivity were interpreted based on shifts in dose-response curves and differences in half-maximal inhibitory concentration values between treatment groups.

Because the experiments were not designed as a complete fixed-ratio dose-matrix study, formal combination-index analysis was not performed. Therefore, the results were interpreted as evidence of altered doxorubicin sensitivity rather than definitive pharmacological synergy.

5. Apoptosis analysis by Annexin V and propidium iodide flow cytometry

HL60/A and K562/A cells were seeded into 6-well plates at 4 × 10⁵ cells/mL and treated for 48 h with vehicle, FTY720 alone, doxorubicin alone, or doxorubicin combined with FTY720. For combination treatment, 5 µM FTY720 was combined with 4 µM doxorubicin in HL60/A cells or 8 µM doxorubicin in K562/A cells.

After treatment, cells were collected, including cells suspended in the culture medium, and washed twice with cold phosphate-buffered saline. Cells were resuspended in Annexin V binding buffer at the concentration recommended by the apoptosis detection kit manufacturer. Each sample was stained with 5 µL Annexin V-fluorescein isothiocyanate or Annexin V-allophycocyanin and 5 µL propidium iodide, followed by incubation for 15 min at room temperature in the dark.

Samples were analyzed immediately by flow cytometry. Unstained controls, single-stained controls, and fluorescence-minus-one controls were used to set compensation and quadrant gates. Debris was excluded using forward-scatter and side-scatter gating. Early apoptotic cells were defined as Annexin V-positive and propidium iodide-negative cells, and late apoptotic or dead cells were defined as Annexin V-positive and propidium iodide-positive cells. Total apoptosis was calculated as the sum of early and late apoptotic cell fractions. At least 10,000 viable single-cell events were acquired for each sample.

6. Intracellular doxorubicin accumulation assay

HL60/A and K562/A cells were seeded into 6-well plates at 4 × 10⁵ cells/mL and cultured overnight. Cells were

Wyniki

FTY720 zmniejszyło żywotność komórek ostrej białaczki szpikowej matczynej i opornych na doksorubicynę

Komórki HL60, K562, HL60/A i K562/A były narażone na rosnące stężenia FTY720 (0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 i 100 µM) przez 48 h, a żywotność komórek mierzona była za pomocą zestawu do liczenia komórek Cell Counting Kit-8. FTY720 zmniejszyło żywotność komórek we wszystkich czterech liniach komórkowych w sposób zależny od stężenia (Rysunek 1A). Obli...

Dyskusja

Odporność na chemioterapię pozostaje jedną z głównych przeszkód w efektywnym leczeniu ostrej białaczki szpikowej. U pacjentów, którzy nie reagują na terapię indukcyjną lub u których występuje nawroty po początkowej odpowiedzi, odporne komórki białaczki mogą się utrzymywać pomimo stosowania schematów opartych na cytarabinie i antracyklinach, co sprawia, że identyfikacja podejść, które zwiększają wrażliwość na leki, stanowi ważne pytanie eksperymentalne i kliniczne²³. Doksorubicyna jest antracykliną...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-well tissue culture plates	Corning / Costar	3516 lub równoważne zweryfikowane w laboratorium	Używane w eksperymentach dotyczących leczenia, apoptozy, akumulacji doksorubicyny i ekspresji białek.
96-well tissue culture plates	Corning / Costar	3599 lub równoważne zweryfikowane w laboratorium	Używane w testach Cell Counting Kit-8.
Alexa Fluor 647 mouse immunoglobulin G1 isotype control	BioLegend	400130 lub równoważne zweryfikowane w laboratorium	Kontrola izotypu dla barwienia przeciwciała sprzężonego z Alexa Fluor 647. Użyj dokładnego numeru katalogowego z fiolki z reagentem.
Alexa Fluor 647-conjugated anti-human multidrug resistance-associated protein 1 / ABCC1 antibody	BioLegend	370103	Używane do wykrywania spektrometrycznego białka związanego z wielolekową opornością człowieka 1. Należy potwierdzić dostępność produktu, ponieważ niektóre formaty BioLegend MRP1 zostały wycofane lub zastąpione.
Annexin V apoptosis detection kit with propidium iodide	BioLegend	640914 lub równoważne zweryfikowane w laboratorium	Używane do analizy apoptozy Annexin V i jodku propydynowego przez cytometrię przepływową. Jeśli zamiast Annexin V-fluoresceiny izotiocyjanianowej użyto Annexin V-alofikocyaniny, zastąp to dokładnym numerem katalogowym zestawu.
Bicinchoninic acid protein assay kit	Thermo Fisher Scientific / Beyotime / dostawca zweryfikowany w laboratorium	Użyj rzeczywistego numeru katalogowego	Używane do pomiaru stężenia białka.
Carbon dioxide cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific / Eppendorf / sprzęt zweryfikowany w laboratorium	Model do wstawienia z zapisu laboratorium	Utrzymywanie komórek w 37 °C i 5% dwutlenku węgla.
Caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	9662; RRID:AB_331439	Wykrywa pełną długość i rozcięte caspase-3 przez Western blot. Jeśli użyto przeciwciała specyficznego dla rozciętej caspase-3, zastąp dokładnym numerem katalogowym.
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies	CK04	Używane do testów żywotności komórek i stężenia hamującego o połowie.
Cell staining buffer	BioLegend	420201	Używane do rozcieńczania przeciwciał i płukania podczas barwienia cytometrii przepływowej.
Cleaved poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase antibody	Cell Signaling Technology	94885; RRID:AB_2800237	Przeciwciało Western blot dla rozciętej poli(adenozyno-difosfo-rybozy) polimerazy.
CompuSyn	ComboSyn, Inc.	Wersja 1.0 lub wersja zweryfikowana w laboratorium	Używane do analizy indeksu kombinacji Chou-Talalay, jeśli dostępne są pełne dane dotyczące kombinacji dawek.
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich / Merck	D2650 lub równoważne zweryfikowane w laboratorium	Nośnik dla roztworów stężonych FTY720 i SC79; końcowe stężenie nie przekraczało 0,1%.
Doxorubicin hydrochloride	Użyj rzeczywistego dostawcy z zapisu zakupu laboratorium	Użyj rzeczywistego numeru katalogowego i partii	Antracykliny używane w badaniach utrzymania odporności i leczenia. To pole musi pasować do rzeczywistego reagentu użytego w eksperymentach.
Enhanced chemiluminescence substrate	Thermo Fisher Scientific / MilliporeSigma / dostawca zweryfikowany w laboratorium	Użyj rzeczywistego numeru katalogowego	Używane do wykrywania sygnałów Western blot.
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10099-141 lub równoważne zweryfikowane w laboratorium	Dodawane do medium hodowlanego w stężeniu 10%. Używaj szerum termicznie inaktywowanego lub nieinaktywowanego termicznie spójnie w wszystkich eksperymentach.
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACScan lub rzeczywisty model instrumentu	Używane do badań apoptozy, akumulacji doksorubicyny wewnątrzkomórkowej i ekspresji transportera. W razie potrzeby zarejestruj konfigurację lasera/filtru w uzupełniających metodach.
Flow cytometry analysis software	BD Biosciences / FlowJo / oprogramowanie zweryfikowane w laboratorium	Wersja do wstawienia z zapisu laboratorium	Używane do kompensacji, bramek i analizy średniego natężenia fluorescencji.
FTY720 / fingolimod hydrochloride	Użyj rzeczywistego dostawcy z zapisu zakupu laboratorium	Użyj rzeczywistego numeru katalogowego i partii	Reagent do leczenia lekami. To pole musi pasować do rzeczywistego reagentu użytego w eksperymentach. Nie zastępuj innym dostawcą, chyba że eksperyment został przeprowadzony z tym produktem.
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase antibody	Abcam	ab181602	Kontrola ładowania dla Western blot. Potwierdź RRID z wkładki produktu przed przesłaniem.
GraphPad Prism	GraphPad Software	Wersja 9.5	Używane do dopasowywania krzywych dawkowania, obliczania stężenia hamującego o połowie i analizy statystycznej.
HL60 human acute myeloid leukemia cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	Nie skatalogowane komercyjnie w niniejszym badaniu	Ludzka linia komórek białaczki szpikowej; autentyfikowane przez kariotyp i morfologię przed użyciem. Jeśli wymagana jest publiczna referencja, HL60 odpowiada RRID:CVCL_0002.
HL60/A doxorubicin-resistant cells	Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin, China	Nie skatalogowane komercyjnie	Oporność na doksorubicynę pochodna komórek HL60; utrzymywane w Fujian Institute of Hematology. Oporność utrzymywano za pomocą 1 μg/mL doksorubi