System reporterowy adenowirusowy oparty na fibroblastach, sterowany promotorem mysiego kolagenu typu I alfa 1, do przesiewania leków antyfibrotycznych

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje opracowanie opartego na fibroblastach adenowirusowego systemu reporterowego, sterowanego przez mysi promotor kolagenu typu I, w celu umożliwienia podłużnego monitorowania aktywacji fibroblastów oraz ułatwienia wysokoprzepustowego przesiewu związków antyfibrotycznych.

Streszczenie

Włóknienie serca, charakteryzujące się nieprawidłową aktywacją fibroblastów i nadmiernym odkładaniem macierzy zewnątrzkomórkowej, nie posiada terapii celowanych, co wynika w dużej mierze z braku podłużnych, skalowalnych i nieniszczących platform przesiewowych in vitro. Tradycyjne analizy punktu końcowego oraz pracochłonne modele komórek macierzystych z natury wykluczają monitorowanie progresji włóknienia w czasie rzeczywistym. Aby pokonać te ograniczenia, niniejszy protokół opisuje generowanie, optymalizację i walidację adenowiralnego systemu reporterowego fluorescencyjnego mCherry sterowanego promotorem mysiego kolagenu typu I alfa 1 (Col1a1) (Ad-mCol1a1p-mCherry) w fibroblastach NIH/3T3. Szczegółowo omówiono kluczowe etapy pakowania rekombinowanego adenowirusa, optymalizację transdukcji (wielokrotność infekcji) w celu zminimalizowania cytotoksyczności oraz ustanowienie stabilnego modelu włóknienia indukowanego przez czynnik wzrostu transformującego beta (TGF-β). Dzięki wyeliminowaniu konieczności fiksacji komórek, system ten umożliwia bezpośrednie i podłużne monitorowanie transkrypcji kolagenu w żywych komórkach. Specyficzność i wiarygodność modelu zostały zwalidowane farmakologicznie przy użyciu inhibitora receptora TGF-β typu I (ALK5) SB431542, a odczyty fluorescencyjne korelowały z endogennymi markerami włóknienia ilościowo określonymi za pomocą ilościowej polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją oraz testu immunoenzymatycznego. Ostatecznie ta kosztowo efektywna platforma stanowi dostępny instrument do wysokoprzepustowego przesiewu nowych środków przeciw włóknieniowych, przyspieszając tym samym translacyjne badania w dziedzinie kardiologii.

Wprowadzenie

Leczenie włóknienia mięśnia sercowego wiąże się ze znacznymi wyzwaniami klinicznymi. Proces ten, charakteryzujący się nieprawidłową aktywacją spoczynkowych fibroblastów do miofibroblastów oraz nadmiernym odkładaniem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), stanowi nieodwracalną ścieżkę końcową wspólną dla niewydolności serca, zawału mięśnia sercowego oraz innych chorób układu sercowo-naczyniowego^1,2,3. Obecne strategie terapeutyczne napotykają jednak istotne ograniczenia. Konwencjonalne interwencje — takie jak diuretyki, β-blokery oraz inhibitory układu renina-angiotensyna-aldosteron — przede wszystkim łagodzą ogólnoustrojowy stres hemodynamiczny i ograniczają aktywację neurohumoralną^4,5,6,7. Terapie te nie oddziałują bezpośrednio na aktywację fibroblastów ani nie zatrzymują postępującego odkładania kolagenu. Co więcej, mimo że patologia ta jest napędzana przez kaskady sygnałowe, takie jak szlak TGF-β/Smad (transformujący czynnik wzrostu beta), stres oksydacyjny i reprogramowanie metaboliczne, przełożenie tych spostrzeżeń na bezpośrednio działające terapie antyfibrotyczne pozostaje trudne ze względu na toksyczność systemową i nieswoiste mechanizmy dostarczania leków^8,9,10. Istnieje zatem pilna potrzeba opracowania nowych, specyficznych dla celu terapii antyfibrotycznych. Głównym wąskim gardłem translacyjnym jest brak systemów oceny funkcjonalnej, które byłyby w stanie w sposób czuły i dynamiczny raportować aktywację fibroblastów. Tradycyjne modele eksperymentalne wykazują znaczące ograniczenia, które uniemożliwiają efektywny screening farmakologiczny^11,12. Chociaż modele zwierzęce in vivo odtwarzają globalne przebudowy serca, obciążone są różnicami międzygatunkowymi, wydłużonym czasem trwania eksperymentów, wysokimi kosztami i niską przepustowością¹¹.

Aby pokonać te przeszkody, opracowano różne platformy przesiewowe in vitro, jednak nadal występują w nich krytyczne wady metodologiczne. Wysokoprzepustowe testy immunofluorescencyjne wymagają destrukcyjnej fiksacji komórek i pracochłonnego przetwarzania, dostarczając jedynie statycznego obrazu, zamiast rejestrować kinetykę aktywacji fibroblastów w czasie rzeczywistym. Podobnie platformy integrujące bezznacznikowe monitorowanie impedancji ze spektrometrią mas (MS/MS) obarczone są brakiem specyficzności i niską skalowalnością, ponieważ spadki impedancji spowodowane ogólną toksycznością komórkową mogą być łatwo pomylone z rzeczywistą skutecznością przeciwzwłóknieniową. Ponadto systemy raportujące oparte na technologii CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), wykorzystujące indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs) do śledzenia markerów cytoszkieletu (np. aktyny alfa-gładkobłonkowca [α-SMA]/ACTA2), napotykają poważne bariery translacyjne¹³. Modele oparte na iPSCs są nadmiernie kosztowne, wymagające technicznie i w dużej mierze niedostępne dla rutynowych wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Co więcej, poleganie na markerach cytoszkieletu, takich jak α-SMA, może nie oddawać dokładnie punktu końcowego procesu patologicznego, ponieważ ich ekspresja nie koreluje ściśle z funkcjonalną sekrecją i nadmiernym odkładaniem się ECM¹⁴. W związku z tym systemy te są niewystarczające do podłużnego mapowania wczesnych odpowiedzi komórkowych na interwencje farmakologiczne.

W przeciwieństwie do powyższego, niniejszy protokół opisuje podłużny system reporterowy funkcji napędzany przez promotor kolagenu typu I alfa 1 (Col1a1), którego celem jest stworzenie niedestrukcyjnej i stabilnej platformy do monitorowania aktywacji fibroblastów. Ponieważ kolagen typu I jest dominującym składnikiem ECM odkładanym podczas przebudowy serca, rejestracja aktywacji transkrypcyjnej genu kodującego ten białko, Col1a1, stanowi bezpośredni i istotny patologicznie wskaźnik aktywacji fibroblastów. Ten model oparty na promotorze Col1a1 umożliwia ciągłe monitorowanie procesów włóknienia na poziomie molekularnym, oferując czułą, podłużną i mierzalną platformę zoptymalizowaną pod kątem przesiewowych badań leków opartych na mechanizmach działania.

Protokół

Potwierdzamy, że wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi. Ponieważ w badaniu wykorzystano wyłącznie ustanowioną linię komórkową fibroblastów zarodkowych myszy NIH Swiss (NIH/3T3) oraz system reporterowy mCol1a1p-mCherry i nie zaangażowano w nie żadnych kręgowców, embrionów ani ludzi, procedury opisane w niniejszym manuskrypcie nie wymagały zgody komisji etycznej.

Wszystkie procedury z wykorzystaniem rekombinowanych wektorów adenowirusowych przeprowadzono zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego oraz standardowymi praktykami dla 2. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2). Praca z wirusami, transdukcja, przechowywanie oraz utylizacja odpadów odbywały się przy użyciu certyfikowanych komór bezpieczeństwa biologicznego i odpowiedniego sprzętu ochrony indywidualnej. Odpady ciekłe zawierające materiał adenowirusowy przed utylizacją odkażano świeżo przygotowanym roztworem wybielacza, a zanieczyszczone materiały zużywalne autoklawowano zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Przypadkowe wycieki były natychmiast dezynfekowane przy użyciu zatwierdzonych środków wirusobójczych, zgodnie z instytucjonalnymi procedurami reagowania na wycieki.

1. Przegląd schematu doświadczalnego

1. Wygenerować rekombinowany adenowirus sterowany promotorem Col1a1 myszy, zgodnie z opisem w kroku 2.
2. Zoptymalizować warunki transdukcji wirusowej w fibroblastach NIH/3T3, zgodnie z opisem w kroku 3.
3. Ustanowić model reporterowy włóknienia in vitro reagujący na TGF-β, zgodnie z opisem w kroku 4.
4. Zweryfikować stabilność, swoistość i biologiczną powtarzalność modelu, wykorzystując stymulację TGF-β zależną od czasu i dawki, zgodnie z opisem w kroku 4.
5. Przeprowadzić inhibicję farmakologiczną z użyciem SB431542, zgodnie z opisem w kroku 5.
6. Wykonać analizy z użyciem enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego (ELISA) oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR), zgodnie z opisem w kroku 5.
   UWAGA: Schematyczny przegląd przebiegu eksperymentu przedstawiono na rysunku 1A. Listę aparatury i odczynników eksperymentalnych znajduje się w tabeli materiałów.

Rycina 1. Schemat tworzenia i walidacji adenowirusowego systemu reporterowego mCol1a1p-mCherry w fibroblastach. (A) Schematyczny przegląd konstrukcji adenowirusowego (AdV) systemu reporterowego mCol1a1p-mCherry oraz przebieg eksperymentalny walidacji modelu w fibroblastach NIH/3T3. Procedura obejmuje klonowanie promotora, montaż rekombinowanego adenowirusa, pakowanie wirusa w komórkach HEK293, optymalizację wielokrotności infekcji (MOI) oraz następujący po nich wysokoprzepustowy screening fluorescencyjny. (B) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne fibroblastów NIH/3T3 zainfekowanych adenowirusem Ad-mCol1a1p-mCherry przy MOI wynoszących 0, 1, 10, 100 i 1000. Jądra komórkowe barwiono Hoechst 33342 (niebieski), a fluorescencja mCherry (czerwony) wskazuje aktywność promotora Col1a1. Intensywność fluorescencji została zmierzona za pomocą obrazowania wysokoprzepustowego i znormalizowana do liczby jąder. Do dalszych eksperymentów wybrano MOI 100 ze względu na silną i jednorodną ekspresję reportera przy minimalnych zmianach morfologicznych. Paski skali = 200 µm. Rycina została stworzona w serwisie BioRender.com przy użyciu zatwierdzonych licencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

2. Konstrukcja, pakowanie i amplifikacja adenowirusa z promotorem mCol1a1

1. Konstrukcja rekombinowanego wektora adenowirusowego
   1. Sklonuj fragment promotora mysiego genu Col1a1 o długości 2354 bp (współrzędne genomowe: chr11:94824779–94827132; od −2271 do +83 bp względem miejsca rozpoczęcia transkrypcji [TSS]) powyżej genu reporterowego mCherry do adenowirusowego wektora transferowego pDC315.
      UWAGA: Pełna sekwencja promotora Col1a1 oraz szczegółowa mapa plazmidu pDC315-mCol1a1p-mCherry zostały przedstawione w Pliku uzupełniającym 1 oraz na Rysunku uzupełniającym 1.
   2. Zlinearyzuj wektor pDC315 za pomocą enzymów BamHI i KpnI. Namnóż wstawkę promotorową przy użyciu starterów zawierających ramiona homologii o długości 15–25 bp.
      UWAGA: Zastosuj strategię bezszwowego klonowania opartą na rekombinacji homologicznej, aby ułatwić rekombinację in vitro.
   3. Zweryfikuj otrzymany plazmid poprzez screening PCR i sekwencjonowanie metodą Sangera.
      UWAGA: Dokładnie sprawdź sekwencję złącza promotor–reporter, aby upewnić się, że nie występują przesunięcia ramki odczytu ani przedwczesne kodony stop.
   4. Wygeneruj rekombinowany adenowirus za pomocą systemu AdMax poprzez wewnątrzkomórkową rekombinację opartą na rekombinazie Cre.
      UWAGA: Plazmid szkieletowy pBHGloxΔE1,3Cre zawiera niereplikacyjny genom Ad5 z delecjami E1/E3 oraz kasetą ekspresyjną rekombinazy Cre, która umożliwia specyficzną dla miejsca rekombinację z miejscem loxP w wektorze transferowym.
   5. Wykonywań kotransfekcję komórek HEK293 zwalidowanym wektorem transferowym pDC315-mCol1a1p-mCherry oraz plazmidem szkieletowym adenowirusowym pBHGloxΔE1,3Cre.
2. Pakowanie i amplifikacja adenowirusa
   1. Hoduj komórki HEK293 w podłożu DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Do pakowania adenowirusowego używaj komórek o niskim numerze pasażu (<20 pasażów).
   2. Wysiej komórki HEK293 przy konfluencji 30%–40% na 24 h przed transfekcją, aby osiągnąć konfluencję 50%–60% w momencie transfekcji.
   3. Kotransfekuj komórki HEK293 5 µg plazmidu transferowego i 5 µg pomocniczego plazmidu pBHGloxΔE1,3Cre przy użyciu odczynnika do transfekcji Lipofectamine 2000.
      UWAGA: Zachowaj stosunek DNA do odczynnika 1:1 (10 µg całkowitego DNA na 10 µL odczynnika do transfekcji).
   4. Kultury transfektowanych komórek inkubuj w 37°C przy 5% CO₂ i monitoruj codziennie pod kątem efektów cytopatycznych.
      UWAGA: Pojawienie się wstępnych CPE może zająć 7–14 dni. Jeśli podłoże stanie się kwaśne (żółte), przeprowadź delikatną wymianę połowy objętości podłoża, nie zakłócając warstwy komórek.
   5. Zbierz komórki i nadsącz, gdy zaobserwowane zostaną typowe CPE, charakteryzujące się zaokrągleniem i kurczeniem się komórek, a co najmniej 50% komórek oddzieli się od powierzchni hodowli.
      UWAGA: Etap ten jest zazwyczaj osiągany 10–15 dni po transfekcji.
   6. Przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania, zamrażając próbki w −70°C przez 30 min i rozmrażając je w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
   7. Po każdym etapie rozmrażania mieszaj zawiesinę na wortexie przez 30 s, aby ułatwić lizę komórek.
      UWAGA: Unikaj przedłużonej inkubacji w 37°C podczas rozmrażania, aby zachować stabilność wirusa.
   8. Przygotuj 10-krotne rozcieńczenia seryjne lizatu wirusowego (10⁻¹ do 10⁻¹³) w kompletnym podłożu DMEM. Dodaj 90 µL każdego rozcieńczenia wirusa do komórek HEK293 wysianych na płytkach 96-dołkowych, stosując 10 powtórzeń na rozcieńczenie.
      UWAGA: Miano wirusa ≥1 × 10⁹ PFU/mL zdefiniowano jako wystarczający punkt końcowy amplifikacji do dalszej puryfikacji.
   9. Oczyszć 10 mL surowego lizatu wirusowego przez filtr 0,45 µm, aby usunąć szczątki komórkowe.
   10. Potraktuj oczyszczony lizat nukleazą Benzonase (10 U/mL) w 37°C przez 30 min.
   11. Oczyść rekombinowany adenowirus za pomocą zestawu Adeno-X Virus Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
       UWAGA: Wymieszaj lizat z 1× buforem do rozcieńczania przed nałożeniem na uprzednio równoważony filtr puryfikacyjny. Przemyj filtr 1× buforem do przemywania (Wash Buffer) i eluuj oczyszczonego wirusa za pomocą 3 mL 1× buforu do elucji (Elution Buffer).
   12. Inkubuj płytki przez 10 dni i oceniaj efekty cytopatyczne (CPE) pod mikroskopem świetlnym. Oznacz pozytywne CPE na podstawie charakterystycznego zaokrąglenia i oddzielania się komórek. Oblicz zakaźne miano wirusa metodą Spearmana–Karbera na podstawie oceny CPE.
       UWAGA: Upewnij się, że końcowy stok wirusa osiąga co najmniej 1 × 10¹¹ PFU/mL do dalszych zastosowań.
   13. Rozdziel oczyszczonego adenowirusa na alikwoty i przechowuj stok wirusa w −80°C.
       UWAGA: Przechowuj oczyszczone alikwoty adenowirusowe w −80°C do długotrwałej konserwacji. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, aby zachować zakaźność wirusa.

3. Hodowla komórek i optymalizacja warunków infekcji wirusowej

1. Hodować fibroblasty NIH/3T3 w pożywce DMEM/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) uzupełnionej o 10% FBS oraz 1% penicyliny i streptomycyny.
   UWAGA: Należy używać komórek między 3. a 8. pasażem, które w kolbie źródłowej osiągnęły 70%–80% konfluencji, aby zapewnić jednolity stan komórek.
2. Wysiać fibroblasty NIH/3T3 do płytek 384-dołkowych w zagęszczeniu 4 × 10³ liczba komórek na dołek w 40 µL pełna pożywka hodowlana.
3. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w obecności 5% CO₂ przez 12 h, aby umożliwić adhezję komórek i wejście w logarytmiczną fazę wzrostu.
   UWAGA: Aby zminimalizować nierównomierny rozkład komórek oraz efekty brzegowe, należy pozostawić płytki w temperaturze pokojowej na 20–30 min przed inkubacją. Zewnętrzne studzienki należy wypełnić sterylnym roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS) lub sterylną wodą.
4. Zainfekuj komórki rekombinowanym adenowirusem przy wielokrotnościach infekcji (MOI) w zakresie od 1 do 1000, wraz z niezinfekowaną kontrolą.
   UWAGA: Oblicz wymaganą objętość adenowirusa, korzystając z następującego wzoru:
   
   
   Tutaj V to objętość zapasu adenowirusa (ml), a N to liczba wysianych komórek na dołek (4 × 10³), MOI to pożądana wielokrotność zakażenia, a T to miano wirusa zakaźnego (PFU/ml). Stan wirusa wykorzystany w niniejszym badaniu miał miano zakaźne wynoszące 1 × 10¹¹ PFU/ml, wyznaczone metodą Spearmana–Karbera opisaną w kroku 2.2.12.
5. Należy upewnić się, że objętość dodanego stoku wirusa nie przekracza 10% całkowitej objętości studzienki.
   UWAGA: Nadmierne objętości zapasów wirusa mogą zmienić pH medium i wywołać nieswoistą cytotoksyczność.
6. Zastąp medium zawierające wirusa przez 40 µL świeża kompletna pożywka hodowlana 24 h po infekcji.
   UWAGA: Należy użyć pożywki DMEM/F12 uzupełnionej o 10% FBS oraz 1% penicyliny i streptomycyny, zgodnie z krokiem 3.1.
7. Wymianę medium należy przeprowadzić przy użyciu zautomatyzowanego systemu do dozowania cieczy pracującego z niską prędkością lub poprzez ostrożne przykładanie końcówek pipety wielokanałowej pod kątem do górnej ścianki bocznej każdego dołka.
   UWAGA: Podczas pracy z płytkami 384-dołkowymi należy unikać standardowej aspiracji próżniowej, aby zminimalizować odrywanie się komórek.
8. Optymalną wielokrotność infekcji (MOI) definiuje się jako najniższą dawkę wirusa, która wywołuje widoczny i jednorodny mCherry fluorescencję, zachowując morfologię komórek i liczbę jąder porównywalną do tych w niezinfekowanych komórkach kontrolnych.
   UWAGA: Ekspresję reportera należy ocenić na podstawie liczby jąder zabarwionych barwnikiem Hoechst oraz obrazowania fluorescencyjnego. Komórki powinny zachować charakterystyczną wrzecionowatą morfologię, bez zaokrąglania lub odrywania się od podłoża. Zbyt wysokie MOI mogą indukować poziom basalny mCherry aktywacja poprzez komórkowe odpowiedzi na stres. Reprezentatywne wyniki fluorescencji przy różnych MOI przedstawiono w Rycina 1B.
9. Wybierz zoptymalizowaną wielokrotność infekcji (MOI) do wszystkich dalszych eksperymentów.
   UWAGA: W niniejszym badaniu do dalszych eksperymentów wybrano MOI wynoszące 100.

4. Ocena stabilności modelu przy użyciu stymulacji TGF-β

1. Zainfekuj fibroblasty NIH/3T3 rekombinowanym adenowirusem przy zoptymalizowanym MOI wynoszącym 100, zgodnie z ustaleniami z etapu 3.9.
2. Poddaj fibroblasty głodzeniu surowiczym w pożywce DMEM/F12 zawierającej 0,2% FBS przez 12 h przed stymulacją TGF-β.
   UWAGA: Głodzenie surowicze przeprowadzono w celu synchronizacji komórek i zminimalizowania podstawowej aktywacji promotora Col1a1.
3. Przygotuj roztwór zapasowy rekombinowanego ludzkiego TGF-β o stężeniu 100 µg/mL, używając 4 mM HCl zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
   UWAGA: Rozdziel roztwór zapasowy TGF-β na małe aliquoty i przechowuj w temperaturze −80°C, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
4. Potraktuj komórki gradientem stężeń TGF-β w zakresie 0–40 ng/mL w sześciu niezależnych powtórzeniach biologicznych.
   UWAGA: Warunek 0 ng/mL służył jako niepobudzona grupa kontrolna.
5. Inkubuj stymulowane komórki w temperaturze 37°C przy 5% CO₂ przez 24, 48 lub 72 h. Użyj osobnych płytek równoległych dla każdego punktu czasowego obrazowania, aby zminimalizować skumulowaną fototoksyczność.
6. Zbarw komórki roztworem Hoechst 33342 o końcowym stężeniu roboczym 2,5 µg/mL przez 15 min przed obrazowaniem.
   UWAGA: Przygotuj roztwór barwiący poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego Hoechst 33342 (10 mg/mL) w stosunku 1:4000 w sterylnym PBS. Barwienie wykonuj w warunkach ochrony przed światłem, aby zminimalizować fotowyblakanie.
7. Nabyj obrazy fluorescencyjne za pomocą systemu obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging system) wyposażonego w suchy obiektyw 10×.
8. Wykonaj zdjęcia pięciu niezakładających się pól na studzienkę w formacie płytki 384-dołkowej dla każdego warunku doświadczalnego.
   UWAGA: Utrzymuj identyczne ustawienia obrazowania we wszystkich grupach doświadczalnych, aby zapewnić porównywalność. Stosuj zautomatyzowany autofokus laserowy i utrzymuj warunki kontroli środowiskowej przy 37°C i 5% CO₂ podczas obrazowania żywych komórek.
9. Nabyj obrazy fluorescencyjne mCherry przy użyciu wzbudzenia 561 nm, filtra emisyjnego przepustowego 600/52 (BP600/52) oraz czasu ekspozycji 200 ms.
10. Nabyj obrazy fluorescencyjne Hoechst przy użyciu wzbudzenia 405 nm, filtra emisyjnego BP445/45 oraz czasu ekspozycji 30 ms.
    UWAGA: Ustaw wzmocnienie kamery (gain) na 1,0 i nabywaj wszystkie obrazy w pełnej rozdzielczości kamery przy binningu 1 × 1, aby zachować liniową detekcję fluorescencji i zmaksymalizować rozdzielczość przestrzenną.
11. Przeanalizuj uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu CellPathfinder.
12. Zidentyfikuj jądra w kanale Hoechst jako obiekty pierwotne, przyjmując referencyjną średnicę jądra 20 µm i zakres pola powierzchni 20–400 µm².
13. Zdefiniuj cytoplazmatyczne obszary zainteresowania (ROI) w kanale mCherry, rozszerzając je od granicy jądra przy użyciu referencyjnej średnicy komórki 60 µm.
    UWAGA: Podczas segmentacji zastosuj filtr „Exclude Edge”, aby usunąć niecałkowite komórki dotykające krawędzi obrazu.
14. Oblicz średnią intensywność fluorescencji dla każdej zidentyfikowanej komórki i wyznacz średnią intensywność fluorescencji na studzienkę ze wszystkich pięciu uchwyconych pól.

5. Walidacja wiarygodności modelu z wykorzystaniem testu ELISA oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

1. Zainfekuj fibroblasty NIH/3T3 rekombinowanym adenowirusem przy zoptymalizowanym MOI wynoszącym 100, zgodnie z opisem w kroku 3.9.
2. Poddaj komórki wstępnej inkubacji z SB431542 przez 30–60 min przed stymulacją TGF-β.
   UWAGA: Przygotuj 20 mM roztwór zapasowy SB431542 w dimetylosulfoksydzie (DMSO) i przechowuj aliquoty w temperaturze −20°C.
3. Potraktuj komórki 10 ng/mL TGF-β oraz SB431542 w końcowych stężeniach 1, 5, 10 i 15 µM. Uwzględnij grupę kontrolną z nośnikiem zawierającą 0,1% (v/v) DMSO bez związku SB431542.
   UWAGA: Utrzymuj końcowe stężenie DMSO na poziomie 0,1% (v/v) we wszystkich grupach badawczych.
4. Przygotuj roztwór roboczy TGF-β, stosując metodę rozcieńczania dwustopniowego.
   UWAGA: Rozcieńcz 100 µg/mL roztwór zapasowy TGF-β (przygotowany w 4 mM HCl zawierającym 0,1% BSA) w stosunku 1:100 w sterylnym PBS przed dalszym rozcieńczeniem w pełnej pożywce hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 10 ng/mL.
5. Inkubuj potraktowane komórki w płytkach 6-dołkowych przez 24 h w temperaturze 37°C przy 5% CO₂.
6. Pobierz 2 mL supernatantu hodowlanego z każdego dołka do analizy metodą ELISA.
7. Wirowarkuj pobrane supernatanty przy 1 000 × g przez 5 min w temperaturze 4°C w celu usunięcia resztek komórkowych.
8. Rozdziel oczyszczone supernatanty na aliquoty i przechowuj je w temperaturze −80°C do czasu przeprowadzenia analizy ELISA.
   UWAGA: Oczyszczone supernatanty mogą być przechowywane w temperaturze −80°C przed analizą ELISA.
9. Po usunięciu supernatantu delikatnie przemyj przylegające komórki lodowatym PBS.
10. Dodaj 1 mL odczynnika TRIzol bezpośrednio do każdego dołka, aby zlizować komórki.
    UWAGA: Kilkukrotnie pipetuj lizat, aby zapewnić całkowitą homogenizację przed przeniesieniem próbek do probówek do mikrocentryfugi. Lizaty RNA mogą być przechowywane w temperaturze −80°C przed ekstrakcją RNA.
11. Wyizoluj całkowite RNA z lizatów do analizy metodą ilościowej polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR).
12. Przeprowadź odwrotną transkrypcję, używając 1 µg całkowitego RNA.
    UWAGA: Odwrotną transkrypcję przeprowadź w następujących warunkach reakcji: 25°C przez 10 min, 42°C przez 15 min oraz 85°C przez 2 min.
13. Wykonaj ilościowy PCR, używając PerfectStart Green qPCR SuperMix. Przygotuj każdą reakcję w końcowej objętości 20 µL zawierającej 5 µL matrycy komplementarnego DNA (cDNA).
14. Przeprowadź reakcje qPCR w następujących warunkach cykli: wstępna denaturacja w 94°C przez 30 s, a następnie 40 cykli: 94°C przez 5 s, 60°C przez 15 s i 72°C przez 10 s.
    UWAGA: Po amplifikacji przeprowadź analizę krzywej topnienia w celu potwierdzenia specyficzności produktu.
15. Znormalizuj ekspresję genu Col1a1 względem 18S rRNA jako kontroli wewnętrznej.
    UWAGA: Wszystkie sekwencje starterów znajdują się w Tabeli uzupełniającej 1.
16. Oznacz ilościowo poziom wydzielonego białka kolagenu typu I w oczyszczonych supernatantach metodą ELISA zgodnie z instrukcją producenta. Zakres krzywej wzorcowej dla testu ELISA kolagenu typu I u myszy wynosi 0,78–50 ng/mL, a czułość detekcji testu to 0,37 ng/mL.
17. Wszystkie wzorce i próbki analizuj w duplikatach technicznych i zmierz gęstość optyczną (OD) przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
    UWAGA: Używaj nierozcieńczonych oczyszczonych supernatantów, aby zmaksymalizować czułość testu w detekcji wydzielonego Col1a1.

Wyniki

Schematyczny przegląd konstrukcji i pakowania rekombinowanego adenowirusa mCol1a1p-mCherry przedstawiono na Rysunku 1A. Promotor mysiego genu Col1a1 został sklonowany powyżej genu reporterowego mCherry i wbudowany do wektora adenowirusowego, a następnie poddany pakowaniu wirusowemu i amplifikacji w komórkach HEK293. Schemat przepływu pracy ilustruje kluczowe etapy eksperymentalne, w tym infekcję wirusową, stymulację włóknistą, interwencję farmakologiczną oraz odczyt sygnału opartego na fluorescencji. Ten schemat stanowi wizualną podstawę do wdrożenia systemu reporterowego i wspiera interpretację późniejszych eksperymentów z walidacji funkcjonalnej.

Aby określić optymalne warunki infekcji wirusowej, fibroblasty NIH/3T3 zainfekowano adenowirusem mCol1a1p-mCherry przy zastosowaniu różnych wartości MOI. Jak pokazano na Rysunku 1B, intensywność fluorescencji mCherry wzrastała wraz ze wzrostem MOI. Przy niskich wartościach MOI ekspresja reportera była słaba i niejednorodna, co stanowiło podoptymalne warunki do analizy ilościowej. Przy wysokich wartościach MOI komórki wykazywały zmienioną morfologię, w tym zaokrąglanie i odrywanie się, co wskazywało na efekty cytotoksyczne. Wartość MOI równa 100 zapewniła silną i jednorodną fluorescencję przy zachowaniu prawidłowej morfologii komórek, w związku z czym została wybrana jako optymalny warunek do dalszych eksperymentów.

Przy zoptymalizowanym MOI fibroblasty NIH/3T3 stymulowano zwiększającymi się stężeniami TGF-β. Fluorescencję reporterową mierzono po 24, 48 i 72 h od stymulacji. Jak pokazano na rycinie 2A–C, intensywność fluorescencji mCherry wzrastała w sposób zależny od stężenia we wszystkich punktach czasowych. Intensywność sygnału stopniowo zwiększała się w czasie od 24 do 72 h, co wykazało odpowiedź zależną od czasu. Wyniki te stanowią pozytywny rezultat, wskazując, że system reporterowy reaguje w sposób podłużny i powtarzalny na stymulację włóknistą.

Rycina 2. Aktywacja reportera mCol1a1p-mCherry zależna od czasu i dawki po stymulacji czynnikiem wzrostu transformującego beta (TGF-β). Fibroblasty NIH/3T3 zainfekowane adenowirusem Ad-mCol1a1p-mCherry przy optymalnym MOI stymulowano rosnącymi stężeniami TGF-β. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne oraz odpowiadające im analizy ilościowe aktywności reportera mCherry przedstawiono po 24 h (A), 48 h (B) i 72 h (C) od stymulacji. Fluorescencja mCherry (czerwona) odzwierciedla aktywność promotora Col1a1, a jądra komórkowe wybarwiono Hoechst 33342 (niebieski). Intensywność fluorescencji ilościowo określono za pomocą obrazowania wysokoprzepustowego (high-content imaging) i znormalizowano względem liczby jąder. Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM) z sześciu niezależnych powtórzeń biologicznych dla każdego stanu. Porównania statystyczne wykonano względem nieleczonej grupy kontrolnej przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Parametry obrazowania pozostawały stałe dla wszystkich warunków eksperymentalnych. Paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby ocenić specyficzność szlaku, fibroblasty NIH/3T3 poddano działaniu inhibitora receptora TGF‑β typu I (ALK5) SB431542 w warunkach stymulacji TGF-β. Jak pokazano na Rysunku 3A–C, SB431542 zredukował intensywność fluorescencji mCherry w sposób zależny od dawki. Hamowanie aktywności reportera obserwowano we wszystkich badanych punktach czasowych, przy czym silniejsza supresja wystąpiła przy wyższych stężeniach inhibitora. Wyniki te stanowią pozytywny rezultat, wskazując, że aktywacja reportera jest zależna od sygnalizacji TGF-β i może być modulowana farmakologicznie.

Rycina 3. SB431542 hamuje indukowaną przez TGF-β aktywację reportera mCol1a1p-mCherry w sposób zależny od czasu i dawki. Fibroblasty NIH/3T3 zainfekowane adenowirusem Ad-mCol1a1p-mCherry stymulowano TGF-β (10 ng/mL) w obecności zwiększających się stężeń inhibitora receptora typu I czynnika wzrostu transformującego beta (ALK5) SB431542 (0, 1, 5, 10 i 15 µM; na panelach ryciny oznaczony skrótem SB43). Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne i odpowiadające im analizy ilościowe przedstawiono dla 24 h (A), 48 h (B) i 72 h (C) po zastosowaniu preparatów. Fluorescencja mCherry (czerwona) odzwierciedla aktywność promotora Col1a1, a jądra komórkowe wybarwiono Hoechst 33342 (niebieski). Intensywność fluorescencji oznaczono za pomocą obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging) i znormalizowano względem liczby jąder. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM z sześciu niezależnych powtórzeń biologicznych dla każdego stanu. Porównania statystyczne przeprowadzono względem grupy traktowanej TGF-β przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Parametry obrazowania pozostawały stałe we wszystkich warunkach eksperymentalnych. Paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby ocenić, czy aktywność reportera odzwierciedla endogenne reakcje włókniste, fibroblasty NIH/3T3 przeanalizowano w zoptymalizowanych warunkach infekcji, stymulacji i inhibicji. Schemat eksperymentalny wykorzystany do walidacji systemu reporterowego przedstawiono na Ryc. 4A. Markery związane z włóknieniem zmierzono na poziomie białek i mRNA. Jak pokazano na Ryc. 4B–C, test ELISA wykazał zwiększone wydzielanie białek związanych z włóknieniem po stymulacji TGF-β, co uległo zmniejszeniu po zastosowaniu SB431542. Spójnie z tym, RT-qPCR wykazał odpowiadające temu zmiany w ekspresji genów związanych z włóknieniem, w tym Col1a1. Zgodność między odczytem fluorescencji, wydzielaniem białek i ekspresją genów stanowi pozytywny wynik walidacji, wskazując, że system reporterowy odzwierciedla aktywację włóknistą w tych warunkach.

Rysunek 4. Walidacja systemu reporterowego mCol1a1p-mCherry za pomocą ilościowej polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) oraz testu immunoenzymatycznego (ELISA). (A) Schematyczny przegląd toku postępowania eksperymentalnego dla walidacji systemu reporterowego. Fibroblasty NIH/3T3 stymulowano TGF-β (10 ng/mL) i traktowano rosnącymi stężeniami inhibitora receptora TGF-β SB431542 (SB43). Lizaty komórkowe i nadsączniki hodowlane zebrano do dalszych analiz. (B) Analiza ilościowa ekspresji matrycowego RNA (mRNA) Col1a1 określona metodą RT-qPCR podczas stymulacji TGF-β w gradiencie stężeń SB431542. Względne poziomy ekspresji mRNA Col1a1 znormalizowano do rybosomalnego RNA 18S (18S rRNA) i przedstawiono jako krotność zmiany względem nieleczonej grupy kontrolnej. (C) Ilościowe oznaczenie poziomu wydzielanego kolagenu typu I w nadsącznikach hodowli komórkowych za pomocą testu ELISA w tych samych warunkach eksperymentalnych co na panelu B. Stężenia kolagenu typu I wyrażono w ng/mL. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM z sześciu niezależnych powtórzeń biologicznych dla każdego warunku. Porównania statystyczne przeprowadzono względem grupy traktowanej TGF-β przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Pełna sekwencja nukleotydowa fragmentu promotora genu Col1a1 myszy użytego do konstrukcji adenowirusowego wektora reporterowego. Region promotorowy o długości 2354 bp odpowiada współrzędnym genomicznym chr11:94824779–94827132 (NC_000077.7) i obejmuje zakres od −2271 do +83 bp względem TSS. Fragment promotora został sklonowany powyżej genu reporterowego mCherry w wektorze wahadłowym pDC315 w celu stworzenia rekombinantowego adenowirusowego systemu reporterowego.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1. Sekwencje starterów użytych do analizy RT-qPCR. Sekwencje starterów bezpośrednich i odwrotnych dla Col1a1 oraz wewnętrznego genu referencyjnego 18S rRNA są podane w orientacji 5′–3′.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S1. Mapa plazmidu adenowirusowego wektora transportowego pDC315-mCol1a1p-mCherry. Fragment promotora mysiego genu Col1a1 o długości 2354 bp został wstawiony powyżej genu reporterowego mCherry z wykorzystaniem strategii bezszwowego klonowania opartego na rekombinacji homologicznej w celu wytworzenia rekombinowanej adenowirusowej konstrukcji reporterowej.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Włóknienie mięśnia sercowego przyczynia się do progresji niewydolności serca, a rozwój skutecznych terapii antyfibrotycznych jest ograniczony brakiem platform do badań przesiewowych w ujęciu podłużnym^2,13. Konwencjonalne metody oceny skuteczności leków przeciw włóknieniu, w tym Western blotting, RT-qPCR oraz barwienie immunofluorescencyjne, opierają się na pomiarach punktowych, które wymagają lizy lub utrwalenia komórek. Podejścia te uniemożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym postępu włóknienia w żywych komórkach i ograniczają ich przydatność w analizach podłużnych oraz wysokoprzepustowych. Ponadto generowanie stabilnych linii komórkowych z reporterem poprzez transfekcję plazmidową lub integrację lentywirusową jest często utrudnione przez niską wydajność transfekcji w fibroblastach, zmienność związaną z losową integracją genomiczną oraz postępujące wyciszanie ekspresji reportera w kolejnych pasażach¹⁵.

Choć wektory lentiwirusowe są często stosowane do dostarczania genów do fibroblastów NIH/3T3, w naszym badaniu wykorzystano specjalnie adenowirusowy system reporterowy, aby zachować wierność fizjologiczną fibroblastów. Lentiwirusy trwale integrują się z genomem gospodarza, niosąc ze sobą immanentne ryzyko mutagenezy insercyjnej, która może nieumyślnie zakłócić endogenne sieci sygnalizacyjne — co stanowi krytyczny problem przy ocenie złożonych kaskad, takich jak fibrogeneza indukowana przez TGF-β. W przeciwieństwie do nich, wektory adenowirusowe pozostają episomalne, co zapewnia integralność genomową. Ponadto pominięcie długotrwałej selekcji antybiotykowej wymaganej dla stabilnych linii komórkowych lentiwirusowych zapobiega zmianom fenotypowym indukowanym terapią, umożliwiając szybką, silną i wysoce wydajną ekspresję przejściową, odpowiednią do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Aby rozwiązać te ograniczenia techniczne, adenowirusowy system reporterowy mCherry sterowany promotorem mCol1a1 umożliwia monitorowanie aktywacji fibroblastów in vitro. System ten łączy dostarczenie adenowirusowe z mysim promotorem Col1a1, który jest markerem transkrypcyjnym związanym z aktywacją fibroblastów i odkładaniem ECM¹⁶. Powiązanie aktywności promotora Col1a1 z fluorescencyjnym reporterem pozwala na wizualizację i kwantyfikację zwrotnych odpowiedzi transkrypcyjnych włóknienia w żywych komórkach. Fluorescencja reportera wzrasta po stymulacji TGF-β w wielu punktach czasowych, odzwierciedlając podłużny postęp aktywacji fibroblastów. Hamowanie aktywności reportera przez inhibitor ALK5 SB431542 wskazuje na regulację zależną od szlaku sygnałowego. Zgodność między fluorescencją reportera a endogenną ekspresją genów i białek związanych z włóknieniem, zmierzoną za pomocą RT-qPCR i ELISA, potwierdza użyteczność tej metody do monitorowania odpowiedzi włóknistych w tych warunkach.

Niedawne badania wykorzystały komórki serca pochodzące z iPSC w połączeniu z perturbacją genetyczną opartą na systemie CRISPR-Cas9 do przesiewania leków i poszukiwania celów terapeutycznych^11,13. Na przykład zmodyfikowane za pomocą CRISPR fluorescencyjne reporterowe fibroblasty serca pochodzące z iPSC zostały zastosowane w szeroko zakrojonych podejściach do przesiewania związków^11,17. Choć metody te zapewniają wysoką precyzję genetyczną, wiążą się z długim czasem różnicowania, złożonością techniczną, zmiennością między partiami oraz zwiększonymi kosztami eksperymentalnymi^13,18. W porównaniu z nimi, opisana tutaj adenowiralna platforma reporterowa umożliwia szybsze wdrożenie bez konieczności edycji genomu czy przedłużonego różnicowania komórek. Podejścia te mogą być stosowane w sposób komplementarny, gdzie system reporterowy mCol1a1p-mCherry służy jako wstępne narzędzie przesiewowe, a modele oparte na iPSC są wykorzystywane do późniejszej walidacji¹¹.

Opisany tutaj system reporterowy mCol1a1p-mCherry zapewnia metodę przesiewania związków kandydackich, w tym modulatorów metabolicznych i produktów naturalnych, w modelu opartym na fibroblastach. Aby zapewnić powtarzalność niniejszego protokołu, należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych etapów oraz kwestie rozwiązywania problemów. Po pierwsze, kluczowa jest czystość preparatu adenowirusowego. Zastosowanie nieoczyszczonych lizatów wirusowych może wprowadzić szczątki komórek gospodarza oraz komponenty cytotoksyczne, co prowadzi do niespecyficznych efektów w fibroblastach NIH/3T3 i zafałszowuje odczyt reportera. Ponadto, aby zapewnić rygorystyczną powtarzalność i spójność między partiami w późniejszych zastosowaniach przesiewowych, każdy preparat wirusowy został poddany ustandaryzowanemu oczyszczaniu i ściśle ilościowo określony za pomocą testu rozcieńczeń końcowych. Poprzez zastosowanie precyzyjnie określonej krotności infekcji (MOI) w oparciu o funkcjonalne miana wirusa (PFU/mL), a nie o ilości objętościowe, skutecznie zniwelowano różnice między partiami, standaryzując odpowiedź reportera we wszystkich niezależnych seriach eksperymentalnych. Po drugie, podczas optymalizacji MOI należy upewnić się, że objętość inokulum wirusowego nie przekracza 10% całkowitej objętości hodowli. Nadmiar buforu wirusowego może zmienić pH i osmolarność pożywki hodowlanej, potencjalnie indukując komórkowe reakcje stresowe niezależnie od stymulacji TGF-β.

Ponadto obsługa płytek 384-dołkowych w obrazowaniu wysokotreściowym (high-content imaging) wiąże się z wyzwaniami technicznymi. Fibroblasty NIH/3T3 są podatne na odrywanie się podczas wymiany medium i etapów płukania. Delikatne dozowanie cieczy, np. poprzez zastosowanie zautomatyzowanych systemów do obsługi cieczy z niską prędkością dozowania lub kierowanie końcówek pipet pod kątem w stronę ścianek bocznych dołków, może ograniczyć utratę komórek. Aby zminimalizować podstawową aktywację promotora Col1a1 i poprawić stosunek sygnału do szumu, przed stymulacją TGF-β można zastosować głodzenie surowicze przez 12–24 h. Podczas sekwencyjnego obrazowania żywych komórek w wielu punktach czasowych (np. 24, 48 i 72 h), skumulowaną fototoksyczność oraz efekty wiązania DNA wynikające z powtarzalnego barwienia Hoechstem należy zminimalizować poprzez optymalizację warunków ekspozycji lub zastosowanie równoległych płytek eksperymentalnych dla każdego punktu czasowego¹⁹.

Należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń tej metody. Po pierwsze, system opiera się na unieśmiertelnionej linii komórkowej fibroblastów i nie w pełni odzwierciedla heterogeniczności komórkowej fibroblastów serca in vivo. Po drugie, reporter odzwierciedla aktywację transkrypcyjną Col1a1 i nie obejmuje regulacji potranskrypcyjnej ani dojrzewania macierzy zewnątrzkomórkowej. Przyszłe modyfikacje mogą obejmować zastosowanie pierwotnych fibroblastów serca, systemów kokultury lub modeli trójwymiarowych w celu zwiększenia istotności fizjologicznej. Podsumowując, niniejszy protokół opisuje adenowiralny system reporterowy sterowany promotorem Col1a1 do monitorowania aktywacji fibroblastów. Metoda integruje dostarczanie wirusowe, modulację farmakologiczną oraz komplementarne testy molekularne, co umożliwia podłużną i nieniszczącą analizę w żywych komórkach. Podejście to może być zastosowane w przesiewaniu związków oraz w badaniu procesów sygnalizacji włóknistej w kontrolowanych warunkach in vitro.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szklano-denna mikropłytka 384-dołkowa	Cellvis, USA	P384-1.5H-N	szklana płytka 384-dołkowa z dnem szklanym, stosowana do wysiewu komórek, infekcji wirusowej, barwienia i obrazowania fluorescencyjnego.
Plazmid szkieletowy adenowirusa	Microbix, Kanada	pBHGloxΔE1,3Cre	Plazmid użyty do generowania pełnowymiarowego rekombinowanego genomu adenowirusa.
Adenowirusowy wektor wahadłowy: pDC315-mCol1a1p-mCherry	GeneChem, Chiny	Usługi niestandardowe	Rekombinowany adenowirusowy wektor transmisyjny zawierający 2354 bp promotora genu Col1a1 myszy sterującego ekspresją mCherry.
Nukleaza Benzonase	Merck Millipore, USA	70664-3	Endonukleaza stosowana podczas oczyszczania adenowirusów w celu usunięcia zanieczyszczających kwasów nukleinowych.
Dygestorium biologiczne (klasa II)	Esco Lifesciences Group, Singapur	AC2-4S1	Certyfikowana komora z laminarnym przepływem powietrza stosowana do pracy z rekombinowanymi adenowirusami oraz do sterylnych procedur hodowli komórkowych.
Pożywka do hodowli komórkowych (kompletne DMEM/F12)	HyClone, USA	12800-017	Pełna pożywka hodowlana stosowana do utrzymywania linii komórkowych NIH/3T3 i HEK293.
Oprogramowanie do analizy obrazów CellPathfinder	Yokogawa Electric Corporation, Japonia	Wersja 3.08.01	Oprogramowanie do analizy obrazu wykorzystywane do zautomatyzowanej kwantyfikacji fluorescencji i segmentacji komórek.
System wysokoprzepustowego obrazowania komórkowego CellVoyager CV8000	Yokogawa Electric Corporation, Japonia	CV8000	System obrazowania wysokotreściowego wykorzystywany do akwizycji fluorescencji mCherry i Hoechst.
Tlenek węgla2 Inkubator do hodowli komórkowych	Thermo Fisher Scientific, USA	3111	Inkubator z nawilżaniem utrzymywany w temperaturze 37°C °C z 5% CO2 do hodowli komórek ssaków.
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich, USA	D2650	Rozpuszczalnik użyty do przygotowania SB431542.
Dulbecco’modyfikowane pożywka Eagle'a/mieszanina odżywcza F-12 (DMEM/F-12)	Servicebio, Chiny	G4610	Podstawowa pożywka hodowlana stosowana dla fibroblastów NIH/3T3.
płodowa surowica bydlęca (FBS)	Ausbian, Australia	VS500T	Suplementy surowicze stosowane w stężeniu 10% (v/v) do przygotowania pełnej pożywki hodowlanej.
Barwnik fluorescencyjny Hoechst 33342	Invitrogen, USA	H3570	Barwnik jądrowy stosowany do obrazowania fluorescencyjnego i normalizacji liczby jąder.
Komórki HEK293	ATCC, USA	CRL-1573	Linia komórkowa pakująca wykorzystywana do produkcji i amplifikacji adenowirusów.
Ludzki rekombinowany TGF-β1	MedChemExpress, Chiny	HY-P78214	Cytokina stosowana do indukowania aktywacji włóknistej w fibroblastach NIH/3T3.
Oprogramowanie do akwizycji obrazu	Yokogawa Electric Corporation, Japonia	Wersja 3.08.01.03	Oprogramowanie wykorzystywane do zautomatyzowanej akwizycji obrazów fluorescencyjnych i sterowania mikroskopem.
Odczynnik do transfekcji oparty na lipidach	Invitrogen, USA	11668-019	Odczyn do transfekcji użyty do wprowadzania plazmidów adenowirusowych do komórek HEK293.
Probówki do mikrocentryfugi	Axygen, USA	MCT-150-C	Probówki wykorzystywane do przechowywania lizatów RNA i przetwarzania próbek.
Czytnik mikropłytek	Tecan, Szwajcaria	Iskra	Wielomodułowy czytnik płytek mikrodołkowych wykorzystywany do pomiarów absorbancji w teście ELISA.
Zestaw ELISA do oznaczania kolagenu typu I u myszy	Meike Biotechnology, Chiny	MK6778A	Zestaw ELISA użyty do oznaczania ilości wydzielonego kolagenu typu I w nadsączach hodowlanych.
Fibroblasty mysie NIH/3T3	Procell Life Science, Chiny	CL-0171	Linia komórkowa fibroblastów mysich wykorzystana do opracowania i walidacji modelu reporterowego.
enzym restrykcyjny PacI	New England Biolabs, USA	R0547S	Enzym restrykcyjny stosowany do linearyzacji plazmidu adenowirusowego.
Penicylina–Roztwór streptomycyny	Gibco, USA	15140-122	Roztwór antybiotyku dodany w stężeniu 1% (v/v) w celu zapobiegania kontaminacji bakteryjnej.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen Biotech, Chiny	AQ602	Gotowa mieszanina (master mix) do qPCR oparta na SYBR Green, stosowana do ilościowej analizy PCR.
bufor fosforanowo-solny (PBS)	Servicebio, Chiny	G4202	Bufor stosowany do przemywania komórek i przygotowania odczynników.
Wektor wahadłowy pDC315-EGFP	GeneChem, Chiny	Brak danych	Rodzicielski adenowiralny wektor wahadłowy użyty do konstrukcji plazmidu reporterowego.
System qPCR	Applied Biosystems, USA	QuantStudio 5	System Real-time PCR wykorzystywany do ilościowej analizy ekspresji genów.
Enzymy restrykcyjne (BamHI i KpnI)	Abclonal, Chiny	RK21101, RK21104	Enzymy restrykcyjne użyte do linearyzacji wektora transmisyjnego.
Zestaw do odwrotnej transkrypcji	TransGen Biotech, Chiny	AT311	Zestaw do odwrotnej transkrypcji stosowany do syntezy cDNA przed analizą RT-qPCR.
Odczynnik do lizy RNA	Invitrogen, USA	15596026	Odczynnik stosowany do ekstrakcji całkowitego RNA z hodowli komórkowych.
SB431542	MedChemExpress, Chiny	301836-41-9	TGF-β inhibitor receptora typu I stosowany w eksperymentach z inhibicją farmakologiczną.
Usługa sekwencjonowania metodą Sangera/Odczynniki	Shanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., Chiny	Obsługa klienta	Usługa sekwencjonowania/odczynniki użyte do weryfikacji sekwencji plazmidu.
Pipety serologiczne	Corning, USA	4488	Sterylne pipety stosowane do przenoszenia cieczy podczas procedur hodowli komórkowej.
Termocykler T30	LongGene Scientific Instruments, Chiny	T30	Termocykler stosowany do odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR.
Roztwór trypsyny z EDTA	Gibco, USA	25200-056	Odczyn do dysocjacji komórek stosowany podczas rutynowego pasażowania komórek.
Zestaw do oczyszczania wirusów	Takara Bio USA	631533	Zestaw stosowany do oczyszczania rekombinowanych adenowirusów.
Kąpiel wodna	Shanghai Yiheng Scientific Instruments, Chiny	HWS-12	Kąpiel wodna z kontrolą temperatury stosowana podczas zamrażania adenowirusów–cykle rozmrażania.