Ten protokół opisuje kroki wymagane do przeprowadzenia hybrydyzacji łańcucha reakcji fluorescencyjnej in situ (HCR-FISH) w narządach wzrokowych larw Drosophila melanogaster. Szczegółowo opisano procedury projektowania sond, hybrydyzacji, amplifikacji oraz montażu tkanki, aby ułatwić wizualizację rozwijającego się narządu wzrokowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Reakcja łańcuchowa hybrydyzacji FISH w rozwijającym się Drosophila płacie wzrokowym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozumienie rozwoju układu nerwowego wymaga precyzyjnej charakterystyki kiedy i gdzie geny są eksponowane. Techniki takie jak in situ hybrydyzacja od dawna umożliwiają wizualizację ekspresji genów w rozwijających się tkankach. Chociaż in situ hybrydyzacja jest szeroko stosowana w embrionach Drosophila melanogaster, jej zastosowanie do rozwoju układu wzrokowego było ograniczone przez kilka wyzwań technicznych. Na przykład długie sondy często słabo penetrują płat wzrokowy, a protokoły, które polegają na dyfuzyjnych reporterach katalitycznych, takich jak peroksydaza chrzanu, często dają niskie współczynniki sygnału do szumu w preparatach całokomórkowych. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z reakcji łańcuchową (HCR-FISH) przezwycięża wiele z tych ograniczeń i umożliwia bardziej niezawodne wykrywanie sygnału. Podobnie jak w konwencjonalnej FISH, monomery sond DNA hybrydyzują z sekwencji RNA w obrębie tkanek. W HCR-FISH jednakże sondy amplifikacyjne sprzężone fluorescencyjnie tworzą stabilne struktury złożone, które wywołują polimeryzację dodatkowych monomerów, wzmacniając intensywność sygnału. Zastosowanie zestawów sond wielokanałowych pozwala również na użycie krótszych oligonukleotydów (~45 nt, w porównaniu z do 1000 nt w konwencjonalnej FISH), poprawiając penetrację sond i uzyskując bardziej jednolite barwienie w próbkach całokomórkowych. W artykule opisano protokół HCR-FISH zoptymalizowany dla płata wzrokowego larw Drosophila. Protokół dostosowuje istniejące podejścia HCR-FISH poprzez optymalizację warunków fiksacji i zwiększenie stężeń sond i złożeń, aby poprawić intensywność sygnału i penetrację tkanek. Podano listy reagentów i szczegółowe procedury. Przedstawiono również potencjalne zastosowania w neurobiologii rozwojowej, w tym wizualizację nowo narodzonych neuronów oraz charakteryzację wzorców ekspresji genów w przypadkach, gdy konwencjonalne metody, takie jak białka endogenownie oznakowane lub barwienie przeciwciałami, nie zapewniają wystarczających informacji.
Wprowadzenie
Zrozumienie sposobu, w jaki budowany jest mózg, wymaga zidentyfikowania zarówno różnorodności występujących typów komórek, jak i repertuarów genów ekspresjonowanych w każdym z tych typów1. Niedawne postępy w sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek umożliwiły badaczom udzielenie odpowiedzi na te pytania z wysoką rozdzielczością2. Jednak wiele podejść opartych na analizie pojedynczych komórek nie zachowuje informacji przestrzennych, co wymaga przeprowadzenia dodatkowych eksperymentów w celu przypisania transkrypcyjnych klastrów typów komórek do ich lokalizacji w rozwijającym się mózgu.
Binarne....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty z Drosophila melanogaster przeprowadzano zgodnie z wytycznymi City College of New York, Columbia University i New York University dotyczącymi opieki nad organizmami badawczymi i ich wykorzystywania. Narzędzia badawcze wykorzystane w tym protokole są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie buforów
UWAGA: Przygotuj wszystkie odczynniki w wolnych od nukleaz probówkach z wykorzystaniem końcówek filtracyjnych.
UWAGA: Na całym czasie trwania procedury należy nosić rękawiczki. Przed rozpoczęciem czynności wyc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dla naukowców zajmujących się neurobiologią rozwojową, metoda HCR-FISH stanowi niezawodne narzędzie do wizualizacji wzorców ekspresji genów oraz określania pozycji przestrzennej rozwijających się neuronów w płacie wzrokowym Drosophila.
W płacie opticznym Drosophila (Rycyna 2A), neurony w neuropilu meduli wywodzą się z komórek macierzystych układu nerwowego (neuroblastów) pochodzących z przestrzennie uporządkowanego neuroepitelium zwanego zewnętrz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsze badanie opisuje adaptację HCR-FISH do zastosowania w narządzie wzrokowym larw Drosophila melanogaster. Konwencjonalne podejścia in situ hybrydyzacji często wykonują się słabo na całotności tkanki mózgu larw z powodu ograniczonego przenikania sond i niskiej intensywności sygnału. Prezentowany tutaj protokół optymalizuje kilka kluczowych kroków, aby poprawić jakość barwienia w rozwijającym się narządzie wzrokowym. Warunki fiksacji powszechnie stosowane w immunohistologii Drosophila zost.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują Claudiowi Desplan za dostęp do sond HCR-FISH firmy Molecular Instruments oraz linii muchówek dpp-GAL4; UAS-Stinger. Autorzy dziękują również Aneesh Acharya i Harry Choi z firmy Molecular Instruments za opinię techniczną oraz dyskusje dotyczące implementacji HCR-FISH. Ten protokół został przystosowany z wcześniej opublikowanych i niepublikowanych metodologii HCR-FISH opracowanych przez Meg Younger22, Hunter Whitbeck, Bogdan Sieriebriennikov, Amanda Araujo Gomes Ferreira, Yen-Chung Chen i Yanqiqi Zeng. Bogdan Sieriebriennikov był wspierany przez Human Frontier Science Program (LT000010/2020-L). Jennifer Malin była wspier....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10% Tween-20 | Bio-Rad Laboratories | 1662404 | NA |
| 20x PBS, pH7.4 | Growcells.com | MRGF-6396 | 2.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4 |
| 20x SSC | Quality Biological | 351-003-131 | 3M NaCl, 0.3M Sodium Citrate |
| 37 °C incubator | Fisher Scientific (Isotemp) | 15-015-2633 | NA |
| 37 °C water bath | Fisher Scientific | FSGPD15D | NA |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap/Fisher Brand | 15-078-291 | NA |
| Antibody: Mouse-anti-Abrupt | DSHB | Abrupt; RRID: AB_528344 | Rozcieńczenie: 1:20 |
| Antibody: Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | Catalog# 06-896; RRID: AB-619712 | Rozcieńczenie: 1:500 |
| Antibody: Rabbit anti-GFP | Life Technologies | #11122; RRID: AB_221569 | Rozcieńczenie: 1:500 |
| Antibody: Rabbit anti-Dll | Genscript/Desplan lab | - | Rozcieńczenie: 1:200 |
| Antibody: Rat anti-NCadherin | DSHB | DN-Ex #8, RRID: AB_528121 | Rozcieńczenie: 1:50 |
| Antibody: Rabbit anti-SoxN | Genscript/Desplan lab | - | Rozcieńczenie: 1:200 |
| Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jam | Gift from D. Godt | - | Rozcieńczenie: 1:2,000 |
| Antibody: Donkey anti-Rat 405 | Jackson ImmunoResearch | Code # 712-475-150; RRID: AB_2340680 | Rozcieńczenie: 1:100 |
| Antibody: Donkey anti-Chicken 488 | Jackson ImmunoResearch | Code #703-545-155; RRID: AB_2340375 | Rozcieńczenie: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | Code #715-545-151; RRID: AB_2341099 | Rozcieńczenie: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Rabbit 488 | Jackson ImmunoResearch | Code #711-545-152; RRID: AB_2313584 | Rozcieńczenie: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Rabbit A555 | Thermo Scientific | Catalog #A-31572; RRID: AB_162543 | Rozcieńczenie: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunoResearch | Code #712-165-153; RRID: AB_2340667 | Rozcieńczenie: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647 | Jackson ImmunoResearch | Code #706-605-148; RRID: AB_2340476 | Rozcieńczenie: 1:200 |
| Antibody: Donkey anti-Rat 647 | Jackson ImmunoResearch | Code #712-605-153; RRID: AB_2340694 | Rozcieńczenie: 1:200 |
| Antifade mountant | Thermo Fisher Scientific | S36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant) | Inne antyfades będą również działać, w tym te z DAPI (S36936) |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM-880 | NA |
| Cover slips (22 x 30) | VWR | 16004-332 | NA |
| Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAG | BDSC | 38626; RRID: BDSC_38626 | NA |
| Fly: D. melanogaster: Canton S | BDSC | 64349; RRID: BDSC_64349 | NA |
| Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4 | BDSC | 1553; RRID: BDSC_1553 | NA |
| Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTB | BDSC | 83660; RRID: BDSC_83660 | NA |
| Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP; | BDSC | 32198; RRID: BDSC_32198 | NA |
| Fly: D. melanogaster: UAS-Stinger | BDSC | 84277; RRID: BDSC_84277 | NA |
| Fly: D. melanogaster: wit-KO-Gal4 | BDSC | 600136; RRID: BDSC_600136 | NA |
| Forceps | Dumont | #5 or #55s | NA |
| Glass slides | VWR | 16005-106 | NA |
| Glycine | Millipore Sigma | G7126-10MG | NA |
| HCR Amplification buffer | Molecular Instruments | HCR Gold RNA-FISH Kit | NA |
| HCR-Gold Amplifiers | Molecular Instruments | HCR Gold RNA-FISH Kit | NA |
| HCR HiFi Probes | Molecular Instruments | HCR Gold RNA-FISH Kit | NA |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments | HCR Gold RNA-FISH Kit | Contains formamide |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments | HCR Gold RNA-FISH Kit | Contains formamide |
| Nail polish (clear) | Electron Microscopy Sciences | 72180 | NA |
| Nuclease-free water (not DEPC-treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | NA |
| Nutating mixer | Corning/Fisher Scientific | 10-320-100 | NA |
| Paraformaldehyde, 16% (w/v) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Toksyczne |
| PCR Machine/Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler) | NA |
| PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL) | USA Scientific | #1402-2400 | NA |
| Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes) | Fisher Scientific | FB0875714 | NA |
| RNase ZAP | ThermoFisher Scientific | AM9780 | NA |
| Slide spacer stickers | SUNJin | IS016 (iSpacer stickers (0.2 mm deep)) | NA |
Bibliografia
- Zeng H, Sanes JR. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nat Rev Neurosci. 2017;18(9):530-46.
- Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 2015;161(5):1202-14.
- Brand AH, Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 1993;118(2):401-15.
- Coons AH, Kaplan MH. Localization of antigen in tissue cells: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 1950;91(1):1-13.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
