Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie pionowo ułożonego urządzenia organ-na-chip kompleksu zębinowo-miazgowego z wykorzystaniem ludzkiego krążka zębinowego

110 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71713

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano sposób wykonania i montażu urządzenia organ-on-a-chip z pionowo ułożonym kompleksem miazga-zębina, zawierającego ludzki krążek zębiny oraz mikrokanały wykonane metodą fotolitografii, a następnie zasiewanie i hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba.

Streszczenie

Konwencjonalne modele przedkliniczne stosowane w badaniach stomatologicznych, w tym modele zwierzęce i statyczne hodowle komórkowe, wykazują istotne ograniczenia w odtwarzaniu warunków fizjologicznych granicy między zębiną a miazgą oraz w przewidywaniu biologicznych odpowiedzi organizmu człowieka na biomateriały stomatologiczne. Technologia organ-on-a-chip (OoC) stanowi alternatywne podejście, umożliwiając odtworzenie specyficznych dla tkanki mikrośrodowisk w kontrolowanych systemach mikroprzepływowych. Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania i montażu urządzenia OoC kompleksu zębina-miazga, zawierającego ludzki dysk zębiny w trzywarstwowej mikroprzepływowej platformie z polidimetylosiloksanu (PDMS). Protokół obejmuje przygotowanie dysku zębiny, wykonanie mikrostrukturalnych form z zastosowaniem fotolitografii, odlewanie i utwardzanie PDMS, łączenie warstw wspomagane plazmą, montaż urządzenia, testy szczelności oraz wysiew mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba w warunkach hodowli statycznej. Omówiono krytyczne parametry wytwarzania wpływające na działanie urządzenia, w tym kontrolę grubości warstwy PDMS, plazmową obróbkę powierzchni oraz integrację dysku zębiny wewnątrz urządzenia w celu zminimalizowania wycieków. Adhezję i żywotność komórek wewnątrz urządzenia oceniono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej oraz konfokalnego barwienia żywe/martwe. Reprezentatywne wyniki wykazują udaną integrację dysku zębiny w obrębie układu mikroprzepływowego, utrzymanie szczelności oraz adhezję żywotnych komórek macierzystych miazgi zęba do powierzchni zębiny. Przedstawiony protokół zapewnia powtarzalną metodę wytwarzania platformy OoC kompleksu zębina-miazga, która może wspierać przyszłe badania nad odpowiedziami komórkowymi na biomateriały stomatologiczne i bodźce mikrośrodowiskowe.

Wprowadzenie

Eksperymenty na zwierzętach od dawna odgrywają kluczową rolę w pogłębianiu wiedzy na temat procesów patologicznych i fizjologicznych oraz stanowią centralny element wczesnych etapów opracowywania leków1. W ciągu XX wieku średnia długość życia ludzi znacznie wzrosła i choć nie można precyzyjnie określić, w jakim stopniu poprawa ta wynika wyłącznie z badań na zwierzętach, powszechnie uznaje się, że wiele współczesnych metod leczenia zostało opracowanych lub zweryfikowanych z wykorzystaniem modeli zwierzęcych2. Godnymi uwagi przykładami są opracowanie szczepionek przeciwko poliomyelitis, odrze i wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, ocena bezpieczeństwa i skuteczności penicyliny oraz produkcja insuliny. W dziedzinie badań nad materiałami stomatologicznymi i biomateriałami modele te miały krytyczne znaczenie dla badania procesu próchnicy, biologii i regeneracji kompleksu zębinowo-miazgowego oraz fizjopatologii tkaneky periodontalnych3,4.

Mimo szerokiego zastosowania tych metodologii, obecny proces opracowywania leków nadal wykazuje wysoki odsetek niepowodzeń, przy czym wiele kandydatów na leki zawodzi podczas badań klinicznych, mimo wykazania skuteczności i bezpieczeństwa w przedklinicznych warunkach laboratoryjnych oraz w modelach zwierzęcych5. Rozbieżność ta wiąże się z różnicami międzygatunkowymi, które mogą ograniczać przewidywalność translacyjną modeli zwierzęcych ze względu na różnice anatomiczne, genetyczne i fizjologiczne między gatunkami6. Ponadto opracowanie nowych podejść terapeutycznych pozostaje czasochłonne i kosztowne7. Co więcej, konwencjonalne modele in vitro wykorzystują głównie uproszczone dwuwymiarowe (2D) hodowle monowarstwowe na niefizjologicznych podłożach plastikowych, co nie pozwala na odtworzenie sygnałów biochemicznych i fizycznych, oddziaływań międzykomórkowych oraz sygnalizacji macierzy pozakomórkowej (ECM) obecnych w ludzkiej jamie ustnej8,9. Chociaż modele 2D oferują pewne zalety eksperymentalne, są one z natury niezdolne do odtworzenia złożonych interakcji zachodzących jednocześnie między wieloma komponentami, takimi jak biofilmy, biomateriały, zębina i komórki miazgi10. W konsekwencji rośnie zainteresowanie opracowaniem alternatywnych platform eksperymentalnych, zdolnych do dokładniejszego odwzorowania ludzkich odpowiedzi biologicznych. W 2022 roku ustawa FDA Modernization Act 2.0 zniosła obowiązek przeprowadzania badań na zwierzętach w procesie zatwierdzania leków i uznała potencjalne zastosowanie alternatywnych platform, w tym technologii organ-on-a-chip (OoC), w badaniach przedklinicznych11.

Organ-on-a-chip (OoC) to urządzenie mikrofluidyczne zaprojektowane w celu replikacji struktury, funkcji i mikrośrodowiska konkretnego organu lub komponentu tkankowego12. Urządzenia te są zasiedlane przez żywe komórki i tkanki hodowane w zaprojektowanych mikrokanałach, które odtwarzają kluczowe aspekty fizjologicznego mikrośrodowiska, w którym komórki naturalnie występują. Poza naśladownictwem strukturalnym, mikrokanały umożliwiają czasowo-przestrzenną kontrolę nad środowiskiem komórkowym i wspierają utrzymanie funkcji specyficznych dla tkanki, zapewniając tym samym warunki eksperymentalne, które mogą bardziej przypominać fizjologię in vivo niż konwencjonalne systemy hodowli12. Szczególnie istotne jest to, że mikrokanały w urządzeniach OoC umożliwiają kontrolowany przepływ medium hodowlanego, który wywiera naprężenie ścinające na obecne w nich komórki13. Te bodźce mechaniczne wpływają na odpowiedzi komórkowe, w tym adhezję, proliferację, migrację, ekspresję genów oraz interakcje międzykomórkowe14,15. Dodatkowo, ciągły przepływ medium przyczynia się do utrzymania mikrośrodowiska poprzez dostarczanie składników odżywczych i usuwanie produktów przemiany materii16. Co więcej, w porównaniu z konwencjonalnymi hodowlami 2D, zgłaszano, że niektóre platformy OoC w trójwymiarowych (3D) modelach na chipie wspierają lepszą kontrolę odczytów związanych ze stresem oksydacyjnym, w tym wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu oraz żywotności komórek17. Systemy OoC stały się zatem obiecującymi platformami do badania fizjologii tkanek, interakcji z biomateriałami i procesów chorobowych w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych18. W badaniach stomatologicznych technologia OoC jest sukcesywnie stosowana do modelowania coraz bardziej złożonych interfejsów tkanek jamy ustnej19. Wczesne platformy tooth-on-a-chip emulowały interfejs biomateriał–dentyna–miazga20, podczas gdy bardziej zaawansowane wersje włączyły naczynia krwionośne i unerwienie nerwem trójdzielnym, aby wierniej odtworzyć złożoność strukturalną i funkcjonalną kompleksu miazga-dentyna21. Poza miazgą, modele 3D niedojrzałych kanałów korzeniowych umożliwiły ocenę irygantów endodontycznych oraz angiogennego pączkowania komórek macierzystych z brodawki szczytowej22,23. Na poziomie periodontu platformy gum-on-a-chip zostały wykorzystane do badania interakcji gospodarz-mikrob oraz oceny potencjału immunomodulacyjnego probiotyków jako czynników terapeutycznych24, natomiast urządzenia periodontal ligament-on-chip wykazały, w jaki sposób przepływ płynu śródręśnego moduluje tworzenie sieci naczyniowej i różnicowanie osteogenne sferoidów komórek macierzystych więzadła ozębnego25,26. Uzupełniając te modele, wyspecjalizowane systemy oral mucosa-on-a-chip oraz dental implant-on-a-chip dodatkowo rozszerzyły zakres mikrofluidycznych badań stomatologicznych poprzez charakteryzację interakcji gospodarz-materiał oraz cytotoksyczności monomerów stomatologicznych w fizjologicznie istotnych warunkach27,28.

Choć systemy OoC są coraz częściej stosowane w badaniach stomatologicznych, jamy ustnej i kraniomaksylofaccjalnych, dalsze wysiłki na rzecz standaryzacji i powtarzalności procesów wytwarzania pozostają istotne. W literaturze opisano kilka modeli tooth-on-a-chip20,29,30,31, prezentujących różne konfiguracje urządzeń i zastosowania eksperymentalne. Jednakże różnice w architekturze urządzeń, metodach wytwarzania, sposobie włączania zębiny oraz raportowaniu parametrów eksperymentalnych mogą ograniczać powtarzalność i bezpośrednie porównywanie badań. W szczególności różnice w geometrii mikrokanałów, strategiach integracji zębiny i podejściach do produkcji mogą wpływać na biologiczne i mechaniczne mikrośrodowisko wewnątrz urządzenia. Niektóre opisane modele wykorzystują zębinę w celu odtworzenia aspektów interfejsu zębina–miazga20,29,30, podczas gdy inne stosują alternatywne konfiguracje31. Ponadto metody wytwarzania, takie jak fotolitografia, cięcie laserowe, mikrofrezowanie i druk 3D, prezentują określone zalety i ograniczenia w zależności od zamierzonego projektu urządzenia i jego zastosowania. Co więcej, krytycznym determinantem użyteczności biologicznej jest orientacja architektoniczna urządzenia, a konkretnie to, czy kanały i plaster zębiny są rozmieszczone w konfiguracji poziomej czy pionowej19,32. W konfiguracjach ułożonych poziomo przedziały rozmieszczone obok siebie ułatwiają boczną kompartymentację i wizualizację komórek w czasie rzeczywistym, co czyni je szczególnie odpowiednimi do modelowania tkanek o naturalnej bocznej organizacji przestrzennej, takich jak kompleks periodontalny24,32. Jednakże projekt ten jest z natury ograniczony w zdolności do odtworzenia prostopadłych interfejsów biologicznych, takich jak kompleks biomateriał-zębina-miazga, ponieważ boczny układ przedziałów nie oddaje wiernie in vivo orientacji bariery zębinowej między jamą a miazgą20,32. Konfiguracje ułożone pionowo rozwiązują te ograniczenia poprzez superpozycję dwóch przedziałów wzdłuż osi y, oddzielonych natywnym plastrem zębiny, co umożliwia jednoczesną kwantyfikację transportu molekularnego przez nienaruszoną zębinę oraz monitorowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórek miazgi mierzonych w medium wylotowym30. Niemniej jednak, rozpoznaną wadą tej orientacji jest obrazowanie przekroju interfejsu zębina-komórka, ponieważ uzyskanie obrazów przekroju interfejsu zębina-komórka w tej samej płaszczyźnie ogniskowania pozostaje technicznie trudniejsze niż w konfiguracjach ułożonych poziomo, gdzie komórki i macierze zewnątrzkomórkowe są rozmieszczone bocznie. Mimo że w literaturze opisano wiele modeli kompleksu zębina-miazga on-a-chip, większość z nich przyjmuje konfigurację poziomą, w której przedziały są rozmieszczone obok siebie w tej samej płaszczyźnie10,20,21,29, podczas gdy stosunkowo niewiele z nich włączyło natywny plaster zębiny w konfiguracji pionowej30. Niemniej jednak, różnice w podejściach do produkcji i parametrach raportowania w tych modelach nadal ograniczają powtarzalność i porównania między badaniami33. Niniejsza praca ma na celu poprawę powtarzalności metodologicznej poprzez dostarczenie szczegółowego protokołu wytwarzania pionowo ułożonego urządzenia tooth-on-a-chip, co ułatwi szersze przyjęcie tej platformy w środowisku badawczym stomatologii.

Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania i montażu urządzenia typu OoC do pionowo ułożonego kompleksu miazga-zębina, zawierającego ludzki dysk zębiny wewnątrz trójwarstwowej mikrofluidycznej platformy z polidimetylosiloksanu (PDMS), wykonanej przy użyciu formy otrzymanej metodą fotolitografii. Protokół opisuje również zasiewanie i hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba wewnątrz urządzenia w warunkach statycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską, a protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyki Universidad de La Frontera dla badań z wykorzystaniem próbek ludzkich.

1. Pozyskanie krążka dentyny

UWAGA: Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować projekt urządzenia (Rycina 1A–1C).

  1. Pozyskiwanie i przechowywanie zębów
    1. Pozyskać zdrowe ludzkie zęby trzonowe lub przedtrzonowe po uzyskaniu świadomej zgody pacjenta.
    2. Przechowywać wszystkie próbki w 0,5% roztworze chloraminy w temperaturze 4°C, aby zapobiec odwodnieniu dentyny i denaturacji białek.
    3. Wymieniać roztwór chloraminy raz w tygodniu podczas przechowywania.
  2. Przygotowanie krążków dentynowych
    1. Przeciąć każdy ząb poziomo w obrębie środkowej jednej trzeciej korony, używając szybkoszybkich końcówek stomatologicznych pracujących z prędkością 350 00 rpm, wyposażonych w cylindryczny wiertło diamentowy (średnica 1 mm; ziarnistość 10–150 µm).
    2. Przecinanie należy przeprowadzać pod ciągłym chłodzeniem wodnym z przepływem około 50 mL/min.
    3. Ustawić miejsce cięcia w środkowej jednej trzeciej korony, aby uniknąć komory miazgi oraz szkliwa obecnego w bruzdach i szczelinach powierzchni żującej, uzyskując w ten sposób krążek składający się głównie z tkanki dentynowej.
      UWAGA: Przecinanie zębów należy wykonywać pod ciągłym nawadnianiem, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawiczki, maskę i okulary ochronne.
  3. Wykańczanie krążków dentynowych
    1. Wypolerować krążek dentynowy, używając sekwencyjnie krążków wykończeniowych o malejącej ziarnistości.
    2. Kontynuować polerowanie do uzyskania końcowej grubości dentyny wynoszącej około 0,8 mm (±± 0,3 mm) oraz wymiarów bocznych około 5 mm × 5 mm (± 0,3 mm) (Rycina 1D).
  4. Przechowywanie krążków dentynowych
    1. Przechowywać przygotowane krążki dentynowe w 0,5% roztworze chloraminy w temperaturze 4°C do momentu montażu urządzenia OoC.

Schemat montażu urządzenia mikroprzepływowego; etapy wykonania z użyciem pęsety, narzędzia przebijającego, tworzenie kanałów cieczowych.
Rycina 1: Przebieg projektowania i wytwarzania urządzenia typu organ-on-a-chip (OoC) dla kompleksu zębinowo-miazgowego. (A) Trójwymiarowy projekt urządzenia przedstawiający trójwarstwową architekturę. (B) Widok z góry projektu urządzenia z głównymi wymiarami. (C) Widok z boku trójwarstwowej konfiguracji urządzenia. (D) Reprezentatywny krążek dentynowy przygotowany o przybliżonej grubości 0,8 mm i wymiarach bocznych około 5 mm × 5 mm. (EKrzemowa forma matrycowa wykonana metodą fotolitografii, użyta do odlewania górnej i dolnej warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS).F) Usuwanie utwardzonej warstwy PDMS z formy krzemowej po polimeryzacji termicznej. (G) Obróbka plazmowa powierzchni PDMS przed łączeniem warstw. (H) Końcowe trójwarstwowe urządzenie OoC kompleksu zębinowo-miazgowego złożone za pomocą wiązania plazmowego i zawierające interfejs zębinowy. (IZmontowane urządzenie podłączone do przewodów w celu przeprowadzenia testu szczelności i przygotowania do eksperymentów mikroprzepływowych. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Wykonanie urządzenia OoC kompleksu miazga-zębina

  1. Przygotowanie miejsca pracy i materiałów
    1. Przygotowanie materiałów i sprzętu
      1. Przygotuj wszystkie materiały i sprzęt wymienione w Tabela materiałów przed rozpoczęciem procesu wytwarzania urządzenia.
      2. Przygotować wycinaki do biopsji przed złożeniem urządzenia.
      3. Wszystkie procedury wytwarzania należy przeprowadzać w czystym środowisku, wolnym od kurzu.
      4. Podczas procesu wytwarzania i montażu urządzenia należy przez cały czas stosować rękawice, okulary ochronne oraz odpowiednie środki ochrony indywidualnej.
        UWAGA: Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować formę wykonaną metodą fotolitografii (Rysunek 1E).
  2. Wytwarzanie formy mikrostrukturalnej
    1. Przygotowanie wafla krzemowego
      1. Wytworzyć formę na 4-calowym, jednostronnie polerowanym waflu krzemowym (typ N, domieszkowany arsenem, metoda wzrostu CZ, <100> orientacja, 50 ±± 25 µm grubość, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, rezystywność 0,01–0,05 Ω·cm).
      2. Kolejno myj wafelek w acetonie, izopropanolu i wodzie ultrapure przez 10 min w każdym z tych mediów, stosując sonikację.
      3. Osuszyć wafelek sprężonym powietrzem.
      4. Wypiecz wafelek w temperaturze 200°C przez 10 min na płycie grzewczej w celu usunięcia pozostałej wilgoci.
      5. Pozostawić wafelek do ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT; 20°C–25°C).
    2. Aktywacja powierzchni i nakładanie fotorezystu
      1. Aktywować powierzchnię wafla krzemowego, używając próżniowej oczyszczarki plazmowej z zastosowaniem plazmy powietrznej na poziomie 7 przez 120 s.
      2. Nanieść negatywny fotorezyst na bazie epoksydu GM 1060 metodą spin coatingu przy 30 obr./min przez 10 s.
      3. Kontynuuj powlekanie wirowaniem przy prędkości 565 obr./min przez 100 s oraz 965 obr./min przez 1 s, stosując przyspieszenie 20 obr./min/s.
      4. Pozostaw pokryty podłoże krzemowe na 10 min.
      5. Przeprowadzić wstępne wypiekanie w temperaturze 65°C przez 10 min.
      6. Kontynuuj wstępne wypiekanie w temperaturze 95°C przez 1 h.
      7. Pozostawić wafle do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
    3. Naświetlanie i wywoływanie
      1. Naświetl fotorezyst przy użyciu systemu bezpośredniej litografii laserowej z dawką 1 950 mJ/cm²2.
      2. Przeprowadź wygrzewanie po wypalaniu w temperaturze 65°C przez 10 min.
      3. Kontynuuj wygrzewanie w temperaturze 95°C przez 30 min.
      4. Pozostawić wafle do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
      5. Pozostawić wafelek na 10 min.
      6. Wywoływać wzór w PGMEA przez 4 min.
      7. Przedłużać wywoływanie w odstępach 30-sekundowych, jeśli na powierzchni pozostał pozostałości fotorezystu.
      8. Zatrzymać proces wywoływania poprzez przepłukanie izopropanolem.
      9. Osusz wafelek przy użyciu sprężonego powietrza.
    4. Wypiekanie twarde
      1. Przeprowadzić utwardzanie w temperaturze 135°C przez 2 h.
      2. Należy pozyskać mikrostrukturalną formę matczyną zawierającą mikrokanały o szerokości 1 mm i 50 µm wysokością.
  3. Przygotowanie i odpowietrzanie mieszaniny PDMS
    1. Przygotowanie mieszaniny PDMS
      1. Wymieszaj bazę PDMS z czynnikiem sieciującym w stosunku wagowym 10:1.
      2. Mieszaninę należy mieszać ręcznie szklaną bagietką w plastikowym zlewce przez około 5 min.
      3. Podczas mieszania należy wykonywać powolne i ciągłe ruchy okrężne.
        UWAGA: Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas mieszania.
    2. Odgazowywanie
      1. Umieść mieszaninę PDMS w deskrykatorze próżniowym podłączonym do pompy próżniowej.
      2. Odgazuj mieszaninę pod ciśnieniem około 70 mmHg przez 5 min.
      3. Krótko przerwij próżnię, aby umożliwić pękanie pęcherzyków powietrza na powierzchni.
      4. Ponownie przywróć próżnię.
      5. Powtarzać cykl do czasu, aż całkowicie znikną widoczne pęcherzyki powietrza.
        UWAGA: Całkowity czas odgazowywania wynosi zazwyczaj około 30 min.
  4. Odlewanie PDMS na formie
    1. Przygotowanie formy
      1. Umieść formę na płaskiej powierzchni.
      2. Oczyść formę za pomocą sprężonego powietrza.
      3. Należy unikać bezpośredniego kontaktu z powierzchnią wzorowaną.
      4. Upewnij się, że forma jest wolna od kurzu i zanieczyszczeń.
    2. Doziwny PDMS
      1. Nanieś około 8 g PDMS wokół krążka dentynowego, aby przygotować warstwę zatopienia dentyny.
      2. Dostosuj wysokość PDMS tak, aby odpowiadała grubości krążka dentynowego (0,8 ± 0,3 mm).
      3. Należy zapobiec pokryciu powierzchni dentyny przez PDMS.
      4. Nanieś około 0,26 g PDMS na każdą jednostkę formy w celu wykonania poszczególnych warstw mikrokanałów.
      5. Należy delikatnie postukać w formę lub zastosować wibracje, aby ułatwić wypełnienie mikrostruktur.
      6. Pozostawić PDMS do czasu, aż wypełni najmniejsze struktury.
      7. Przykryć formę pokrywką lub płaskim przykryciem, nie dotykając powierzchni PDMS.
        UWAGA: Warstwa zatopienia w dentynie ma grubość około 0,8 mm, a każda warstwa mikrokanałów ma grubość około 0,4 mm, co daje całkowitą grubość urządzenia wynoszącą około 1,6 mm.
        UWAGA: W przypadku planowania obrazowania konfokalnego należy dostosować grubość warstwy do odległości roboczej obiektywu konfokalnego.
  5. Utwardzanie
    1. Umieścić formy w piecu w temperaturze 50°C.
    2. Utwardzać PDMS przez 4 h.
  6. Usuwanie warstw PDMS
    1. Usuwanie utwardzonego PDMS
      1. Ostrożnie oddziel utwardzone warstwy PDMS od formy (Rycina 1F).
      2. Należy ostrożnie obchodzić się z warstwami PDMS, aby uniknąć uszkodzenia mikrostruktur.
  7. Łączenie warstw PDMS oraz wykonanie portów wlotowych i wylotowych
    1. Wytwarzanie portów wlotowych i wylotowych
      1. Wykonaj perforacje w wyznaczonych miejscach wlotowych i wylotowych, używając 1 mm trepanu do biopsji.
      2. Podczas wybijania otworów należy umieścić stronę z mikrokanałem skierowaną do góry.
        UWAGA: Warstwę PDMS należy położyć na macie do cięcia, aby uniknąć uszkodzeń strukturalnych.
      3. Wykonaj dwa otwory w górnej warstwie, odpowiadające górnemu mikrokanałowi.
    2. Czyszczenie warstw PDMS
      1. Oczyścić warstwy PDMS za pomocą alkoholu izopropylowego lub etanolu.
      2. Usunąć pozostałe cząsteczki kurzu za pomocą sterylnej taśmy klejącej.
      3. Przed montażem należy upewnić się, że wszystkie powierzchnie wiążące są wolne od zanieczyszczeń.
    3. Aktywacja plazmowa powierzchni PDMS
      1. Ustaw górną i środkową warstwę PDMS do traktowania plazmą (Rycina 1G).
      2. Aktywować powierzchnie za pomocą ręcznego urządzenia do plazmowania koronowego, pracującego z mocą około 25 W, wykorzystując powietrze otoczenia jako gaz roboczy.
      3. Zachowaj odległość roboczą wynoszącą około 1 mm pomiędzy źródłem plazmy a powierzchnią PDMS.
        OSTROŻNIE: Zabieg plazmowy należy przeprowadzać przy odpowiedniej wentylacji i unikać bezpośredniej ekspozycji na ozon generowany przez plazmę.
      4. Włącz urządzenie do obróbki plazmowej i odczekaj 5 s w celu stabilizacji.
      5. Zweryfikuj wytworzenie jednorodnej wiązki plazmy przed rozpoczęciem zabiegu.
      6. Poddaj górną warstwę PDMS obróbce przez 10 s, wykonując ciągły ruch tam i z powrotem z prędkością około 5 mm/s.
      7. Poddaj środkową warstwę PDMS obróbce przez 10 s, zachowując ten sam ruch i odległość.
      8. Zastosuj dodatkową 1-sekundową obróbkę plazmową warstwy wierzchniej bezpośrednio przed sklejeniem.
    4. Łączenie warstwy górnej i środkowej
      1. Zrównaj górny mikrokanał z krążkiem z dentyny bezpośrednio po obróbce plazmowej.
      2. Połącz ze sobą górną i środkową warstwę.
      3. Umieść złączony zespół w piekarniku w temperaturze 75°C przez 5 min.
      4. Utrwal wiązanie podczas inkubacji.
        UWAGA: tarcza z dentyny i mikrokanał są widoczne gołym okiem i mogą zostać wyrównane bez użycia dodatkowych narzędzi do pozycjonowania.
    5. Wytwarzanie dolnych portów mikrokanałów
      1. Wykonaj dwa otwory odpowiadające dolnemu mikrokanałowi poprzez złączone warstwy górną i środkową.
      2. Wykonaj wycinanie przez obie warstwy jednocześnie, aby zapewnić ich odpowiednie dopasowanie.
        UWAGA: Procedura ta powoduje powstanie czterech perforacji w warstwie wierzchniej i dwóch perforacji w warstwie środkowej.
      3. Przed wycinaniem należy umieścić złączony zestaw na stabilnej macie do cięcia.
      4. Wywrzeć stały nacisk w dół jednym płynnym ruchem.
        UWAGA: Należy unikać sił obrotowych lub bocznych, aby zminimalizować ryzyko rozwarstwienia.
      5. Usuń zanieczyszczenia z miejsc perforacji, używając zwilżonej alkoholem izopropylowym, sterylnej gazy niepozostawiającej włókien.
      6. Należy sprawdzić perforacje oraz przyległe obszary wiązania przy odpowiednim oświetleniu.
      7. Przed kontynuowaniem należy sprawdzić, czy nie występuje delaminacja, rozdarcia lub niepełne perforacje.
    6. Łączenie warstwy dolnej
      1. Poddać warstwę dolną obróbce plazmowej zgodnie z opisem w kroku 2.7.4.
      2. Wyrównaj otwory wlotowe i wylotowe dolnego mikrokanału z perforacjami w warstwie górnej i środkowej.
      3. Przyklej warstwę dolną, aby zakończyć montaż urządzenia.
        UWAGA: Przed połączeniem należy zaznaczyć miejsca wlotu i wylotu na powierzchni zewnętrznej warstwy dolnej, aby ułatwić wyrównanie.
        UWAGA: Komory plazmowe mogą zapewniać silniejsze wiązanie niż pióra plazmowe, zgodnie z doniesieniami w literaturze36.
        UWAGA: Gotowe urządzenie składa się z trójwarstwowej platformy mikroprzepływowej zawierającej interfejs z dentyny (Rycina 1H). Dolna powierzchnia dentyny reprezentuje stronę miazgi modelu, natomiast górna powierzchnia dentyny reprezentuje stronę koronarną, przeznaczoną do ekspozycji na biomateriały stomatologiczne lub preparaty bakteryjne.
  8. Test szczelności urządzenia mikroprzepływowego
    1. Inspekcja zmontowanego urządzenia
      1. Należy sprawdzić, czy w złożonym urządzeniu nie występuje przesunięcie elementów.
      2. Należy sprawdzić zespół pod kątem niepełnego sklejenia oraz widocznych wycieków.
    2. Badanie szczelności
      1. Podłącz igły Luer-lock 19G do portów wlotowych (Rycina 1E).
      2. Podłącz igły do przewodów pompy mikrofluidycznej.
      3. Delikatnie wciśnij nasadki igieł w wykonane otwory, aby uzyskać szczelne połączenie.
      4. Wstrzyknij sterylny PBS lub pożywkę hodowlaną z szybkością przepływu wynoszącą 10 µL/min.
      5. Utrzymać przepływ cieczy przez co najmniej 5 min.
      6. Podczas aplikacji materiału płynnego należy sprawdzić wszystkie powierzchnie wiązane, brzegi kanałów oraz krawędzie krążków dentynowych.
      7. Obserwuj urządzenie przy odpowiednim oświetleniu podczas i po wstrzyknięciu.
      8. Należy potwierdzić brak gromadzenia się płynu, wilgoci lub powstawania kropel.
      9. Zaklasyfikuj urządzenie jako szczelne, jeśli nie wykryto żadnego wycieku.
      10. Należy odrzucić urządzenia wykazujące wycieki.
        UWAGA: Przed zasiewaniem komórek lub wykorzystaniem w eksperymencie należy przeprowadzić test szczelności każdego wykonanego urządzenia.
  9. Sterylizacja i przechowywanie urządzenia mikroprzepływowego
    1. Sterylizacja
      1. Naświetlaj górną powierzchnię zmontowanego urządzenia światłem UV (254 nm) przez 30 min wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.
      2. Naświetlaj dolną powierzchnię światłem UV przez dodatkowe 30 min.
      3. Przepłucz mikrokanały 70% etanolem przez 20 min.
      4. Przemyj mikrokanały trzykrotnie sterylnym PBS w celu usunięcia pozostałości etanolu.
    2. Przechowywanie
      1. Należy niezwłocznie wykorzystać wysterylizowane urządzenie do eksperymentów z kulturami komórkowymi.
      2. Alternatywnie urządzenie można przechowywać w sterylnym PBS w temperaturze 4°C w sterylnym pojemniku do momentu użycia.
        OSTRZEŻENIE: Po montażu urządzenia nie należy używać chloramin ani innych roztworów dezynfekujących, ponieważ PDMS może absorbować te związki, co może negatywnie wpłynąć na żywotność komórek.

3. Ocena adhezji i żywotności mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba

  1. Przygotowanie powierzchni dentyny
    1. Wstrzyknąć 10% EDTA do urządzenia.
    2. Utrzymaj kontakt roztworu EDTA z powierzchnią zębiny przez 15 min.
    3. Wstrzykiwać 0,5 ml EDTA co 3 min, aby utrzymać przepływ cieczy w mikrokanale.
    4. Przemyj krążek dentynowy trzy razy wodą ultrapure.
    5. Każde płukanie należy prowadzić przez 5 min.
      UWAGA: Obróbka EDTA usuwa warstwę smear layer i odsłania białka macierzy dentynowej.
      OSTRZEŻENIE: Podczas pracy z roztworami EDTA należy stosować rękawice i okulary ochronne, aby uniknąć podrażnienia skóry i oczu.
  2. Wysiew komórek macierzystych miazgi zęba
    1. Ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba
      1. Zasiać mezenchymalne komórki macierzyste miazgi zęba do kolby T75 z gęstością 1 × 106 liczba komórek na kolbę.
      2. Inkubować komórki w temperaturze 37°C oraz 5% CO22 do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 80%.
      3. Odczep komórki za pomocą trypsyny.
      4. Zneutralizować trypsynę, używając pełnej pożywki hodowlanej.
      5. Odwiruj zawiesinę komórkową, aby uzyskać osad komórkowy.
      6. Ocena żywotności komórek z użyciem błękitu trypanu.
      7. Należy używać zawiesin komórkowych o żywotności ≥90%.
    2. Przygotowanie zawiesiny komórkowej
      1. Przygotować uprzednio ogrzaną zawiesinę komórkową w temperaturze 37°C.
      2. Dostosować stężenie komórek do poziomu 10 0 komórek/ml w pełnej pożywce hodowlanej.
      3. Przygotować końcową objętość zawiesiny wynoszącą 1–2 mL.
        UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano komórki w 5. pasażu.
    3. Wysiew komórek
      1. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do otworu wlotowego dolnego mikrokanału.
      2. Odwróć urządzenie po wysianiu komórek
        UWAGA: Odwrócenie urządzenia sprzyja sedymentacji komórek w kierunku powierzchni dentyny i zwiększa adhezję komórek.
    4. Inkubacja
      1. Umieść odwrócone urządzenie w szalce Petriego.
      2. Do szalki Petriego należy dodać 1 ml pożywki w celu zminimalizowania parowania.
      3. Inkubować urządzenie w temperaturze 37°C oraz 5% CO22 przez 24 h.
      4. Przez cały okres inkubacji należy zachować statyczne warunki hodowli.
        UWAGA: W niniejszym badaniu nie przeprowadzono walidacji przepływu dynamicznego.
        UWAGA: Niniejszy protokół opisuje warunki hodowli statycznej w celu wstępnej walidacji urządzenia oraz oceny adhezji komórek.
    5. Wstępna walidacja urządzenia
      1. Ocena adhezji komórekk z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej.
      2. Przed przeprowadzeniem analizy należy wyjąć krążek dentynowy poprzez rozmontowanie urządzenia.
  3. Przygotowanie próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej
    1. Odzyskiwanie i przemywanie próbek
      1. Zdemontuj urządzenie po 24 h inkubacji.
      2. Wyjmij krążek dentyny i przenieś go na płytkę hodowlaną lub do szalki Petriego.
      3. Ułożyć powierzchnię zębiny zasianej komórkami stroną skierowaną do góry.
      4. Przemyć krążek dentynowy dwukrotnie, używając 1 ml PBS.
    2. Fiksacja
      1. Dodać 2 ml 2,5% glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym Sorensena.
      2. Inkubować próbkę przez 30 min w temperaturze pokojowej.
        OSTROŻNIE: Glutaraldehyd jest toksyczny i może powodować podrażnienie skóry, oczu oraz dróg oddechowych. Procedury utrwalania należy przeprowadzać w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej.
    3. Przemywanie po utrwalaniu
      1. Usunąć roztwór glutaraldehydu.
      2. Przemyć krążek dentynowy trzykrotnie ultraczystą wodą destylowaną w temperaturze pokojowej.
    4. Analiza SEM
      1. Próbki należy przeanalizować przy użyciu środowiskowego skaningowego mikroskopu elektronowego.
      2. Pracuj na mikroskopie w warunkach niskiej próżni (25 Pa).
      3. Należy zastosować napięcie przyspieszające 10,0 kV oraz odległość roboczą 7,0 mm.
      4. Należy pozyskać obrazy w trybie detekcji trójwymiarowej elektronów wstecznie rozproszonych (BSE-3D).
      5. Wykonaj zdjęcia przy powiększeniu ×20 (Rysunek 2A).
  4. Ocena żywotności komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej
    1. Przygotowanie próbek
      1. Wysiać i hodować komórki zgodnie z opisem w kroku 3.2.
      2. Inkubować urządzenie przez 24 h w temperaturze 37°C i 5% CO22.
      3. Zdemontuj urządzenie i odsłoń powierzchnię dentyny.
      4. Przenieść krążek dentynowy do płytki z dołkami zawierającej uprzednio ogrzany HBSS.+/+ uzupełnione o Ca2+ oraz Mg2+.
    2. Przemywanie próbek
      1. Przemyć krążek dentynowy dwukrotnie za pomocą HBSS+/+.
      2. Przed barwieniem należy usunąć pozostałości surowicy oraz czerwieni fenolowej.
        UWAGA: Pozostałości surowicy i czerwieni fenolowej mogą zwiększyć tło autofluorescencji.
    3. Barwienie żywych komórek
      1. Przygotuj świeży roztwór roboczy kalceiny AM o stężeniu 2 µM w HBSS+/+.
      2. Należy dodać wystarczającą ilość roztworu barwiącego, aby całkowicie pokryć powierzchnię zębiny.
      3. Inkubować próbkę przez 20 min w temperaturze 37°C w ciemności.
      4. Usuń roztwór barwiący po inkubacji.
    4. Barwienie martwych komórek
      1. Dodaj roztwór roboczy jodku propidyny (1–2 µg/mL w HBSS+/+).
      2. Inkubować próbkę przez 5–8 min w temperaturze 37°C w ciemności.
      3. Czas inkubacji nie może przekroczyć 10 min.
      4. Przemyć próbkę dwukrotnie roztworem HBSS+/+.
      5. Próbkę należy utrzymywać w buforze aż do momentu obrazowania.
    5. Akwizycja obrazu w mikroskopii konfokalnej
      1. Należy wykonać obrazy konfokalne w ciągu 30 min od barwienia.
      2. Należy sekwencyjnie pozyskać obrazy w kanałach zielonym i czerwonym.
      3. Użyj λex 490 nm i λem 515 nm do obrazowania żywych komórek.
      4. Użyj λex 535 nm i λem 617 nm do obrazowania martwych komórek.
        UWAGA: Należy chronić roztwory do barwienia fluorescencyjnego oraz zbarwione próbki przed ekspozycją na światło podczas inkubacji i procedur obrazowania (Rycina 2B).

Porównanie mikroskopii elektronowej i mikroskopii fluorescencyjnej, analiza struktury komórkowej.
Rysunek 2: Reprezentatywna ocena adhezji i żywotności komórek macierzystych miazgi zęba w obrębie urządzenia OoC kompleksu zębinowo-miazgowego. (A) Obraz z pomiaru za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej przedstawiający adherentne mezenchymalne komórki macierzyste miazgi zęba (biała gwiazdka) na powierzchni dentyny po 24 h statycznej hodowli w urządzeniu OoC. Po 24 h hodowli adherentne komórki pokrywały 54,35 ± 0,92% powierzchni dentyny wystawionej na działanie mikrokanału. W obszarze dentyny pokrytym PDMS (czarna gwiazdka) nie zaobserwowano komórek, co wskazuje na skuteczne uszczelnienie między warstwami urządzenia. Pasek skali = 200 µm. (BObraz z mikroskopii konfokalnej przedstawiający żywe komórki macierzyste miazgi zęba zabarwione na zielono i przytwierdzone do powierzchni zębiny (białe strzałki) po 24 h statycznej hodowli. Widoczne są również martwe komórki zabarwione na czerwono (niebieskie strzałki). Pasek skali = 50 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślne wykonanie urządzenia typu tooth-on-a-chip przebiegało zgodnie z procesem przedstawionym na Ryc. 1A–1I, obejmującym przygotowanie krążka zmaciny (Ryc. 1D), wykonanie formy otrzymanej metodą fotolitografii (Ryc. 1E), usunięcie utwardzonych warstw PDMS (Ryc. 1F), aktywację plazmową przed wiązaniem (Ryc. 1G), montaż końcowego urządzenia (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie opisuje szczegółowy protokół wytwarzania pionowo ułożonego urządzenia tooth-on-a-chip, zawierającego zębinę oraz komórki macierzyste miazgi zęba, i demonstruje reprezentatywną adhezję oraz żywotność komórek wewnątrz urządzenia w warunkach hodowli statycznej. Protokół został opracowany w celu zapewnienia powtarzalnego schematu pracy dla wytwarzania i montażu platformy OoC kompleksu zębina–miazga, odpowiedniej do badań in vitro interfejsu zębiny. Ustanowienie takiego schematu pracy jest szczególnie istotn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych oraz brak konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Niniejsza praca była wspierana przez Projekt DIM24-0004 i Projekt PP24-0031, Dirección de Investigación, Universidad de La Frontera; FONDECYT Regular nr 1260116 oraz FONDECYT de Iniciación nr 11230701, Narodowa Agencja Badań i Rozwoju (ANID), Chile.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały biologiczne i chemiczne
AcetonExpertQSOLV 8Czyszczenie wafla krzemowego
podłoże hodowlane Alpha MEMCytivaSH30265.02Pożywka do hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba
Chloramina (0,5%)Merck7080-50-4Roztwór do przechowywania krążków dentynowych
Macierzyste komórki miazgi zębaNie dotyczyNie dotyczyPierwotna hodowla komórek. Patrz kroki 3.2.1 i 3.2.2
EDTA (10%)WinklerN2222158EUsuwanie warstwy przesmarowania
Negatywowy fotorezyst na bazie epoksyduGersteltecGM1060Wytwarzanie form metodą fotolitografii
Glutaraldehyd (2,5%) w buforze Sorensena 0,1 M’bufor fosforanowySigma-Aldrich210908-06utrwalanie do SEM
Zdrowe ludzkie zęby (trzonowce lub przedtrzonowce)Nie dotyczyNie dotyczyPróbka ludzka
IzopropanolExpertQSOLV 16Czyszczenie wafla, zatrzymywanie wywoływania i czyszczenie PDMS
Zestaw do oceny żywotności LIVE/DEADSigma-Aldrich451Barwienie fluorescencyjne żywotności. 
PBS (bufor fosforanowy)Corning46-013-CMMycie i test szczelności
Baza i czynnik sieciujący PDMS (polidimetylosiloksan)DowSylgard 184Wytwarzanie urządzenia
PGMEASigma Aldrich484431Wywoływanie fotorezystu
Błękit trypanuSigma Aldrich T8154-100mlOcena żywotności komórek
TrypsynaCorning25-053-CIOdrywanie komórek
Woda ultrazczystaCytivaSH30529.01Roztwór piorący
Materiały eksploatacyjne i sprzęt laboratoryjny
igły do strzykawek 19GVmaticVCB19050Podłączenie urządzenia do mikropompy lub strzykawki
Wyciśnik do biopsji (średnica: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Wykonanie portów wlotowych i wylotowych
Mata do cięciaNicecoolNie dotyczyOchrona powierzchni podczas wykrawania
Dyski do wykańczania stomatologicznego (np. Sof-Lex)3MSof-LexPolerowanie dentyny
Adaptery z gniazdem Luer na kolceRunze FluidicsRH-M016Połączenie rurek
Szklany lub plastikowy pręt do mieszaniaDuranNie dotyczyMieszanie PDMS
Strzykawki podskórneŻurawinapc-12246Wysiew komórek i test szczelności
Sterylna gaza niepozostawiająca włókienLindersonNie dotyczyUsuwanie resztek po wycinaniu
Adaptery Luer męskieRunze FluidicsRH-G016Połączenie przewodów
Naczynie do mieszaniaDuranNie dotyczyPrzygotowanie PDMS
Szalka Petriego (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219Hodowla komórkowa/inkubacja
Podłoże z politetrafluoroetylenuCCTValNie dotyczyWytwarzanie pośredniej warstwy dentynowej
Wafer krzemowyJiaozuo Commercial FineWinNie dotyczyWytwarzanie form
Rurka silikonowaRunze Fluidics96421Połączenie płynowe
kolba T75Corning 353136Ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba
Płytka wielodołkowaSPL Life Sciences30006Barwienie konfokalne i przygotowanie do obrazowania
Sprzęt i instrumenty
Osuszacz powietrzaMETALPLANTITAN-040Osuszanie sprężonego powietrza
Źródło sprężonego powietrzaSCHULZCSD-18.1Czyszczenie form i powierzchni
Mikroskop konfokalnyOlympusNie dotyczyModel: FV1000
System bezpośredniej litografii laserowejHeidelberguPG 101Naświetlanie fotorezystu
Skaningowy mikroskop elektronowy z komorą środowiskowąHitachiNie dotyczyModel: Quanta 400 
Głowica szybkozrotowaNakanishiNie dotyczyModel: Pana-max2
Płyta grzewczaLabTechEH20A PlusWygrzewanie wafla i wygrzewanie fotorezystu
Dygestorium z laminarnym przepływem powietrzaBioBaseBBS8V1708313DSterylizacja urządzeń
Pompa mikroprzepływowaNowa EraNie dotyczyModel: 1002X-ES. Badanie szczelności przy 10 µl/min
Forma mikrostrukturalna (wykonana metodą fotolitografii)CCTValNie dotyczySpecyfikacje dotyczące wykonania formy znajdują się w kroku 2.2
Piec lub inkubatorMemmertUN110Utwardzanie PDMS w temperaturze 50°C°C i konsolidacja wiązań w 75°C
Komora do czyszczenia plazmowego w próżniPlazma FariGD-5Aktywacja wafli plazmą
Ręczne urządzenie do plazmy koronowej Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACAktywacja plazmowa PDMS
SonikatorElma SonicS 10 (H)Czyszczenie wafla
Komora próżniowa lub eksykator (250 mm)WinglassNie dotyczyOdpowietrzanie PDMS
Pompa próżniowaKOŁYSARKA300Odgazowywanie PDMS

Bibliografia

  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organ na chipieurz dzenie mikroprzep ywoweodlewanie PDMSfotolitografiaplazmowa modyfikacja powierzchnimezenchymalne kom rki macierzyste miazgi z baadhezja kom rkowamikroskopia konfokalna

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.