Procedura powtarzalnego opuszczania ciężaru w celu ustanowienia mysiego modelu przewlekłego urazu mózgu

Podsumowanie

Przedstawiono protokół dotyczący stworzenia powtarzalnego mysiego modelu łagodnego zamkniętego urazu mózgu dla badania mechanizmów leżących u podstaw przewlekłych zachowań przypominających depresję w przypadku braku dużych strukturalnych uszkodzeń mózgu.

Streszczenie

Uraz mózgu (TBI) może prowadzić do trwałych zmian neuropatologicznych i długotrwałych następstw neuropsychiatrycznych. Podczas powrotu do zdrowia, znaczna część pacjentów rozwija zaburzenia afektywne, w tym objawy depresyjne i dolegliwości związane ze snem, nawet jeśli rutynowa tomografia komputerowa lub rezonans magnetyczny nie ujawnia wyraźnych nieprawidłowości strukturalnych. Potrzebne są modele eksperymentalne, które odtworzą te cechy, aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw przewlekłych objawów neuropsychiatrycznych po urazie. Przedstawiamy tu protokół, aby stworzyć model mysiego powtarzającego się łagodnego urazu mózgu z zamkniętym uderzeniem w głowę do badania mechanizmów leżących u podstaw przewlekłych zachowań przypominających depresję bez wyraźnych, ogólnych wad strukturalnych mózgu wykrywalnych przez mikroskopijne badanie i MRI ważone T2. W tej metodzie, cały czas czynny czaszka jest narażona i poddawana wielokrotnym uderzeniom przy użyciu określonych parametrów spadku ciężaru przez pięć kolejnych dni. W warunkach opisanych tutaj, procedura powoduje zamknięty uraz głowy bez złamań czaszki lub makroskopijnego ogniskowego stłuczenia. Po okresie pooperacyjnym, myszy wykazują zachowania przypominające depresję, nie wykazując jednocześnie wyraźnych ogniskowych nieprawidłowości strukturalnych w badaniu ogólnym lub w rezonansie magnetycznym ważonym T2 w warunkach stosowanych w tym badaniu. Ten protokół zapewnia eksperymentalne podejście do badania przewlekłych zachowań przypominających depresję po powtarzających się łagodnych urazach mózgu i do oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Wprowadzenie

Jednakże, ponieważ obecny paradygmat dostarcza przede wszystkim liniowego wpływu na mysz z unieruchomionymi głowami, powinien być interpretowany jako model zamkniętego urazu mózgu rmTBI zoptymalizowany do badania przewlekłych wyników emocjonalnych, a nie jako bezpośrednie biomechaniczne naśladownictwo urazów mózgu związanych ze sportem lub drobnych urazów drogowych.”Uraz mózgu (TBI) jest obecnie jedną z głównych przyczyn zgony związanej z traumatycznym uszczerbkiem na zdrowiu i śmiertelnością, powodując znaczne obciążenie medyczne i gospodarcze dla rodzin i społeczeństwa^1,2. Należy zauważyć, że uszkodzenie ośrodkowego układu nerwowego po TBI nie jest przemijające; zazwyczaj rozwija się w sposób przewlekły i postępujący. Badanie nad TBI ujawniło, że nawet 18 lat po urazie, utrzymuje się aktywność mikrogleju, a przewlekła neuroinflamacja powoduje poważne pogorszenie stanu neuronów³. Dane epidemiologiczne wskazują, że do 28%–32% pacjentów rozwija poważne zaburzenia emocjonalne podczas długotrwałej fazy powrotu do zdrowia⁴. W niniejszym artykule rmTBI odnosi się do paradygmatu indukcji powtarzającego się łagodnego urazu mózgu, podczas gdy następujący po urazie przewlekły etap, charakteryzujący się trwałymi zmianami zachowania, nazywany jest tutaj przewlekłym urazem mózgu (c-TBI). Termin c-TBI jest tutaj używany do opisania przewlekłego stanu po urazie charakteryzującego się trwałymi zmianami zachowania po rmTBI, a nie odrębnego paradygmatu urazu. To użycie jest koncepcyjnie spójne z naszą poprzednią pracą, która wykazała, że eksperymentalny TBI może rozwijać się jako przewlekły proces postępujący, związany z długotrwałymi nieprawidłowościami histopatologicznymi i behawioralnymi.

Te przewlekłe skutki neuropsychiatryczne poważnie obniżają jakość życia pacjentów i wyniki funkcjonalne⁵. Jednakże, dokładna patogeneza leżąca u podstaw tych wtórze zakłóceń emocjonalnych pozostaje niejasna, a opcje leczenia klinicznego są znacznie ograniczone. Dlatego badanie mechanizmów zachowań przypominających depresję wywołanych przez c-TBI i identyfikowanie precyzyjnych docelowych terapii jest pilną potrzebą kliniczną i ma znaczące znaczenie praktyczne.

Aby wyjaśnić patomechanizmy TBI, naukowcy opracowali różne modele zwierzęce, wśród których model kontrolowanego uderzenia kortykalnego (CCI) jest obecnie jednym z najczęściej stosowanych^6,7. CCI pozwala na precyzyjne sterowanie parametrami uderzenia w celu wygenerowania wysoce powtarzalnych ogniskowych uszkodzeń. Jednakże, zarówno CCI, jak i tradycyjne modele urazu płynowego (FPI) zazwyczaj wymagają wykonania przeszczepu czaszki. Takie podejścia są szczególnie przydatne do badania ogniskowego stłuczenia, utraty tkanki i ciężkich reakcji neuroinflamacyjnych związanych z uszkodzeniem, ale mają tendencję do symulowania ciężkiego otwartego urazu mózgu, co znacząco różni się od najczęstszych klinicznych przedstawień łagodnych zamkniętych urazów głowy, takich jak urazy mózgu związane ze sportem^8,9. Istotnie, martwicy tkanki mózgowej, bliznom gleju i późno fazowej kawitacji spowodowanej przez przeszczep czaszki i uderzenie przedstawiają dwie główne ograniczenia. Po pierwsze, poważne wady strukturalne często powodują dysfunkcję ruchomą, co bezpośrednio komplikuje dokładną ocenę wyników zachowania. Po drugie, fizyczna utrata tkanki odciąga długodystansowe łącza neuronowe. Jak wykazano w poprzednich badaniach przy użyciu modelu TBI indukowanego CCI, myszy wykazywały znaczne ogniskowe stłuczenia mózgu⁴. Ta strukturalna ingerencja poważnie utrudnia zastosowanie zaawansowanych technik neuroanatomicznych, takich jak wirusowe śledzenie, czyniąc badanie objawów psychiatrycznych i ich powiązanych obwodów neuronalnych w dużej mierze niewykonalnym. W związku z tym, chociaż te modele nadal są przydatne do badań nad ciężkim lub ogniskowym TBI, mogą być mniej odpowiednie, gdy celem jest badanie przewlekłych zaburzeń emocjonalnych po powtarzających się łagodnych zamkniętych urazach głowy, szczególnie gdy zachowanie integralności strukturalnej jest ważne dla analiz na poziomie zachowań i obwodów.

Aby pokonać ograniczenia wymienionych wyżej ciężkich modeli otwartego urazu mózgu, niniejsze badanie szczegółowo opisuje protokół ustanowienia mysiego modelu powtarzającego się łagodnego urazu mózgu (rmTBI) za pomocą metody upadku ciężaru na narażoną, nienaruszoną czaszkę bez przeszczepu czaszki. Ten protokół wykorzystuje precyzyjnie określone parametry uderzenia: wysokość spadku 25 cm i ciężar 20 g. Miejsce uderzenia zostało ukierunkowane 2 mm na lewo od szwu strzałkowego i 2 mm za szwem czołowym, za pomocą wygiętego metalowego kończyka uderzeniowego o średnicy 4 mm, aby zapewnić dokładność i jednorodność siły uderzenia. Ponadto, określona częstotliwość powtarzanych uderzeń przez pięć kolejnych dni zap

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Instytutu Sztucznej Inteligencji, Hefei Comprehensive National Science Center (Numer zgody IAI2024071004). Wszystkie procedury były wykonywane zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Schematyczny diagram protokołu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 1. Można zastosować odpowiednie urządzenia od innych dostawców, pod warunkiem, że zostaną zachowane kluczowe cechy wydajności, takie jak 20 g wagi uderzenia, 25 cm wysokość upadku, 4 mm średnica końcówki uderzeniowej, niezawodne podawanie izofluranu i ustawienia MRI porównywalne z tymi użytymi tutaj. Reagenty i użyte sprzęty są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Przygotuj zwierzęta.
   1. Użyj samców myszy C57BL/6N w wieku 8-10 tygodni i ważących 20-25 g.
   2. Przechowuj myszy w pojedynczo wentylowanych klatkach (IVCs) w specjalnym wolnym od patogenów (SPF) obiekcie hodowli zwierząt. Zapewnij pokarm i wodę ad libitum oraz utrzymuj cykl 12 h światło/12 h ciemność w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności.
   3. Przyzwyczaj myszy do pomieszczenia przed eksperymentem i wykonaj rutynowe badania zdrowia zgodnie z instytucjonalnymi procedurami opieki nad zwierzętami.
2. Przypisz grupy.
   1. Losowo przypisz myszy do grupy Naive, grupy Sham i grupy c-TBI. Badacze odpowiedzialni za interpretację MRI, ogólną ocenę patologiczną i punktowanie behawioralne/analizę danych byli nieświadomi przypisania do grupy.
   2. Zapisz numer identyfikacyjny zwierzęcia i przypisanie do grupy przed pierwszą sesją urazu.

2. Przygotowanie do operacji i znieczulenia

1. Przygotuj instrumenty chirurgiczne i system znieczulenia.
   1. Przygotuj sterylny skalpel wyposażony w ostrzałko nr 11, sterylne waciki, sterylny fizjologiczny roztwór soli, 10% roztwór powidenu jodu, 5-0 nietrawione szwy monofilamentowe z polipropylenu, taśmę klejącą i chlortetracyklinę w maści okulistycznej.
   2. Sterilizuj instrumenty chirurgiczne przed użyciem, umieść je na czystym polu chirurgicznym i utrzymuj aseptyczną technikę przez cały zabieg. Noś odpowiednie wyposażenie ochrony osobistej, w tym rękawiczki, labrador i ochronę oczu.
   3. Przygotuj termostatowane poduszeczki grzewcze i ustaw je na 37 °C ± 0,5 °C.
   4. Podłącz komorę indukcyjną i nos koniec do systemu znieczulenia gazowego dla zwierząt laboratoryjnych.
   5. Ustaw szybkość przepływu tlenu na 0,5-1,0 L/min i przygotuj vaporizer izofluranu do indukcji i podtrzymującego. Przeprowadzaj znieczulenie w dobrze wentylowanym obszarze lub używaj zatwierdzonego systemu odprowadzania odpadowych gazów.
2. Przygotuj mysz do operacji.
   1. Podaj buprenorfinę HCl (0,1 mg/kg, dootrzewnowo) 30 min przed znieczuleniem i operacją zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt.
   2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie izofuranem. Ustaw vaporizer na 3-5% do indukcji i monitoruj mysz ciągle, aż zaniknie odruch prawienia się i przestaną się spontanicznie poruszać kończynami. Nie przekraczaj 5% izofluranu podczas indukcji.
   3. Przenieś mysz na ramę stereotaktyczną w pozycji brzusznej i utrzymuj znieczulenie przez nos koniec. Zmniejsz ustawienie vaporizera do 1-2% na podtrzymanie, utrzymując szybkość przepływu tlenu na poziomie 0,5-1,0 L/min.
      1. Podczas zabiegu utrzymuj stabilną częstotliwość oddechu na poziomie około 60-100 oddechów/min. Jeśli częstotliwość oddechu spadnie poniżej 60 oddechów/min lub oddech stanie się płytki lub nieregularny, natychmiast zmniejsz stężenie izofluranu, zapewnij wsparcie w postaci podgrzania i opóźnij uderzenie, aż oddech ustabilizuje się. Nie przekraczaj 2% izofluranu podczas podtrzymującego znieczulenia.
   4. Potwierdź odpowiednie znieczulenie przez brak odruchu wycofania łap, zamocuj głowę za pomocą zacisków stereotaktycznych bez uszkodzenia błon bębenkowych (Rysunek 2A) i utrzymuj mysz w pozycji brzusznej. Jeśli nie można osiągnąć odpowiedniego znieczulenia w podanym zakresie indukcji i podtrzymującego lub jeśli wystąpi nadmierny spadek oddechu, wyklucz zwierzę z tej sesji urazowej.
   5. Nałóż chlortetracyklinę w maści okulistycznej na oba oczy, ogol i zdezynfekuj miejsce operacji 10% roztworem powidenu jodu.

3. Ustanowienie modelu powtarzającego się łagodnego urazu mózgu

1. Odsłonij czaszkę.
   1. Wykonaj podłużne cięcie pośrodkowe, o długości około 0,5 cm do 1 cm, w skórze głowy za pomocą sterylnego skal

Wyniki

Ocenian i neuropatologiczne ocena myszy z c-TBI

Aby ocenić ogólny stan zdrowia i podstawową funkcję motoryczną zwierząt, monitorowano masę ciała i wyniki przejścia po belce zgodnie z harmonogramem przedstawionym na Rysunek 1. Różnice między grupami w długotrwałej ocenie przeprowadzono za pomocą liniowego modelu mieszanego z efektem losowym zwierzęcia. Przed modelowaniem nie było statystycznie istotnych różnic w masie ciała między grupami (

Dyskusja

Niniejsze badanie szczegółowo opisuje standaryzowany protokół eksperymentalny do ustanowienia mysiego modelu powtarzającego się łagodnego urazu mózgu (rmTBI) przy użyciu powtarzanej metody wolnego upadku ciężaru. Poprzez zamocowanie myszy z odsłoniętym czaszkiem w urządzeniu stereotaktycznym i stosowanie powtarzanych uderzeń w określonych punktach za pomocą 20-gramowego ciężaru upuszczanego z wysokości 25 cm przez pięć kolejnych dni, indukowane zostało zachowanie fenotypowe charakterystyczne dla przewlekłych zachowań prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-0 nonabsorbable polypropylene monofilament suture	Jinhuan Medical	I303	zamknięcie rany
Maszyna do znieczulenia	RWD Life Science	R550	budowa modeli zwierzęcych
Oprogramowanie do śledzenia zachowań ANY-maze	Stoelting	Wersja 7	oprogramowanie behawioralne
Labirynt Barnesa	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XB108	oprogramowanie behawioralne
Biorender	BioRender	https://biorender.com	oprogramowanie do rysowania naukowego
Buprenorfina	Sigma-Aldrich	Y0001108	ból pooperacyjny
Golarka elektryczna	AUX	AUX-C5-1	usuwanie włosów przed operacją
Test pływania pod przymusem	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	oprogramowanie behawioralne
GraphPad Prism 9.5	La Jolla	9.5	oprogramowanie statystyczne
Izofluran	RWD Life Science	R510-22-10	budowa modeli zwierzęcych
Myszy	Charles river	C57/6N	zwierzę eksperymentalne
Test na otwartym polu	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XZ301	oprogramowanie behawioralne
Maść okulistyczna	BEIJING TWINLUCK PHARMACEUTICAL	H11021342	zapobieganie wysychaniu rogówki podczas znieczulenia
Paraformaldehyd (PFA), 4%	Biosharp	BL539A	perfuzja i fiksacja tkanek
Roztwór fosforanowego buforu soli (PBS)	Biosharp	BL1425A	perfuzja i mycie tkanek
Roztwór povidonu jodowego, 10%	Beyotime	27883-25g	dezynfekcja skóry przed operacją
System obrazowania jądrowego magnetycznego przedklinicznego	United Imaging Life Science Instrument	uMR9.4T	oprogramowanie do obrazowania
Ostrza skalpela nr 11	Jinhuan Medical	K3-11	nacięcie skóry podczas operacji
Uchwyt skalpela	Jinhuan Medical	K6-10	używany z ostrzami skalpela nr 11
Narzędzie stereotaksji	RWD Life Science	68025	budowa modeli zwierzęcych
Sterylna gaza	HYNAUT	BK05	kontrola krwotoku i czyszczenie chirurgiczne
Test zawieszenia na ogonie	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	oprogramowanie behawioralne
Uderzeniowy ważyk	RWD Life Science	68093	budowa modeli zwierzęcych