Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
To badanie integruje farmakologię sieciową, dokowanie molekularne oraz symulację dynamik molekularnych (MD), aby wyjaśnić kluczowe aktywne składniki i cele terapeutyczne Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD) w zaburzeniach ze spektrum autyzmu (ASD), identyfikuje kluczowe reszty wiązania poprzez skanowanie alaninowe i sprawdza efekty w modelu szczurów z zaburzeniami ze spektrum autyzmu wywołanym kwasem walproinowym.
Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) to złożone zaburzenie neurorozwojowe, a jego patogeneza jest ściśle związana z przewlekłym zapaleniem ośrodkowego układu nerwowego. Jako klasyczna formuła medycyny tradycyjnej (TCM), Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD) jest stosowany w zaburzeniach neurorozwojowych i pamięci ze względu na jego zgłaszane działanie neuroprotekcyjne, jednak jego konkretny mechanizm molekularny w ASD pozostaje niejasny. Niniejsze badanie integruje farmakologię sieciową, analizę dokowania molekularnego i symulację MD w celu systematycznego wyjaśnienia rdzennych aktywnych składników i kandydatów do terapii dotyczących KSZZD dla ASD zarówno na poziomie układowym, jak i atomowym. Następnie kluczowe reszty wiązania są identyfikowane przez elastyczne skanowanie alaninowe, a efekty biologiczne są oceniane za pomocą modelu szczurów z ASD wywołanym kwasem walproinowym (VPA). Analiza farmakologii sieciowej wykazała, że kwercetyny, kluczowy składnik KSZZD, może działać częściowo poprzez regulację szlaku sygnalizacyjnego zapalnego pośredniczonego przez TNF-α. Wyniki dokowania molekularnego wykazały, że energie wiązania rdzennych składników KSZZD do ich celów były wszystkie niższe niż -5,0 kcal/mol, spośród których kwercetyny wykazywały najsilniejsze powinowactwo wiązania z TNF (-8,52 kcal/mol). Symulacja MD sugeruje, że kwercetyny mogą utrzymywać stabilne wiązanie z aktywną kieszenią TNF-α, a skanowanie alaninowe dodatkowo zidentyfikowało GLU104 i GLN102 jako kluczowe reszty aminokwasowe dla utrzymania stabilności strukturalnej kompleksu. Eksperymenty in vivo wykazały, że interwencja kwercetynami znacząco poprawiła zachowania lokomotoryczne i eksploracyjne u szczurów z ASD wywołanym VPA i skutecznie zmniejszyła poziomy ekspresji TNF-α w surowicy i tkankach mózgu. Te ustalenia sugerują, że kwercetyny mogą przyczyniać się do przewidywanych efektów KSZZD, przynajmniej częściowo, poprzez hamowanie szlaku sygnalizacyjnego TNF-α.
Zaburzenie Ze Spektru Autystycznego (ASD) jest złożonym zaburzeniem neurorozwojowym charakteryzującym się upośledzoną komunikacją społeczną, ograniczonymi zainteresowaniami i powtarzającymi się stereotypowymi zachowaniami1. Patologiczny mechanizm ASD jest bardzo złożony i obejmuje interakcję zmian genetycznych, regulacji epigenetycznej i czynników środowiskowych, które w efekcie prowadzą do upośledzonej plastyczności synaptycznej i nieprawidłowego połączenia obwodów nerwowych2,3. Przewlekłe zapalenie w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) odgrywa kluczową rolę w patogenezie ASD, a interwencje ukierunkowane na neurozapalenie stały się obiecującymi strategiami terapeutycznymi.
Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD), klasyczny wzór medycyny tradycyjnej, został po raz pierwszy opisany w Essential Prescriptions Worth a Thousand Gold for Emergencies. Składa się z czterech ziołowych składników: skorupy żółwia, kości smoka, korzenia Polygalae i kłącza Acori Tatarinowii. KSZZD jest tradycyjnie używany do tonizacji serca i nerek, uspokajania umysłu i stabilizowania ducha. Klinicznie jest powszechnie stosowany w leczeniu opóźnienia rozwoju intelektualnego i zaburzeń pamięci4. Współczesne badania farmakologiczne sugerują, że KSZZD i jego aktywne składniki wywierają działanie neuroprotekcyjne, przeciwzapalne i przeciwutleniające oraz mogą poprawiać naukę, pamięć i zachowania podobne do lęku w modelach zaburzeń neurorozwojowych5. Nasza analiza fitochemiczna wykazała, że kwercetyną i inne flawonoidy są kluczowymi aktywnymi składnikami tej formuły, które mogą przenikać przez barierę krew-mózg i wykazywać znaczne działanie przeciwzapalne6. Jednak mechanizm, za pomocą którego te aktywne składniki pośredniczą w terapeutycznych efektach KSZZD w ASD, pozostaje słabo poznany.
Dzięki szybkiemu rozwojowi bioinformatyki, techniki takie jak farmakologia sieciowa, dokowanie molekularne, symulacja dynamiki molekularnej i obliczenia chemii kwantowej dostarczyły potężnych narzędzi do wyjaśniania interakcji między aktywnymi składnikami medycyny tradycyjnej a celami chorobowymi na poziomie atomowym7,8,9,10,11. Dzięki integracji różnorodnych źródeł danych, farmakologia sieciowa umożliwia zbudowanie złożonej, interaktywnej sieci "składnik-cel-szlak" z perspektywy biologii systemowej, umożliwiając wstępne zidentyfikowanie kluczowych węzłów biologicznych dla interwencji w chorobach medycyny tradycyjnej.
Na tej podstawie, dokowanie molekularne może być dalej wykorzystane do symulowania pasowania geometrycznego i dopasowania energetycznego między składnikami a białkami docelowymi oraz przewidywania ich trybów wiązania i potencjalnej aktywności. Następnie przeprowadzana jest symulacja dynamiki molekularnej (MD), aby zbadać fluktuacje strukturalne i stabilność wiązania kompleksu w warunkach wodnych i fizjologicznych. W połączeniu z skanowaniem alaninowym, symulacja mutagenezy skierowanej na miejsce jest stosowana, aby dokładnie zlokalizować resztki rdzennych "gorących plam" odpowiedzialnych za utrzymanie powinowactwa wiązania oraz wyjaśnić wagę wkładu farmakoforu na poziomie aminokwasowym. Wreszcie, weryfikacja oparta na dobrze zaprojektowanych eksperymentach farmakologicznych może skutecznie ujawnić mechanizm molekularny leżący u podstaw działania terapeutycznego związków medycyny tradycyjnej na określone choroby.
Dlatego niniejsze badanie ma na celu przede wszystkim wyselekcjonowanie rdzennych składników i celów KSZZD w leczeniu ASD za pomocą farmakologii sieciowej. Następnie, w połączeniu z dokowaniem molekularnym, symulacją dynamiki molekularnej i elastycznym skanowaniem alaninowym, zostaną zidentyfikowane "gorące plamy resztkowe" utrzymujące stabilność kompleksu oraz zostanie oceniona dynamiczna interakcja między kwercetyna a TNF-α. Wreszcie, wyniki obliczeniowe zostaną zweryfikowane eksperymentalnie na modelu szczurów z ASD wywołanym VPA za pomocą ocen zachowania zwierząt, histopatologii mózgu i poziomów ekspresji czynników zapalnych. Niniejsze badanie ma na celu zbadanie potencjalnych mechanizmów, za pomocą których składniki pochodzące z KSZZD mogą wpływać na drogi zapalne związane z autyzmem z wieloskalowego punktu widzenia, zapewniając podstawę do dalszego badania interwencji medycyny tradycyjnej w zaburzeniach neurorozwojowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Analiza farmakologii sieciowej
Słowo kluczowe 'Autyzm' zostało użyte do wyszukania bazy GeneCards (https://www.genecards.org/) w celu znalezienia docelowych genów związanych z autyzmem12,13,14. Cele uzyskane z baz danych zostały połączone po usunięciu duplikatów. Znane cele aktywnych składników, które nie zostały uchwycone przez przewidywania baz danych, zostały uzupełnione na podstawie raportów literaturowych15. Cele chorobowe i potencjalne cele składników leków zostały jednolicie standaryzowane do Symboli Genów przy użyciu bazy danych białek UniProt (https://www.uniprot.org/), a te dwa zestawy celów zostały przemapowane, aby zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne KSZZD dla autyzmu16.
Na podstawie bazy danych farmakologii systemowej medycyny tradycyjnej chińskiej i platformy analitycznej (TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php), potencjalne aktywne biologicznie związki w KSZZD i ich odpowiednie cele zostały przesięte zgodnie z kryteriami biodostępności doustnej (OB ≥ 0,30) i wskaźnika podobieństwa do leków (DL ≥ 0,18)17. Identyfikatory SMILES związków zostały pobrane z bazy danych PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), a następnie zastosowano Swiss Target Prediction (http://swisstargetprediction.ch/), aby zbadać potencjalne cele nieuwzględnione w platformie TCMSP18. Następnie zastosowano dodatkowe przesiewanie za pomocą bazy danych HERB (http://herb.ac.cn) zgodnie z zasadą Lipinskiego, z następującymi kryteriami: masa cząsteczkowa (MW ≤ 500 Da), współczynnik rozdzielania oktanol/woda (AlogP ≤ 5), liczba donorów wiązań wodorowych (Hdon ≤ 5), liczba akceptorów wiązań wodorowych (Hacc ≤ 10) i liczba rotacyjnych wiązań (RBN ≤ 10). Następnie przesiewanie celów zostało przeprowadzone za pomocą bazy danych BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) z następującymi kryteriami: próg wartości (≥0,84), wynik drożności (≥0,10) i wartość P (≤0,05). W końcu zastosowano bazę danych UniProt (https://www.uniprot.org), aby przekonwertować wybrane nazwy celów na standardowe Symbole Genów.
Nakładające się cele między celami leków i celami autyzmu zostały zidentyfikowane za pomocą narzędzia online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be). Te nakładające się cele zostały zaimportowane do bazy danych STRING (https://string-db.org/) w celu skonstruowania sieci interakcji białko-białko (PPI)19. Gatunek został ustawiony na Homo sapiens, a interakcje białko-białko o wynikach poniżej 0,40 zostały wyfiltrowane. Wynikowa sieć została zaimportowana do oprogramowania Cytoscape 3.10.0 w celu analizy wizualnej16, gdzie leki, związki i cele były reprezentowane przez czerwone romby, niebieskie kółka i zielone trójkąty odpowiednio, a wagi krawędzi odzwierciedlały stopień centralności węzłów. Następnie zastosowano wtyczkę CytoNCA do obliczenia wartości stopnia centralności, sklasyfikowania głównych związków i zidentyfikowania głównych związków rdzeniowych. Analiza wzbogacenia bioinformatycznego genów docelowych została przeprowadzona za pomocą platformy Metascape20, obejmującą analizę GO (proces biologiczny, BP; funkcja molekularna, MF; składnik komórkowy, CC) oraz analizę ścieżek KEGG.
Dockowanie molekularne
Zidentyfikowane powyżej białka receptorowe związane z autyzmem zostały przetworzone przed dokowaniem poprzez naprawę brakujących reszty, optymalizację stanu protonacji i usunięcie cząsteczek wody krystalicznej, aby zachować integralność strukturalną receptora. Następnie zastosowano metodę półsztywnego dokowania w module CDOCKER21. Reszty w promieniu 10 Å od liganda współkrystalu zdefiniowano jako aktywną kieszeń, a symulacja wiązania ligand-receptor była przeprowadzana w tej okolicy.
Wyniki dokowania były oceniane na podstawie energii interakcji CDOCKER jako kluczowego wskaźnika, przy czym niższe wartości energii wskazywały na bardziej stabilne przewidywane wiązanie między ligandem a receptorem. Wiarygodność trybu dokowania była oceniana poprzez porównanie przestrzennej konformacji wiązania komponentu podstawowego z konformacją liganda współkrystalu w aktywnej kieszeni. Kompleks z optymalną energią wiązania i najsilniejszymi interakcjami był wybierany jako początkowa konformacja dla następnej symulacji dynamiki molekularnej.
Symulacja dynamiki molekularnej
Na podstawie wyników dokowania molekularnego przeprowadzono symulację dynamiki molekularnej w celu zbadania mechanizmu wiązania między kompleksem quercetyny a TNF-α. To podejście symuluje ruch molekularny i interakcje na poziomie atomowym oraz analizuje dynamiczne zmiany w białkach, ligandach i otaczającym środowisku, zapewniając informacje o zmianie konformacyjnej molekuł, stabilności wiązania i dynamice białko-ligand. Kompleks receptor-ligand został rozpuszczony za pomocą modelu wody TIP3P, z odległością buforową co najmniej 12 Å między kompleksem a granicą systemu, aby zapewnić pełne rozpuszczenie i zmniejszyć efekty gran
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Analiza wyników badań farmakologii sieciowej nad KSZZD w leczeniu autyzmu
Z bazy danych GeneCards pozyskano łącznie 15 770 docelowych genów związanych z autyzmem. Cele z wynikiem trafności ≥ 4,21 zostały wybrane jako potencjalne cele dla autyzmu, co dało 1014 docelowych genów chorobowych. 827 docelowych genów KSZZD zostało przeciętych z 1014 celami autyzmu i uzyskano 125 wspólnych docelowych genów. Wizualizacja została przeprowadzona za pomocą platformy SRplot
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Kluczowym pytaniem jest, dlaczego kwercetyna, a nie inne podstawowe składniki, została wybrana do walidacji eksperymentalnej i czy może reprezentować holistyczne działanie KSZZD. Wybór ten opierał się na następujących wskazówkach: (i) w prenatalnym modelu szczurów indukowanym VPA, kwercetyna znacząco zapobiegała deficiencji interakcji społecznych i oksydacyjnemu uszkodzeniu mózgu29; (ii) w modelu autyzmu indukowanym kwasem propionowym, doustne podanie kwercetyna obniżyło poziom TNF-α w mózgu i pop...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.
To dzieło jest częścią No.: Zun Shi Ke He HZ Zi (2024) No. 54. Tytuł projektu: Badanie nad efektem terapeutycznym Jiawei Kongsheng Zhenzhong Dan na autyzmie na podstawie szlaku sygnalizacyjnego BDNF-ERK-CREB.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0.5% CMC-Na normal saline solution | Not specified in manuscript | Not specified | Środek użyty dla grup blank/model i zawiesiny kwercetyny. |
| 0.9% normal saline | Not specified in manuscript | Not specified | Środek użyty dla wstrzyknięć matczynych blank-kontrolnych. |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Thermo Scientific Chemicals | J61899.AK | Używany do fiksacji tkanki mózgowej. |
| 75% alcohol | Not specified in manuscript | Not specified | Używany do czyszczenia urządzenia open-field między zwierzętami. |
| Absolute ethanol | Not specified in manuscript | Not specified | Używany do odwodnienia tkanki przed osadzeniem. |
| Alkaline water | Not specified in manuscript | Not specified | Używany do niebielenia sekcji pobarwionych hematoksyliną. |
| Amber14SB protein force field | Not specified in manuscript | Not applicable | Siłownik białkowy używany do symulacji dynamiki molekularnej. |
| BATMAN-TCM database | Not specified in manuscript | Not applicable | Baza danych do przesiewowego badania celów online: http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/ |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Używany do ilościowego oznaczania białek w homogenatach tkankowych. |
| Bluing reagent | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | Używany po barwieniu hematoksyliną do niebielenia jąder. |
| CDOCKER module | Not specified in manuscript | Not applicable | Półelastyczny moduł dokowania używany do dokowania molekularnego. |
| Clearing / dewaxing reagent | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | Clear-Rite 3, 6901 | Może być używany do klarowania i odparafinowania w procesach histologicznych. |
| CytoNCA plugin | Not specified in manuscript | Not applicable | Wtyczka Cytoscape używana do analizy centralności stopnia. |
| Cytoscape software | Not specified in manuscript | Version 3.10.0 | Używany do wizualizacji sieci i analizy interakcji białko-białko. |
| Discovery Studio software | Not specified in manuscript | Versions 2019 and 2021 | Używany do przetwarzania receptorów, dokowania i skanowania alaninowego. |
| Draw Venn Diagram online tool | Not specified in manuscript | Not applicable | Narzędzie online do diagramów Venna: http://bioinformatics.psb.ugent.be |
| Eosin-Y (alkoholowy) | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7111 | Używany do kontrastowania cytoplazmy w barwieniu H&E. |
| Fully automatic dehydrator | Not specified in manuscript | Not specified | Używany do stopniowego odwadniania utrwalonych tkanek mózgowych. |
| GeneCards database | Not specified in manuscript | Not applicable | Baza danych online używana do pobierania danych dotyczących autyzmu: https://www.genecards.org/ |
| GraphPad Prism software | Not specified in manuscript | Version 9.5 | Używany do analizy statystycznej i tworzenia wykresów. |
| Hematoxylin staining solution | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7211 | Używany do barwienia jąder w barwieniu H&E. |
| HERB database | Not specified in manuscript | Not applicable | Baza danych online używana do uzupełniającego badania związków: http://herb.ac.cn |
| Hydrochloric acid alcohol | Not specified in manuscript | Not specified | Używany do różnicowania podczas barwienia H&E. |
| Metascape platform | Not specified in manuscript | Not applicable | Platforma online używana do analizy wzbogacania GO i KEGG. |
| Microplate reader | Thermo Scientific | Multiskan FC, 51119000 | Używany do odczytywania absorbancji na 450 nm. |
| Microscope | Not specified in manuscript | Not specified | Używany do obserwacji sekcji mózgu pobarwionych H&E. |
| Microsoft Excel software | Microsoft | Not specified | Używany do losowania szczurów za pomocą funkcji RANDBETWEEN. |
| Mounting medium | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 4111 | Używany do nakładania szkiełek i trwałego osadzania pobarwionych sekcji. |
| Open field test apparatus | Not specified in manuscript | Not specified | 50 cm × 50 cm × 30 cm pudełko używane do testów behawioralnych. |
| Paraffin | Not specified in manuscript | Not specified | Używany do osadzania tkanki mózgowej w parafinie. |
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | Używany jako schłodzony bufor do homogenizacji tkanki. |
| PLIP interaction fingerprinting | Not specified in manuscript | Not applicable | Używany do analizy odcisków palców interakcji białko-ligand. |
| PubChem database | Not specified in manuscript | Not applicable | Baza danych online używana do pobierania identyfikatorów SMILES: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ |
| Quercetin | Not specified in manuscript | Not specified | Podawany przez żołądkę w dawce 100 mg/kg/dzień. |
| Rat TNF-α ELISA Kit | Invitrogen | ERA56RB | Odpowiedni do wykrywania TNF-α w surowicy i homogenacie tkankowym. |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 16R, 75004383 | Używany do wirowania surowicy i homogenatu tkankowego. |
| Schrödinger Suite software | Schrödinger, LLC | Version 2024 | Używany do budowy systemu symulacji dynamiki molekularnej. |
| SPF-grade Sprague-Dawley rats | Not specified in manuscript | Not specified | 3 samce i 3 samice szczurów użyte do ustanowienia modelu zwierzęcego. |
| SPSS software | Not specified in manuscript | Version 25.0 | Używany do analizy statystycznej. |
| SRplot platform | Not specified in manuscript | Not applicable | Platforma online używana do wizualizacji: https://www.bioinformatics.com.cn/ |
| STRING database | Not specified in manuscript | Version 12.0 | Używany do budowy sieci interakcji białko-białko: https://string-db.org/ |
| SwissTargetPrediction platform | Not specified in manuscript | Not applicable | Platforma online używana do przewidywania celów: http://swisstargetprediction.ch/ |