Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie pionowo ułożonego urządzenia organ-na-chip kompleksu zębinowo-miazgowego z wykorzystaniem ludzkiego krążka zębinowego

DOI:

10.3791/71713

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano sposób wykonania i montażu urządzenia organ-on-a-chip z pionowo ułożonym kompleksem miazga-zębina, zawierającego ludzki krążek zębiny oraz mikrokanały wykonane metodą fotolitografii, a następnie zasiewanie i hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne modele przedkliniczne stosowane w badaniach stomatologicznych, w tym modele zwierzęce i statyczne hodowle komórkowe, wykazują istotne ograniczenia w odtwarzaniu warunków fizjologicznych granicy między zębiną a miazgą oraz w przewidywaniu biologicznych odpowiedzi organizmu człowieka na biomateriały stomatologiczne. Technologia organ-on-a-chip (OoC) stanowi alternatywne podejście, umożliwiając odtworzenie specyficznych dla tkanki mikrośrodowisk w kontrolowanych systemach mikroprzepływowych. Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania i montażu urządzenia OoC kompleksu zębina-miazga, zawierającego ludzki dysk zębiny w trzywarstwowej mikroprzepływowej platformie z polidimetylosiloksanu (PDMS). Protokół obejmuje przygotowanie dysku zębiny, wykonanie mikrostrukturalnych form z zastosowaniem fotolitografii, odlewanie i utwardzanie PDMS, łączenie warstw wspomagane plazmą, montaż urządzenia, testy szczelności oraz wysiew mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba w warunkach hodowli statycznej. Omówiono krytyczne parametry wytwarzania wpływające na działanie urządzenia, w tym kontrolę grubości warstwy PDMS, plazmową obróbkę powierzchni oraz integrację dysku zębiny wewnątrz urządzenia w celu zminimalizowania wycieków. Adhezję i żywotność komórek wewnątrz urządzenia oceniono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej oraz konfokalnego barwienia żywe/martwe. Reprezentatywne wyniki wykazują udaną integrację dysku zębiny w obrębie układu mikroprzepływowego, utrzymanie szczelności oraz adhezję żywotnych komórek macierzystych miazgi zęba do powierzchni zębiny. Przedstawiony protokół zapewnia powtarzalną metodę wytwarzania platformy OoC kompleksu zębina-miazga, która może wspierać przyszłe badania nad odpowiedziami komórkowymi na biomateriały stomatologiczne i bodźce mikrośrodowiskowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach od dawna odgrywają kluczową rolę w pogłębianiu wiedzy na temat procesów patologicznych i fizjologicznych oraz stanowią centralny element wczesnych etapów opracowywania leków1. W ciągu XX wieku średnia długość życia ludzi znacznie wzrosła i choć nie można precyzyjnie określić, w jakim stopniu poprawa ta wynika wyłącznie z badań na zwierzętach, powszechnie uznaje się, że wiele współczesnych metod leczenia zostało opracowanych lub zweryfikowanych z wykorzystaniem modeli zwierzęcych2. Godnymi uwagi przykładami są opracowanie szczepionek przeciwko poliomyelitis, odrze i wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, ocena bezpieczeństwa i skuteczności penicyliny oraz produkcja insuliny. W dziedzinie badań nad materiałami stomatologicznymi i biomateriałami modele te miały krytyczne znaczenie dla badania procesu próchnicy, biologii i regeneracji kompleksu zębinowo-miazgowego oraz fizjopatologii tkaneky periodontalnych3,4.

Mimo szerokiego zastosowania tych metodologii, obecny proces opracowywania leków nadal wykazuje wysoki odsetek niepowodzeń, przy czym wiele kandydatów na leki zawodzi podczas badań klinicznych, mimo wykazania skuteczności i bezpieczeństwa w przedklinicznych warunkach laboratoryjnych oraz w modelach zwierzęcych5. Rozbieżność ta wiąże się z różnicami międzygatunkowymi, które mogą ograniczać przewidywalność translacyjną modeli zwierzęcych ze względu na różnice anatomiczne, genetyczne i fizjologiczne między gatunkami6. Ponadto opracowanie nowych podejść terapeutycznych pozostaje czasochłonne i kosztowne7. Co więcej, konwencjonalne modele in vitro wykorzystują głównie uproszczone dwuwymiarowe (2D) hodowle monowarstwowe na niefizjologicznych podłożach plastikowych, co nie pozwala na odtworzenie sygnałów biochemicznych i fizycznych, oddziaływań międzykomórkowych oraz sygnalizacji macierzy pozakomórkowej (ECM) obecnych w ludzkiej jamie ustnej8,9. Chociaż modele 2D oferują pewne zalety eksperymentalne, są one z natury niezdolne do odtworzenia złożonych interakcji zachodzących jednocześnie między wieloma komponentami, takimi jak biofilmy, biomateriały, zębina i komórki miazgi10. W konsekwencji rośnie zainteresowanie opracowaniem alternatywnych platform eksperymentalnych, zdolnych do dokładniejszego odwzorowania ludzkich odpowiedzi biologicznych. W 2022 roku ustawa FDA Modernization Act 2.0 zniosła obowiązek przeprowadzania badań na zwierzętach w procesie zatwierdzania leków i uznała potencjalne zastosowanie alternatywnych platform, w tym technologii organ-on-a-chip (OoC), w badaniach przedklinicznych11.

Organ-on-a-chip (OoC) to urządzenie mikrofluidyczne zaprojektowane w celu replikacji struktury, funkcji i mikrośrodowiska konkretnego organu lub komponentu tkankowego12. Urządzenia te są zasiedlane przez żywe komórki i tkanki hodowane w zaprojektowanych mikrokanałach, które odtwarzają kluczowe aspekty fizjologicznego mikrośrodowiska, w którym komórki naturalnie występują. Poza naśladownictwem strukturalnym, mikrokanały umożliwiają czasowo-przestrzenną kontrolę nad środowiskiem komórkowym i wspierają utrzymanie funkcji specyficznych dla tkanki, zapewniając tym samym warunki eksperymentalne, które mogą bardziej przypominać fizjologię in vivo niż konwencjonalne systemy hodowli12. Szczególnie istotne jest to, że mikrokanały w urządzeniach OoC umożliwiają kontrolowany przepływ medium hodowlanego, który wywiera naprężenie ścinające na obecne w nich komórki13. Te bodźce mechaniczne wpływają na odpowiedzi komórkowe, w tym adhezję, proliferację, migrację, ekspresję genów oraz interakcje międzykomórkowe14,15. Dodatkowo, ciągły przepływ medium przyczynia się do utrzymania mikrośrodowiska poprzez dostarczanie składników odżywczych i usuwanie produktów przemiany materii16. Co więcej, w porównaniu z konwencjonalnymi hodowlami 2D, zgłaszano, że niektóre platformy OoC w trójwymiarowych (3D) modelach na chipie wspierają lepszą kontrolę odczytów związanych ze stresem oksydacyjnym, w tym wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu oraz żywotności komórek17. Systemy OoC stały się zatem obiecującymi platformami do badania fizjologii tkanek, interakcji z biomateriałami i procesów chorobowych w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych18. W badaniach stomatologicznych technologia OoC jest sukcesywnie stosowana do modelowania coraz bardziej złożonych interfejsów tkanek jamy ustnej19. Wczesne platformy tooth-on-a-chip emulowały interfejs biomateriał–dentyna–miazga20, podczas gdy bardziej zaawansowane wersje włączyły naczynia krwionośne i unerwienie nerwem trójdzielnym, aby wierniej odtworzyć złożoność strukturalną i funkcjonalną kompleksu miazga-dentyna21. Poza miazgą, modele 3D niedojrzałych kanałów korzeniowych umożliwiły ocenę irygantów endodontycznych oraz angiogennego pączkowania komórek macierzystych z brodawki szczytowej22,23. Na poziomie periodontu platformy gum-on-a-chip zostały wykorzystane do badania interakcji gospodarz-mikrob oraz oceny potencjału immunomodulacyjnego probiotyków jako czynników terapeutycznych24, natomiast urządzenia periodontal ligament-on-chip wykazały, w jaki sposób przepływ płynu śródręśnego moduluje tworzenie sieci naczyniowej i różnicowanie osteogenne sferoidów komórek macierzystych więzadła ozębnego25,26. Uzupełniając te modele, wyspecjalizowane systemy oral mucosa-on-a-chip oraz dental implant-on-a-chip dodatkowo rozszerzyły zakres mikrofluidycznych badań stomatologicznych poprzez charakteryzację interakcji gospodarz-materiał oraz cytotoksyczności monomerów stomatologicznych w fizjologicznie istotnych warunkach27,28.

Choć systemy OoC są coraz częściej stosowane w badaniach stomatologicznych, jamy ustnej i kraniomaksylofaccjalnych, dalsze wysiłki na rzecz standaryzacji i powtarzalności procesów wytwarzania pozostają istotne. W literaturze opisano kilka modeli tooth-on-a-chip20,29,30,31, prezentujących różne konfiguracje urządzeń i zastosowania eksperymentalne. Jednakże różnice w architekturze urządzeń, metodach wytwarzania, sposobie włączania zębiny oraz raportowaniu parametrów eksperymentalnych mogą ograniczać powtarzalność i bezpośrednie porównywanie badań. W szczególności różnice w geometrii mikrokanałów, strategiach integracji zębiny i podejściach do produkcji mogą wpływać na biologiczne i mechaniczne mikrośrodowisko wewnątrz urządzenia. Niektóre opisane modele wykorzystują zębinę w celu odtworzenia aspektów interfejsu zębina–miazga20,29,30, podczas gdy inne stosują alternatywne konfiguracje31. Ponadto metody wytwarzania, takie jak fotolitografia, cięcie laserowe, mikrofrezowanie i druk 3D, prezentują określone zalety i ograniczenia w zależności od zamierzonego projektu urządzenia i jego zastosowania. Co więcej, krytycznym determinantem użyteczności biologicznej jest orientacja architektoniczna urządzenia, a konkretnie to, czy kanały i plaster zębiny są rozmieszczone w konfiguracji poziomej czy pionowej19,32. W konfiguracjach ułożonych poziomo przedziały rozmieszczone obok siebie ułatwiają boczną kompartymentację i wizualizację komórek w czasie rzeczywistym, co czyni je szczególnie odpowiednimi do modelowania tkanek o naturalnej bocznej organizacji przestrzennej, takich jak kompleks periodontalny24,32. Jednakże projekt ten jest z natury ograniczony w zdolności do odtworzenia prostopadłych interfejsów biologicznych, takich jak kompleks biomateriał-zębina-miazga, ponieważ boczny układ przedziałów nie oddaje wiernie in vivo orientacji bariery zębinowej między jamą a miazgą20,32. Konfiguracje ułożone pionowo rozwiązują te ograniczenia poprzez superpozycję dwóch przedziałów wzdłuż osi y, oddzielonych natywnym plastrem zębiny, co umożliwia jednoczesną kwantyfikację transportu molekularnego przez nienaruszoną zębinę oraz monitorowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórek miazgi mierzonych w medium wylotowym30. Niemniej jednak, rozpoznaną wadą tej orientacji jest obrazowanie przekroju interfejsu zębina-komórka, ponieważ uzyskanie obrazów przekroju interfejsu zębina-komórka w tej samej płaszczyźnie ogniskowania pozostaje technicznie trudniejsze niż w konfiguracjach ułożonych poziomo, gdzie komórki i macierze zewnątrzkomórkowe są rozmieszczone bocznie. Mimo że w literaturze opisano wiele modeli kompleksu zębina-miazga on-a-chip, większość z nich przyjmuje konfigurację poziomą, w której przedziały są rozmieszczone obok siebie w tej samej płaszczyźnie10,20,21,29, podczas gdy stosunkowo niewiele z nich włączyło natywny plaster zębiny w konfiguracji pionowej30. Niemniej jednak, różnice w podejściach do produkcji i parametrach raportowania w tych modelach nadal ograniczają powtarzalność i porównania między badaniami33. Niniejsza praca ma na celu poprawę powtarzalności metodologicznej poprzez dostarczenie szczegółowego protokołu wytwarzania pionowo ułożonego urządzenia tooth-on-a-chip, co ułatwi szersze przyjęcie tej platformy w środowisku badawczym stomatologii.

Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania i montażu urządzenia typu OoC do pionowo ułożonego kompleksu miazga-zębina, zawierającego ludzki dysk zębiny wewnątrz trójwarstwowej mikrofluidycznej platformy z polidimetylosiloksanu (PDMS), wykonanej przy użyciu formy otrzymanej metodą fotolitografii. Protokół opisuje również zasiewanie i hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba wewnątrz urządzenia w warunkach statycznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzone przez Komisję Etyczną Universidad de La Frontera w odniesieniu do badań z wykorzystaniem próbek pochodzenia ludzkiego.

1. Pozyskanie krążka dentynowego

UWAGA: Przygotuj projekt urządzenia przed rozpoczęciem protokołu (Rysunek 1A–1C).

  1. Pozyskiwanie i przechowywanie zębów
    1. Pozyskaj zdrowe ludzkie zęby trzonowe lub przedtrzonowe po uzyskaniu świadomej zgody pacjenta.
    2. Przechowuj wszystkie próbki w 0,5% roztworze chloraminy w temperaturze 4°C, aby zapobiec odwodnieniu dentyny i denaturacji białek.
    3. Wymieniaj roztwór chloraminy raz w tygodniu podczas przechowywania.
  2. Przygotowanie krążków dentynowych
    1. Przetnij każdy ząb poziomo w połowie wysokości korony, używając wysokobiegowej końcówki pracującej z prędkością 350 000 rpm, wyposażonej w cylindryczny wiertak diamentowy (średnica 1 mm; ziarnistość 100–150 µm).
    2. Wykonuj cięcie pod stałym chłodzeniem wodnym z przepływem około 50 mL/min.
    3. Umieść miejsce cięcia w środkowej części korony, aby uniknąć komory miazgi oraz szkliwa obecnego w bruzdach i szczelinach powierzchni żującej, uzyskując w ten sposób krążek składający się głównie z tkanki dentynowej.
      UWAGA: Przecinanie zębów należy przeprowadzać pod stałym chłodzeniem, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawiczki, maskę i okulary ochronne.
  3. Wykańczanie krążków dentynowych
    1. Wypoleruj krążek dentynowy, używając sekwencyjnie krążków wykańczających o coraz mniejszej ziarnistości.
    2. Kontynuuj polerowanie do uzyskania końcowej grubości dentyny około 0,8 mm (±± 0,3 mm) i wymiarów bocznych około 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Rycina 1D).
  4. Przechowywanie krążków dentynowych
    1. Przechowuj przygotowane krążki dentynowe w 0,5% roztworze chloraminy w temperaturze 4°C do momentu montażu urządzenia OoC.

figure-protocol-1
Rycina 1: Schemat projektowania i procesu wytwarzania urządzenia organ-on-a-chip (OoC) kompleksu miazga–zębina. (A) Trójwymiarowy projekt urządzenia przedstawiający trójwarstwową architekturę. (B) Widok z góry projektu urządzenia z głównymi wymiarami. (C) Widok boczny trójwarstwowej konfiguracji urządzenia. (D) Reprezentatywny krążek zębiny przygotowany o przybliżonej grubości 0.8 mm i wymiarach bocznych około 5 mm × 5 mm. (E) Krzemowa forma matrycowa wykonana metodą fotolitografii, użyta do odlewania górnej i dolnej warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS). (F) Usuwanie utwardzonej warstwy PDMS z formy krzemowej po polimeryzacji termicznej. (G) Obróbka plazmowa powierzchni PDMS przed łączeniem warstw. (H) Gotowe trójwarstwowe urządzenie OoC kompleksu miazga–zębina, złożone poprzez wiązanie plazmowe i zawierające interfejs zębiny. (I) Złożone urządzenie podłączone do przewodów w celu testowania szczelności i przygotowania do eksperymentów mikrofluidycznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

2. Budowa urządzenia OoC dla kompleksu miazga–zębina

  1. Przygotowanie miejsca pracy i materiałów
    1. Przygotowanie materiałów i sprzętu
      1. Przed rozpoczęciem procesu wytwarzania urządzenia należy przygotować wszystkie materiały i sprzęt wymienione w tabeli materiałów.
      2. Przed montażem urządzenia należy przygotować wycinaki do biopsji.
      3. Wszystkie procedury wytwarzania należy przeprowadzać w czystym środowisku, wolnym od kurzu.
      4. Podczas wytwarzania i montażu urządzenia należy nosić rękawiczki, okulary ochronne i odpowiednie środki ochrony osobistej.
        UWAGA: Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować formę wykonaną metodą fotolitografii (Rysunek 1E).
  2. Wytwarzanie mikrostrukturalnej formy
    1. Przygotowanie płytki krzemowej
      1. Formę należy wykonać na 4-calowej, jednostronnie polerowanej płytce krzemowej (typ N, domieszkowana As, metoda wzrostu CZ, orientacja <100>, grubość 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, rezystywność 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Płytkę należy czyścić sekwencyjnie w acetonie, izopropanolu i wodzie ultraczystej przez 10 min każdy w kąpieli ultradźwiękowej.
      3. Płytkę należy osuszyć sprężonym powietrzem.
      4. Płytkę należy wypiekać w temperaturze 200°C przez 10 min na płycie grzejnej w celu usunięcia pozostałości wilgoci.
      5. Należy pozwolić płytce ostygnąć do temperatury pokojowej (RT; 20°C–25°C).
    2. Aktywacja powierzchni i nakładanie fotorezystu
      1. Powierzchnię płytki krzemowej należy aktywować za pomocą próżniowej myjki plazmowej z wykorzystaniem plazmy powietrznej na poziomie 7 przez 120 s.
      2. Negatywny fotorezyst na bazie epoksydu GM 1060 należy nanieść metodą spin-coatingu przy 300 rpm przez 10 s.
      3. Kontynuować spin-coating przy 565 rpm przez 100 s oraz 965 rpm przez 1 s, stosując przyspieszenie 200 rpm/s.
      4. Powleczoną płytkę należy pozostawić do odpoczynku na 10 min.
      5. Przeprowadzić wstępne wypiekanie (pre-bake) w temperaturze 65°C przez 10 min.
      6. Kontynuować wstępne wypiekanie w temperaturze 95°C przez 1 h.
      7. Należy pozwolić płytce ostygnąć do RT.
    3. Naświetlanie i wywoływanie
      1. Fotorezyst należy naświetlić za pomocą systemu bezpośredniej litografii laserowej z dawką 1 950 mJ/cm2.
      2. Przeprowadzić wypiekanie końcowe (post-bake) w temperaturze 65°C przez 10 min.
      3. Kontynuować wypiekanie końcowe w temperaturze 95°C przez 30 min.
      4. Należy pozwolić płytce ostygnąć do RT.
      5. Należy pozostawić płytkę do odpoczynku na 10 min.
      6. Wzór należy wywołać w PGMEA przez 4 min.
      7. Czas wywoływania należy wydłużyć o interwały 30 s, jeśli pozostały resztki fotorezystu.
      8. Wywoływanie należy przerwać poprzez płukanie izopropanolem.
      9. Płytkę należy osuszyć sprężonym powietrzem.
    4. Wypiekanie utwardzające (hard bake)
      1. Przeprowadzić wypiekanie utwardzające w temperaturze 135°C przez 2 h.
      2. W ten sposób otrzymuje się mikrostrukturalną formę matryczną zawierającą mikrokanały o szerokości 1 mm i wysokości 50 µm.
  3. Przygotowanie i odgazowanie mieszaniny PDMS
    1. Przygotowanie mieszaniny PDMS
      1. Bazę PDMS i czynnik sieciujący należy zmieszać w stosunku wagowym 10:1.
      2. Mieszaninę należy mieszać ręcznie szklaną rurką w plastikowym zlewce przez około 5 min.
      3. Podczas mieszania należy wykonywać powolne i ciągłe ruchy okrężne.
        UWAGA: Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas mieszania.
    2. Odgazowanie
      1. Mieszaninę PDMS należy umieścić w desykatorze próżniowym podłączonym do pompy próżniowej.
      2. Mieszaninę należy odgazowywać przy ciśnieniu około 700 mmHg przez 5 min.
      3. Należy krótko przerwać próżnię, aby pozwolić na pęknięcie pęcherzyków powietrza na powierzchni.
      4. Należy ponownie przyłożyć próżnię.
      5. Cykl należy powtarzać do momentu, aż nie będzie widocznych pęcherzyków.
        UWAGA: Całkowity czas odgazowywania wynosi zazwyczaj około 30 min.
  4. Odlewanie PDMS na formie
    1. Przygotowanie formy
      1. Formę należy umieścić na płaskiej powierzchni.
      2. Formę należy oczyścić sprężonym powietrzem.
      3. Należy unikać bezpośredniego kontaktu z powierzchnią wzorowaną.
      4. Należy upewnić się, że forma jest wolna od kurzu i zanieczyszczeń.
    2. Dozowanie PDMS
      1. Wokół krążka dentyny należy dozować około 8 g PDMS, aby wytworzyć warstwę osadzającą dentynę.
      2. Wysokość PDMS należy dostosować do grubości krążka dentyny (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Należy dopilnować, aby PDMS nie zakrył powierzchni dentyny.
      4. Na każdą jednostkę formy należy dozować około 0,26 g PDMS, aby wytworzyć każdą warstwę mikrokanałów.
      5. Należy delikatnie postukać w formę lub zastosować wibracje, aby ułatwić wypełnienie mikrostruktur.
      6. Należy pozwolić PDMS osiaść w najmniejszych elementach.
      7. Formę należy przykryć pokrywką lub płaskim osłoniaczem, nie dotykając powierzchni PDMS.
        UWAGA: Warstwa osadzająca dentynę ma grubość około 0,8 mm, a każda warstwa mikrokanałów około 0,4 mm, co daje całkowitą grubość urządzenia około 1,6 mm.
        UWAGA: Grubość warstw należy dostosować do odległości roboczej obiektywu konfokalnego, jeśli planowane jest obrazowanie konfokalne.
  5. Utwardzanie
    1. Formy należy umieścić w piecu w temperaturze 50°C.
    2. PDMS należy utwardzać przez 4 h.
  6. Usuwanie warstw PDMS
    1. Usuwanie utwardzonego PDMS
      1. Utwardzone warstwy PDMS należy ostrożnie oddzielić od formy (Rysunek 1F).
      2. Z warstwami PDMS należy obchodzić się ostrożnie, aby nie uszkodzić mikrostruktur.
  7. Łączenie warstw PDMS i wytwarzanie portów wlotowych i wylotowych
    1. Wytwarzanie portów wlotowych i wylotowych
      1. W wyznaczonych miejscach wlotowych i wylotowych należy wykonać perforacje za pomocą 1 mm wycinaka do biopsji.
      2. Podczas wycinania strona z mikrokanałami powinna być skierowana do góry.
        UWAGA: Warstwę PDMS należy położyć na macie do cięcia, aby uniknąć uszkodzeń strukturalnych.
      3. W górnej warstwie należy wykonać dwie perforacje odpowiadające górnemu mikrokanałowi.
    2. Czyszczenie warstw PDMS
      1. Warstwy PDMS należy oczyścić alkoholem izopropylowym lub etanolem.
      2. Pozostałe cząsteczki kurzu należy usunąć za pomocą sterylnej taśmy klejącej.
      3. Przed montażem należy upewnić się, że wszystkie powierzchnie łączone są wolne od zanieczyszczeń.
    3. Aktywacja plazmowa powierzchni PDMS
      1. Górną i środkową warstwę PDMS należy ustawić do obróbki plazmowej (Rysunek 1G).
      2. Powierzchnie należy aktywować za pomocą ręcznego urządzenia do plazmy koronowej pracującego z mocą około 25 W, z powietrzem otoczenia jako gazem roboczym.
      3. Należy zachować odległość roboczą około 1 mm między źródłem plazmy a powierzchnią PDMS.
        OSTROŻNIE: Obróbkę plazmową należy przeprowadzać przy odpowiedniej wentylacji i unikać bezpośredniej ekspozycji na ozon generowany przez plazmę.
      4. Należy uruchomić urządzenie do obróbki plazmowej i odczekać 5 s na stabilizację.
      5. Przed obróbką należy sprawdzić, czy generowana jest jednorodna wiązka plazmy.
      6. Górną warstwę PDMS należy traktować plazmą przez 10 s, wykonując ciągły ruch w przód i w tył z prędkością około 5 mm/s.
      7. Środkową warstwę PDMS należy traktować przez 10 s, stosując ten sam ruch i odległość.
      8. Bezpośrednio przed łączeniem górną warstwę należy poddać dodatkowej, 1-sekundowej obróbce plazmowej.
    4. Łączenie warstwy górnej i środkowej
      1. Bezpośrednio po obróbce plazmowej należy wyrównać górny mikrokanał z krążkiem dentyny.
      2. Należy połączyć warstwę górną i środkową.
      3. Połączony zespół należy umieścić w piecu w temperaturze 75°C na 5 min.
      4. W czasie inkubacji następuje konsolidacja połączenia.
        UWAGA: Krążek dentyny i mikrokanał są widoczne gołym okiem i można je wyrównać bez dodatkowych narzędzi pomocniczych.
    5. Wytwarzanie portów dolnego mikrokanału
      1. Przez połączone warstwy górną i środkową należy wykonać dwie perforacje odpowiadające dolnemu mikrokanałowi.
      2. Wycinanie należy przeprowadzić przez obie warstwy jednocześnie, aby zapewnić ich wyrównanie.
        UWAGA: Ta procedura powoduje powstanie czterech perforacji w warstwie górnej i dwóch perforacji w warstwie środkowej.
      3. Przed wycinaniem połączony zespół należy położyć na twardej macie do cięcia.
      4. Należy przyłożyć stały nacisk w dół jednym zdecydowanym ruchem.
        UWAGA: Należy unikać sił obrotowych lub bocznych, aby zminimalizować ryzyko rozwarstwienia.
      5. Resztki z miejsc perforacji należy usunąć za pomocą sterylnej gazy beztkaninowej zwilżonej alkoholem izopropylowym.
      6. Perforacje i otaczające je obszary połączeń należy sprawdzić w odpowiednim oświetleniu.
      7. Przed przejściem dalej należy potwierdzić brak rozwarstwień, rozdarć lub niepełnych perforacji.
    6. Łączenie warstwy dolnej
      1. Warstwę dolną należy poddać obróbce plazmowej zgodnie z opisem w kroku 2.7.4.
      2. Porty wlotowe i wylotowe dolnego mikrokanału należy wyrównać z perforacjami w warstwach górnej i środkowej.
      3. Należy przyłączyć warstwę dolną, aby zakończyć montaż urządzenia.
        UWAGA: Przed łączeniem warto zaznaczyć miejsca wlotów i wylotów na zewnętrznej powierzchni warstwy dolnej, aby ułatwić wyrównanie.
        UWAGA: Komory plazmowe mogą zapewniać silniejsze wiązanie niż pisaki plazmowe, jak doniesiono w literaturze36.
        UWAGA: Gotowe urządzenie składa się z trójwarstwowej platformy mikrofluidycznej z interfejsem dentynowym (Rysunek 1H). Dolna powierzchnia dentyny reprezentuje stronę miazgi modelu, natomiast górna powierzchnia dentyny reprezentuje stronę koronarną do ekspozycji na biomateriały stomatologiczne lub preparaty bakteryjne.
  8. Testowanie szczelności urządzenia mikrofluidycznego
    1. Inspekcja zmontowanego urządzenia
      1. Zmontowane urządzenie należy sprawdzić pod kątem przesunięć.
      2. Zmontowany układ należy sprawdzić pod kątem niepełnego połączenia i widocznych wycieków.
    2. Testowanie szczelności
      1. Do portów wlotowych należy podłączyć igły Luer-lock 19G (Rysunek 1E).
      2. Igły należy podłączyć do przewodów pompy mikrofluidycznej.
      3. Złącza igieł należy delikatnie docisnąć do wyciętych portów, aby uzyskać szczelne dopasowanie.
      4. Należy wstrzyknąć sterylny PBS lub pożywkę hodowlaną z przepływem 10 µL/min.
      5. Przepływ cieczy należy utrzymać przez co najmniej 5 min.
      6. Podczas przepływu należy kontrolować wszystkie interfejsy łączone, krawędzie kanałów i brzegi krążka dentyny.
      7. Urządzenie należy obserwować w odpowiednim oświetleniu podczas i po wstrzykiwaniu.
      8. Należy potwierdzić brak gromadzenia się cieczy, zawilgocenia lub tworzenia się kropel.
      9. Jeśli nie wykryto wycieków, urządzenie uznaje się za szczelne.
      10. Urządzenia wykazujące nieszczelności należy odrzucić.
        UWAGA: Test szczelności należy przeprowadzić na każdym wykonanym urządzeniu przed zasiewaniem komórek lub użyciem eksperymentalnym.
  9. Sterylizacja i przechowywanie urządzenia mikrofluidycznego
    1. Sterylizacja
      1. Górną powierzchnię zmontowanego urządzenia należy naświetlać światłem UV (254 nm) przez 30 min wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.
      2. Powierzchnię dolną należy naświetlać światłem UV przez kolejne 30 min.
      3. Mikrokanały należy płukać 70% etanolem przez 20 min.
      4. Mikrokanały należy przemyć trzy razy sterylnym PBS, aby usunąć pozostałości etanolu.
    2. Przechowywanie
      1. Zasterylizowane urządzenie należy wykorzystać niezwłocznie do eksperymentów z kulturą komórek.
      2. Alternatywnie urządzenie można przechowywać zanurzone w sterylnym PBS w temperaturze 4°C w sterylnym pojemniku do czasu użycia.
        ​OSTROŻNIE: Po montażu urządzenia nie wolno używać chloraminy ani innych roztworów dezynfekujących, ponieważ PDMS może absorbować te związki, co może pogorszyć żywotność komórek.

3. Ocena adhezji i żywotności mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba

  1. Przygotowanie powierzchni dentyny
    1. Wstrzyknąć 10% EDTA do urządzenia.
    2. Utrzymać kontakt roztworu EDTA z powierzchnią dentyny przez 15 min.
    3. Wstrzykiwać 0,5 mL EDTA co 3 min, aby utrzymać ruch cieczy w mikrokanale.
    4. Przemyć dysk dentynowy trzy razy wodą ultrapure.
    5. Każde płukanie powinno trwać 5 min.
      UWAGA: Obróbka EDTA usuwa warstwę smear layer i odsłania białka macierzy dentynowej.
      OSTROŻNIE: Roztworami EDTA należy posługiwać się w rękawiczkach i okularach ochronnych, aby uniknąć podrażnienia skóry i oczu.
  2. Wysiew komórek macierzystych miazgi zęba
    1. Ekspansja komórek macierzystych miazgi zęba
      1. Wysiać komórki macierzyste miazgi zęba do kolby T75 w zagęszczeniu 1 × 106 komórek na kolbę.
      2. Inkubować komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2 do osiągnięcia około 80% konfluencji.
      3. Odczepić komórki za pomocą trypsyny.
      4. Zneutralizować trypsynę za pomocą pełnej pożywki hodowlanej.
      5. Odwirować zawiesinę komórkową w celu uzyskania osadu komórkowego.
      6. Ocenić żywotność komórek za pomocą błękitu trypanu.
      7. Stosować zawiesiny komórkowe o żywotności ≥90%.
    2. Przygotowanie zawiesiny komórkowej
      1. Przygotować podgrzaną do 37°C zawiesinę komórkową.
      2. Dostosować stężenie komórek do poziomu 100 000 komórek/mL w pełnej pożywce hodowlanej.
      3. Przygotować końcową objętość zawiesiny wynoszącą 1–2 mL.
        UWAGA: W niniejszym badaniu użyto komórek w 5. pasażu.
    3. Wysiew komórek
      1. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do wlotu dolnego mikrokanału.
      2. Odwrócić urządzenie po wysiewie komórek
        UWAGA: Odwrócenie urządzenia sprzyja sedymentacji komórek w stronę powierzchni dentyny i zwiększa adhezję komórek.
    4. Inkubacja
      1. Umieścić odwrócone urządzenie w szalce Petriego.
      2. Dodać 1 mL pożywki hodowlanej do szalki Petriego, aby zminimalizować parowanie.
      3. Inkubować urządzenie w 37°C i 5% CO2 przez 24 h.
      4. Przez cały okres inkubacji utrzymać statyczne warunki hodowli.
        UWAGA: W niniejszym badaniu nie przeprowadzono walidacji przepływu dynamicznego.
        UWAGA: Niniejszy protokół opisuje statyczne warunki hodowli w celu wstępnej walidacji urządzenia i oceny adhezji komórek.
    5. Wstępna walidacja urządzenia
      1. Ocenić adhezję komórek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
      2. Przed analizą odzyskać dysk dentynowy poprzez demontaż urządzenia.
  3. Przygotowanie próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej
    1. Odzyskiwanie i płukanie próbek
      1. Zdemontować urządzenie po 24 h inkubacji.
      2. Odzyskać dysk dentynowy i przenieść go na płytkę hodowlaną lub do szalki Petriego.
      3. Ułożyć dysk tak, aby wysiany komórkami obszar dentyny był skierowany do góry.
      4. Przemyć dysk dentynowy dwukrotnie za pomocą 1 mL PBS.
    2. Fiksacja
      1. Dodać 2 mL 2,5% glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym Sorensena.
      2. Inkubować próbkę przez 30 min w RT.
        OSTROŻNIE: Glutaraldehyd jest toksyczny i może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. Procedury fiksacji należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej.
    3. Płukanie po fiksacji
      1. Usunąć roztwór glutaraldehydu.
      2. Przemyć dysk dentynowy trzy razy ultrapure wodą destylowaną w RT.
    4. Analiza SEM
      1. Przeanalizować próbki za pomocą środowiskowego skaningowego mikroskopu elektronowego.
      2. Użyć mikroskopu w warunkach niskiej próżni (25 Pa).
      3. Zastosować napięcie przyspieszające 10,0 kV i odległość roboczą 7,0 mm.
      4. Pozyskać obrazy w trybie detekcji 3D elektronów wstecznie rozproszonych (BSE-3D).
      5. Wykonać zdjęcia przy powiększeniu ×200 (Rysunek 2A).
  4. Ocena żywotności komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej
    1. Przygotowanie próbek
      1. Wysiać i hodować komórki zgodnie z opisem w punkcie 3.2.
      2. Inkubować urządzenie przez 24 h w 37°C i 5% CO2.
      3. Zdemontować urządzenie i odsłonić powierzchnię dentyny.
      4. Przenieść dysk dentynowy na płytkę wielodołkową zawierającą podgrzany HBSS+/+ uzupełniony o Ca2+ i Mg2+.
    2. Płukanie próbek
      1. Przemyć dysk dentynowy dwukrotnie HBSS+/+.
      2. Przed barwieniem usunąć resztki surowicy i czerwieni fenolowej.
        UWAGA: Pozostałości surowicy i czerwieni fenolowej mogą zwiększyć tło autofluorescencji.
    3. Barwienie komórek żywych
      1. Przygotować świeży roztwór roboczy Calcein AM o stężeniu 2 µM w HBSS+/+.
      2. Dodać wystarczającą ilość roztworu barwiącego, aby całkowicie pokryć powierzchnię dentyny.
      3. Inkubować próbkę przez 20 min w 37°C w ciemności.
      4. Po inkubacji usunąć roztwór barwiący.
    4. Barwienie komórek martwych
      1. Dodać roztwór roboczy jodku propidyny (1–2 µg/mL w HBSS+/+).
      2. Inkubować próbkę przez 5–8 min w 37°C w ciemności.
      3. Nie przekraczać 10 min inkubacji.
      4. Przemyć próbkę dwukrotnie HBSS+/+.
      5. Przechowywać próbkę zanurzoną w buforze aż do momentu obrazowania.
    5. Pozyskiwanie obrazów mikroskopią konfokalną
      1. Pozyskać obrazy konfokalne w ciągu 30 min od barwienia.
      2. Pozyskiwać obrazy sekwencyjnie w kanałach zielonym i czerwonym.
      3. Do obrazowania komórek żywych użyć λex 490 nm i λem 515 nm.
      4. Do obrazowania komórek martwych użyć λex 535 nm i λem 617 nm.
        ​UWAGA: Fluorescencyjne roztwory barwiące oraz zbarwione próbki należy chronić przed światłem podczas procedur inkubacji i obrazowania (Rysunek 2B).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Reprezentatywna ocena adhezji i żywotności mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba w urządzeniu OoC kompleksu miazga-zębina. (A) Obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego przedstawiający adherentne komórki macierzyste miazgi zęba (biała gwiazdka) na powierzchni zębiny po 24 h statycznej hodowli w urządzeniu OoC. Po 24 h hodowli adherentne komórki pokrywały 54,35 ± 0,92% powierzchni zębiny wystawionej na mikrokanał. W obszarze zębiny pokrytym PDMS (czarna gwiazdka) nie obserwuje się komórek, co wskazuje na skuteczne uszczelnienie między warstwami urządzenia. Pasek skali = 200 µm. (B) Obraz z mikroskopii konfokalnej przedstawiający żywe komórki macierzyste miazgi zęba zabarwione na zielono i przytwierdzone do powierzchni zębiny (białe strzałki) po 24 h statycznej hodowli. Obserwuje się również martwe komórki zabarwione na czerwono (niebieskie strzałki). Pasek skali = 50 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne wykonanie urządzenia tooth-on-a-chip przebiegało zgodnie z schematem przedstawionym na Rysunku 1A–1I, obejmując przygotowanie krążka dentynowego (Rysunek 1D), wykonanie formy metodą fotolitografii (Rysunek 1E), usunięcie utwardzonych warstw PDMS (Rysunek 1F), aktywację plazmową przed wiązaniem (Rysunek 1G), montaż końcowego urządzenia (Rysunek 1H) oraz podłączenie urządzenia do układu mikroprzepływowego (Rysunek 1I). Powstałe urządzenie składało się z trójwarstwowego zestawu PDMS, w którym krążek dentynowy został w pełni zintegrowany z warstwą środkową, a górny i dolny mikrokanały znajdowały się po obu stronach powierzchni dentyny (Rysunek 1H).

Pozytywny wynik na tym etapie charakteryzował się brakiem widocznych pęcherzyków powietrza lub rozwarstwienia oraz szczelnym przepływem cieczy po wstrzyknięciu PBS lub pożywki hodowlanej przez porty wlotowe (Rycina 1I). Niewspółosiowość portów mikrokanałów, niepełne wiązanie plazmowe lub nieszczelność na styku dentyna–PDMS świadczyły o niepowodzeniu procesu montażu i wymagały powtórzenia procedury wykonania.

Wykonano łącznie 30 urządzeń, z których około 20% uległo awarii podczas produkcji lub testów. Awarie były związane przede wszystkim z wyciekiem płynu poza granice mikrokanału z powodu niepełnego wiązania plazmowego, natomiast mniejsza część awarii wynikała z delaminacji w innych obszarach urządzenia. Żadnych awarii nie przypisano wyciekom na styku zębiny i PDMS ani błędnemu ustawieniu wlotowych i wylotowych portów mikrokanału.

Po 24 h hodowli statycznej pomyślne wysiewanie komórek potwierdzono poprzez obecność przylegających komórek macierzystych miazgi zęba o morfologii fibroblastycznej na powierzchni dentyny. Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwoliła na ocenę zarówno adhezji komórek, jak i integralności urządzenia (Rycina 2A). Stosując niniejszy protokół, komórki przylegające pokryły 54,35 ± 0,92% powierzchni dentyny wystawionej na działanie mikrokanału po 24 h hodowli. Pozytywny wynik potwierdzono obecnością komórek przylegających wyłącznie w obszarze mikrokanału, podczas gdy powierzchnia dentyny pokryta PDMS pozostała wolna od przytwierdzenia komórek (Rycina 2A). Taki rozkład przestrzenny potwierdził skuteczne uszczelnienie pomiędzy warstwami urządzenia oraz prawidłowy montaż urządzenia. Odwrotnie, obecność komórek poza granicami mikrokanału świadczyła o nieszczelności i powinna być uznana za wynik negatywny.

Mikroskopia konfokalna z zastosowaniem barwienia żywe/martwe umożliwiła niedestrukcyjną ocenę żywotności komórek wewnątrz urządzenia. Wynik pomyślny charakteryzował się przewagą komórek żywych wykazujących zieloną fluorescencję i morfologię fibroblastyczną, przy jedynie sporadycznym występowaniu komórek martwych zabarwionych na czerwono (Rysunek 2B). W przeciwieństwie do tego, wysoki odsetek komórek martwych wskazywałby na suboptimalne przygotowanie dentyny, niewystarczające płukanie lub nieodpowiednie warunki hodowli.

Podczas optymalizacji protokołu oceniono początkową strategię wykonania, w której do pozycjonowania krążka dentyny w środkowej warstwie PDMS wykorzystano stałą formę z wcześniej zdefiniowanym wgłębieniem (Ryc. 3A). Chociaż podejście to miało na celu standaryzację rozmieszczenia krążka i ograniczenie przecieków na styku krążek–PDMS, w praktyce okazało się ono nieefektywne. Ponieważ obszar odpowiadający wgłębieniu na krążek dentyny musiał być ręcznie wycinany z utwardzonej warstwy PDMS, nie można było niezawodnie uzyskać precyzyjnego dopasowania krawędzi krążka do wyciętych brzegów PDMS, co prowadziło do powstania szczelin międzyfazowych powodujących przecieki w około 50% wykonanych urządzeń (Ryc. 3A).

figure-results-1
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy ilustrujące nieudane podejścia do wykonania urządzenia, zidentyfikowane podczas optymalizacji urządzenia OoC kompleksu miazga–zębina. (A) Forma silikonowa zawierająca stałe zagłębienia zaprojektowane do standaryzowanego pozycjonowania krążków zębiny (białe strzałki). Ze względu na nieuniknioną zmienność wymiarów krążków zębiny wynikającą z ręcznego przygotowania próbek, nie udało się osiągnąć niezawodnego dopasowania do stałej geometrii formy, co prowadziło do powstania szczelin międzyfazowych i wycieków w około 50% wykonanych urządzeń. (B) Obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego powierzchni zębiny po nałożeniu materiału uszczelniającego na styku krążek–PDMS. Wskazano odsłoniętą zębinę (czarna gwiazdka) oraz osady materiału uszczelniającego (biała gwiazdka). Niezamierzone rozprzestrzenienie się materiału uszczelniającego na powierzchnię zębiny upośledziło adhezję komórek i zmniejszyło powierzchnię dostępną do kolonizacji komórkowej. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby wyeliminować to ograniczenie, na styku krążka i PDMS zastosowano materiał uszczelniający. Podejście to wprowadziło jednak dodatkową wadę, ponieważ materiał uszczelniający rozlał się na powierzchnię dentyny i uniemożliwił adhezję komórek w obszarach pokrytych tym materiałem, co wykazano w badaniu za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (Rysunek 3B). Te nieoptymalne wyniki uwydatniły dwa krytyczne ograniczenia pierwotnej strategii wykonania: niewystarczające dopasowanie między wyciętym ręcznie wgłębieniem w PDMS a krążkiem dentyny oraz ograniczoną adhezję komórek związaną ze stosowanym materiałem uszczelniającym.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie opisuje szczegółowy protokół wytwarzania pionowo ułożonego urządzenia tooth-on-a-chip, zawierającego zębinę oraz komórki macierzyste miazgi zęba, i demonstruje reprezentatywną adhezję oraz żywotność komórek wewnątrz urządzenia w warunkach hodowli statycznej. Protokół został opracowany w celu zapewnienia powtarzalnego schematu pracy dla wytwarzania i montażu platformy OoC kompleksu zębina–miazga, odpowiedniej do badań in vitro interfejsu zębiny. Ustanowienie takiego schematu pracy jest szczególnie istotne, ponieważ nasz niedawny przegląd systematyczny wykazał, że dziedzina modeli mikrofluidycznych dla kompleksu zębina–miazga znajduje się w fazie początkowej, charakteryzującej się dużą heterogenicznością metodologiczną w zakresie architektury urządzeń i materiałów, co poważnie ogranicza powtarzalność i standaryzację obecnych modeli tooth-on-a-chip34. Poprzez dostarczenie szczegółowego i powtarzalnego protokołu, niniejsze badanie eliminuje te ograniczenia i przyczynia się do rozwoju lepiej zdefiniowanych modeli biologicznych. W szerszym kontekście rozwoju OoC zastosowanego w biologii jamy ustnej, França i współpracownicy15 zapoczątkowali tę dziedzinę mikrofluidycznym modelem tooth-on-a-chip zawierającym dyski zębinowe i komórki odontoblastopodobne, wykazując możliwość odtworzenia interfejsu zębina–miazga w dynamicznym środowisku mikrofluidycznym oraz oceny odpowiedzi cytotoksycznej na materiały stomatologiczne. Od tego przełomowego wkładu w literaturze opisano coraz większą liczbę platform oralnych OoC34, odnoszących się do różnych aspektów biologii tkanek zębowych, interakcji biomateriałowych oraz mikrobiologii jamy ustnej, co ugruntowało to podejście jako aktywną i szybko rozwijającą się dziedzinę badań. Przedstawiony protokół wnosi wkład w ten obszar, dostarczając szczegółowy i powtarzalny schemat wytwarzania platformy tooth-on-a-chip o pionowej strukturze, dostępnej dla grup badawczych dysponujących standardowymi możliwościami mikrofluidycznymi.

Kilka etapów protokołu jest krytycznych dla pomyślnego wykonania i działania urządzenia. W szczególności wylewanie PDMS na formę wymaga dokładnej kontroli w celu uzyskania jednolitej grubości warstwy i właściwego ukształtowania mikrokanałów. Grubość warstw PDMS powinna być dobrana w zależności od zamierzonego zastosowania końcowego. Na przykład mikroskopia konfokalna wymaga odpowiednio cienkich warstw PDMS, aby umożliwić wizualizację optyczną komórek przylegających do powierzchni zębiny. Jednakże cieńsze warstwy mogą być trudniejsze w manipulacji podczas procedur wykonania i montażu. W konsekwencji optymalizacja grubości PDMS stanowi istotny kompromis między dostępnością do obrazowania a praktyczną obsługą podczas wytwarzania urządzenia. Ponadto w niniejszym badaniu mikroskopia konfokalna nienaruszone urządzeń nie była możliwa, ponieważ warstwa PDMS pokrywająca komórki miała grubość 0,4 mm, co przekraczało głębokość penetracji dostępnego mikroskopu konfokalnego (0,2 mm). W rezultacie obrazowanie konfokalne przeprowadzono po demontażu urządzenia i bezpośredniej ekspozycji powierzchni zębiny. Dodatkowo mikroskopia fluorescencyjna nie była możliwa do zastosowania w tym urządzeniu, ponieważ naturalna nieprzezroczystość zębiny uniemożliwiała bezpośrednią wizualizację optyczną komórek przylegających do jej powierzchni.

Ograniczenie to jest szczególnie istotne w przypadku konfiguracji OoC o układzie pionowym, w których mikrokanał zawierający komórki znajduje się pod krążkiem dentyny, co powoduje, że dostęp optyczny jest utrudniony zarówno przez znajdującą się powyżej warstwę PDMS, jak i przez nieprzezroczystość samej dentyny. Ograniczenie to nie występuje w projektach chipów o układzie poziomym, gdzie mikrokanały biegną bocznie obok dentyny, a nie pod nią, co umożliwia bezpośredni dostęp optyczny do powierzchni zasianej komórkami bez zakłóceń wynikających z nieprzezroczystości dentyny lub grubości PDMS. Wybór między konfiguracją pionową a poziomą powinien zatem uwzględniać nie tylko wymagania płynowe i biologiczne, ale także dostępne w laboratorium metody obrazowania. W systemie OoC projekt urządzenia odgrywa istotną rolę, a mikrośrodowisko musi być utrzymywane jak najbliżej warunków in vivo. Podobnie jak większość tkanek, ząb jest poddawany bodźcom mechanicznym i wykazuje zachowanie anizotropowe35, co oznacza, że jego właściwości różnią się w zależności od kierunku przyłożonego bodźca. Ponadto istnieją różnice histologiczne między koronalną częścią kompleksu dentyna-miazga, gdzie dentyna i odontoblasty są ułożone pionowo, a częścią boczną, gdzie odontoblasty znajdują się obok dentyny, z wyraźnymi różnicami w liczbie komórek, ich organizacji oraz orientacji kanalików dentynowych. Projekt chipa o układzie pionowym zapewnia zatem bardziej wierną reprezentację anatomiczną zmian próchnicowych i materiałów restauracyjnych wpływających na aspekt koronalny kompleksu dentyna-miazga.

Precyzyjna obróbka powierzchni plazmą jest niezbędna dla pomyślnego montażu urządzeń i pozostaje jednym z głównych wyzwań w produkcji chipów36. W niniejszym badaniu w 20% wykonanych urządzeń wystąpiła delaminacja. Wynik ten nie jest zaskakujący, ponieważ wiązanie PDMS–PDMS uzyskiwane za pomocą ręcznego pióra plazmowego, zastosowanego w obecnej pracy, generuje niższą koncentrację reaktywnych form tlenu niż systemy komór plazmowych próżniowych, które pozwalają na osiągnięcie stężeń tlenu powyżej poziomu atmosferycznego, a w konsekwencji tworzą większą liczbę kowalencyjnych grup powierzchniowych dostępnych do wiązania36. W rezultacie wytrzymałość wiązania osiągnięta przy użyciu pióra plazmowego jest z natury niższa i mniej powtarzalna niż ta uzyskiwana w dedykowanej komorze plazmowej, co prawdopodobnie przyczyniło się do zaobserwowanego wskaźnika delaminacji. Optymalizacja strategii integracji z dentyną wymagała również wielokrotnych iteracji procesu wytwarzania, aby uzyskać ścisły kontakt między dyskiem dentynowym a środkową warstwą PDMS przy jednoczesnym zminimalizowaniu wycieków. Początkowe podejście polegało na wykonaniu w środkowej warstwie zdefiniowanego wcześniej zagłębienia do umieszczenia dentyny; jednak ręczne wycinanie zagłębienia uniemożliwiło spójne dopasowanie dysku dentynowego do krawędzi PDMS, co prowadziło do wycieków podczas wstrzykiwania pożywki hodowlanej i skutkowało ogólnym wskaźnikiem sukcesu produkcji na poziomie około 50%.

Następnie oceniono zastosowanie kleju do protez w celu poprawy uszczelnienia na styku dentyna–PDMS, jednak skaningowa mikroskopia elektronowa wykazała zakłócenia w adhezji komórek oraz utrudnioną wizualizację komórek na powierzchni dentyny. W związku z tym zoptymalizowano ostateczny protokół poprzez umieszczenie krążka dentynowego bezpośrednio w formie przed starannym odlewaniem PDMS wokół próbki, co poprawiło integrację krążka dentynowego z urządzeniem i zmniejszyło potrzebę stosowania dodatkowych materiałów uszczelniających. Podejście to skutecznie wyeliminowało przecieki na styku dentyna–PDMS, zapewniając ścisły i dopasowany kontakt między krawędziami krążka dentynowego a otaczającym go PDMS, bez polegania na wtórnych środkach uszczelniających, które mogłyby zakłócać adhezję komórek do powierzchni dentyny. Należy również wziąć pod uwagę kilka ograniczeń niniejszej metody. Wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych wciąż w części zależy od procedur manualnych, co może wprowadzać zmienność między urządzeniami i operatorami. Chociaż fotolitografia zapewnia wysoką precyzję i powtarzalność w wytwarzaniu geometrii mikrokanałów, proces ten może wymagać specjalistycznego sprzętu i wiedzy technicznej. Alternatywne podejścia do wytwarzania, w tym techniki druku trójwymiarowego, mogą ułatwić prototypowanie urządzeń i zwiększyć dostępność dla niektórych laboratoriów; jednak czynniki takie jak rozdzielczość druku, pozostałości monomerów i biokompatybilność materiałów wymagają starnej optymalizacji37.

Ciągłe dostarczanie pożywki zapewnia komórkom stabilne środowisko i chroni je przed gromadzeniem się produktów przemiany materii lub zaburzeniami równowagi wapniowo-fosforowej16. Liczne badania wykazały, że naprężenia ścinające indukowane stałym przepływem mogą symulować procesy mechanotransdukcji podobne do sygnalizacji in vivo, które są kluczowymi czynnikami determinującymi zachowanie komórek38,39, przyczyniając się do różnicowania i dojrzewania komórek oraz indukując znaczące zmiany w ich morfologii, ekspresji genów i funkcji39. Niniejsze badanie opisuje wykonanie i wstępną walidację urządzenia, wykazując adhezję i żywotność komórek po 24 h w warunkach hodowli statycznej; w związku z tym nie oceniano wpływu dynamicznego przepływu. Wprowadzenie warunków dynamicznego przepływu stanowi ważny kierunek przyszłych badań i zostanie omówione w kolejnych pracach. Przedstawiony protokół zapewnia powtarzalny schemat wytwarzania urządzenia OoC z pionowo ułożonym kompleksem miazga–zębina, zawierającego zębinę w obrębie trójwarstwowej platformy mikroprzepływowej z PDMS. Potencjalne zastosowania modelu obejmują badanie oddziaływań między zębiną a biomateriałem, odpowiedzi komórkowych na materiały stomatologiczne oraz ocenę in vitro interfejsu miazga–zębina w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych oraz brak konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza praca była wspierana przez Projekt DIM24-0004 i Projekt PP24-0031, Dirección de Investigación, Universidad de La Frontera; FONDECYT Regular nr 1260116 oraz FONDECYT de Iniciación nr 11230701, Narodowa Agencja Badań i Rozwoju (ANID), Chile.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały biologiczne i chemiczne
AcetonExpertQSOLV 8Czyszczenie wafla krzemowego
podłoże hodowlane Alpha MEMCytivaSH30265.02Pożywka do hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba
Chloramina (0,5%)Merck7080-50-4Roztwór do przechowywania krążków dentynowych
Macierzyste komórki miazgi zębaNie dotyczyNie dotyczyPierwotna hodowla komórek. Patrz kroki 3.2.1 i 3.2.2
EDTA (10%)WinklerN2222158EUsuwanie warstwy przesmarowania
Negatywowy fotorezyst na bazie epoksyduGersteltecGM1060Wytwarzanie form metodą fotolitografii
Glutaraldehyd (2,5%) w buforze Sorensena 0,1 M’bufor fosforanowySigma-Aldrich210908-06utrwalanie do SEM
Zdrowe ludzkie zęby (trzonowce lub przedtrzonowce)Nie dotyczyNie dotyczyPróbka ludzka
IzopropanolExpertQSOLV 16Czyszczenie wafla, zatrzymywanie wywoływania i czyszczenie PDMS
Zestaw do oceny żywotności LIVE/DEADSigma-Aldrich451Barwienie fluorescencyjne żywotności. 
PBS (bufor fosforanowy)Corning46-013-CMMycie i test szczelności
Baza i czynnik sieciujący PDMS (polidimetylosiloksan)DowSylgard 184Wytwarzanie urządzenia
PGMEASigma Aldrich484431Wywoływanie fotorezystu
Błękit trypanuSigma Aldrich T8154-100mlOcena żywotności komórek
TrypsynaCorning25-053-CIOdrywanie komórek
Woda ultrazczystaCytivaSH30529.01Roztwór piorący
Materiały eksploatacyjne i sprzęt laboratoryjny
igły do strzykawek 19GVmaticVCB19050Podłączenie urządzenia do mikropompy lub strzykawki
Wyciśnik do biopsji (średnica: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Wykonanie portów wlotowych i wylotowych
Mata do cięciaNicecoolNie dotyczyOchrona powierzchni podczas wykrawania
Dyski do wykańczania stomatologicznego (np. Sof-Lex)3MSof-LexPolerowanie dentyny
Adaptery z gniazdem Luer na kolceRunze FluidicsRH-M016Połączenie rurek
Szklany lub plastikowy pręt do mieszaniaDuranNie dotyczyMieszanie PDMS
Strzykawki podskórneŻurawinapc-12246Wysiew komórek i test szczelności
Sterylna gaza niepozostawiająca włókienLindersonNie dotyczyUsuwanie resztek po wycinaniu
Adaptery Luer męskieRunze FluidicsRH-G016Połączenie przewodów
Naczynie do mieszaniaDuranNie dotyczyPrzygotowanie PDMS
Szalka Petriego (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219Hodowla komórkowa/inkubacja
Podłoże z politetrafluoroetylenuCCTValNie dotyczyWytwarzanie pośredniej warstwy dentynowej
Wafer krzemowyJiaozuo Commercial FineWinNie dotyczyWytwarzanie form
Rurka silikonowaRunze Fluidics96421Połączenie płynowe
kolba T75Corning 353136Ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba
Płytka wielodołkowaSPL Life Sciences30006Barwienie konfokalne i przygotowanie do obrazowania
Sprzęt i instrumenty
Osuszacz powietrzaMETALPLANTITAN-040Osuszanie sprężonego powietrza
Źródło sprężonego powietrzaSCHULZCSD-18.1Czyszczenie form i powierzchni
Mikroskop konfokalnyOlympusNie dotyczyModel: FV1000
System bezpośredniej litografii laserowejHeidelberguPG 101Naświetlanie fotorezystu
Skaningowy mikroskop elektronowy z komorą środowiskowąHitachiNie dotyczyModel: Quanta 400 
Głowica szybkozrotowaNakanishiNie dotyczyModel: Pana-max2
Płyta grzewczaLabTechEH20A PlusWygrzewanie wafla i wygrzewanie fotorezystu
Dygestorium z laminarnym przepływem powietrzaBioBaseBBS8V1708313DSterylizacja urządzeń
Pompa mikroprzepływowaNowa EraNie dotyczyModel: 1002X-ES. Badanie szczelności przy 10 µl/min
Forma mikrostrukturalna (wykonana metodą fotolitografii)CCTValNie dotyczySpecyfikacje dotyczące wykonania formy znajdują się w kroku 2.2
Piec lub inkubatorMemmertUN110Utwardzanie PDMS w temperaturze 50°C°C i konsolidacja wiązań w 75°C
Komora do czyszczenia plazmowego w próżniPlazma FariGD-5Aktywacja wafli plazmą
Ręczne urządzenie do plazmy koronowej Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACAktywacja plazmowa PDMS
SonikatorElma SonicS 10 (H)Czyszczenie wafla
Komora próżniowa lub eksykator (250 mm)WinglassNie dotyczyOdpowietrzanie PDMS
Pompa próżniowaKOŁYSARKA300Odgazowywanie PDMS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organ na chipieurz dzenie mikroprzep ywoweodlewanie PDMSfotolitografiaplazmowa modyfikacja powierzchnimezenchymalne kom rki macierzyste miazgi z baadhezja kom rkowamikroskopia konfokalna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły