Reakcja łańcuchowa hybrydyzacji FISH w rozwijającym się Drosophila płacie wzrokowym

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kroki wymagane do przeprowadzenia hybrydyzacji łańcucha reakcji fluorescencyjnej in situ (HCR-FISH) w narządach wzrokowych larw Drosophila melanogaster. Szczegółowo opisano procedury projektowania sond, hybrydyzacji, amplifikacji oraz montażu tkanki, aby ułatwić wizualizację rozwijającego się narządu wzrokowego.

Streszczenie

Rozumienie rozwoju układu nerwowego wymaga precyzyjnej charakterystyki kiedy i gdzie geny są eksponowane. Techniki takie jak in situ hybrydyzacja od dawna umożliwiają wizualizację ekspresji genów w rozwijających się tkankach. Chociaż in situ hybrydyzacja jest szeroko stosowana w embrionach Drosophila melanogaster, jej zastosowanie do rozwoju układu wzrokowego było ograniczone przez kilka wyzwań technicznych. Na przykład długie sondy często słabo penetrują płat wzrokowy, a protokoły, które polegają na dyfuzyjnych reporterach katalitycznych, takich jak peroksydaza chrzanu, często dają niskie współczynniki sygnału do szumu w preparatach całokomórkowych. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z reakcji łańcuchową (HCR-FISH) przezwycięża wiele z tych ograniczeń i umożliwia bardziej niezawodne wykrywanie sygnału. Podobnie jak w konwencjonalnej FISH, monomery sond DNA hybrydyzują z sekwencji RNA w obrębie tkanek. W HCR-FISH jednakże sondy amplifikacyjne sprzężone fluorescencyjnie tworzą stabilne struktury złożone, które wywołują polimeryzację dodatkowych monomerów, wzmacniając intensywność sygnału. Zastosowanie zestawów sond wielokanałowych pozwala również na użycie krótszych oligonukleotydów (~45 nt, w porównaniu z do 1000 nt w konwencjonalnej FISH), poprawiając penetrację sond i uzyskując bardziej jednolite barwienie w próbkach całokomórkowych. W artykule opisano protokół HCR-FISH zoptymalizowany dla płata wzrokowego larw Drosophila. Protokół dostosowuje istniejące podejścia HCR-FISH poprzez optymalizację warunków fiksacji i zwiększenie stężeń sond i złożeń, aby poprawić intensywność sygnału i penetrację tkanek. Podano listy reagentów i szczegółowe procedury. Przedstawiono również potencjalne zastosowania w neurobiologii rozwojowej, w tym wizualizację nowo narodzonych neuronów oraz charakteryzację wzorców ekspresji genów w przypadkach, gdy konwencjonalne metody, takie jak białka endogenownie oznakowane lub barwienie przeciwciałami, nie zapewniają wystarczających informacji.

Wprowadzenie

Rozumienie, jak złożony jest mózg, wymaga zidentyfikowania zarówno różnorodności obecnych typów komórek, jak i repertuaru genów wyrażanych w każdym z tych typów¹. Ostatnie osiągnięcia w sekwencjonowaniu RNA z pojedynczych komórek pozwoliły badaczom na zadawanie tych pytań z dużą rozdzielczością². Jednak wiele podejść do pojedynczych komórek nie zachowuje informacji przestrzennych, wymagając dodatkowych eksperymentów w celu przypisania klastrów transkrypcyjnych typów komórek do ich lokalizacji w rozwijającym się mózgu.

Dwóchskładnikowe systemy ekspresji genów, takie jak GAL4-UAS, mogą dostarczać informacji o pozycji, ale nie są ilościowe³. Ponadto opóźnienia między ekspresją genu a wykryciem reportera mogą zacierać fizjologicznie istotne wzorce ekspresji w wczesnych etapach rozwoju. Immunobarwienie jest kolejnym powszechnie stosowanym podejściem do określania tkankowych wzorców ekspresji⁴. Jednak wydzielane białka często są rozproszone i trudne do dokładnego zlokalizowania.

Podejścia z oznaczaniem nukleotydów, takie jak hybrydyzacja in situ (ISH), były również szeroko stosowane w celu uzyskania informacji przestrzennych na temat ekspresji genów⁵. W ISH oznakowane oligonukleotydy DNA wiążą się z odwrotnie komplementarnymi sekwencjami RNA, które nas interesują. Wczesne metody ISH wykorzystywały radioaktywnie oznaczone sondy DNA⁶, podczas gdy późniejsze protokoły wprowadzały bezpieczniejsze znaczniki takie jak digoksygenina, fluoresceina i rodamina^7,8,9. Naukowcy szybko przystosowali ISH do zastosowania w Drosophila melanogaster, gdzie została zastosowana do charakteryzacji organizacji chromosomów politenowych i mapowania wzorców ekspresji genów takich jak hunchback w całych zarodkach^10,11.

Mimo że jest szeroko stosowane, kilka ograniczeń technicznych hamowało stosowanie ISH w grubszych preparatach całych zarodków, takich jak larwalny płat wzrokowy. Wiele protokołów in situ opierało się na dyfuzyjnych reporterach katalitycznych, takich jak peroksydaza rzodkiewkowa, co często prowadziło do niskich stosunków sygnału do szumu¹². Ponadto wiele podejść korzystało z długich sond docelowych do pojedynczych sekwencji w celu poprawy swoistości. Chociaż skuteczne w zarodkach Drosophila i chromosomach politenowych, długie sondy słabo penetrują mózg larw i często wytwarzają nierównomierne oznakowane^10,11,13.

Rozwój jednomolekularnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (smFISH) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z reakcji łańcuchową (HCR-FISH) pozbył się wielu z tych ograniczeń^14,15. Używając zestawów krótkich sond rozmieszczonych na pojedynczej regionie genu, smFISH zmniejsza średnią długość sond z około 1 000 nt do około 40 nt¹⁶. To znacznie poprawia penetrację sond, zachowując jednocześnie silną intensywność sygnału. HCR-FISH dalej poprawia stosunek sygnału do szumu poprzez zastosowanie amplifikacyjnych sond sprzężonych z fluorescenem, które zwiększają dokładność pozycyjną i amplifikują wyjście sygnału. Co ważne, ten krok amplifikacyjny wydaje się skalować liniowo z stężeniem transkryptu, umożliwiając ilościowe pomiaru poziomów ekspresji genów¹⁷.

HCR-FISH zaczyna się od sond inicjacyjnych uzupełniających docelową sekwencję. Te niedookreślone oligonukleotydy DNA zawierają pojedynczą inicjacyjną sekwencję, która wiąże się z domeną wejściową fluorescencyjnie oznakowanej sondy amplifikacyjnej H1. Amplifikatory H1 przyjmują strukturę włoskową, która utrzymuje nieaktywność katalizującą aż do powiązania z sekwencją inicjacyjną. Po powiązaniu, amplifikatora H1 otwiera się i eksponuje sekwencję, która wiąże się z partnerową sondą H2. Ta interakcja otwiera włoskową sondę H2, pozwalając jej nawiązać wiązanie z inną sondą H1 (Rysunek 1)¹⁵. Powtarzane cykle powiązania H1/H2 generują stabilny polimer, który amplifikują sygnał fluorescencyjny, zmniejszając jednocześnie poziom szumu. Ponieważ każda inicjacyjna sekwencja jest specyficzna dla odpowiedniej pary H1/H2, wiele sond o różnych sekwencjach inicjacyjnych i fluoroforach może być jednocześnie użyte do oznakowaniu kilku genów w tym samym próbce.

Rysunek 1: Graficzne przedstawienie przepływu pracy HCR-FISH. Sondy DNA zawierające sekwencję inicjacyjną hybrydyzują z docelową transkrypcją RNA. Fluorescencyjnie oznako

Protokół

Wszystkie eksperymenty z Drosophila melanogaster przeprowadzano zgodnie z wytycznymi City College of New York, Columbia University i New York University dotyczącymi opieki nad organizmami badawczymi i ich wykorzystywania. Narzędzia badawcze wykorzystane w tym protokole są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie buforów

UWAGA: Przygotuj wszystkie odczynniki w wolnych od nukleaz probówkach z wykorzystaniem końcówek filtracyjnych.
UWAGA: Na całym czasie trwania procedury należy nosić rękawiczki. Przed rozpoczęciem czynności wyczyść powierzchnie robocze roztworem do dekontaminacji RNase.

1. Przygotuj roztwory wolne od nukleaz
   1. Przygotuj 1x PBS-T poprzez rozcieńczenie 20x PBS, Triton X-100 i glicyny w wodzie wolnej od nukleaz do ostatecznych stężeń 1x PBS, 1% (v/v) Triton X-100 i 1 mM glicyny.
   2. Przygotuj 5x SSCT poprzez rozcieńczenie 20x SSC i Tween-20 w wodzie wolnej od nukleaz do ostatecznego uzyskania 5x SSC zawierającego 0,1% (v/v) Tween-20.
   3. Roztwórz 20x PBS w wodzie wolnej od nukleaz do uzyskania 1x PBS.

2. Zaprojektuj sondy

1. Aby zaprojektować sondy komercyjnie, wybierz izoformę interesującego gatunku i zamów sondy dopasowane do pożądanego amplifikatora za pomocą interfejsu internetowego dostawcy.
   UWAGA: Komercyjne chemizmy sond HCR i sekwencje inicjatorów są własnością firmy Molecular Instruments i objęte są patentami.
   1. Zmodyfikuj region docelowy w interfejsie internetowym, jeśli wykrywanie transkryptów specyficznych dla gatunku lub pre-mRNA jest pożądane.
   2. Zamów około 20 sond na wysoce eksponowane transkrypty. Użyj do 40 sond na transkrypty o niskiej obfitości w preparatach całkowitych Drosophila.
      UWAGA: Zamów specjalistyczne oligonukleotydy na krótsze transkrypty, które mieszczą mniej miejsc wiązania sond.
2. Aby zaprojektować sondy ręcznie, pobierz sekwencję FASTA dla docelowego transkryptu. Określ, czy ma to być jedna izoforma czy wszystkie izoformy genu.
   UWAGA: Uprzywilejowuj ekzony konstytutywne lub wysoko eksponowane izoformy zidentyfikowane na podstawie danych sekwencjonowania RNA, aby poprawić sygnał.
   1. Jeśli zaprojektujesz sondy do wykrywania pre-mRNA, zaprojektuj sondy obejmujące złącza introny-ekzony. Zaprojektuj sondy obejmujące złącza splajsowe, aby wykryć dojrzałe transkrypty. Użyj sond intronikowych do wykrywania nowo powstałych transkryptów w jądrach.
      UWAGA: Sondy intronikowe mogą nie kolocalizować się z dojrzałymi transkryptami cytoplazmatycznymi i mogą wymagać dodatkowych markerów do identyfikacji komórek.
   2. Określ rozmiar zestawu sond. Użyj co najmniej około 5 sond na krótkie transkrypty, gdy nie można zaprojektować większych zestawów sond. Użyj 20 sond do zastosowań standardowych i około 40 sond dla optymalnej wrażliwości w próbkach całkowitych^18,23.
   3. Jeśli zaprojektujesz własne sondy, użyj sekwencji 25nt oddzielonych odstępem 2bp i dodaj podzielone sekwencje inicjatorów na 5’ koniec każdego oligonukleotydu.
      UWAGA: Chociaż pierwszej generacji podzielone sekwencje inicjatorów są dostępne publicznie, komercyjne sekwencje inicjatorów drugiej generacji są własnością prywatną¹⁸.
   4. Jeśli zaprojektujesz własne sondy, zweryfikuj sekwencje sond. Upewnij się, że sondy w każdym zestawie mają podobne temperatury topienia. Potwierdź 100% identyczność pomiędzy sondami.
      UWAGA: Unikaj silnych regionów bogatych w G i utrzymuj podobną zawartość GC wśród sond²⁴. Zminimalizuj sekwencje powtarzające się i oceń wiążące poza docelowo używając BLAST²⁵.
   5. Użyj publicznie dostępnego oprogramowania do projektowania sond, gdy to odpowiednie^26,27.
      UWAGA: Narzędzia open-source mogą nie odtworzyć zoptymalizowanej wydajności komercyjnych pipeline'ów do projektowania sond.

3. Dysekcja, utrwalacz i prehybrydyzacja mózgu

1. Podgrzej bufor hybrydyzacji sond do 37 °C.
   OSTROŻNIE: Bufor hybrydyzacji sond zawiera formiamid. Obsługuj w wyciągu chemicznym używając odpowiednich środków ochrony osobistej.
2. Roztwórz każdy zestaw sond do ostatecznego stężenia 1 µM używając wolnej od nukleaz wody destylowanej.
3. Rozmieść około 250 µL wolnego od nukleaz PBS na talerzu do dysekcji.
4. Przenieś wędrowną larwę trzeciego stadium do PBS za pomocą kleszczy. Trzymaj brzuch jedną parą

Wyniki

Dla naukowców badających neurobiologię rozwojową HCR-FISH zapewnia niezawodną metodę wizualizacji wzorców ekspresji genów i określania przestrzennych położeń rozwijających się neuronów w obrębie oczka Drosophila.

W oczu Drosophila (Rysunek 2A), neurony w neuropilu meduły pochodzą od komórek macierzystych nerwowych (neuroblastów) pochodzących z przestrzennie ułożonego neuroepitelium zwanego Zewnętrznym Centrum Proliferacji (OPC) (

Dyskusja

Niniejsze badanie opisuje adaptację HCR-FISH do zastosowania w narządzie wzrokowym larw Drosophila melanogaster. Konwencjonalne podejścia in situ hybrydyzacji często wykonują się słabo na całotności tkanki mózgu larw z powodu ograniczonego przenikania sond i niskiej intensywności sygnału. Prezentowany tutaj protokół optymalizuje kilka kluczowych kroków, aby poprawić jakość barwienia w rozwijającym się narządzie wzrokowym. Warunki fiksacji powszechnie stosowane w immunohistologii Drosophila zost...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% Tween-20	Bio-Rad Laboratories	1662404	NA
20x PBS, pH7.4	Growcells.com	MRGF-6396	2.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4
20x SSC	Quality Biological	351-003-131	3M NaCl, 0.3M Sodium Citrate
37 °C incubator	Fisher Scientific (Isotemp)	15-015-2633	NA
37 °C water bath	Fisher Scientific	FSGPD15D	NA
Aluminum foil	Reynolds Wrap/Fisher Brand	15-078-291	NA
Antibody: Mouse-anti-Abrupt	DSHB	Abrupt; RRID: AB_528344	Rozcieńczenie: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFP	Millipore Sigma	Catalog# 06-896; RRID: AB-619712	Rozcieńczenie: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFP	Life Technologies	#11122; RRID: AB_221569	Rozcieńczenie: 1:500
Antibody: Rabbit anti-Dll	Genscript/Desplan lab	-	Rozcieńczenie: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherin	DSHB	DN-Ex #8, RRID: AB_528121	Rozcieńczenie: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxN	Genscript/Desplan lab	-	Rozcieńczenie: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jam	Gift from D. Godt	-	Rozcieńczenie: 1:2,000
Antibody: Donkey anti-Rat 405	Jackson ImmunoResearch	Code # 712-475-150; RRID: AB_2340680	Rozcieńczenie: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488	Jackson ImmunoResearch	Code #703-545-155; RRID: AB_2340375	Rozcieńczenie: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488	Jackson ImmunoResearch	Code #715-545-151; RRID: AB_2341099	Rozcieńczenie: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488	Jackson ImmunoResearch	Code #711-545-152; RRID: AB_2313584	Rozcieńczenie: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555	Thermo Scientific	Catalog #A-31572; RRID: AB_162543	Rozcieńczenie: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3	Jackson ImmunoResearch	Code #712-165-153; RRID: AB_2340667	Rozcieńczenie: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647	Jackson ImmunoResearch	Code #706-605-148; RRID: AB_2340476	Rozcieńczenie: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647	Jackson ImmunoResearch	Code #712-605-153; RRID: AB_2340694	Rozcieńczenie: 1:200
Antifade mountant	Thermo Fisher Scientific	S36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)	Inne antyfades będą również działać, w tym te z DAPI (S36936)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM-880	NA
Cover slips (22 x 30)	VWR	16004-332	NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAG	BDSC	38626; RRID: BDSC_38626	NA
Fly: D. melanogaster: Canton S	BDSC	64349; RRID: BDSC_64349	NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4	BDSC	1553; RRID: BDSC_1553	NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTB	BDSC	83660; RRID: BDSC_83660	NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;	BDSC	32198; RRID: BDSC_32198	NA
Fly: D. melanogaster: UAS-Stinger	BDSC	84277; RRID: BDSC_84277	NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4	BDSC	600136; RRID: BDSC_600136	NA
Forceps	Dumont	#5 or #55s	NA
Glass slides	VWR	16005-106	NA
Glycine	Millipore Sigma	G7126-10MG	NA
HCR Amplification buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR-Gold Amplifiers	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR HiFi Probes	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR Probe Hybridization Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Contains formamide
HCR Probe Wash Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Contains formamide
Nail polish (clear)	Electron Microscopy Sciences	72180	NA
Nuclease-free water (not DEPC-treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9937	NA
Nutating mixer	Corning/Fisher Scientific	10-320-100	NA
Paraformaldehyde, 16% (w/v)	Electron Microscopy Sciences	15710	Toksyczne
PCR Machine/Thermal Cycler	Bio-Rad	1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)	NA
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL)	USA Scientific	#1402-2400	NA
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)	Fisher Scientific	FB0875714	NA
RNase ZAP	ThermoFisher Scientific	AM9780	NA
Slide spacer stickers	SUNJin	IS016 (iSpacer stickers (0.2 mm deep))	NA