Platforma magnetycznej nanoaktuacji do zdalnej i kontrolowanej mechanostymulacji komórek Schwanna z obrazowaniem konfokalnym w czasie rzeczywistym

Yang Wang; Ting Liu; Mingxi Yang; Chong Qi; Bin Liu

doi:10.3791/71685

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Platforma magnetycznej nanoaktuacji do zdalnej i kontrolowanej mechanostymulacji komórek Schwanna z obrazowaniem konfokalnym w czasie rzeczywistym

83 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71685

⸱

8 września 2026

Yang Wang¹^,² , Ting Liu³ , Mingxi Yang¹^,² , Chong Qi⁴ , Bin Liu¹^,²

¹Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, ²Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, ³International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin University, ⁴Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia kompatybilną z mikroskopem platformę magnetycznej nanoaktywacji, która integruje fluorescencyjne superparamagnetyczne nanocząsteczki, skalibrowany elektromagnes oraz obrazowanie konfokalne w czasie rzeczywistym, aby zdalnie i w sposób kontrolowany stymulować komórki Schwanna i dynamicznie monitorować ich odpowiedzi mechanosensoryczne.

Streszczenie

Siły mechaniczne w krytyczny sposób regulują zachowanie komórek, jednak wiele istniejących metod stymulacji mechanicznej opiera się na bezpośrednim kontakcie fizycznym lub sztucznie zaprojektowanych środowiskach zewnątrzkomórkowych, co ogranicza ich elastyczność w dynamicznych badaniach żywych komórek. W niniejszej pracy przedstawiamy platformę magnetycznej nano-aktuacji do zdalnej, bezkontaktowej i kontrolowanej mechanostymulacji komórek Schwanna in vitro. Zintegrowany układ ten umożliwia zdalną stymulację magnetyczną oraz zsynchronizowany obrazowanie żywych komórek w ramach jednej sesji eksperymentalnej. Niniejsza publikacja opisuje przygotowanie fluorescencyjnych superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPIONs), opcjonalnie funkcjonalizowanych SPIONs nakierowanych na aktynę (f-SPIONs), konstrukcję i kalibrację kompatybilnego z mikroskopem urządzenia do stymulacji elektromagnetycznej, szacowanie sił magnetycznych na poziomie pojedynczej cząsteczki i pojedynczej komórki oraz integrację aktuacji magnetycznej z obrazowaniem konfokalnym w czasie rzeczywistym. Komórki Schwanna to wysoce mechanowrażliwe komórki glejowe, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju, utrzymaniu i regeneracji nerwów obwodowych. Monitorowanie w czasie rzeczywistym ich reakcji na stymulację mechaniczną jest niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób siły mechaniczne wpływają na organizację cytoszkieletu i zachowanie komórek. Platforma ta zapewnia powtarzalny schemat postępowania w badaniu mechanobiologii komórek Schwanna i może zostać zaadaptowana do innych mechanowrażliwych typów komórek oraz układów wielokomórkowych.

Wprowadzenie

Sygnały mechaniczne regulują szeroki zakres procesów komórkowych, w tym adhezję, migrację, proliferację, różnicowanie oraz plastyczność fenotypową¹^,²^,³. Badania w dziedzinie mechanobiologii wykazały, że zarówno neurony, jak i komórki glejowe wykazują wyraźną mechanoczułość i responsywność w trakcie rozwoju⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Aby zbadać, w jaki sposób komórki wyczuwają siły i reagują na nie, opracowano wiele podejść eksperymentalnych, w tym mikroskopię sił atomowych (AFM), aspirację mikropipetą, pęsety optyczne, systemy hodowli oparte na rozciąganiu oraz platformy mikrofluidyczne⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Techniki te znacznie posunęły naprzód badania nad mechanotransdukcją. Jednak wiele z nich wymaga bezpośredniego kontaktu fizycznego z komórkami lub opiera się na zdefiniowanych sztucznych środowiskach mechanicznych, co czyni je mniej odpowiednimi do stymulacji zdalnej, dynamicznie kontrolowalnej i kompatybilnej z obrazowaniem.

Dostarczanie siły za pośrednictwem magnetycznych nanocząsteczek stanowi alternatywną strategię zdalnej mechanostymulacji¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Ponieważ większość tkanek biologicznych wykazuje niską podatność magnetyczną, zewnętrznie przyłożone pola magnetyczne mogą przenikać przez próbki biologiczne bez bezpośredniego kontaktu i selektywnie oddziaływać na cząstki reagujące magnetycznie, wprowadzone do komórek lub tkanek. W obecności gradientu pola magnetycznego cząstki te podlegają siłom kierunkowym, które można wykorzystać do wywołania zaburzeń mechanicznych na poziomie subkomórkowym, komórkowym lub tkankowym⁸^,⁹. Podejście to jest atrakcyjne, ponieważ jest bezkontaktowe, regulowane, kompatybilne z obrazowaniem na żywo i potencjalnie możliwe do rozszerzenia na bardziej złożone systemy biologiczne.

Komórki Schwanna są wysoce mechanowrażliwymi komórkami glejowymi¹⁹^,²⁰, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju, utrzymaniu i regeneracji nerwów obwodowych²¹^,²².Dynamiczna obserwacja reakcji komórek Schwanna na stymulację fizyczną jest istotna dla zrozumienia, w jaki sposób siła reguluje organizację cytoszkieletu i zachowanie komórek. Jednak wiele konwencjonalnych systemów przykładania siły nie jest łatwo kompatybilnych z mikroskopią wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy platformę magnetycznej nanoaktywacji, która łączy fluorescencyjne magnetyczne supercząstki (f-SPIONs) nakierowane na cytoszkielet aktynowy, specjalistyczne urządzenie elektromagnetyczne kompatybilne z elementem stołu mikroskopu konfokalnego oraz ilościowe ramy do szacowania siły. Ten zintegrowany układ umożliwia zdalną stymulację magnetyczną i zsynchronizowane obrazowanie żywych komórek w ramach jednej sesji eksperymentalnej.

Opisany tutaj schemat obejmuje przygotowanie fluorescencyjnych magnetycznych supercząsteczek (SPIONs), opcjonalną funkcjonalizację z wykorzystaniem faloidyny w celu ukierunkowania na aktynę dla otrzymania f-SPIONs, charakterystykę nanocząsteczek, konstrukcję urządzenia elektromagnetycznego i kalibrację pola, oszacowanie siły magnetycznej oraz połączoną stymulację magnetyczną z obrazowaniem konfokalnym w czasie rzeczywistym. Chociaż platforma ta została tutaj zoptymalizowana dla komórek Schwanna, może ona stanowić praktyczne ramy dla pokrewnych badań nad innymi żywymi systemami reagującymi mechanicznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty opisane w niniejszym protokole wykorzystywały ugruntowaną linię komórek Schwanna szczura (RSC96) i nie angażowały uczestników będących ludźmi ani żywych zwierząt. Badanie to zostało przeprowadzone w ramach szerszego projektu badawczego obejmującego eksperymenty na zwierzętach, który został zatwierdzony przez Komitet ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Pierwszego Szpitala Uniwersytetu w Jilin (numer zatwierdzenia 2022-0045).

1. Przygotowanie fluorescencyjnych supercząstek magnetycznych

Synteza nanocząstek Fe₃O₄ powlekanych kwasem oleinowym.
UWAGA: Nanocząstki Fe₃O₄ powlekane kwasem oleinowym zsyntezowano metodą rozkładu termicznego, zgodnie z wcześniejszym opisem²⁰^,²³.
1. Do kolby reakcyjnej z 20 mL eteru benzylowego dodać 2 mmol Fe(acac)₃, 6 mmol kwasu oleinowego, 6 mmol oleilaminy oraz 5 mmol 1,2-heksadekanodiolu.
2. Mieszaninę mieszać w atmosferze azotu przez 15 min aż do uzyskania jednorodnego roztworu prekursora.
3. Podgrzać mieszaninę do 200 °C z szybkością 20 °C/min.
4. Utrzymywać temperaturę reakcji 200 °C przez 30 min.
5. Zwiększyć temperaturę do 265 °C i prowadzić reflux mieszaniny przez 30 min.
6. Pozostawić mieszaninę reakcyjną do naturalnego ochłodzenia do temperatury pokojowej.
7. zebrać nanocząstki Fe₃O₄ metodą separacji magnetycznej.
8. Przemyć nanocząstki 3 razy etanolem.
9. Redyspergować oczyszczone nanocząstki w toluenie.
Montaż supercząstek Fe₃O₄·Cy3.5.
UWAGA: Supercząstki Fe₃O₄·Cy3.5 przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem²⁰^,²⁴^,²⁵.
1. Dyspergować 28 mg nanocząstek Fe₃O₄ powlekanych kwasem oleinowym w 4 mL toluenu w 50 mL trójszyjnej kolbie okrągłodnnej.
2. Przygotować fazę wodną zawierającą 12,5 mg dodecylosiarczanu sodu i 3 mg Cyanine 3.5 (Cy 3.5) w 12,5 mL wody.
3. Połączyć zawiesinę nanocząstek Fe₃O₄ w toluenie (28 mg w 4 mL; 7 mg/mL) z wodnym roztworem surfaktantu i barwnika, aby utworzyć mikroemulsję olej w wodzie.
4. Mieszać dokładnie do momentu uzyskania stabilnej emulsji.
5. Podgrzać trójszyjną kolbę okrągłodnną do 60 °C i mieszać w sposób ciągły przy 300 rpm przez 6 h.
  UWAGA: Procedura odparowania w obniżonym ciśnieniu lub za pomocą wirówki nie jest wymagana.
6. Odparować toluen w warunkach opisanych powyżej, aby wywołać agregację nanocząstek Fe₃O₄. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej przenieść niewielką porcję roztworu do probówki i pozostawić go w spoczynku. Brak rozwarstwienia faz wskazuje na całkowite usunięcie toluenu.
7. Przenieść zawiesinę supercząstek Fe₃O₄·Cy3.5 do probówek wirówkowych o pojemności 15 mL. Wirować przy 2 370 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej w celu zebrania supercząstek, a następnie ostrożnie odlać nadsącz, nie naruszając osadu.
8. Redyspergować osad w ultrapurej wodzie dejonizowanej i ponownie wirować przy 2 370 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Odlać nadsącz i powtórzyć procedurę płukania trzy razy, aby usunąć pozostałości wolnego barwnika Cy3.5 i dodecylosiarczanu sodu.
Powlekanie supercząstek polidopaminą (PDA).
UWAGA: Supercząstki powlekane polidopaminą przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem²⁰^,²⁶.
1. Wirować zawiesinę supercząstek Fe₃O₄·Cy3.5 przy 2 370 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej i odlać nadsącz.
2. Redyspergować osad w 10 mM buforze Tris (pH 8,5).
3. Dodać 26 mg monomeru dopaminy do zawiesiny.
4. Mieszać mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 3 h w warunkach zasadowych.
5. Wirować zawiesinę przy 2 370 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
6. Usunąć nadsącz i redyspergować osad w wodzie ultrapurej, aby uzyskać cząstki Fe₃O₄·Cy3.5@PDA (SPIONs).
Opcjonalna funkcjonalizacja cząstek faloidyną-Alexa Fluor 350.
UWAGA: Supercząstki funkcjonalizowano powierzchniowo przy użyciu komercyjnie dostępnej faloidyny-Alexa Fluor 350²⁰.
1. Przygotować 5 mL roztworu wodnego zawierającego 100 jednostek faloidyny-Alexa Fluor 350.
2. Dodać 200 µL zawiesiny Fe₃O₄·Cy3.5@PDA zawierającej 2 mg cząstek do roztworu.
3. Mieszać mieszaninę delikatnie w temperaturze pokojowej przez 24 h.
4. Wirować mieszaninę przy 2 370 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
5. Odlać nadsącz i redyspergować osad w wodzie dejonizowanej.
6. Przechowywać końcową formulację Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@faloidyna (f-SPIONs) w warunkach chronionych przed światłem do czasu użycia.

2. Charakterystyka nanocząsteczek

Określenie morfologii i rozmiaru.
1. Przygotować próbki nanocząsteczek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) lub transmisyjnej mikroskopii elektronowej wysokiej rozdzielczości (HRTEM) zgodnie z wymaganiami urządzenia.
2. Wykonać zdjęcia w celu określenia ogólnej morfologii cząsteczek, struktury rdzeń-otoczka oraz średnicy średniej (Rysunek 1).
3. Przygotować wodne zawiesiny nanocząsteczek do dynamicznego rozpraszania światła (DLS).
4. Zmierzyć średnicę hydrodynamiczną oraz wskaźnik polidyspersyjności (PDI).
5. Porównać wyniki mikroskopii elektronowej i DLS, aby ocenić jednorodność formulacji oraz zachowanie koloidalne.
Określenie właściwości magnetycznych.
1. Przygotować wysuszone lub skoncentrowane próbki nanocząsteczek odpowiednie do analizy za pomocą nadprzewodzącego kwantowego interferometru (SQUID).
2. Zarejestrować krzywe histerezy magnetycznej w temperaturze 300 K.
3. Wyznaczyć namagnesowanie nasycenia, remanencję i koercję.
4. Potwierdzić, że cząsteczki wykazują zachowanie superparamagnetyczne z pomijalną remanencją i koercją.
Określenie właściwości fluorescencyjnych.
1. Przygotować zawiesinę f-SPION w ultraczystej wodzie dejonizowanej i przenieść zawiesinę do kuwety kwarcowej.
2. Zarejestrować widma fotoluminescencji za pomocą spektrofluorometru.
3. Potwierdzić, że sygnał fluorescencyjny pozostaje wykrywalny po przemyciu i ponownym zawieszeniu.
Walidacja lokalizacji związanej z aktyną przy użyciu formulacji celowanej.
1. Pozyskać komórki RSC96.
  UWAGA: Komórki RSC96 użyte w tej badaniu, będące spontanicznie przekształconą linią komórek Schwanna szczura, ustanowioną poprzez długotrwałą hodowlę pierwotnych komórek Schwanna szczura, zostały pozyskane z Banku Komórek Chińskiej Akademii Nauk w Szanghaju, Chiny (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) i przebadały negatywnie pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmami i grzybami. Użyto komórek z pasaży 3–10.
2. Hodować komórki w pożywce DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztworu penicyliny i streptomycyny (100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny).
3. Zasiać komórki RSC96 z gęstością 1 × 10⁵ komórek na 35 mm szalkę mikroskopową do hodowli komórkowych i hodować je przez 24 h w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej zawierającej 5% CO₂, aby umożliwić adhezję komórek.
4. Odssać istniejącą pożywkę hodowlaną, przemyć komórki dwukrotnie solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS) i dodać kompletną pożywkę hodowlaną zawierającą 15 µg/mL f-SPIONs. Inkubować komórki z f-SPIONs przez 12 h.
5. Odssać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki dwukrotnie lodowatym PBS zawierającym 1 mM deferoksaminy, aby dokładnie usunąć cząsteczki niezinternalizowane.
6. Wykonać obrazy konfokalne w celu oceny wewnątrzkomórkowej dystrybucji cząsteczek. Ustawić parametry obrazowania na otwór pinhole o wielkości 1 jednostki Airy'ego (AU) i krok z o wartością 0,43 µm, aby uzyskać wysokorozdzielcze przekroje optyczne struktur wewnątrzkomórkowych.
7. Zbadać, czy cząsteczki wykazują wzbogacenie w obszarach komórkowych związanych z aktyną.

3. Konstrukcja i kalibracja urządzenia do stymulacji elektromagnetycznej (Rycina 2)

Zmontuj urządzenie elektromagnetyczne.
1. Zbuduj kompaktowy system cewek elektromagnetycznych o rozmiarach dopasowanych do stolika mikroskopu konfokalnego i komory do hodowli żywych komórek (Rysunek 2A,B).
2. Podłącz cewkę do sterowalnego zasilacza lub zewnętrznego źródła prądu.
3. Przeprowadź numeryczną symulację środowiska gradientowego pola magnetycznego przy użyciu oprogramowania COMSOL Multiphysics 4.3b (Rysunek 2C,D).
4. Potwierdź, że elektromagnes generuje odpowiadające gradientowe pole magnetyczne (GMF) przy różnych prądach wejściowych (Rysunek 2G).
Zmierz gęstość strumienia magnetycznego i skalibruj gradient pola magnetycznego.
1. Umieść elektromagnes obok naczynia hodowlanego, kierując końcówkę bieguna w stronę centrum naczynia, w odległości 1 mm od jego zewnętrznej ścianki (Rysunek 2E,F).
2. Zachowaj tę względną konfigurację geometryczną między elektromagnesem a naczyniem hodowlanym podczas wszystkich późniejszych eksperymentów obrazowania i stymulacji siłą magnetyczną żywych komórek.
3. Użyj cyfrowego gaussometru do pomiaru gęstości strumienia magnetycznego w predefiniowanych pozycjach w obszarze stymulacji, wykorzystując siatkę pozycjonującą na dnie naczynia hodowlanego jako odniesienie przestrzenne.
4. Oblicz lokalny gradient pola na podstawie przestrzennej zmiany gęstości strumienia magnetycznego.
5. Skalibruj i zwaliduj numerycznie symulowany gradient pola magnetycznego, korzystając z eksperymentalnie zmierzonych i obliczonych wartości gradientu pola magnetycznego.

4. Szacowanie sił magnetycznych generowanych przez platformę.

Zdefiniuj model szacowania siły.
1. Zastosuj równanie siły dla nanocząstek magnetycznych w niejednorodnym polu magnetycznym²⁷^,²⁸:
2. Przy założeniu wyrównania superparamagnetycznego z przyłożonym polem, uprość równanie do postaci
  $Schemat równania siły magnetycznej do obliczania dynamiki SPION, przedstawiający $ F_{f-SPION} = m \frac{dB}{dr} $.$
  gdzie:
  F to siła nanomagnetyczna
  m to magnetyczny moment dipolowy
  to gradient pola magnetycznego
  dB/dr to gradient pola magnetycznego (T/m) generowany przez odpowiednie urządzenie do generowania pola magnetycznego.
3. We wszystkich obliczeniach stosuj zmierzony gradient pola z skalibrowanego urządzenia.
Oszacuj siłę działającą na pojedynczą nanocząstkę.
1. Wyznacz średnie wymiary cząstek na podstawie obrazów HRTEM.
2. Oblicz objętość rdzenia magnetycznego, zakładając geometrię sferyczną.
3. Oszacuj objętość magnetyczną specyficzną dla Fe₃O₄ na podstawie frakcji magnetycznej rdzenia.
4. Oblicz magnetyczny moment dipolowy zgodnie z wzorem
  gdzie:
  M_m oznacza namagnesowanie masowe f-SPIONs (16 A·m²/kg) przy danej intensywności pola;
  ρ to gęstość Fe₃O₄ (5,24 g/cm³).
  V to objętość magnetycznego rdzenia Fe₃O₄ w każdej f-SPION (5,89 × 10⁻¹⁷ cm³).
5. Pomnóż moment dipolowy przez zmierzony gradient pola, aby oszacować siłę działającą na pojedynczą nanocząstkę ( $Tarcie statyczne SPIONs; wzór $F_{f-SPION}$; koncepcja w analizie sił nanocząstek magnetycznych.$ ).
Oszacuj pobranie nanocząstek przez pojedynczą komórkę Schwanna.
1. Wysiej komórki Schwanna RSC96 w zagęszczeniu 5 × 10⁵ komórek na dołek w 35 mm mikroskopowych szalkach do hodowli komórkowej.
2. Inkubuj komórki przez 24 h w standardowych warunkach hodowli.
3. Wymień pożywkę na świeżą pożywkę zawierającą 15 µg/mL f-SPIONs.
4. Inkubuj komórki przez kolejne 12 h.
5. Przemyj komórki dwukrotnie lodowatym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym zawierającym 1 mM deferoksaminy.
6. Zbierz i policz komórki.
7. Zmierz wewnątrzkomórkową zawartość żelaza za pomocą spektroskopii emisyjnej z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-AES).
8. Oblicz liczbę zinternalizowanych cząstek na komórkę, dzieląc średnią masę żelaza na komórkę przez masę żelaza w jednej cząstce .
Oszacuj siłę przekazywaną do pojedynczej komórki Schwanna.
1. Oblicz siłę na poziomie komórki zgodnie z wzorem
  
  gdzie:
  $Tarcie statyczne SPIONs; wzór $F_{f-SPION}$; koncepcja w analizie sił nanocząstek magnetycznych.$ to siła magnetyczna działająca na pojedynczą f-SPION.
  to liczba f-SPIONs zinternalizowanych w jednej komórce.
  F_cell to siła magnetyczna działająca na pojedynczą komórkę.
2. Podaj otrzymaną wartość jako szacunkową siłę magnetyczną przekazywaną do pojedynczej komórki Schwanna (F_cell).
3. Wyraźnie zaznacz, że wartość ta jest szacunkiem opartym na modelu, a nie bezpośrednim pomiarem siły wewnątrzkomórkowej.

5. Połączenie stymulacji magnetycznej z obrazowaniem w czasie rzeczywistym za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM)

Obciążenie komórek Schwanna nanocząsteczkami magnetycznymi.
1. Wysiać komórki Schwanna w kompatybilnych z obrazowaniem szalkach hodowlanych ibidi lub mikrofluidycznych komorach hodowlanych.
2. Pozostawić komórki do czasu ich przytwierdzenia i regeneracji.
3. Wymienić istniejące medium na świeże medium hodowlane zawierające 15 µg/mL f-SPIONs.
4. Inkubować komórki przez 12 h, aby umożliwić obciążenie f-SPIONs.
5. Sprawdzić morfologię komórek przed przejściem do kolejnych etapów.
Usunięcie nanocząsteczek niezinternalizowanych.
1. Usunąć medium zawierające nanocząsteczki.
2. Przemyć komórki dwukrotnie roztworem PBS zawierającym 1 mM deferoksaminy.
3. Wymienić roztwór płuczący na kompatybilne z obrazowaniem medium do żywych komórek.
4. Potwierdzić niskie tło nanocząsteczek pozakomórkowych przed obrazowaniem.
Integracja urządzenia elektromagnetycznego z systemem obrazowania CLSM.
1. Zmontować elektromagnes z komorą do hodowli żywych komórek, pozycjonując elektromagnes w jego skalibrowanym wcześniej miejscu.
2. Umieścić zmontowaną komorę do hodowli żywych komórek na stoliku mikroskopu konfokalnego (Rycina 3). Potwierdzić, że szalka hodowlana znajduje się w efektywnym obszarze stymulacji (Rycina 3A).
3. Włączyć elektromagnes zgodnie z zadanymi parametrami i potwierdzić skuteczną ekspozycję na gradient pola magnetycznego w obszarze szalki hodowlanej (Rycina 3B).
4. Potwierdzić, że obiektyw może osiągnąć płaszczyznę ogniskową bez przeszkód.
5. Potwierdzić, że urządzenie nie utrudnia pozycjonowania obiektywu ani ruchu stolika.
6. Biorąc pod uwagę ciepło generowane podczas pracy elektromagnesu, dostosować ustawienia temperatury komponentów komory do żywych komórek zgodnie z określonymi optymalnymi warunkami hodowli, aby zapewnić wewnętrzne środowisko o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ (Rycina 3C).
7. Potwierdzić, że cały system pracuje normalnie i stabilnie.
Funkcjonalne obrazowanie Ca²⁺ w żywych komórkach.
1. Inkubować komórki z roztworem Krebsa–Ringera (pH 7.4) zawierającym 3 µM Fluo-4 AM i 0.1% Pluronic F-127 w temperaturze 37 °C przez 30 min.
2. Po inkubacji przemyć hodowle dwukrotnie PBS i przenieść je na platformę do obrazowania żywych komórek systemu CLSM w celu wykonania obrazowania (Rycina 4A).
3. Korzystając z siatki pozycjonującej na dnie szalki hodowlanej ibidi, obrazować pięć predefiniowanych lokalizacji.
4. Podzielić każde pole obrazowania w równe części na 25 regionów i wybrać od 0 do 3 komórek z każdego regionu do kwantyfikacji fluorescencji, w zależności od rzeczywistej gęstości komórek w danym regionie.
5. Zdefiniować pełny obrys pojedynczej komórki jako obszar zainteresowania (ROI) i monitorować magnetycznie indukowaną odpowiedź wapniową poprzez analizę zmian natężenia fluorescencji (ΔF) w obrębie ROI.
6. Obliczyć zmianę natężenia fluorescencji jako ΔF = (F_stim- F₀). Przyjąć, że zmiana natężenia fluorescencji przed i po stymulacji (ΔF/F₀) przekraczająca 10% stanowi zdarzenie odpowiedzi wapniowej.
  UWAGA: F_unstim reprezentuje natężenie fluorescencji przed stymulacją siłą magnetyczną, F₀ reprezentuje bazowe natężenie fluorescencji, a F_stim reprezentuje wywołane natężenie fluorescencji po stymulacji siłą magnetyczną.
7. W celu korekcji tła odjąć średnie natężenie fluorescencji tła zmierzone w regionie wolnym od komórek od wartości natężenia fluorescencji każdego ROI.
8. Przeprowadzić trzy niezależne eksperymenty, włączając jedną szalkę hodowlaną do każdego eksperymentu.
Wykonanie obrazowania poklatkowego i zastosowanie stymulacji magnetycznej podczas obrazowania.
1. Ustawić parametry obrazowania poklatkowego w następujący sposób: odstęp między akwizycjami 2.1 s na klatkę, całkowity czas akwizycji 650 s oraz standardowe obrazowanie sekcyjne optyczne o wysokiej rozdzielczości z użyciem 1 AU.
2. Podczas obrazowania komórek pozyskiwać obrazy w sposób ciągły przez 50 s bez dopływu prądu, aby zapisać wewnątrzkomórkowe natężenie fluorescencji wapnia w nieobecności stymulacji siłą magnetyczną (F_unstim) (Rycina 2H oraz Rycina 4B).
3. Znormalizować natężenie fluorescencji zarejestrowane podczas pierwszych 50 s i zdefiniować je jako bazowe natężenie fluorescencji (F₀).
4. Następnie przyłożyć stały prąd o natężeniu 3.0 A do elektromagnesu, poddając komórki Schwanna obciążone nanocząsteczkami magnetycznymi działaniu gradientu pola magnetycznego o wartości 3.25 T/m, a tym samym stymulując je siłą magnetyczną. Kontynuować obrazowanie poklatkowe przez 10 min, aby zapisać wewnątrzkomórkowe natężenie fluorescencji wapnia podczas stymulacji siłą magnetyczną (F_stim) (Rycina 2H oraz Rycina 4C).
5. Obliczyć ilościowo zmianę natężenia fluorescencji jako ΔF/F₀ (Rycina 4D,E).
Przeprowadzenie analizy statystycznej i analiza danych fluorescencji Ca²⁺.
1. Dla każdej komórki obliczyć medianę wartości ΔF/F₀ w analizowanej serii czasowej i użyć tej wartości jako wskaźnika odpowiedzi Ca²⁺ na poziomie komórkowym.
2. Przeprowadzić trzy niezależne eksperymenty dla każdego warunku eksperymentalnego, z jedną szalką hodowlaną na warunek w każdym eksperymencie. Połączyć komórki analizowane w trzech niezależnych eksperymentach do prezentacji opisowej i podać n jako całkowitą liczbę komórek analizowanych w każdej grupie.
3. Ocenić normalność rozkładu danych ΔF/F₀ na poziomie komórkowym za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa.
4. Ponieważ dane odpowiedzi fluorescencyjnej Ca²⁺ nie mają rozkładu normalnego, przedstawić dane jako medianę i rozstęp międzykwartylny (IQR).
5. Analizować różnice między grupami za pomocą nieparametrycznego testu Friedmana, a następnie testów Wilcoxona dla porównań parzystych, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami.
6. Przyjąć, że P < 0.05 wskazuje na istotność statystyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Transmisyjna mikroskopia elektronowa wysokiej rozdzielczości (HRTEM) wykazała, że końcowa formulacja nanocząsteczek posiada zgrupowany rdzeń magnetyczny oraz zewnętrzną otoczkę po modyfikacji powierzchniowej (Rycina 1). Końcowe f-SPIONs miały średnią średnicę całkowitą 63,36 ± 16,65 nm, z rdzeniem magnetycznym bogatym w Fe₃O₄ o średnicy około 56,60 ± 6,19 nm oraz zewnętrzną otoczką złożoną z polidopaminy i faloidyny-Alexa Fluor 350 o średniej grubości około 5,79 ± 1,36 nm. Wyniki te potwierd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nanocząstki tlenku żelaza są powszechnie uznawane za nanomateriały magnetyczne o korzystnej biokompatybilności. Superparamagnetyczne nanocząstki Fe₃O₄, szeroko stosowane jako środki kontrastowe w obrazowaniu rezonansem magnetycznym, znajdują rozległe zastosowanie w klinicznej diagnostyce obrazowej²⁹^,³⁰. W niedawnym badaniu przeprowadzonym przez naszą grupę²⁰ wykazano, że f-SPIONs charakteryzują się niezwykle niską cytotoksycznością i dosko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie istnieją żadne konkurencyjne interesy finansowe.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez National Natural Science Foundation of China (granty nr 82571677 i 82001304 dla Y.W.), Special Program for Medical and Health Care Talents w prowincji Jilin (grant nr JLSRCZX2025-134 dla Y.W.) oraz Bethune Program Project na Uniwersytecie w Jilin (grant nr 2024B19 dla Y.W.). Autorzy dziękują College of Chemistry na Uniwersytecie w Jilin (State Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials) oraz Changchun Institute of Applied Chemistry przy Chińskiej Akademii Nauk za pomoc w projektowaniu, syntezie i charakteryzacji nanomateriałów. Autorzy dziękują również Institute of Translational Medicine w The First Hospital of Jilin University za pomoc w obrazowaniu CLSM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,2-heksadekanodiol	Sigma-Aldrich	213748	Stopień techniczny, 90%; stosowany w syntezie z rozkładem termicznym
ibidi 35 mm µ-szalki	ibidi	80156	Stosowane do hodowli i obrazowania komórek Schwanna
Eter benzylowy	Sigma-Aldrich	108014	98%; rozpuszczalnik dla Fe₃O₄ synteza nanocząstek
Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy	Nikon	AXR (Ti2-E)	Stosowane do obrazowania żywych komórek oraz obrazowania fluorescencyjnego
Niestandardowy elektromagnes	Własnej konstrukcji	Nie dotyczy	Kompaktowy jednobiegunowy elektromagnes do generowania gradientowego pola magnetycznego in vitro
Kwas cyjaniny 3,5-karboksylowy	Duofluor Inc.	D10128	Barwnik fluorescencyjny stosowany do wykrywania Fe₃O₄·montaż supercząsteczek Cy3.5; MW 593,20; przechowywać w temp. -20 °C, chroniąc przed światłem
Solem mezylanu deferoksaminy	Sigma-Aldrich	D9533	Chelator żelaza stosowany do usuwania żelaza niezinternalizowanego i związanego z błoną
Cyfrowy gaussometr	WEITE MAGNETIC	WT103	Służy do pomiaru gęstości strumienia magnetycznego i kalibracji gradientu pola magnetycznego generowanego przez niestandardowy elektromagnes
Chlorowodorek dopaminy	Sigma-Aldrich	H8502	≥98% (TLC); stosowany do powlekania polidopaminą
Urządzenie do dynamicznego rozpraszania światła	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	Stosowane do pomiaru średnicy hydrodynamicznej oraz PDI
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	Wskaźnik wapnia stosowany do pomiarów Ca w żywych komórkach²⁺ obrazowanie
Spektrofluorometr	Shimadzu	RF-6000	Stosowane do charakterystyki fotoluminescencyjnej
transmisyjny mikroskop elektronowy wysokiej rozdzielczości	JEOL	JEM-F200	Stosowane do obrazowania morfologii i rdzenia nanocząstek za pomocą HRTEM–struktura powłokowa
Spektrometr emisyjny z plazmą indukcyjnie sprzężoną	PerkinElmer	Optima 3300 DV	Stosowane do ilościowego oznaczania żelaza wewnątrzkomórkowego
Acetyloacetonian żelaza(III), Fe(acac)₃	Sigma-Aldrich	F300	97%; prekursor dla Fe₃O₄ synteza nanocząstek
Inkubator nadstolikowy do hodowli komórek żywych	TOKAI HIT	TENP&tlenek węgla (II)₂	Stosowane do konfokalnego obrazowania żywych komórek podczas stymulacji magnetycznej
Kwas oleinowy	Sigma-Aldrich	O1008	≥99% (GC); ligand powierzchniowy dla Fe₃O₄ synteza nanocząstek
Oleyloamina	Sigma-Aldrich	O7805	Klasa techniczna, 70%; ligand do syntezy nanocząstek
Faloidyna–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	Opcjonalny odczyn do funkcjonalizacji nakierowanej na aktynę
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Stosowane w celu ułatwienia wprowadzania Fluo-4 AM do żywych komórek w celu pomiaru stężenia Ca2+²⁺ obrazowanie
Programowalny regulowany zasilacz prądu stałego	Tongmen	eTM-L605SPL (60 V, 5 A)	Służy do zasilania niestandardowego elektromagnesu do generowania gradientu pola magnetycznego in vitro
komórki Schwanna RSC96	Bank Komórek Chińskiej Akademii Nauk	Nie dotyczy	Linia komórek Schwanna pochodzenia szczurzego
Dodcylo硫酸 sodu (SDS)	Sigma-Aldrich	436143	odczynnik klasy ACS, ≥99,0%; surfaktant do mikroemulsji typu olej w wodzie
magnetometr SQUID	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	Stosowane do pomiaru histerezy magnetycznej w temperaturze 300 K
Toluen	Sigma-Aldrich	244511	Bezwodny, 99,8%; rozpuszczalnik do montażu supercząstek
Transmisyjny mikroskop elektronowy	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	Stosowane do obserwacji ultrastruktury tkanek komórkowych i nerwowych

Bibliografia

Cheng B, et al. Mechanobiology across timescales. Nat Rev Phys. 2025;7:621-44.
Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
Pillai EK, Franze K. Mechanics in the nervous system: from development to disease. Neuron. 2024;112(3):342-61.
Franze K. The mechanical control of nervous system development. Development. 2013;140(15):3069-77.
Franze K, Guck J. The biophysics of neuronal growth. Rep Prog Phys. 2010;73:094601.
Moore SW, Sheetz MP. Biophysics of substrate interaction: influence on neural motility, differentiation, and repair. Dev Neurobiol. 2011;71(11):1090-101.
Franze K, Janmey PA, Guck J. Mechanics in neuronal development and repair. Annu Rev Biomed Eng. 2013;15:227-51.
Sun W, et al. Biophysical approaches for applying and measuring biological forces. Adv Sci (Weinh). 2022;9(5):e2105254.
Mohammed D, et al. Innovative tools for mechanobiology: unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:162.
Constantinou I, Bastounis EE. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 2023;41:939-50.
Polacheck WJ, Li R, Uzel SGM, Kamm RD. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 2013;13(12):2252-67.
Li Z, et al. Non-invasive acquisition of mechanical properties of cells via passive microfluidic mechanisms: a review. Biomicrofluidics. 2021;15(3):031501.
Xiao Y, Du J. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications. J Mater Chem B. 2020;8(3):354-67.
Yang X, et al. Nanotechnology enables novel modalities for neuromodulation. Adv Mater. 2021;33(52):e2103208.
Semeano AT, et al. Effects of magnetite nanoparticles and static magnetic field on neural differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 2022;18(4):1337-54.
Lee B, et al. Design of oxide nanoparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 2025;10:252-67.
Kim YJ, et al. Magnetoelectric nanodiscs enable wireless transgene-free neuromodulation. Nat Nanotechnol. 2025;20:121-31.
Signorelli L, Hescham SA, Pralle A, Gregurec D. Magnetic nanomaterials for wireless thermal and mechanical neuromodulation. iScience. 2022;25(11):105401.
Liu T, Wang Y, Lu L, Liu Y. SPIONs-mediated magnetic actuation promotes nerve regeneration by inducing and maintaining repair-supportive phenotypes in Schwann cells. J Nanobiotechnology. 2022;20:159.
Liu T, et al. f-SPION-mediated magnetic stimulation induces reparative Schwann cell reprogramming via cytoskeletal dynamics-gated activation of Piezo1. J Nanobiotechnology. 2026;24:298.
Jessen KR, Mirsky R, Lloyd AC. Schwann cells: development and role in nerve repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(7):a020487.
Jessen KR, Mirsky R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 2016;594(13):3521-31.
Sun S, Zeng H. Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles. J Am Chem Soc. 2002;124(28):8204-5.
Zhuang J, Wu H, Yang Y, Cao YC. Controlling colloidal superparticle growth through solvophobic interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(12):2208-12.
Bai F, et al. A versatile bottom-up assembly approach to colloidal spheres from nanocrystals. Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(35):6650-3.
Tang L, et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(43):15344-9.
Tay A, Kunze A, Murray C, Di Carlo D. Induction of calcium influx in cortical neural networks by nanomagnetic forces. ACS Nano. 2016;10(2):2331-41.
Tay A, Di Carlo D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Lett. 2017;17(2):886-92.
Cheng FY, et al. Characterization of aqueous dispersions of Fe(3)O(4) nanoparticles and their biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(7):729-38.
Lee N, et al. Iron oxide-based nanoparticles for multimodal imaging and magnetoresponsive therapy. Chem Rev. 2015;115(19):10637-89.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Nanocząstki superparamagnetyczne stymulacja magnetyczna obrazowanie żywych komórek organizacja cytoszkieletu stymulacja elektromagnetyczna mechanobiologia

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Informuj mnie o aktualizacjach: