Obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy Orbitrap

Nathan Colwell; Dan Chen; Deepti Bhusal; Zongkai Peng; Zhibo Yang

doi:10.3791/71691

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy Orbitrap

DOI:

10.3791/71691

⸱

12 czerwca 2026

Nathan Colwell¹^,² , Dan Chen² , Deepti Bhusal¹^,² , Zongkai Peng² , Zhibo Yang¹^,²

¹Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, ²Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje spektrometrię masową pojedynczych komórek obrazowania komórek OVCAR-8 z wykorzystaniem jonizacji z desorpcji i elektrozrygowania połączonych ze spektrometrami masowymi Orbitrap do metabolomiki wysokiej rozdzielczości przestrzennej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dezorpcyjna elektrorozpyłowa ionizacja - obrazowanie spektrometrią masową (DESI - MSI) umożliwia obrazowanie molekularne w warunkach środowiskowych bez macierzy z minimalną przygotowaniem próbki. Ten protokół opisuje przepływ pracy dla jednokomórkowego MSI komórek OVCAR-8 za pomocą DESI sprzężonego z widmometriami masowymi Orbitrap. System integruje rozpylacz DESI, zmodyfikowany interfejs widmometru masowego, zmotoryzowaną podstawę XYZ oraz podstawę optyczną do obrazowania o wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Komórki są hodowane na siatkowanych szklanych okrągach, myte roztworem formianu amonu, aby zmniejszyć zakłócenia soli, suszone i analizowane w warunkach środowiskowych. Rozpuszczalnik jest dostarczany ciągle za pomocą systemu nano-chromatografii cieczowej, a gaz do rozpylania azotu jest regulowany, aby utrzymać stabilność rozpylania. Protokół opisuje również skanowanie rasterowe, kontrolę pikseli i rejestrację obrazu optycznego do spektrometrii masowej dla lokalizacji jednokomórkowej. Wysoka rozdzielczość masy i dokładność masy zapewniona przez wykrywanie Orbitrap umożliwia rozróżnienie blisko spokrewnionych gatunków molekularnych i wspiera jednokomórkową analizę metabolomową. Ten protokół zapewnia adaptacyjną strategię wdrażania jednokomórkowego MSI o wysokiej rozdzielczości przestrzennej za pomocą wielu platform widmometrii masowej Orbitrap.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolomika stara się kompleksowo scharakteryzować małe metabolity cząsteczkowe, które odzwierciedlają stan funkcjonalny systemów biologicznych¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Ponieważ metabolity są bezpośrednim produktem aktywności enzymatycznej, zapewniają dynamiczne odczytywanie fenotypu komórkowego i regulacji biochemicznej. Jednak konwencjonalne przepływy metabolomiki zwykle polegają na metodach ekstrakcji masowej, które uśredniają sygnały dla tysięcy do milionów komórek, co zasłania niejednorodność komórkową⁶^,⁷^,⁸.

Metabolomika pojedynczych komórek radzi sobie z tą ograniczeniem, umożliwiając profilowanie molekularne na poziomie pojedynczych komórek, ujawniając różnorodność metaboliczną w złożonych populacjach i poprawiając rozumienie mechanizmu postępu choroby, reakcji na leki i różnicowania komórkowego. Spektrometria mas (MS) jest niezbędnym narzędziem do analizy molekularnej próbek biologicznych. Ostatnie osiągnięcia w technikach MS, w tym przygotowanie próbek, instrumentacja i analiza danych, umożliwiają przeprowadzanie badań metabolomiki MS na poziomie pojedynczych komórek⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹².

Imaging MS (MSI), które umożliwia przestrzennie rozdzieloną analizę molekularną próbek biologicznych, integruje precyzyjny ruch próbki, zminimalizowane pobieranie próbek, wydajną jonizację i wizualizacje danych poprzez uzyskanie pełnego widma masowego w każdej zdefiniowanej współrzędnej przestrzennej na powierzchni próbki¹²^,¹³^,¹⁴. Obrazy MS są rekonstruowane poprzez nakreślenie intensywności wybranych wartości stosunku masy do ładunku (m/z) wzdłuż współrzędnych x–y, zachowując w ten sposób informacje przestrzenne o chemikaliach w złożonych systemach biologicznych¹²^,¹³^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Uzyskanie przestrzennie rozdzielonej metabolomiki pojedynczych komórek wymaga platform analitycznych zdolnych do zachowania lokalizacji molekularnej, zachowując jednocześnie wystarczającą czułość i rozdzielczość masową, aby wykryć gatunki o niskiej obfitości⁹^,¹²^,¹⁹^,²⁰.

Imaging MSI pojedynczych komórek stawia dodatkowe wyzwania, ponieważ pojedyncze komórki zazwyczaj mają średnicę od 5 do 20 μm⁸^,²¹. Na tej skali przestrzennej, obfitość analitów na jedno zdarzenie pobierania próbek jest niezwykle ograniczona. Dlatego wiele czynników, w tym dokładna kontrola ruchu próbki, zminimalizowane pobieranie próbek, wysoka wydajność jonizacji i wydajne przenoszenie jonów, są równie istotne, aby uzyskać interpretowalne informacje molekularne z pojedynczych komórek¹⁴^,²². Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)–MSI, technika oparta na próżni rutynowo używana do badań MSI o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, wymaga depozycji matrycy i operacji w próżni; jednak krystalizacja matrycy w MALDI może wprowadzić delokalizację i zmienność analitów na skalę pojedynczych komórek²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷. W przeciwieństwie do tego, podejścia do ambient MSI pracują w warunkach otoczenia, a próbki zachowują stany chemiczne zbliżone do naturalnych, ponieważ wymagana jest mała lub żadna przygotowanie próbki. Wśród metod ambient MSI, DESI²⁸, nano-DESI²¹, nano-DESI wspomagane pneumatycznie²⁹, i Single-probe⁸^,³⁰^,³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵, zostały wcześniej użyte do badań MSI pojedynczych komórek. Chociaż techniki oparte na mikropłynowej ekstrakcji, w tym nano-DESI, nano-DESI wspomagane pneumatycznie i Single-probe, zapewniają wysokie pobieranie próbek i wydajność jonizacji, polegają one na utrzymaniu stabilnego mostka płynnego na końcówce sondy pobierającej, podczas gdy zakłócenie mostka płynnego, takie jak zmiany w morfologii powierzchni lub zatkanie sondy, może wpływać na jakość eksperymentów MSI⁵^,⁸^,²¹^,³⁰^,³⁵.

DESI to

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki OVCAR-8 uzyskane zostały od American Type Culture Collection (ATCC). Wszystkie procedury hodowli komórkowej przeprowadzano zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi biobezpieczeństwa. Komórki rutynowo badano pod kątem zakażenia mykoplazmą za pomocą zestawu do wykrywania mykoplazm zgodnie z instrukcjami producenta.

UWAGA: Wykonuj wszystkie procedury zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi biobezpieczeństwa. Noś odpowiednie elementy ochrony osobistej. Obsługuj rozpuszczalniki organiczne w komorze chemicznej.

1. Hodowla i przygotowanie komórek OVCAR-8 na osłonkach siatkowych

Przygotuj pełne medium poprzez uzupełnienie medium RPMI-1640 10% surowicą pobranego od byka płodnego i 1% penicyliną-streptomycyną. Podgrzej medium do 37°C.
Utrzymuj komórki OVCAR-8 w 10 cm naczyniach do hodowli komórkowej zawierających 10 mL pełnego medium. Inkubuj komórki w 37°C w inkubatorze umiarkowanie wilgotnym z 5% CO₂.
Przenos komórki, gdy około 80% powierzchni kultury jest wizualnie zajęte przez przylegające komórki, zazwyczaj co 2 dni w opisanym warunkach hodowli.
1. Wyssawaj medium z 10 cm naczynia kulturowego i przepłukuj komórki raz z 5 mL 1x fosforanowego buforu salinicznego.
2. Dodaj 2 mL 0,25% trypsyny-kwasu etilenodiaminoctowego do naczynia kulturowego. Inkubuj komórki w 37°C przez około 3 min lub do momentu, gdy większość komórek widocznie oderwie się od powierzchni kultury po zbadaniu pod mikroskopem.
3. Dodaj 8 mL podgrzanego pełnego medium do naczynia, aby zneutralizować trypsynę. Używając 10 mL pipety serologicznej, delikatnie przesączaj zawiesinę komórkową w górę i w dół około 15-20 razy, aby rozproszyć komórki.
4. Przenieś 1 mL zawiesiny do 9 mL świeżego pełnego medium.
5. Zlicz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Wprowadź 10 μL resuspendowanej zawiesiny komórkowej bezpośrednio na ślizgę liczącą bez dodatkowego rozcieńczenia i wykonaj liczenie komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
  UWAGA: Barwników do wyznaczania żywotności komórek, takich jak niebieski trypanowy, nie używano w tym protokole. Oceń stan komórek wizualnie, monitorując morfologię komórek i przyczepianie przed trypsynizacją.
Zasiaj komórki na osłonkach.
1. Rozcień komórki do końcowej koncentracji ~1 x 10⁶ komórek/mL za pomocą pełnego medium. Oblicz wymaganą objętość zawiesiny komórkowej używając C₁V₁ = C₂V₂, gdzie C₁ to stężenie zliczynych komórek, V₁ to wymagana objętość zawiesiny komórkowej, C₂ to docelowe stężenie, a V₂ to pożądana końcowa objętość.
2. Umieść pojedyncze osłonki szklanej siatki o wymiarach 28 mm z odstępem siatki 50 μm w dołkach 6-dołkowej płytki.
  UWAGA: Przed użyciem do hodowli komórkowej autoklawuj osłonki szklane. Umieść je z siatką skierowaną w dół, aby zminimalizować zakłócenia w wzroście komórek.
3. Dodaj 2 mL pełnego medium i 200 μL zawiesiny komórkowej (~2 x 10⁵ komórek/dołek) do każdego dołka. Delikatnie kołysaj płytkę 6-dołkową wzorem "X", aby równomiernie rozłożyć komórki na powierzchni osłonki.
4. Inkubuj komórki przez około 15-20 h, aby umożliwić przyczepianie się komórek.
  UWAGA: Monitoruj rutynowo morfologię komórek za pomocą mikroskopu, aby zapewnić normalny wzrost komórek. Badaj potencjalne zakażenie mykoplazmą za pomocą zestawu do wykrywania mykoplazm, jeśli komórki rosną słabo.

2. Mycie komórek roztworem formiamidu amonowego (AF)

UWAGA: Przygotuj świeży roztwór AF przed każdym użyciem.

Przygotuj izotoniczny bufor mycia AF tuż przed użyciem. Waga 0,45 g AF i rozpuść je w 50 mL wody LC/MS-klasy, aby uzyskać końcowe stężenie AF 0,14 M (0,9% w/w). Nie koryguj pH⁵^,⁴⁵.
UWAGA: Używaj świeżo przygotowanego roztworu AF tego samego dnia przygotowania. Trzymaj roztwór lodowato zimny (0°C-4°C) do momentu użycia.
Wyssawaj medium kulturowe z każdego dołka 6-dołkowej płytki. Natychmiast dodaj 2 mL zimnego roztworu AF do każdego dołka.
Używając sterylnych szczypiec, delikatnie podnieś każdą osłonkę zawierającą przylegające komórki z dołka, zachowując powierzchnię pokrytą komórkami skierowaną w górę. Krótko umieść osłonkę przez 2-3 s w oddzielnym dołku wstępnie wypełnionym 2 mL zimnego 0,9% roztworu AF.
Powtórz proces płukania w sum

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukcesywne wykonanie tego protokołu produkuje zbiory danych DESI-MSI, w których optycznie zidentyfikowane pojedyncze komórki przestrzennie odpowiadają zlokalizowanym sygnałom jonów molekularnych (Rysunek 2). Obrazy mikroskopu światła przedniego uzyskane przed analizą DESI-MSI umożliwiają wizualne zidentyfikowanie pojedynczych komórek OVCAR-8 i ułatwiają rejestrację obrazu optycznego do MS przy użyciu siatki pokrywki jako odniesienia pozycyjnego. Reprezentatywne obrazy jonowe DESI-MSI demonstrują zlokalizowane dystrybucje jonów, które przestrzennie korelują z pojedynczymi komórkami zidentyfikowanymi na odpowiednim obrazie światła przedniego (Rysunek 2A–2D).

Rysunek 2. Porównanie mikroskopu światła przedniego i MSI komórek OVCAR-8. (A) Obraz mikroskopu światła przedniego komórek OVCAR-8 uzyskany przy powiększeniu 10×. (B–D) Obrazy MS uzyskane za pomocą DESI-MSI o wielkości piksela 5,5 µm × 10 µm. Pokazane są reprezentatywne dystrybucje jonów dla (B) m/z 317,111, (C) m/z 808,562 i (D) m/z 788,616. Skala skokowa = 50 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pojedyncze komórki generuja pełne widma mas zawierające wiele jonów związanych z lipidami i małe cząsteczki. Zamiast polegać na pojedynczym markerze molekularnym, każda komórka wykazuje profil wielo-jonowy, który funkcjonuje jako chemiczny odcisk palca. Reprezentatywne obrazy jonowe przy m/z 317,111, m/z 808,562 i m/z 788,616 demonstrują heterogeniczne dystrybucje molekularne między sąsiednimi komórkami, wskazując na mierzalną heterogeniczność metaboliczną na poziomie pojedynczej komórki (Rysunek 2B–2D). Adnotacje oparte na METASPACE sugerują, że jony wykryte przy m/z 808,562 i m/z 788,616 były głównie związane z fosfatydylocholinami i fosfatydyloetanolaminą, podczas gdy m/z 317,111 odpowiadało kilku kandydatkom do małych cząsteczek i związków związanych z dipeptydami. Te wyniki pokazują, że platforma umożliwia wykrywanie przestrzennie zlokalizowanych cech molekularnych z optycznie zidentyfikowanych pojedynczych komórek w warunkach środowiskowych. Dodatkowe wyniki, w tym gatunki przejściowo zaanotowane, zidentyfikowane gatunki MS/MS, reprezentatywne obrazy MS i widma mas, są dostępne w poprzednich badaniach²⁰.

Zintegrowana platforma DESI-MSI składa się z opryskiwacza DESI, zmodyfikowanego adaptera FAIMS, zmotoryzowanego stołu XYZ i podstawy optycznej zamontowanej obok wlotu Orbitrap (Rysunek 1). Konfiguracja umożliwia stabilną dostawę rozpuszczalnika, kontrolowane przemieszczanie stołu i wyrównanie strumienia oprysku DESI z wlotem spektrometru mas w eksperymentach z obrazową analizą pojedynczych komórek w warunkach środowiskowych. Dostosowany rurek transferu jonów przedstawiony na Rysunku 3 umożliwia transmisję jonów między regionem źródła DESI a wlotem Orbitrap. Zakrzywiona geometria kapilara ułatwia pozycjonowanie opryskiwacza DESI względem powierzchni próbki i regionu wlotu, zachowując nieprzeszkodzoną transmisję jonów.

Rysunek 3. Dostosowany rurek transferu jonów dla Orbitrap MSI. Fotografia niestandardowego wykonanego rurka transferu jonów używanego do połączenia opryskiwacza DESI z spektrometrem mas Orbitrap Fusion Lumos. Rysunek pokazuje zakrzywioną geometrię kapilara transferu i zespół montażowy stosowany do transmisji jonów podczas eksperymentów z obrazową analizą pojedynczych komórek MSI w warunkach środowiskowych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4 przedstawia zmodyfikowany adapter FAIMS zintegrowany z podstawą optyczną i zmotoryzowanym stołem XYZ. Widok z góry (Rysunek 4A) ilustruje pozycjonowanie stołu próbki i zmodyfikowanego adaptera względem wlotu Orbitrap, podczas gdy widok od dołu (Rysunek 4B) pokazuje wsporniki montażowe i zestaw stołu służące do podtrzymywania platformy obrażowania. Mechaniczna stabilność zintegrowanej konstrukcji jest ważna dla utrzymania spójnego ruchu skanowania i minimalizowania dryfu pozycyjnego podczas nabywania obrazu.

figure-results-3

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To protokoll umożliwia środowiskowe pojedyncze DESI–MSI za pomocą spektrometrów mas Orbitrap o wysokiej rozdzielczości masowej poprzez integrację precyzyjnej kontroli stopnia, nanoskalowej dostawy rozpuszczalnika, optycznego celowania oraz wysokorozdzielczej analizy masowej. Połączenie tych elementów pozwala na przełamanie wielu barier technicznych, które historycznie ograniczały zastosowanie DESI–MSI na poziomie pojedynczych komórek. W szczególności, skoordynowany kontrola stabilności rozpylenia, transmisji jonów i czasu akwizycji umożliwia niezawodne wykrywanie sygnałów molekularnych z bardzo małych objętości próbek odpowiadających pojedynczym komórkom. Centralnym czynnikiem wpływającym na wydajność tego przepływu pracy jest stabilność i ograniczenie rozpylenia DESI. Na skalę mikrometrów, małe zakłócenia w szybkości przepływu rozpuszczalnika, ciśnieniu gazu lub pozycjonowaniu dyszy mogą znacząco zmienić efektywny obszar pobierania próbek. Zastosowanie nanoskalowej dostawy rozpuszczalnika w połączeniu z odpowiednim przeciwciśnieniem poprawia stabilność rozpylenia i zmniejsza rozprzestrzenianie się rozpuszczalnika, zwiększając w ten sposób wierność przestrzenną. Ponadto, utrzymanie stałej odległości dyszy od powierzchni i kąta jest kluczowe dla reprodukowalnej wydajności jonizacji. Nawet niewielkie odchylenia w geometrii mogą prowadzić do znacznych różnic w intensywności sygnału, szczególnie przy analizie heterogenicznych próbek komórkowych. W praktyce, optymalizacja warunków rozpylenia DESI była wykonywana empirycznie poprzez monitorowanie całkowitego prądu jonów, stabilności spektrum oraz wartości NL (zazwyczaj około 10⁵–10⁶) podczas akwizycji. Odtwarzalna jakość sygnału została osiągnięta poprzez iteracyjną regulację pozycji dyszy, stabilności przepływu rozpuszczalnika, ciśnienia gazu oraz ujednolicenia rozpylenia DESI względem wlotu Orbitrap.

Efektywność transmisji jonów reprezentuje kolejne kluczowe ograniczenie na skalę pojedynczych komórek, ponieważ obfitość analitów jest naturalnie niska w pojedynczych komórkach. Na tych skalach przestrzennych, efektywna transmisja jonów może stać się większym ograniczeniem praktycznym niż wydajność jonizacji w niektórych implementacjach, ponieważ tylko bardzo mała frakcja dezorbowanych jonów dociera do wlotu spektrometru mas. Dlatego też, efektywny transfer jonów z regionu pobierania do wlotu spektrometru mas jest zasadniczy. Zmodyfikowany adapter obudowy FAIMS stosowany w tym protokole zapewnia interfejs między źródłem rozpylenia DESI a spektrometrem mas Thermo, umożliwiając kompatybilność z wieloma modelami urządzeń, w tym platformami Orbitrap Tribrid, Exploris i Astral. Integracja zmodyfikowanego adaptera obudowy FAIMS z płytą optyczną zapewnia również stabilność mechaniczną, minimalizując niedopasowanie podczas dłuższych eksperymentów obrazowania. Synchronizacja ruchu stopnia i akwizycji spektrum masowego jest również kluczowa dla osiągnięcia wysokiej rozdzielczości przestrzennej. W DESI–MSI, wymiar piksela w kierunku skanowania jest rządzony relacją między prędkością stopnia a szybkością akwizycji, podczas gdy ortogonalny wymiar jest definiowany przez zaprogramowaną wielkość kroku. Dokładna kontrola tych parametrów umożliwia precyzyjne pobieranie próbek. Ponieważ wiele komórek ssaków zazwyczaj waha się od około 5–20 µm średnicy, wymiary pikseli zbliżające się do kilku mikrometrów są wymagane, aby zminimalizować nakładanie się sygnałów między sąsiednimi komórkami i poprawić lokalizację cech molekularnych do poszczególnych regionów komórkowych. Jednakże, nominalny rozmiar piksela niekoniecznie odpowiada prawdziwemu śladowi pobierania próbek, ponieważ oddziaływanie rozpylenia rozpuszczalnika z powierzchnią próbki może wprowadzić boczne rozprzestrzenianie się i częściowe nakładanie się sygnałów między sąsiednimi pikselami. Podane wymiary pikseli powinny zatem być interpretowane w kontekście efektywnej rozdzielczości przestrzennej, a nie ściśle geometrycznych definicji. Dostosowana rura transferu jonów użyta w tym badaniu została zaprojektowana zgodnie z geometrią standardowej rury transferu jonów, aby zachować charakterystyki transmisji jonów, umożliwiając integrację z konfiguracją źródła DESI.

Wysoka moc rozdzielania mas i dokładność masy zapewniana przez spektrometry masowe Orbitrap są zasadnicze dla rozdzielania złożonej mieszanki metabolitów i lipidów obecnych w pojedynczych komórkach. Wiele wykrytych cech molekularnych zostało wstępnie skomentowane za pomocą dokładnych pomiarów masy i analizy METASPACE. Ponieważ wiele kandydatów może odpowiadać jednej zmierzonej wartości m/z, dodatkowe walidacje MS/MS oraz ortogonalne strategie potwierdzania molekularnego mogą dalsze wzmocnić identyfikację molekularną w przyszłych badaniach. W trybie jonów dodatnich, widma DESI są często zdominowanie przez gatunki fosfolipidów o bliskich lub izobarycznych wartościach m/z. Wysokorozdzielcze wykrywanie Orbitrap umożliwia różnicowanie tych gatunków, poprawiając w ten sposób specyficzność molekularną i zmniejszając niejednoznaczność spektralną. Ta zdolność jest szczególnie ważna dla analiz na poziomie pojedynczych komórek, gdzie poleganie na ograniczonej liczbie jonów może prowadzić do błędnej interpretacji heterogeniczności komórkowej. Ta adaptacyjność sugeruje, że podobne strategie mogą być stosowane do innych platform spektrometri

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sporów interesu do ujawnięcia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To dzieło było wspierane przez fundusze National Institutes of Health (1R01AI177469), National Science Foundation (2305182), Chan Zuckerberg Initiative i Department of Defense (DoD OC220161).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
−80 °C zamrażarka	Eppendorf New Brunswick	U700	Przechowywanie próbek biologicznych przed przygotowaniem.
6" pionowy wspornik do płyt zaciskowych, otwory 1/4"-20 (2 sztuki)	Millipore Sigma	VB01A	Mechaniczne wsparcie i stabilizacja niestandardowego zespołu montażu dysz
Acetonitryl	Fisher Chemical	240744	Rozpuszczalnik organiczny do przygotki i optymalizacji rozpuszczalnika zgodnego z DESI
Formian amonu	Thermo Fisher Scientific	401152500	Przygotowanie buforu do płukania formianiem amonu w celu izotonicznego mycia komórek przed DESI–MSI
Mikroskop Brightfield	Fisher Scientific	12575252	Optyczne obrazowanie i wizualizację przyczepionych komórek przed nabywaniem DESI–MSI
Kolumna C18	Waters	186009259	Generacja ciśnienia przeciwprądowego w linii do stabilnego formowania rozpylacza DESI w nano-flow
Drut miedziowy	N/D	N/D	Połączenie elektryczne i uziemienie podczas produkcji montażu dysz
Sprayer DESI XS	Waters	700014033	Źródło jonizacji DESI w środowisku do eksperymentów DESI–MSI z pojedynczymi komórkami
Żywica epoksydowa	Devcon	20945	Stabilizacja mechaniczna i utrwalenie niestandardowych komponentów montażu dysz
Adapter obudowy źródła jonów FAIMS Pro	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Modyfikacja i produkcja niestandardowego interfejsu DESI zgodnego z Orbitrapem
Kwas mrówkowy	Ward’s Science	470301-120	Modyfikator kwasowy do przygotki rozpuszczalnika do sprayera DESI
Metanol	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Rozpuszczalnik organiczny do przygotki rozpuszczalnika do sprayera DESI
Regulator gazu	Millipore Sigma	23831-U	Regulacja ciśnienia gazu osłaniającego azotem podczas działania DESI
Szklana pokrywka z kratką	Ibidi	10817	Podłoże do hodowli komórek i odniesienie pozycyjne do rejestracji obrazu optycznego do MS
Przewód uziemiający	N/D	N/D	Połączenie uziemiające do sprayera DESI i zespołu interfejsu
Inkubator	HeraCell	51026282	Utrzymanie kultur komórek ssaków w kontrolowanych warunkach temperatury i CO₂
Woda klasy LC/MS	Thermo Fisher Scientific	W6500	Przygotowanie buforu do mycia formianiem amonu i rozpuszczalnika do sprayera DESI
Platforma METASPACE	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Oparte na chmurze wizualizację obrazu MS i przestrzenną analizę danych metabolomiki
Modyfikowany interfejs FAIMS	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Niestandardowy interfejs do łączenia sprayera DESI z widmami masowymi Orbitrap
Stojaczek XYZ z napędem	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Kontrolowane ruch rasterowy podczas nabywania DESI–MSI
Zestaw do wykrywania mykoplazm MycoAlert PLUS	Lonza	LT07-703	Routynowe monitorowanie kontaminacji mykoplazmą w hodowanych komórkach
System nanochromatografii cieczowej	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	System dostarczania rozpuszczalnika nano-flow do generacji sprayera DESI
Podłoże optyczne	Thorlabs	MB1012	Platforma podtrzymująca mechanicznie sprayer DESI i zmodyfikowany zespół interfejsu
Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific	UVPD	Wysokorozdzielczy spektrometr masowy Orbitrap do nabywania danych DESI–MSI
Rura PEEK	IDEX	1535	Połączenie linii rozpuszczalnika między systemem nano-LC a sprayerem DESI
Penicylina z streptomycyną	Gibco	15140-122	Dodatek antybiotyczny do pożywki do hodowli komórek ssaków
Bufor słony fosforanowy (PBS)	VWR	0780-50L	Roztwór do mycia hodowanych komórek podczas przesadzania
Pożywka RPMI-1640	Gibco	11875093	Pożywka do hodowli komórek ssaków do utrzymania komórek OVCAR-8
Oprogramowanie sterujące stolcem	Lasken Group	Wersja 6	Sterowanie oprogramowaniem skanowania rasterowego, ruchu stołka i parametrów nabywania obrazów
Rura ze stali nierdzewnej	MicroGroup	316H16H	Niestandardowa rura do przenoszenia jonów (1/16" OD, 0,033" ID) do integracji z interfejsem Orbitrap
Strzykawka, 250 µL	Hamilton	1725LTN250UL	Ładowanie rozpuszczalnika i dostarczanie nano-flow rozpuszczalnika
Syntetyczne surowicowe surowica bydlęca (FBS)	HyClone	SH3006603	Dodatek surowicowy do przygotki pełnej pożywki do hodowli komórek ssaków
Automatyczny licznik komórek TC20	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	Automatyczne liczenie hodowanych komórek przed wysiewem na pokrywkach
Naczynie do hodowania tkanki, 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Rozrost i utrzymanie adhezywnych kultur komórek OVCAR-8
Trypsyna-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	Enzymatyczne oderwanie adhezywnych komórek podczas przesadzania
Żywica UV	Prime Dental	6.03	Produkcja i stabilizacja niestandardowych komponentów montażu spray

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MSI pojedynczych kom rek kom rki OVCAR 8 wysoka rozdzielczo przestrzenna nanociek oprzep ywowa chromatografia analiza metabolomiczna obrazowanie molekularne

Obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy Orbitrap

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły