Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie testu reporterowego STAT6 do przesiewowego badania toksyn środowiskowych wpływających na alergiczny stan zapalny dróg oddechowych

144 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71694

⸱

25 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje generowanie i walidację stabilnego testu reporterowego lucyferazy STAT6 w ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych. Metoda ta umożliwia efektywne przesiewanie toksyn środowiskowych oraz składników zanieczyszczeń powietrza, które modulują aktywność STAT6 w kontrolowanych warunkach in vitro.

Streszczenie

Alergiczny stan zapalny dróg oddechowych związany z zanieczyszczeniem powietrza stanowi coraz poważniejszy problem zdrowia publicznego. Interleukina-4 (IL-4) i interleukina-13 (IL-13), które aktywują szlak białka STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription 6) – kluczowego mediatora alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych – mogą modulować toksyczność oddechową zanieczyszczeń. Niniejsze badanie opisuje opracowanie i walidację stabilnego testu reporterowego lucyferazy STAT6 w ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych w celu oceny toksyn środowiskowych modulujących sygnalizację STAT6. Ludzkie komórki nabłonka oskrzeli 16HBE14o− Komórki poddano transdukcji wektorem lentiwirusowym niosącym raportujący gen lucyferazy respondentny na STAT6, po czym zoptymalizowano selekcję puromycyną oraz wielokrotność infekcji (MOI), a następnie przeprowadzono izolację monoklonalną metodą rozcieńczeń ograniczających. Wyselekcjonowano stabilny klon wykazujący silną i powtarzalną indukcję w kolejnych pasażach. Responsywność raportora zwalidowano poprzez stymulację IL-4/IL-13, a zależność od STAT6 potwierdzono przy użyciu selektywnych inhibitorów STAT6, STAT5 i STAT3. Wydajność analizy ilościowo oceniono za pomocą współczynnika Z′-analiza czynnikowa, która wykazała powtarzalną separację sygnałów. Ponadto test zastosowano w odniesieniu do poszczególnych składników zanieczyszczeń powietrza, a benzo[bfluoranten oraz pyły zawieszone istotnie zwiększyły aktywność reportera STAT6. Metoda ta stanowi skalowalne podejście do pomiaru aktywności STAT6 w komórkach nabłonka dróg oddechowych oraz do priorytetyzacji toksykantów środowiskowych modulujących sygnalizację alergiczną w drogach oddechowych.

Wprowadzenie

Zanieczyszczenie powietrza stanowi jedno z najpilniejszych globalnych wyzwań w dziedzinie zdrowia publicznego, niosąc ze sobą głębokie skutki zdrowotne i społeczno-ekonomiczne. Obecnie jest ono klasyfikowane jako drugi wiodący czynnik ryzyka zgonów, odpowiadając za 8,1 miliona śmierci rocznie1,2,3. Wśród zanieczyszczeń przenoszonych drogą powietrzną największe ryzyko zdrowotne stwarza pył zawieszony o średnicy cząstek mniejszej niż 2,5 mikrometra (PM2,5), ze względu na jego zdolność do głębokiego przenikania do dróg oddechowych4,5. Podwyższona ekspozycja na PM2,5 jest konsekwentnie powiązana z upośledzeniem funkcji płuc oraz zwiększoną częstotliwością hospitalizacji z powodu chorób układu oddechowego6. Częstość występowania alergicznych chorób zapalnych, w tym astmy, alergicznego nieżytu nosa oraz atopowego zapalenia skóry, wzrasta na całym świecie i jest nieproporcjonalnie wyższa w silnie zanieczyszczonych megamiastach4.

Alergiczne choroby dróg oddechowych, takie jak astma atopowa, są w głównej mierze pośredniczone przez odpowiedź zapalną typu 2, charakteryzującą się podwyższonym poziomem cytokin interleukiny‑4 (IL‑4) i interleukiny‑13 (IL‑13) oraz aktywacją szlaku sygnałowego białka STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription 6)7. W komórkach nabłonka dróg oddechowych zależna od IL-4 i IL-13 fosforylacja STAT6 promuje nadmierną sekrecję śluzu oraz zaburzenie bariery nabłonkowej, co wskazuje na STAT6 jako centralny mediator patologii alergicznych dróg oddechowych i istotny cel terapeutyczny8,9. Dowody eksperymentalne z modeli mysich wskazują, że ekspozycja na PM2.5 i dwutlenek siarki nasila sygnalizację STAT6 i zaostrza alergiczny stan zapalny dróg oddechowych10,11. Jednakże nie oceniono systematycznie, czy poszczególne składniki zanieczyszczeń powietrza bezpośrednio modulują aktywność transkrypcyjną STAT6 w ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych.

Zanieczyszczenie powietrza składa się z chemicznie złożonej mieszaniny składników, w tym pyłów zawieszonych, wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA), metali ciężkich i soli nieorganicznych, których indywidualny wpływ na aktywację STAT6 w drogach oddechowych pozostaje słabo zdefiniowany12,13. Obecne metody pomiaru aktywności STAT6 w komórkach nabłonka dróg oddechowych, takie jak końcowe testy fosforylacji czy systemy reporterowe oparte na przejściowej transfekcji, nie nadają się do wielkoskalowego przesiewania chemicznego. Stabilna, komórkowa platforma reporterowa STAT6 w ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych stanowiłaby zatem skalowalne narzędzie do identyfikacji związków pochodzących z zanieczyszczeń, które modulują sygnały alergiczne w drogach oddechowych. Niniejszy protokół opisuje opracowanie i walidację stabilnego testu reporterowego STAT6 z lucyferazą w komórkach nabłonka dróg oddechowych 16HBE14o−, umożliwiającego ilościową ocenę aktywacji STAT6 w celu systematycznego przesiewania próbek środowiskowych i poszczególnych toksykantów chemicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zatwierdzenie etyczne dotyczące udziału ludzi nie jest wymagane, ponieważ w badaniu wykorzystano uznaną linię komórek nabłonka oskrzeli człowieka 16HBE14o−.

1. Generowanie linii 16HBE14o− komórki stabilnie wykazujące ekspresję reportera aktywności STAT6

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat procedury.

  1. Hodowla komórkowa
    UWAGA: Wszystkie procedury należy przeprowadzać z zachowaniem zasad aseptyki w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II. Przed użyciem należy potwierdzić, że komórki nie są zanieczyszczone mycoplasmapą.
    1. Utrzymanie linii 16HBE14o-− komórki w minimalnym medium niezbędnym (minimum essential medium) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Inkubować komórki w 37 °C w uwilgotnionej atmosferze zawierającej 5% CO22i wymieniać pożywkę co drugi dzień.
    2. Pozostawić komórki do czasu osiągnięcia konfluencji na poziomie około 80%. Odessać medium hodowlane i jednokrotnie przemyć monowarstwę komórek solą fizjologiczną w buforze fosforanowym.
    3. Dodać odpowiednią ilość soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, aby przykryć monowarstwę komórek, a następnie inkubować komórki przez 20 min w temperaturze 37 °CCałkowicie odessaj roztwór soli fosforanowo-buforowany.
      UWAGA: Należy zastosować 20-minutową inkubację w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, aby ułatwić rozbicie ciasnych połączeń międzykomórkowych tworzonych przez tę linię komórkową. Czas ten stanowi zoptymalizowaną wewnętrznie modyfikację metody.
    4. Dodaj odpowiednią ilość 0,25% roztworu trypsyny i kwasu etylenodiaminotetraoctowego, aby przykryć monowarstwę komórek. Inkubuj komórki przez 10 min w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Monitorować odrywanie się komórek za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego. W razie potrzeby delikatnie opukiwać naczynie hodowlane, aby ułatwić odrywanie.
    5. Dodaj około pięciu objętości pełnej pożywki w stosunku do objętości roztworu trypsyny i kwasu etylenodiaminotetraoctowego, aby zahamować aktywność enzymatyczną. Delikatnie pipetuj zawiesinę, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
    6. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki do wirowania o pojemności 15 mL. Odwiruj zawiesinę przy 30 × g przez 5 min w temperaturze 25 °C.
    7. Ostrożnie odessać supernatant i resuspendować osad komórkowy w świeżej pożywce hodowlanej. Delikatnie zhomogenizować zawiesinę poprzez pipetowanie i potwierdzić obecność zawiesiny pojedynczych komórek pod odwróconym mikroskopem świetlnym.
    8. Należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru i dostosować ich stężenie do gęstości wymaganej dla kolejnego etapu eksperymentu. Należy zastosować rutynowy stosunek pasażowania 1:8.
      UWAGA: Należy odnieść się do Tabela uzupełniająca 1 i Tabela uzupełniająca 2 dla powierzchni wzrostu naczyń hodowlanych oraz odpowiadających im objętości solistycznej buforu fosforanowego i roztworu trypsyny z etylenodiaminotetraoctowym kwasem (EDTA).
  2. Oznaczanie cytotoksyczności indukowanej puromycyną
    UWAGA: Należy dobrać antybiotyk zgodnie z genem oporności zakodowanym w konstrukcie lentiwirusowym.
    1. Wysiej komórki 16HBE14o− komórki w stężeniu 2 × 104 liczba komórek na dołek w 96-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej 100 µL pełnej pożywki hodowlanej na dołek. Inkubować komórki przez noc.
    2. Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą puromycynę w końcowych stężeniach 0,5, 1, 2 lub 4 µg/mLPrzygotuj oddzielne płytki dla punktów czasowych 24, 48 i 72 h.
    3. Dodaj 5 µL odczynnika do liczenia komórek do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 1 h w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do dołków, ponieważ mogą one zakłócać pomiary absorbancji.
    4. Zmierz absorbancję przy 450 nm, stosując 650 nm jako długość fali referencyjnej. Bezpośrednio przed pomiarem absorbancji w trybie punktu końcowego (endpoint mode) wstrząśnij płytką przez 15 s.
    5. Obliczenie żywotności komórek14 stosując równanie 1.
      Równanie żywotności komórek, OD450-650 dla próbek, kontroli, blanku; wzór do analizy bioassay.
      gdzie:
      Równanie absorbancji OD450-650, metoda odejmowania, stosowana w spektrofotometrii, wzór.
      Wzór na gęstość optyczną (OD450-650) dla analizy absorbancji w eksperymentach spektroskopowych.
      Równanie gęstości optycznej, OD450-650blank=OD450blank-OD650blank, służące do analizy danych spektroskopowych.
      UWAGA: Próbkę kontrolną należy zdefiniować jako komórki niepoddane działaniu czynnika, a próbkę ślepą jako pożywkę bez komórek zawierającą odczyn analityczny. Należy wybrać najniższe stężenie puromycyny, które całkowicie eliminuje komórki nietrasdukowane w czasie od 48 do 72 h.
  3. Wyznaczenie optymalnej wielokrotności infekcji
    OSTRZEŻENIE: Cząstki lentiwirusowe należy obsługiwać w warunkach 2. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2) w zarejestrowanym laboratorium klasy BSL-2 i zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie manipulacje z wirusem należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II. Materiały jednorazowe skażone wirusem oraz rozlane ciecze należy pokryć 10% roztworem wybielacza na co najmniej 1 h przed utylizacją jako odpady biologiczne.
    UWAGA: Należy zoptymalizować wielokrotność infekcji (MOI), ponieważ bezpośrednio wpływa ona na wydajność transdukcji.
    1. Oblicz wymaganą objętość zapasu lentiwirusa15 stosując równanie 2.
      wzór na obliczenie MOI, stosunek cząsteczek wirusa do komórek docelowych, równanie biologii molekularnej.
      gdzie:
      Wzór na funkcjonalny miano wirusa, T_virus = TU/mL, równanie do analizy danych w badaniach wirusologicznych.
      Równanie objętości wirusa, V_virus=objętość wirusa w mL, formuła, badanie wirusologiczne, metoda obliczeniowa
      Równowaga statyczna, równanie: N_cells = liczba komórek docelowych, schemat do celów badań edukacyjnych.
      UWAGA: Funkcjonalny miano zapasu lentiwirusowego reportera lucyferazy STAT6 użytego w tym protokole wynosiło 5 × 107 jednostek transdukujących/ml. Dla 2 × 104 komórek docelowych MOI wynoszące 20 odpowiada 8 µL zapasu lentiwirusa na studzienkę. Objętość wirusa należy przeliczyć ponownie dla preparatów wirusowych o różnych mianach.
    2. Zasiać komórki 16HBE14o-− komórki w stężeniu 2 × 104 liczba komórek na dołek w białej płytce 96-dołkowej z przezroczystym dnem zawierającej 100 µL pełnej pożywki hodowlanej na każdą studzienkę. Inkubować komórki przez noc, aż osiągną około 80% konfluencji.
    3. Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą 5 µg/mL polybrene oraz lentiwirusowy reporter lucyferazowy STAT6 przy MOI wynoszących odpowiednio 1, 5, 10 i 20. Należy uwzględnić studienkę kontrolną (mock-control) z komórkami nietransdukowanymi, bez dodatku lentiwirusa.
      UWAGA: Oblicz objętość lentiwirusa wymaganą dla każdego MOI na podstawie funkcjonalnego miana roztworu macierzystego.
    4. Inkubować komórki z cząstkami lentiwirusowymi przez 48 h. Wymienić medium do transdukcji na świeże medium hodowlane i inkubować komórki przez kolejne 24 h.
    5. Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą interleukinę-4 i interleukinę-13 w stężeniu 10 ng/mL każda. Inkubuj komórki przez 24 h.
    6. Dodaj 25 µL odczynnika do testu lucyferazy do każdej studzienki16Chronić płytkę przed światłem i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.
    7. Wstrząsaj płytkę liniowo przez 20 s. Zmierz luminescencję w trybie pomiaru końcowego (endpoint), odczytując całą płytkę przy ustawieniu wzmocnienia (gain) na 120.
      UWAGA: Pomiar luminescencji należy przeprowadzić w ciągu 1 h od dodania odczynnika do analizy lucyferazy, aby zarejestrować maksymalny sygnał. Należy przestrzegać instrukcji bezpieczeństwa i obsługi dostarczonych przez producenta odczynnika.
      UWAGA: Do wszystkich pomiarów absorbancji i luminescencji należy używać tego samego wielofunkcyjnego czytnika mikropłytek oraz tych samych ustawień akwizycji.
  4. Selekcja komórek transdukowanych
    1. Wysiej komórki 16HBE14o− komórki w stężeniu 2 × 105 komórek/ml w 24-dołkowej płytce hodowlanej. Inkubować komórki przez noc.
    2. Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą lentiwirusowy reporter lucyferazy STAT6 przy MOI wynoszącym 20 i 5 µg/mL polybrene. Inkubować komórki przez 48 h.
    3. Wymień medium do transdukcji na świeże medium hodowlane. Inkubuj komórki przez kolejne 24 h.
    4. Odssać pożywkę hodowlaną i dodać świeżą pożywkę zawierającą 1 µg/mL puromycyną. Inkubować komórki przez 5 dni, wymieniając pożywkę selekcyjną co 2 dni.
    5. Kontynuuj selekcję puromycyną do momentu, aż wszystkie komórki w studzience kontrolnej mock (nietransdukowanej) zostaną wyeliminowane.
      UWAGA: Po transdukcji należy odczekać co najmniej 24 h przed zastosowaniem selekcji antybiotykowej, aby umożliwić ekspresję genu oporności.
  5. Izolacja pojedynczych klonów komórkowych metodą rozcieńczeń ograniczających
    1. Odseparować i przeliczyć komórki reporterowe STAT6 wyselekcjonowane puromycyną. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek o stężeniu 5 komórek/ml poprzez rozcieńczanie seryjne.
      UWAGA: Należy zapobiegać aglomeracji komórek podczas rozcieńczania. W razie potrzeby należy przefiltrować zawiesinę przez sitko komórkowe.
    2. Odmierzyć 200 µL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki płytki hodowlanej z 96 studzienkami, aby uzyskać średnią gęstość wynoszącą około jednej komórki na studzienkę.
    3. W ciągu 24 h należy zbadać każdą studzienkę za pomocą mikroskopu odwróconego i zidentyfikować studzienki zawierające pojedynczą komórkę. Należy wykluczyć studzienki zawierające więcej niż jedną komórkę lub wiele przestrzennie oddzielnych ognisk komórkowych.
    4. Monitoruj wybrane studzienki podczas pierwszego tygodnia, aby potwierdzić wzrost klonalny. Wymieniaj pożywkę co 3 dni.
    5. Namnażaj każdy klon w oryginalnej płytce 96-dołkowej przez około 20 dni lub do momentu osiągnięcia przez komórki konfluencji. Przenoś każdy klon sekwencyjnie do płytki 6-dołkowej, a następnie do kolby hodowlanej T-25.
      UWAGA: Hodować komórki w płytce 6-dołkowej przez około 6 dni przed przeniesieniem ich do kolby T-25 lub przenieść je po osiągnięciu odpowiedniej konfluencji.
      MOMENT PRZERWANIA: Kontynuować namnażanie klonów lub poddać je krio konserwacji w stężeniu 1 × 106 liczba komórek na fiolkę w 1 ml medium do kriokonserwacji zawierającego 90% płodowej surowicy bydlęcej i 10% dimsylosulfoksydu.
    6. Wysiać każdy z namnożonych klonów w zagęszczeniu 2 × 105 komórek/ml w białej płytce 96-dołkowej z przezroczystym dnem. Inkubować komórki przez noc.
    7. Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą IL-4 i IL-13 w stężeniu 10 ng/mL każda. Inkubuj komórki przez 24 h.
    8. Zmierz aktywność lucyferazy zgodnie z opisem w krokach 1.3.6–1.3.7. Porównaj indukowaną aktywność reportera pomiędzy poszczególnymi klonami.
    9. Powtórz test lucyferazowy przy zwiększającej się liczbie pasażowań komórek. Wybierz klony, które utrzymują stałą aktywność reportera indukowaną cytokinami w kolejnych pasażach.
      UWAGA: Wybrano klon 3 ze względu na niską podstawową luminescencję oraz zdolność do utrzymania stabilnego sygnału aktywacji indukowanej cytokinami w kolejnych pasażach.

2. Ustanowienie i walidacja testu reporterowego aktywności STAT6

UWAGA: Rysunek 2 przedstawia schemat całego procesu.

  1. Walidacja testu reporterowego aktywności białka STAT6
    1. Wysiać komórki reporterowe STAT6 w zagęszczeniu 2 × 105 komórek/ml do białej płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem przy użyciu 100 µL pełnej pożywki hodowlanej na dołek. Inkubować komórki przez noc.
    2. Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą IL-4 i IL-13 w stężeniach końcowych 10 ng/mL dla każdego z nich. Jednocześnie dodaj inhibitory selektywne w następujący sposób: 10 nM AS151749 (inhibitor STAT6), 2.5 µM AC-4-130 (inhibitor STAT5) lub 2.5 µM Stattic (inhibitor STAT3).
    3. Należy uwzględnić kontrolę nośnika zawierającą 0,1% dimetylosiarczku (DMSO). Inkubować komórki przez 24 h.
    4. Określ żywotność komórek, stosując metodę zliczania komórek zgodnie z opisem w krokach 1.2.3–1.2.5.
    5. Zmierz aktywność lucyferazy zgodnie z opisem w krokach 1.3.6–1.3.7.
    6. Znormalizuj sygnał luminescencji dla każdej studzienki do odpowiadającej jej żywotności komórek. Wyraź znormalizowane wartości względem grupy kontrolnej traktowanej cytokinami.
      UWAGA: Obniżona żywotność komórek może prowadzić do spadku sygnału lucyferazy niezależnie od aktywności STAT6. Aktywność reportera należy interpretować dopiero po potwierdzeniu dopuszczalnej żywotności komórek.
  2. Ocena odporności testu
    1. Ocenić odporność testu poprzez obliczenie współczynnika Z' z wykorzystaniem 21 powtórzeń w dojkach dla grup kontroli dodatniej i ujemnej.
    2. Oblicz współczynnik Z′- przy użyciu równania 3.
      Równanie równowagi statycznej, wzór na czynnik Z, wyrażenie matematyczne dla kontroli jakości testu.
      gdzie:
      Równanie równowagi statycznej, σₚ oznacza odchylenie standardowe w grupie kontrolnej, edukacyjna ilustracja wzoru.
      Równanie odchylenia standardowego, σn, stosowane w analizie statystycznej w celu oceny dokładności kontroli negatywnej.
      Równanie μ<sub>p</sub>=średni sygnał kontroli pozytywnej; koncepcja statystycznej analizy danych.
      Równowaga statyczna, równanie μn= średni sygnał kontroli negatywnej, analiza edukacyjna.
      UWAGA: Wartość czynnika Z′ w przedziale od 0,5 do 1,0 wskazuje, że test nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

3. Zastosowanie testu reporterowego STAT6 do przesiewania toksykantów środowiskowych

OSTRZEŻENIE: Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne oraz sole metali ciężkich należy traktować jako materiały toksyczne i potencjalnie kancerogenne. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, wszystkie manipulacje przeprowadzać w certyfikowanym dygestorium chemicznym i utylizować zanieczyszczone materiały zgodnie z instytucjonalnymi procedurami postępowania z odpadami niebezpiecznymi.

  1. Przesiewanie toksykantów środowiskowych
    1. Wysiać komórki raportujące STAT6 w gęstości 2 × 105 komórek/mL do białej płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem, używając 10 µL pełnej pożywki hodowlanej na dołek. Inkubować komórki przez noc.
    2. Wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą poszczególne badane związki w pożądanym stężeniu końcowym, które w tym protokole wynosi 10 µM, i traktować komórki w obecności IL-4 oraz IL-13.
    3. Uwzględnić grupę kontrolną negatywną zawierającą 0,1% dimetylosulfoksydu oraz grupę kontrolną pozytywną zawierającą IL-4 i IL-13 w stężeniu 10 ng/mL każda. Inkubować komórki przez 24 h.
    4. Ocenić żywotność komórek za pomocą testu zliczania komórek, zgodnie z opisem w krokach 1.2.3–1.2.5.
    5. Zmierzyć aktywność lucyferazy zgodnie z opisem w krokach 1.3.6–1.3.7.
    6. Znormalizować sygnał luminescencji z każdego dołka do odpowiadającej mu wartości żywotności komórek. Wynik znormalizowany wyrazić w stosunku do grupy kontrolnej negatywnej.
    7. Wykluczyć z interpretacji aktywności raportującego STAT6 związki, które obniżają żywotność komórek poniżej 80%.
      UWAGA: Sygnały raportujące otrzymane w warunkach cytotoksycznych należy uznać za niewiarygodne, ponieważ obniżona żywotność komórek może zmieniać luminescencję niezależnie od aktywności szlaku STAT6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby określić optymalne stężenie puromycyny do selekcji stabilnej, komórki rodzicielskie 16HBE14o− poddano działaniu zwiększających się stężeń puromycyny (0,5–4 µg/mL), a żywotność komórek oceniano po 24, 48 i 72 h za pomocą testu żywotności komórek. Puromycyna obniżała żywotność komórek w sposób zależny od dawki i czasu, przy czym wszystkie stężenia zredukowały żywotność poniżej 20% po 48–72 h (Rycina 3). Stężenie 1 µg/mL było najniższym stężeniem, które całkowicie wyeliminowało k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szlaki sygnalizacyjne IL-4/IL-13–JAK–STAT6 stanowią nie tylko istotny cel terapeutyczny, ale są również kluczowym czynnikiem patogenezy chorób alergicznych, w tym astmy oraz alergicznego nieżytu nosa22. Niniejszy protokół opisuje prosty, stabilny test reporterowy oparty na linii komórkowej, służący do identyfikacji modulatorów aktywności STAT6. Test ten może być stosowany do oceny efektów modulujących STAT6 przez szeroką gamę związków środowiskowych i jest łatwo adaptowalny do wysokoprzepustowych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Narodową Radę Badawczą Tajlandii (NRCT) (Grant nr N42A680388), a projekt badawczy jest wspierany przez Uniwersytet Mahidola (Strategiczny Fundusz Badawczy: 2025) (Grant nr 35). Rysunki 1 i 2 zostały stworzone przy użyciu BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyny-EDTAGibco25200072Odczyn do dysocjacji komórek
probówka stożkowa do wirowania o pojemności 15 mlCorningCLS430791Sterylna polipropylenowa probówka do wirowania
16HBE14o- linia komórek nabłonka oskrzeli człowiekaPrezent od dr Nawiyi Huipao (Prince of Songkla University, Tajlandia) oraz prof. dr. Dietera C. Gruenerta (University of California San Francisco, USA)RRID:CVCL_0112Linia komórkowa nabłonka oskrzeli człowieka (pasaże 35–40); potwierdzono brak zakażenia mycoplasma, a komórki zachowują morfologię zróżnicowanego nabłonka dróg oddechowych oraz właściwości barierowe. Literatura: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
przezroczysta płytka 24-dołkowa z płaskim dnem, traktowana do hodowli tkanekCorning3527Płytka do hodowli komórkowych
przezroczysta płytka 6-dołkowa z płaskim dnem, traktowana do hodowli tkanekCorning3516Płytka do hodowli komórkowej
przezroczysta 96-dołkowa polistyrenowa mikropłytka o płaskim dnie, modyfikowana do hodowli tkanekCorning3599Płytka do testu żywotności komórek
biała 96-dołkowa polistyrenowa mikropłytka do hodowli tkankowych z przezroczystym dnemCorning3610Płytka do analiz luminescencyjnych
AC-4-130 (inhibitor STAT5)MedChemExpressHY-124500Selektywny inhibitor STAT5
AS1517499 (inhibitor STAT6)MedChemExpressHY-100614Selektywny inhibitor STAT6
Benzo[b]fluorantenAccuStandardH-128NWielopierścieniowy węglowodór aromatyczny
Dygestorium biologiczne, klasa IINuaireNU-543-400EDo procedur aseptycznej hodowli komórkowej
Chlorek kadmu (CdCl2)Sigma202908Związek metalu ciężkiego
zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301Test żywotności komórek
Kolba do hodowli komórkowych, 25 cm² (T-25)Corning430639Kolba do hodowli tkankowych
CO2 inkubatorNuaireNU-5710EUtrzymywano w 37 °C, 5% CO22, uwilgotniona atmosfera
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650Rozpuszczalnik (stężenie końcowe 0,1%) i krioprotektant (10%)
Płytkowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF7524Suplement do pożywki (10%) i pożywka do kriokonserwacji (10%)
Komora licznikowa (hemocytometr)BOECOBOE14Ręczne zliczanie komórek
Odwrócony mikroskop świetlny z kontrastem fazowymZEISSPrimovertObserwacja morfologii komórek
System analizy lucyferazy (jednoetapowy)BPS Bioscience60690Test reporterowy z użyciem lucyferazy
Chlorek rtęci (HgCl2)Sigma215465Związek metalu ciężkiego
Czytnik mikropłytekBioTekSynergy Neo2Wielomodułowy czytnik płytek mikrotytrażowych/luminometr sterowany oprogramowaniem Gen5 (v3.08.01). Absorbancję mierzono przy 450 nm z referencją przy 650 nm po 15–20 s wstrząsania liniowego. Luminescencję zmierzono w trybie końcowym (endpoint), stosując wzmocnienie detektora 120 po 20 s wstrząsania liniowego.
podstawowa pożywka Eagle (MEM)Gibco11095-080Podstawowa pożywka hodowlana
Siarczan niklu (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203Związek metali ciężkich
Pył zawieszony (PM)Krajowy Instytut Standardów i TechnologiiSRM 2975Standardowy materiał odniesienia dla pyłów zawieszonych
penicylina-streptomycyna (100×)Gibco15140122Suplement antybiotykowy (stężenie końcowe 1%)
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)Gibco18912014Bufor piorący
PolybreneSigmaTR-1003-GWzmacniacz transdukcji lentiwirusowej
PuromycynaMedChemExpressHY-B1743AAntybiotyk do selekcji stabilnych linii komórkowych
Rekombinowana ludzka IL-13Thermo Fisher ScientificA42526Cytokina do stymulacji
Rekombinowana ludzka IL-4Thermo Fisher ScientificA42602Cytokina do stymulacji
lentiwirus z reporterem lucyferazowym STAT6BPS Bioscience78799Konstrukt reporterowy lentiwirusowy; miano zapasu 5 × 107 TU/ml
Stattic (inhibitor STAT3)MedChemExpressHY-13818Selektywny inhibitor STAT3

Bibliografia

  1. Organisation for Economic Co-operation and Development. The Economic Consequences of Outdoor Air Pollution. OECD Publishing; Paris; 2016.
  2. Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
  3. Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
  4. State of Global Air. Trends in Air Quality and Health Impacts: Insights from Central, South, and Southeast Asia. 2025. Available at: https://www.stateofglobalair.org/
  5. Shi X. Acute effects of air pollution on human health in China: Evidence and prospects. China CDC Wkly. 2021;3(45):941-942.
  6. Tsai YG, et al. Long-term PM2.5 exposure impairs lung growth and increases airway inflammation in Taiwanese school children. ERJ Open Res. 2025;11(4).
  7. Walford HH, Doherty TA. STAT6 and lung inflammation. JAKSTAT. 2013;2(4):e25301.
  8. Moonwiriyakit A, et al. GPR120/FFAR4 stimulation attenuates airway remodeling and suppresses IL-4- and IL-13-induced airway epithelial injury via inhibition of STAT6 and Akt. Biomed Pharmacother. 2023;168:115774.
  9. Pelaia C, et al. Biological therapy of severe asthma with dupilumab, a dual receptor antagonist of interleukins 4 and 13. Vaccines (Basel). 2022;10(6).
  10. Yang Y, et al. Continuous exposure to PM2.5 exacerbates ovalbumin-induced asthma in mouse lung via the JAK-STAT6 signaling pathway. Adv Clin Exp Med. 2020;29(7):825-832.
  11. Li X, Huang L, Wang N, Yi H, Wang H. Sulfur dioxide exposure enhances Th2 inflammatory responses via activation of the STAT6 pathway in asthmatic mice. Toxicol Lett. 2018;285:43-50.
  12. Reiss R, et al. Evidence of health impacts of sulfate- and nitrate-containing particles in ambient air. Inhal Toxicol. 2007;19(5):419-449.
  13. Li R, et al. Key toxic components and sources affecting oxidative potential of atmospheric particulate matter using interpretable machine learning: Insights from fog episodes. J Hazard Mater. 2024;465:133175.
  14. Posimo JM, et al. Viability assays for cells in culture. J Vis Exp. 2014;(83):e50645.
  15. Baumlin-Schmid N, Salathe M, Fregien NL. Optimal lentivirus production and cell culture conditions necessary to successfully transduce primary human bronchial epithelial cells. J Vis Exp. 2016;(113).
  16. Nozeret K, Pernin A, Buddelmeijer N. Click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein N-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening. J Vis Exp. 2020;(159).
  17. Rolling C, Treton D, Pellegrini S, Galanaud P, Richard Y. IL-4 and IL-13 receptors share the γc chain and activate STAT6, STAT3, and STAT5 proteins in normal human B cells. FEBS Lett. 1996;393(1):53-56.
  18. Deimel LP, Li Z, Roy S, Ranasinghe C. STAT3 determines IL-4 signalling outcomes in naïve T cells. Sci Rep. 2021;11(1):10495.
  19. Wingelhofer B, et al. Pharmacologic inhibition of STAT5 in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2018;32(5):1135-1146.
  20. McMurray JS. A new small-molecule STAT3 inhibitor. Chem Biol. 2006;13(11):1123-1124.
  21. Chiba Y, Todoroki M, Nishida Y, Tanabe M, Misawa M. A novel STAT6 inhibitor, AS1517499, ameliorates antigen-induced bronchial hypercontractility in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;41(5):516-524.
  22. Zhang X, et al. The immunogenetic landscape of allergic rhinitis: From cellular effectors to gene regulation and targeted therapies. Int J Biol Sci. 2026;22(3):1322-1345.
  23. Yu H, Li Q, Kolosov VP, Perelman JM, Zhou X. Interleukin-13 induces mucin 5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells. Cell Commun Adhes. 2010;17(4-6):83-92.
  24. White SR, Martin LD, Stern R, Laxman B, Marroquin BA. Expression of IL-4/IL-13 receptors in differentiating human airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(5):L681-L693.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

komórki nabłonka dróg oddechowychsygnalizacja STAT6reporter lucyferazowystymulacja IL-4stymulacja IL-13analiza czynnika Z'transdukcja lentiwirusowa

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.