SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology): Zintegrowana platforma obliczeniowa do usprawnienia przepływu pracy w mikroskopii krioelektronowej

Haibin Liu; Yangyu Wu; Wenpeng Zhang; Qining Liu; Huaican Xu; Zhenqian Guo; Fanhao Meng; Xinyu Men; Allen Chunlong Guo

doi:10.3791/71725

Artykuł metodologiczny

SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology): Zintegrowana platforma obliczeniowa do usprawnienia przepływu pracy w mikroskopii krioelektronowej

DOI:

10.3791/71725

⸱

16 czerwca 2026

Haibin Liu¹ , Yangyu Wu² , Wenpeng Zhang¹ , Qining Liu¹ , Huaican Xu¹ , Zhenqian Guo² , Fanhao Meng² , Xinyu Men² , Allen Chunlong Guo¹

¹Shuimu BioSciences Ltd., ²Cryo-EM Center, Shuimu BioSciences Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia krok po kroku przepływ kryo-mikroskopii elektronowej przy użyciu zintegrowanej platformy oprogramowania (SMART), która łączy akwizycję danych, trójwymiarową rekonstrukcję i budowanie modelu atomowego w jednym interfejsie opartym na przeglądarce. Jako przykład struktura ludzkiego TRPML1 jest określana z rozdzielczością 2,38 Å

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia kriogeniczna (cryo-EM) stała się centralnym narzędziem w biologii strukturalnej, jednak obecne przepływy pracy zazwyczaj wymagają wielu wyspecjalizowanych pakietów oprogramowania do pozyskiwania danych, trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji i budowy modelu atomowego, co prowadzi do rozproszonych potoków pracy i częstych manualnych interwencji. Przedstawiamy SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology), zintegrowaną platformę oprogramowania, która łączy trzy moduły—DataSmart do automatycznego zbierania danych, CryoSmart do przetwarzania obrazów i rekonstrukcji 3D oraz ModelSmart do budowy modelu atomowego opartego na głębokim nauce—w jednolitej, dostępnej przez przeglądarkę interfejsie. Ten protokół zapewnia krokowe instrukcje dotyczące obsługi wszystkich trzech modułów. Przepływ pracy obejmuje zautomatyzowane nawigowanie przez próbki i pozyskiwanie danych, korekcję ruchu, estymację funkcji transferu kontrastu (CTF), wybieranie cząstek, dwuwymiarową (2D) klasyfikację, rafinację 3D, ulepszanie mapy i generowanie modelu atomowego. Jako przykład, zastosowaliśmy cały przepływ pracy do określenia struktury ludzkiego TRPML1, Ca²⁺⁺-przepuszczalnego lizosomalnego kanału kationowego, osiągając globalną rozdzielczość 2,38 Å przez złoty standard Fourier shell correlation (FSC) przy kryteriu 0,143. Wszystkie trzy moduły (DataSmart, CryoSmart i ModelSmart) zostały zastosowane sekwencyjnie do tego samego zestawu danych TRPML1 w ramach tego badania. Protokół jest zaprojektowany tak, aby był dostępny dla użytkowników o różnym poziomie doświadczenia w dziedzinie cryo-EM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia kriogeniczna elektronowa: ewolucja technologiczna i wpływ biologiczny. Określenie trójwymiarowej struktury białek pozostaje centralnym wyzwaniem w biologii molekularnej, ponieważ funkcja biologiczna jest ściśle związana z przestrzennym ułożeniem resztek aminokwasowych. Rozwikłanie tych konfiguracji strukturalnych jest niezbędne do odczytania mechanizmów enzymatycznych, interakcji ligandów i szlaków sygnałowych w komórkach na poziomie atomowym. To imperatywne wymóg napędzał przekształcające rozwój w mikroskopii kriogenicznej elektronowej (cryo-EM), która stała się powszechnie stosowaną techniką biologii strukturalnej¹^,².

Analiza kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek (SPA) służy jako potężne podejście do uzyskania biologicznych wglądów w różne typy próbek poprzez rozdzielcze struktury izolowanych kompleksów³. Obejmują one wirusy, białka błonowe, skręcone zespoły i inne dynamiczne i niejednorodne makrocząsteczki, obejmujące szeroki zakres rozmiarów molekularnych – od około 50 kDa do kilkudziesięciu megadaltonów.

Analiza SPA w krio-EM stała się filarem techniki do rozdzielania trójwymiarowych (3D) architektur makrocząsteczek biologicznych, obejmując trzy współzależne etapy komputerowego przetwarzania: akwizycję danych, odtworzenie 3D i budowanie modeli atomowych (Rysunek 1).

Podczas akwizycji danych, szkłowane próbki są obrazowe pod warunkami niskiej dawki promieniowania, aby wygenerować filmy mikroskopowe, rejestrując tysiące projekcji cząstek w stanie niemal natywnym. Te surowe zestawy danych są następnie przetwarzane przez iteracyjne algorytmy wyrównywania i klasyfikacji, aby odtworzyć mapy gęstości objętościowych. Wreszcie budowane są i udoskonalają modele atomowe, które pasują do gęstości, ujawniając interakcje molekularne na poziomie niemal atomowym.

Powyższa analiza pokazuje, że wynik cryo-EM reprezentuje jedynie punkt wyjściowy potoku strukturalnego. Przekształcanie tych surowych danych w interpretowalne modele atomowe wymaga kaskady wyspecjalizowanych narzędzi oprogramowania komputerowego. Dlatego też oprogramowanie służy jako kluczowy most, który przekształca surowe dane w modele atomowe.

Fragmentaryczny ekosystem oprogramowania krio-EM: obecne narzędzia i ograniczenia. Nowoczesne przepływy pracy w krio-EM opierają się na mozaice wyspecjalizowanych narzędzi oprogramowania, każde z nich obsługujące oddzielne etapy:

Akwizycja danych. Podczas gdy wiele pakietów oprogramowania do akwizycji danych krio-EM jest dostępnych publicznie – w tym Leginon⁴^,⁵, SerialEM⁶, UCSFImage4⁷, TFS EPU⁸^,⁹, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰, i Auto-EMation¹¹ – te narzędzia przeważnie wytwarzają surowe dane filmowe z ograniczonymi możliwościami przetwarzania po akwyzjicji. Krytyczne kroki przepływu pracy, takie jak ustawienie parametrów, dostosowanie szablonów, nadal wymagają pracochłonnych operacji manualnych, często wymagając zbyt wielu parametrów na zbiór danych. Ta zależność od eksperckiej interwencji wprowadza wyzwania dotyczące powtarzalności i nieefektywności przepływu pracy, szczególnie w scenariuszach o wysokiej wydajności.

Odtwarzanie 3D. Krio-EM zanotowało znaczne postępy w oprogramowaniu do odtwarzania 3D, umożliwiając rozdzielczość niemal atomową makrocząsteczek biologicznych. Wśród najczęściej stosowanych narzędzi są RELION, cryoSPARC i EMAN2, każde z nich oferuje wyróżniające się zalety i ograniczenia. RELION stosuje podejście bayesowskie do iteracyjnej rafinowanej analizy, wyróżniając się w obsłudze heterogenicznych zestawów danych i osiąganiu wysokiej rozdzielczości odtworzeń¹². Jednak jego intensywność obliczeniowa i stroma krzywa uczenia się często wymagają eksperckiej interwencji. CryoSPARC, wykorzystując przyspieszenie GPU i głębokie uczenie, znacznie zmniejsza czas przetwarzania i jest przyjazny dla użytkownika¹³. EMAN2 zapewnia kompleksowy pakiet do selekcji cząstek i odtwarzania 3D, ale wymaga rozległej ręcznej regulacji i brakuje mu możliwości opinii czasu rzeczywistego¹⁴. Podczas gdy te narzędzia wyróżniają się w określonych aspektach odtwarzania 3D, pozostają ograniczone do pojedynczych funkcjonalności, brakując integracji z akwyzcją danych początkowych lub modelowaniem atomowym w dół strumienia. Na przykład RELION i cryoSPARC wymagają ręcznego przenoszenia danych z oprogramowania kontrolującego mikroskop, co wprowadza nieefektywności i potencjalne błędy. Co więcej, żadne z tych narzędzi nie zapewnia oceny jakości w czasie rzeczywistym podczas zbierania danych lub płynnego przejścia do budowania modeli atomowych, co prowadzi do rozdrobnionych przepływów pracy, które utrudniają wydajność i powtarzalność.

Ostatni etap komputerowego przetwarzania w opartym na krio-EM determinowaniu struktury to budowanie modeli atomowych, gdzie współrzęd

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linie komórek Expi293F wykorzystywana do ekspresji białka ludzkiego TRPML1 została zakupiona od firmy Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd (Numer katalogowy: SC0236058). Tożsamość linii komórek została odpowiednio uwierzytelniona za pomocą profilu Short Tandem Repeat (STR) (Plik uzupełniający 1).

Oświadczenie etyczne
Niniejsze badanie nie obejmowało uczestników ludzkich, zwierząt lub próbek uzyskanych bezpośrednio od ludzi lub zwierząt. Białko ludzkiego TRPML1 zostało wyprodukowane przez rekombinancyjną ekspresję i wyczyszczone in vitro. Linie komórek Expi293F wykorzystywane do rekombinancyjnej ekspresji białek są dostępnymi komercyjnie, ustabilizowanymi, nieśmiertelnymi liniami komórek. W związku z tym nie wymagano zgody instytucjonalnego komitetu etycznego ani pisemnej zgody uczestników.

UWAGA: Zintegrowana platforma przepływu pracy cryo-EM składa się z trzech głównych modułów: zautomatyzowanego modułu akwizycji danych, hybrydowego modułu rekonstrukcji 3D wspomaganego siecią neuronową oraz modułu modelowania atomowego opartego na głębokiej uczelni, przy czym dane służą jako interfejs komunikacyjny między tymi komponentami oprogramowania, jak pokazano na Rysunku 2. Zintegrowana platforma przepływu pracy cryo-EM przyjmuje architekturę przeglądarka-serwer (B/S), umożliwiając użytkownikom wykonywanie wszystkich operacji za pośrednictwem interfejsu internetowego, zapewniając tym samym użyteczność i dostępność operacyjną.

1. Zautomatyzowana akwizycja danych

UWAGA: Zintegrowana platforma przepływu pracy cryo-EM składa się z trzech głównych modułów: zautomatyzowanego modułu akwizycji danych, hybrydowego modułu rekonstrukcji 3D wspomaganego siecią neuronową oraz modułu modelowania atomowego opartego na głębokiej uczelni. Dane służą jako interfejs komunikacyjny między tymi komponentami oprogramowania (Rysunek 2). System korzysta z architektury przeglądarka-serwer (B/S), która umożliwia wszystkie operacje za pośrednictwem interfejsu internetowego.

Inicjalizacja projektu
1. Utwórz nowy projekt w oprogramowaniu platformy zautomatyzowanej akwizycji danych.
2. Wybierz opcję dziedziczenia ustawień konfiguracji z poprzedniego projektu, jeśli jest to pożądane. Ponownie wykorzystaj dziedziczone parametry do konfiguracji mikroskopu elektronowskiego zamiast tworzyć nową konfigurację.
Kontrola przesunięcia wiązki
UWAGA: Wykonaj regulację przesunięcia wiązki w oprogramowaniu kontrolnym mikroskopu elektronowego przekaźnikowego (TEM).
1. Sprawdzenie przy niskim powiększeniu (Atlas i GridSquare)
  1. Otwórz moduł Screening. Zdobądź obrazy przy powiększeniu Atlas i GridSquare.
  2. Upewnij się, że obrazy są odpowiednio oświetlone i nie występuje przesunięcie wiązki. Upewnij się, że środek obrazu nie jest usytuowany nad prętami siatki.
2. Kontrola powiększenia akwizycji danych
  1. Zdobądź obrazy przy powiększeniu akwizycji danych (np. 60K lub 100K). Oceń wyrównanie wiązki.
  2. Skoryguj przesunięcie wiązki przed kontynuacją, jeśli akwizycja obrazu zakończyła się niepowodzeniem lub zaobserwowano znaczne przesunięcie wiązki.
3. Kontrola powiększenia eucentricznego otworu
  1. Zdobądź obrazy przy powiększeniu otworu/eucentricznym (zazwyczaj 8K). Skoryguj przesunięcie wiązki, aż punkt oświetlenia będzie centralnie usytuowany, jeśli wiązka nie jest usytuowana centralnie.
  2. Nie modyfikuj położenia przesłony. Upewnij się, że wielkość przesłony odpowiada wielkości przesłony użytej podczas akwizycji danych.
Regulacja wysokości Z
1. Automatyczne Regulowanie Eucentriczne
  1. Przejdź do strony Screening. Przesuń stolik do czystego obszaru folii węglowej na wysokości otworu/eucentricznej. Otwórz moduł Automatyczne Eucentriczne na stronie AutoFunction.
  2. Kliknij Start. Monitoruj panel logu w celu uzyskania informacji zwrotnych. Przejdź do innego obszaru i powtórz procedurę, jeśli operacja nie powiodła się.
2. Automatyczna regulacja fokusu
  1. Otwórz moduł AutoFocus na stronie AutoFunction. Kliknij Start.
  2. Przejrzyj komunikaty logu. Skoryguj parametry zgodnie z wskazówkami lub powtórz sekcję 1.3.1, jeśli automatyczne ustawianie fokusu zakończy się niepowodzeniem.
Kontrola wyrównania powiększenia
1. Kontrola Wyrównania
  1. Znajdź rozpoznawalną cechę na powiększeniu danych i uzyskaj obraz. Uzyskaj obraz na powiększeniu otworu/eucentricznym.
  2. Porównaj centralne regiony obu obrazów. Przejdź do kalibracji, jeśli wykryto niewyrównanie między powiększeniami da

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TRPML1, również znany jako mukolipyna-1 (MCOLN1), to lizosomowy kanał kationowy niezbędny do utrzymania homeostazy jonowej, regulowania ruchu pęcherzyków i wspierania autofagii w komórkach ssaków²⁷^,²⁸. Dysfunkcja TRPML1 z powodu mutacji genetycznych została bezpośrednio związana z mukolipidoza typu IV, ciężkim neurodegeneracyjnym zaburzeniem spichrzowania lizosomalnego charakteryzującym się nieprawidłowym rozwojem neuronów, zwyrodnieniem siatkówki i niedokrwistoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oznaczanie struktury makrocząsteczek biologicznych za pomocą kriomikroskopii elektronowej (kriomikroskopia elektronowa, cryo-EM) w sposób naturalny obejmuje długotrwały, wieloetapowy przepływ pracy wymagający ścisłej integracji narzędzi obliczeniowych i opierania się na interwencji ekspertów. Zintegrowana platforma radzi sobie z tym wyzwaniem, ujednolicając pozyskiwanie danych, odbudowę 3D i modelowanie atomowe w jednolitym, pionowo zintegrowanym systemie—krok w kierunku bardziej opływowych przepływów pracy w kriomikrosk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badania były finansowane i wspierane przez Shuimu BioSciences, które również przyczyniły się do projektowania badań, ich realizacji, interpretacji danych, a także przeglądu i ostatecznej aprobaty rękopisu. Wszyscy autorzy są pracownikami Shuimu BioSciences i deklarują brak dalszych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Jing Li z cryo-EM Center Shuimu BioSciences za porady dotyczące reprezentatywnego zestawu danych. Dziękujemy dr Yujie Liu z Działu Białek i Krystalografii Shuimu BioSciences za dostarczenie próbki białka hTRPML1. Z wdzięcznością wyrażamy uznanie dla Adiunkta Qiangfeng Zhang, dr Kui Xu, Adiunkta Xueming Li i Inżyniera Bo Shen z Wydziału Nauk o Życiu, Uniwersytetu Tsinghua, jak również dla Profesora Xinzheng Zhang i dr Chunling Wu z Instytutu Biofizyki, Chińskiej Akademii Nauk, za ich cenny wkład i wskazówki podczas opracowywania zintegrowanej platformy przepływu pracy cryo-EM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Moduł rekonstrukcji 3D platformy SMART; włączona hybrydowa sieć neuronowa
Cryo-electron microscope	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Używany do pozyskiwania danych; wyposażony w filtr energetyczny
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Automatyczny moduł pozyskiwania danych platformy SMART
DeepEMhancer	Open source	V0.17	Oparty na deep learningu proces przetwarzania objętościowych danych krio-EM; zintegrowany z CryoSmart Map Enhancer
Direct electron detector	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Kamera używana do nagrywania filmów
Grid	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Siatka próbki krio-EM
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Moduł modelowania atomowego opartego na deep learningu platformy SMART; rozszerza framework SMARTFold
SMART Platform	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Zintegrowana platforma krio-EM; architektura przeglądarka-serwer (B/S); obejmuje moduły DataSmart, CryoSmart i ModelSmart
TEM control software	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Oprogramowanie sterujące mikroskopem elektronowym do regulacji przesunięcia wiązki
Topaz	Open source	V 2.5	Narzędzie do wybierania cząstek oparte na deep learningu; zintegrowane jako wtyczka w CryoSmart
TRPML1 protein sample	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	Ludzki TRPML1 (mukolipinia-1); przygotowany wewnątrz laboratorium przez departament białek i krystalografii
Vitrification device	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Do przygotowania próbki krio-EM
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Oprogramowanie ogólnego przeznaczenia do wyświetlania, analizy i innych funkcji

SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Zintegrowana platforma przepływu pracy krio-EM
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Framework deep learningu leżący u podstaw ModelSmart
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Automatyczne oprogramowanie do pozyskiwania danych krio-EM
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	Automatyczne oprogramowanie do pozyskiwania TEM/krio-EM
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Automatyczne oprogramowanie do zbierania danych krio-EM
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Automatyczne zbieranie krio-EM na wielu siatkach
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Oprogramowanie do pozyskiwania mikroskopii elektronowej
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Automatyczny system do pozyskiwania krio-EM
Auto-EMation	Tsinghua University	N/A	Automatyczne oprogramowanie do pozyskiwania krio-EM
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	Bayesowskie oprogramowanie do rekonstrukcji krio-EM
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Przetwarzanie i rekonstrukcja obrazów krio-EM
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Zestaw do przetwarzania obrazów krio-EM
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	Oprogramowanie do estymacji CTF
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	Estymacja CTF przyspieszona przez GPU
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Oprogramowanie do korekcji ruchu
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Zestaw do ulepszania map krio-EM oparty na deep learningu
Topaz	University of California Berkeley	RRID:SCR_018037	Wybieranie cząstek oparte na deep learningu
UCSF ChimeraX	University of California San Francisco	RRID:SCR_015872	Oprogramowanie do wizualizacji molekularnej
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	Pasowanie CTF używane w przepływie pracy CryoSmart
EMDB-8840	Electron Microscopy Data Bank	Accession: EMD-8840	Ludzka mapa referencyjna TRPML1
EMPIAR-10204	Electron Microscopy Public Image Archive	Accession: EMPIAR-10204	Zestaw danych referencyjnych β-galaktozydazy
Transmission Electron Microscope (TEM)	Not specified	N/A	Używany do pozyskiwania danych krio-EM
FEI Tecnai Electron Microscope	FEI (now Thermo Fisher Scientific)	Not specified	Wspomniane w cytowanym przepływie pracy
Energy Filter	Not specified	N/A	Używany podczas automatycznego zbierania
GPU Computing Node	Not specified	N/A	Używany do obliczeń ModelSmart

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biologia strukturalna automatyczne zbieranie danych przetwarzanie obraz w rekonstrukcja 3D budowanie modelu atomowego modele g bokiego uczenia wybieranie cz steczek klasyfikacja 2D korekcja ruchu

SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology): Zintegrowana platforma obliczeniowa do usprawnienia przepływu pracy w mikroskopii krioelektronowej

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły