Artykuł metodologiczny

Przygotowanie białka błonowego–funkcjonalizowanego polimeru oraz dużych i olbrzymich unilamellarnych pęcherzyków polimerowych/lipidowych

DOI:

10.3791/71699

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Process Systems Engineering, Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems, 2Max Planck School Matter to Life, 3Process Systems Engineering, Otto von Guericke University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje rekonstytucję z otoczenia detergentowego białka błonowego, cytochromu bo3 ubichinol oksydazy, do dużych unilamelarnych wezykuł zrobionych z PDMS-g-PEO i ich konwersję do gigantycznych wezykuł poprzez fuzję–elektroformację. Powstałe funkcjonalne przegrody oparte na polimerach są odpowiednie dla zaawansowanych badań biochemicznych i biofizycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wezykle utworzone z amfifilowych kopolimerów, samodzielnie lub zmieszane z fosfolipidami, oferują lepszą stabilność mechaniczną i chemiczną w porównaniu do konwencjonalnych wezykulipidowych. Czyni to je atrakcyjnym podwoziem, które można dalej rozwijać i rozszerzać, aby umożliwić konkretne zastosowania, takie jak dostarczanie leków, diagnostyczne bioczujniki, budowanie sztucznych komórek oraz bioinspirowane mikro- i nanoreaktory. W szczególności funkcjonalizacja poprzez włączenie białka błonowego jest niezbędna dla wielu z tych zastosowań. Przedstawiamy protokół przygotowywania białko-błonowych funkcjonalnych dużych jednobłonkowych wezykułów (LUVs) z kopolimeru przyszczepowego PDMS-g-PEO za pomocą rekonstytucji z mediatorem detergentowym. Ponadto opisujemy, jak te duże wezyki mogą być przekształcane w gigantyczne jednobłonkowe wezyki (GUVs) przy użyciu podejścia fuzyjno-elektroformacyjnego. Protokół obejmuje fluorescencyjne oznakowanie białek błonowych, przygotowanie polimerowych i hybrydowych LUVs, rekonstytucję białka błonowego, analizę rozkładu wielkości za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), ocenę aktywności białka za pomocą pomiarów zużycia tlenu, przygotowanie funkcjonalnych białkowo GUVs oraz analizę wstawiania białka i aktywności pompowania protonów w GUVs za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wyniki reprezentatywne demonstrują tworzenie monodyspersyjnych proteo-LUVs o indeksie polidyspersyjności (PDI) poniżej 0,2 oraz pomyślne generowanie proteo-GUVs o średnicach od 5 do 35 µm. Aktywność białka potwierdzona jest pomiarami zużycia tlenu zarówno w polimerowych LUVs (18,2 nmol/min/mL), jak i hybrydowych LUVs (26,9 nmol/min/mL). Wstawianie białka do GUVs jest mierzone za pomocą intensywności fluorescencji, z wynikiem 20,6 ± 3,7 a.u. dla polimerowych GUVs i 26,2 ± 5,0 a.u. dla hybrydowych GUVs. Aktywność pompowania protonów w GUVs, monitorowana za pomocą uwięzionego pH-czułego barwnika, jest zgodna z funkcjonalnością białka, przy czym przeważa pompowanie protonów do wewnątrz. Mechaniczna miękkość kopolimeru i lipidowa grubość dwuwarstwy (~5,3 nm) wspierają efektywne wstawianie białka i zachowanie jego funkcjonalności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kopolimery blokowe amfifilne mogą samoistnie łączyć się w roztworze wodnym w membrany, które spontanicznie krzywią się i zamykają na siebie, tworząc sferyczne, otoczone membranami przedziały zwane polimerozomami (polimerowymi pęcherzykami). W porównaniu z membranami lipidowymi, przedziały na bazie polimerów oferują większą chemiczną wszechstronność i zwiększoną stabilność chemiczną1 i mechaniczną2, co sprawia, że są bardzo atrakcyjne w zastosowaniach takich jak dostarczanie leków, nano- i mikreaktory oraz budowa trwałych sztucznych komórek. Zarówno nasza grupa, jak i inne, funkcjonalizowali membrany polimerowe poprzez wstawienie białek membranowych, aby stworzyć sztuczne organelle i komórki1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Polimery zawierające hydrofobowy rdzeń poli(dimetyloksylan) (PDMS) są szczególnie dobrze przystosowane do wbudowywania białek membranowych ze względu na wysoką elastyczność łańcucha i możliwość dostosowania hydrofobowej grubości membrany, aby lepiej dopasować się do domeny transbłonowej białka5. Podczas gdy nasze laboratorium koncentrowało się głównie na skopolimerze szczepionym poli(dimetyloksylan)-szczepiony-poli(tlenek etylenu) (PDMS-g-PEO), który tworzy wysoce dynamiczne membrany4,16,17, które są bardziej miękkie niż konwencjonalne dwuwarstwowce lipidowe i mają grubość około 5,3 nm1, inne grupy z powodzeniem stosowały skopolimery na bazie PDMS, takie jak PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA5,6,7,8,9,10,11 oraz PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz12 do rekonstytucji białek membranowych. Nawet stosunkowo sztywne skopolimery dwuwarstwowowe, takie jak PBD-b-PEO, szczególnie w systemach hybrydowych zmieszanych z lipidami, zostały wykorzystane do pomyślnej inkorporacji białek13. Te przykłady podkreślają wszechstronność membran na bazie polimerów jako platform rekonstytucyjnych, które mogą dodatkowo zapewnić zwiększoną stabilność chemiczną1 i wydłużony czas działania funkcjonalnego14 dla wkomponowanych białek membranowych. Chociaż hybrydowe membrany polimer/lipid nie zawsze mogą odpowiadać stabilności chemicznej czystych systemów polimerowych1, oferują atrakcyjny kompromis poprzez łączenie mechanicznej wytrzymałości polimerów z biologiczną istotnością lipidów. Prowadzi to do otoczenia membranowego, które bardziej naśladuje rodzime membrany biologiczne, zachowując jednocześnie kluczowe zalety materiałów syntetycznych. Takie hybrydowe architektury mogą oferować dodatkowe zalety, w tym zmniejszoną przenikalność dla protonów wynikającą z nanoskalowych przekształceń1 i formowanie domen wewnątrz membrany15.

Istnieje kilka technik rekonstytucji białek membranowych w nanoskalowych pęcherzykach (LUV), w tym rekonstytucja z otoczenia organicznego (np. odwrotna faza parowania, nawadnianie warstw lipid-białko), podejścia mechaniczne (np. sonikowanie, prasa francuska, mrożenie i rozmrażanie) oraz rekonstytucja z użyciem detergentów (poprzez usunięcie detergentu, rozcieńczenie lub bezpośrednie wkomponowanie)18, a także nowsze strategie, takie jak bezpośredni transfer z nanodysków kopolimeru styrenu i kwasu maleinowego19. Podczas gdy poriny zostały pomyślnie wkomponowano w polimerowe LUV poprzez bezpośrednie wstawienie, na przykład poprzez dodanie białka do warstwy polimerowej podczas nawadniania8. To podejście ogólnie prowadzi do niskiej wydajności wkomponowania dla większych lub bardziej złożonych białek membranowych i często prowadzi do losowej orientacji białka. W związku z tym rekonstytucja z użyciem detergentu, która polega na kontrolowanym dodaniu detergentu z następującym usunięciem, pozostaje najczęściej stosowaną metodą. Jest to również preferowana strategia wkomponowania większych białek membranowych w polimerowe LUV, szczególnie dla białek asymetrycznych, w których kontrolowana orientacja jest kluczowa dla funkcji. W tym podejściu membrany pęcherzyków są najpierw nasycone wybranym detergentem (koncentracja detergentu nasycającego oznaczana jest jako Rsat), częściowo solenizujące się (współistnienie pęcherzyków i miceli) lub całkowicie solenizujące, czyli rozkładające na micele (koncentracja detergentu oznaczana jest jako R<

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie niebezpieczne odpady chemiczne powstałe podczas tego protokołu muszą być usuwane zgodnie z instytucjonalnymi i lokalnymi przepisami.

1. Przygotowanie do Bio-Beads SM-2

UWAGA: Bio-Beads SM-2 są wstępnie płukane metanolem w celu usunięcia substancji konserwujących i zanieczyszczeń organicznych przed adsorpcją detergentu.

  1. Umieść papier filtracyjny w lejku szklanym umieszczonym nad czystym szklanym kubeczkiem lub kolbą.
  2. Dodaj co najmniej 600 mg Bio-Beads SM-2 do lejka (wystarczająco na 3 powtórzenia rekonstytucji zarówno dla hybrydowych, jak i polimerowych LUVs).
    UWAGA: Wymagana jest minimalna ilość 90 mg Bio-Beads SM-2 na jedną rekonstytucję, zgodnie z krokami 4.4.1. Można przygotować większą ilość, jeśli planuje się więcej rekonstytucji.
  3. Przepłucz kulki trzy razy czystym metanolu, używając wystarczającej objętości, aby całkowicie zanurzyć kulki za każdym razem.
    UWAGA: Przeprowadzaj wszystkie czynności związane z obsługą metanolu w kapturze chemicznym.
  4. Natychmiast przepłucz kulki trzy razy wodą Milli-Q, aby usunąć resztki metanolu.
    UWAGA: Nie pozwól, aby kulki wyschły podczas procedury płukania. Podczas usuwania roztworów płukających upewnij się, że kulki pozostają wilgotne i nie są całkowicie suche.
  5. Przenieś przepłukane kulki do odpowiedniego pojemnika do przechowywania (np. sterylnego 50 mL polipropylenowego kuboczka do wirowania lub szklanki z szczelnie zamkniętą pokrywką), dodaj wodę Milli-Q, aż kulki będą całkowicie zanurzone, i przechowuj w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 miesiące.

2. Fluorescencyjne znakowanie białek błonowych

  1. Rozcieńczenie białka
    1. Rozpuść cytochrom bo3 oksydazę do stężenia 2,2 mg/mL w buforze HEPES 20 mM zawierającym 0,05% n-dodecyl-α-D-maltozydu (DDM) (w/v), pH 8,3. To pH zapewnia wystarczającą frakcję nieprotonowanych (reaktywnych) pierwotnych amin dla efektywnego znakowań.
      ​UWAGA: W przypadku optymalnego znakowań za pomocą barwników ATTO N-hydroksysuccynimidylowych (NHS), utrzymuj pH buforu w zakresie 8,3–8,5. W przypadku innych barwników postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi koniugacji białek, w tym zalecanych warunków znakowań.
  2. Dodanie barwnika
    1. Dodaj ośmiokrotny nadmiar molowy aktywnego wobec amin ATTO 643 N-hydroksysuccynimidylowego (NHS) estru, rozpuszczonego w stężeniu 2 mg/mL w bezvodnym DMSO, do roztworu białka.
      ​UWAGA: W przypadku innych barwników postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi koniugacji białek, w tym zalecanych nadmiaru molowego barwnika w stosunku do białka.
    2. Delikatnie wymieszaj stukając trzykrotnie w kubeczku mikrowirówkowym, aby zapewnić jednorodne rozproszenie barwnika.
  3. Inkubacja
    1. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 1,5 h w łagodnym agitowaniu (250 obr./min) w termomikserze, w ciemności, aby zapobiec fotobledzeniu.
  4. Usuwanie niezwiązanego barwnika
    1. Równoważ Superdex 200 10/300 GL kolumny (CV: 23,562 mL) co najmniej 2 objętościami kolumny (około 48 mL) buforu elucji białka błonowego (20 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,05% DDM (w/v)) przy przepływie 0,3 mL/min za pomocą systemu czyszczenia ÄKTA.
      UWAGA: W przypadku usuwania nadmiaru fluorescencyjnego barwnika, krótsze kolumny żelowe (10–20 cm długości łożyska) są ogólnie wystarczające, szczególnie dla mniej hydrofilowych barwników. Producent barwnika zaleca desalinowanie za pomocą matrycy Sephadex G-25. W niniejszym badaniu użyto kolumny Superdex 200 10/300 GL ze względu na dostępność urządzenia.
    2. Wprowadź do 500 μL oznakowanego białka za pomocą 1 mL pętli kapilarnej i eluj z tym samym buforem przy 0,3 mL/min.
    3. Monitoruj elucję, mierząc absorpcję przy 280 nm dla białka i 643 nm dla barwnika ATTO 643.
    4. Zbieraj frakcje 0,5 mL przez 1,5 objętości kolumny. Zidentyfikuj frakcje zawierające zarówno białko, jak i barwnik. Użyj bezpośrednio, jeśli są wystarczająco skoncentrowane, lub skoncentruj za pomocą jednostek filtracyjnych Amicon. W przypadku koncentracji za pomocą filtrów Amicon, użyj filtra wirującego o granicy cięcia 30 kDa i wiruj w temperaturze 4 °C przez 30 min przy 14 000 × g.
  5. Wyznaczanie stężenia białka i stopnia znakowań (DOL)
    1. Zmierzyć widma absorpcji oczyszczonego koniugatu.
    2. Oblicz stężenie bi

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oksydazę cytochromu bo3 z E. coli wyrażano z plazmidu pETcyo w szczepie E. coli C43 (DE3) ΔcyoABCDE i oczyszczano zgodnie z wcześniejszym opisem29. Oczyszczoną oksydazę bo3 stosowano bezpośrednio do rekonstytucji i pomiarów aktywności lub oznaczano fluoroforami, takimi jak ATTO 643 (niniejsze badanie) lub innymi fluoroforami ATTO1,15. W przypadku bardzo hydrofilowych fluoroforów, takich jak ATTO 643, zastosowano kolumnę o długości 30 cm w celu osiągnięcia efektywnej separacji niezwiązanego fluoroforu z oznaczonym białkiem (Rysunek 3A). Stopień oznaczenia (DOL), obliczony na podstawie widm absorpcji, zazwyczaj wynosił od 1,1 do 1,3 cząsteczek fluoroforu na enzym, w zależności od stosowanego fluoroforu ATTO. W przypadku oksydazy bo3 oznaczonej ATTO 643, DOL wynosił 1,16 (Rysunek 3B).

Do rekonstytucji białka LUV-y przygotowywano najpierw metodą nawadniania cienkowarstwowego, a następnie cyklami zamrażania-odmrażania i wyciskaniem, aby uzyskać jednorodne rozmiary pęcherzyków. W przypadku polimerosomów bufor nawadniający uzupełniano detergentem. Rozkłady wielkości pęcherzyków analizowano za pomocą dynamicznego rozpraszania światła przed rekonstytucją (Rysunek 4, Tabela 2). Zarówno hybrydowe jak i polimerowe LUV-y charakteryzowały się przeciętnymi średnicami 85–95 nm z wąskim rozkładem wielkości (PDI < 0,2). Oczekuje się, że pęcherzyki na bazie PDMS-g-PEO będą nieco mniejsze niż średnica porów membrany wyciskającej. Typowe polimerosomy wykazywały bardzo jednorodne rozmiary, z wartościami PDI poniżej 0,1, podczas gdy hybrydowe pęcherzyki tworzyły dość jednorodne populacje o wartościach PDI okazjonalnie powyżej 0,1, ale zawsze poniżej 0,2.

Białko błonowe oksydaza bo3 zostało następnie wprowadzone do LUV-ów w obecności detergentu (w tym badaniu cholan sodu). Detergent następnie usuwano za pomocą kul Bio-Beads. Po rekonstytucji rozmiar polimerosomów zwiększył się nieznacznie (Rysunek 4A), podczas gdy rozmiar hybrydowych pęcherzyków pozostał niezmieniony (Rysunek 4B). W obu układach zaobserwowano niewielką zmianę PDI (Tabela 2). Takie niewielkie zmiany wielkości są oczekiwane, ponieważ solubilizacja i usuwanie za pośrednictwem detergentu mogą reorganizować łańcuchy polimerowe w błonie. Aktywność białka oceniano poprzez pomiar zużycia tlenu, co wskazuje, czy białko zachowało funkcjonalną aktywność (Rysunek 5A). Brak zużycia tlenu w kontroli ujemnej LUV-ów wolnych od białka potwierdza, że obserwowany sygnał pochodzi specyficznie od aktywności oksydazy bo3. Przy rekonstytucji z zastosowaniem cholanatu sodu w stężeniach stosowanych tutaj, aktywność białka była zazwyczaj nieznacznie wyższa w hybrydowych pęcherzykach niż w polimerosomach (Rysunek 5B). Pewną zmienność aktywności białka obserwowano między partiami czyszczenia, a nawet między frakcjami w obrębie tej samej partii. Dlatego w badaniach porównawczych – takich jak porównywanie aktywności białka w różnych układach błonowych – należy stosować tę samą frakcję oczyszczonego białka, aby zapewnić spójność.

Aby wygenerować funkcjonalne białkowo PDMS-g-PEO i PDMS-g-PEO/soy PC GUV-y, zastosowano podejście fuzja-elektroformacja. W tej metodzie proteo-LUV-y mieszano z LUV-ami wolnymi od białka i nakładano na szklanych slajdów pokrytych ITO, po czym przeprowadzano częściowe odwodnienie, aby wspomóc fuzję pęcherzyków i utworzenie warstwy polimeru/białka lub polimeru/lipidu/białka. Niewystarczające odwodnienie prowadziło do niskiego wydajności GUV-ów, mniejszego rozmiaru GUV-ów i obecności niezfuzowanego (proteo-)LUV-ów.

Pomyślne włączenie oznaczonego białka, oksydazy bo3-ATTO 643, do błony potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej po sedymentacji GUV-ów w stężonym gradientzie składającym się z sacharozy i glukozy (Rysunek 6A, B). Określanie fluorescencyjności związanej z błoną za pomocą prostej linii profilu może być stronnicze, ponieważ mierzona intensywność zależy od kąta, pod jakim narysowano linię. Aby zminimalizować ten efekt, intensywność fluorescencyjności oceniano za pomocą wielokąta narysowanego wzdłuż całej kontury błony każdego GUV-u.

Aby ocenić możliwe korelacje między wielkością pęcherzyka a włączeniem białka, analizowano średnicę GUV-ów równolegle (Rysunek 6C, D).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polimerosomy i hybrydowe pęcherzyki polimer/lipid wykazują zwiększoną stabilność chemiczną i mechaniczną w porównaniu z konwencjonalnymi pęcherzykami lipidowymi, co sprawia, że są bardzo atrakcyjne w zastosowaniach, począwszy od dostarczania leków i biosensorystyki, aż po nano- i mikroreaktory oraz sztuczne komórki. Jednak ich charakterystyczna architektura błony i właściwości biofizyczne często uniemożliwiają bezpośrednie przeniesienie protokołów zoptymalizowanych dla pęcherzyków lipidowych do systemów opartych na polimerach15,20,30. Prezentowany tutaj protokół uwzględnia te różnice i zapewnia zoptymalizowany przepływ pracy do rekonstytucji białek błonowych w polimerowych i hybrydowych LUV opartych na PDMS-g-PEO, poprzedzone skalowaniem do GUV poprzez fuzję-elektroformację.

Kluczowym etapem protokołu jest przygotowanie LUV o wąskim i powtarzalnym rozkładzie wielkości. Podobnie jak w przypadku warstw lipidowych, warstwy PDMS-g-PEO samoistnie układają się w pęcherzyki po nawodnieniu buforem wodnym. W przeciwieństwie do systemów lipidowych, które często dają mieszaninę pęcherzyków jednowarstwowych i wielowarstwowych, PDMS-g-PEO preferencyjnie tworzy struktury jednowarstwowe1, eliminując konieczność cykli zamrażania i rozmrażania, zwykle stosowanych w celu zmniejszenia wielowarstwowości w preparatach lipidowych. Ekstruzja jest przeprowadzana w celu standaryzacji rozkładu wielkości pęcherzyków. Ze względu na zwiększoną miękkość membran PDMS-g-PEO w porównaniu z dwuwarstwowami lipidowymi1, wystarczające są niższe ciśnienia ekstruzji. Chociaż zalecane przez producenta 11 przejść ekstruzji jest generalnie wystarczające, zwiększenie liczby przejść zazwyczaj prowadzi do węższego rozkładu wielkości i lepszej powtarzalności. Jednak nadmierna ekstruzja może produkować pęcherzyki nieco mniejsze niż nominalny rozmiar porów membrany. Powtarzana ekstruzja może również zmniejszać wydajność pęcherzyków z powodu utraty materiału; wcześniej stwierdziliśmy, że około 31% materiału PDMS-g-PEO i 25% PDMS-g-PEO/soy PC utraciło się po 21 przejściach przez membranę 100 nm1. Dlatego liczbę przejść ekstruzji należy zoptymalizować, aby zrównoważyć jednorodność wielkości z integralnością i wydajnością pęcherzyków.

Rekonstytucja z użyciem detergentu jest kolejnym kluczowymi czynnikiem sukcesu. Optymalny rodzaj i stężenie detergentu zależy zarówno od konkretnego białka błonowego, jak i składu błony3,20. W przypadku czystych polimerowych membran, gdy warunki nasycenia są optymalne, włączenie detergentu podczas nawadniania warstw daje wyższą efektywność wstawiania niż nasycanie wstępnie uformowanych pęcherzyków. Bardziej sztywne polimerowe membrany, takie jak te utworzone z PBD-b-PEO, wymagają znacznie wyższych stężeń detergentu do solubilizacji membrany30, co podkreśla potrzebę optymalizacji specyficznej dla polimeru. Sukces wstawiania powinien być zweryfikowany nie tylko poprzez pomiary aktywności – w porównaniu z micelami detergentu lub pęcherzykami lipidowymi – ale także poprzez analizę strukturalną, taką jak krio-TEM, aby ocenić głębokość wstawiania i adaptację błony do wadliwego dopasowania hydrofobowości1. Orientacja białka jest równie krytyczna, szczególnie dla pomp protonowych, ponieważ funkcjonalny gradient protonów wymaga, aby większość pomp była jednolicie zorientowana. Idealnie, pompy powinny transportować protony do środka, aby umożliwić sprzężenie z procesami zużywającymi gradient, takimi jak synteza ATP3,15. Orientację można ocenić za pomocą znaków białkowych, na przykład poprzez selektywne gaszenie barwników narażonych na zewnętrzną stronę pęcherzyka lub przez przemieszczanie fluorescencyjnych znaków przymocowanych do tagów His20. Te podejścia są przedstawiane jako ogólne zalecenia dotyczące optymalizacji protokołu i nie zostały zastosowane w niniejszym badaniu.

Skalowanie od proteo-LUV do proteo-GUV za pomocą fuzji-elektroformacji wymaga starannej kontroli parametrów depozycji i odwadniania. Stężenie LUV i wielkość kropel krytycznie wpływają na końcową wydajność i czystość GUV. Zbyt wysokie stężenia LUV (≥10 mg/mL) mogą prowadzić do pozostania niezfuzowanych LUV w końcowej próbce, podczas gdy zbyt niskie stężenia (<5 mg/mL) zmniejszają wydajność GUV z powodu niewystarczającej zdeponowanej ilości materiału. Odwadnianie musi być częściowe, a nie całkowite – co jest wskazane przez pojawienie się białego pierścienia na obwodzie kropli zamiast całkowicie białej kropli – ponieważ nadmierne odwadnianie może upośledzić lub całkowicie zniszczyć aktywność białka błonowego, szczególnie w przypadku pomp protonowych. Stąd kontrolowana wilgotność i temperatura są niezbędne, aby odpowiednio destabilizować membrany na potrzeby fuzji, zachowując jednocześnie funkcjonalność

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to przeprowadzono w ramach Max Planck School Matter to Life, wspierane przez Fundację Dieter Schwarz we współpracy z Towarzystwem Maxa Plancka. Jesteśmy wdzięczni Claudii Bednarz za izolację i oczyszczenie cytochromu bo3 oksydazy oraz Anne Christin Weinrich za pomoc w przygotowaniu wezykuł i mikroskopii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ÄKTA pure™ chromatography systemCytiva29018224
18:1 Liss Rhod PEAvanti Research810150
8 well chambered coverglassCellvisC8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal FiltersSigma AldrichUFC5030
ATTO 643 NHS esterATTO-TECAD 643-31
Bio-Beads SM-2Bio-Rad1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)Serva361-09-1
Coenzyme Q1TargetMolTGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5Leica Microsystems603810
DTT (Dithiothreitol)Merck10197777001
Fine Tip Ultra Micro PastettePastetteLW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt) Sigma Aldrich6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)pgoCEC020S
LAS X softwareLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360LMS24572
Mini-extruderAvanti Research610000
Oxytherm+P systemHansatech Instruments/
Plasma cleaner (benchtop)Harrick PlasmaPDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μmAvanti Research610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)Grace Bio-Labs 41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)laboratory-made, cut from silicone sheet
Soy PC (95%)Avanti Research441601
Specord 50 PLUS spectrophotometerAnalytik Jena823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)Cytiva28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)IKA Lab Dancer3365000
Thermomixer comfort 5355Eppendorf5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)Dow Corning000000000004109892
Zetasizer Nano ZS Malvern PanalyticalZEN3600

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

BiochemiaWydanie 234Wydanie 234polimersomyhybrydowe p cherzyki polimerowo lipidowePDMS g PEOdu e jednowarstwowe p cherzyki LUVsgigantyczne jednowarstwowe p cherzyki GUVsrekonstytucja bia ek b onowychelektroformowanie
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły