Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

Podsumowanie

Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Streszczenie

Długie niekodujące RNA (lncRNA) stały się ważnymi regulatorami różnorodnych procesów biologicznych. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw funkcji większości lncRNA pozostają słabo poznane. Identyfikacja oddziałujących białek, szczególnie białek wiązających RNA (RBP), jest kluczową strategią w celu wyjaśnienia funkcji lncRNA. Wśród dostępnych metod, kompleksowa identyfikacja białek wiązających RNA (ChIRP) połączona ze spektrometrią mas jest szeroko stosowana ze względu na prosty projekt sondy i prosty przebieg. Konwencjonalna ChIRP opiera się na fiksacji paraformaldehydem (PFA), która rejestruje zarówno bezpośrednie kontakty RNA-białko, jak i pośrednie interakcje pośredniczone przez czynniki łączące. W przeciwieństwie do tego, fiksacja UV połączona ze ścisłymi warunkami płukania preferencyjnie zachowuje bezpośrednie interakcje RNA-białko. Wykorzystując lncRNA Tug1 jako model, fiksacja UV i fiksacja PFA zostały porównane w ramach ChIRP w hodowlach komórkowych, co wykazało, że metoda ChIRP oparta na UV wzbogaca bezpośrednie interakcje lncRNA-białko. Ta metoda oparta na UV została następnie rozszerzona na jądra myszy, gdzie tkanki zostały rozdrobnione do zawiesiny jednokomórkowych przed fiksacją UV, umożliwiając identyfikację białek wiążących Tug1 w naturalnym kontekście tkankowym. Porównanie z interaktoma pochodzącymi z linii komórkowych ujawniło zarówno wspólne, jak i specyficzne dla tkanki interaktory. Dwie wspólne bezpośrednie interakcje zostały niezależnie zweryfikowane przez wzmocnioną immunoprecypitację krzyżową (eCLIP). Ta metoda ChIRP oparta na UV jest określana jako cPDiRT (przechwytywanie białek bezpośrednio współpracujących z celem RNA). Razem, cPDiRT umożliwia identyfikację białek wiążących lncRNA zarówno w hodowlach komórkowych, jak i w naturalnych tkankach. Połączenie dysocjacji tkankowej i fiksacji UV zapewnia szeroko stosowalną strategię do badania bezpośrednich interakcji lncRNA-białko w różnych układach narządowych.

Wprowadzenie

Ostatnio przeprowadzone badania transkryptomiczne o wysokiej wydajności odkryły tysiące długich niekodujących RNA (lncRNA), które biorą udział w różnorodnych procesach biologicznych, od organizacji chromatyny po sygnalizację komórkową^1,2. Mimo ich szerokiego występowania i funkcjonalnego znaczenia, mechanizmy molekularne większości lncRNA pozostają słabo poznane. Główną przeszkodą jest identyfikacja ich fizycznych partnerów białkowych, szczególnie białek wiążących RNA (RBP)^3,4,5.

Obecne metody RNA-centryczne opierają się głównie na chemicznym skraplaniu, które wychwytuje zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie interakcje RNA-białko. W rezultacie, podejścia te są bardziej odpowiednie do globalnego mapowania interaktomu niż do identyfikacji prawdziwych bezpośrednich kontaktów⁶. Kompleksowe identyfikowanie białek wiążących RNA z kolejnym spektrometrią mas (ChIRP-MS) to szeroko stosowana technika do mapowania interakcji lncRNA-RBP ze względu na prosty projekt sondy i efektywny przepływ pracy^7,8. Konwencjonalny ChIRP-MS używa skraplacza paraformaldehydowego (PFA), który wychwytuje zarówno bezpośrednie kontakty RNA-białko, jak i pośrednie skojarzenia pośredniczone przez czynniki mostujące^9,10.

Natomiast skraplanie UV przy 254 nm oferuje kluczową zaletę. Łączy ono kowalemnie RNA i białka tylko wtedy, gdy znajdują się w odległości niemal zerowej (zazwyczaj < 1 Å)¹¹. Proces ten zamienia wiązania wodorowe w stabilne wiązania kowalencyjne i umożliwia rygorystyczne warunki mycia w wysokiej zasadowości, które usuwają niekowalencyjnie związane pośrednie interaktory. W rezultacie, podejścia UV-oparte zapewniają większą specyficzność dla bezpośrednich interakcji RNA-białko niż metody skraplania chemicznego^12,13. Niemniej, podejścia UV-oparte są nadal niedostatecznie wykorzystywane w badaniach interaktomu lncRNA pochodzących z tkanek, głównie ze względu na obawy dotyczące efektywności skraplania i ograniczonego przenikania UV.

Aby zbadać bezpośrednie interakcje lncRNA-białko w fizjologicznie istotnym kontekście, lncRNA Tug1 został wybrany jako system modelowy. Tug1 stanowi idealny punkt odniesienia do walidacji tkankowego przepływu pracy dotyczącego bezpośrednich interakcji ze względu na jego poważny fenotyp knockout i wysokie stężenie w jądrach. Genetyczne wyłączenie Tug1 powoduje całkowitą bezpłodność u samców, upośledzenie spermatogenezy i nieprawidłową morfologię plemników¹⁴. Ponadto, Tug1 wspiera funkcję komórek Sertolego i integralność bariery krew-jądro w myszy na wysokotłuszczowej diecie¹⁵. Pomimo tych dobrze ustalonych fenotypów, bezpośrednie partnerzy białkowi, którzy mediują funkcję Tug1 w jądrach – organie wyrażającym dużą liczbę RBP, które zostały niedawno eksperymentalnie opisane¹⁶ – pozostają nieznani. Ta luka w wiedzy w dużej mierze odzwierciedla fakt, że większość metod mapowania interakcji lncRNA-białko została opracowana dla układów komórkowych.

Aby zmierzyć się z tą ograniczeniem, struktura ChIRP została zmodyfikowana poprzez zastąpienie skraplania PFA skraplaniem UV w celu uchwycenia białek, które bezpośrednio współpracują z Tug1. Kandydatki do interakcji zostały niezależnie zweryfikowane przez ulepszoną immunoprecypitację z krzyżowaniem poprzez sekwencjonowanie głębokie (eCLIP-seq)¹⁷. Przepływ pracy został następnie rozszerzony na zastosowania tkankowe poprzez odizolowanie świeżej tkanki jądrowej myszy na pojedyncze komórki przed skraplaniem UV. Ten zoptymalizowany podejście został oznaczony jako cPDiRT (uchwytywanie białek bezpośrednio współpracujących z docelowymi RNA).

Zastosowanie cPDiRT do Tug1 w jądrze myszy umożliwiło mapowanie bezpośrednich interakcji w natywnym kontekście tkankowym. Równoległe eksperymenty na hodowanych komórkach zapewniły bezpośrednie porównanie profili interakcji opartych na PFA i UV. W połączeniu z niezależną walidacją eCLIP, to podejście wygenerowało wysoko-zaufaną zbiór partnerów molekularnych, które mogą przyczyniać się do funkcji Tug1 podczas spermatogenezy. Przedstawiony tutaj protokół umożliwia uchwytywanie białek, które bezpośrednio współpracują z docelowym lncRNA zarówno w komórkach hodowanych, jak i w natywnych tkankach. Definiując bezpośrednie interaktomu Tug1 w jądrze, ta metoda poszerza badania mechanistyczne lncRNA niezbędnego dla płodności i zapewnia ogólną platformę do badania interakcji lncRNA-białko w tkankach rozrodczych i innych złożonych tkankach.

Protokół

Wszystkie roztwory zostały przygotowane z wykorzystaniem ultraczystej wody i reagentów bez nukleazy i proteazy. Wszystkie reagenty i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (Numer zgody: IACUC-1812003-4) i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi (National Research Council, 8. wydanie). Utrzymuj samce myszy C57BL/6 (w wieku 4 tygodni) w cyklu 12 h światło/12 h ciemność z dostępem do żywności i wody ad libitum. Minimalizuj cierpienie zwierząt, stosując najmniejszą liczbę zwierząt niezbędną do osiągnięcia istotności statystycznej. Zabijanie myszy odbywało się poprzez wdychanie CO₂, a następnie przez ścięcie szyjne zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi. 

1. Przygotuj bufory

1. Przygotuj bufor lizaty komórkowej
   1. Przygotuj bufor lizaty komórkowej zawierający 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM EDTA i 1% SDS.
   2. Natychmiast przed użyciem dodaj 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteaz i specjalistyczny inhibitor RNazy.
      UWAGA: SDS jest podrażniającym skórę i oczy środkiem. Unikaj wdychania pyłu lub aerozoli. PMSF jest wysoce toksyczny, działa jako inhibitor cholinesterazy i jest niestabilny w roztworze wodnym. Przygotuj PMSF natychmiast przed użyciem. Podczas postępowania z tymi reagentami należy nosić rękawiczki i okulary ochronne. Obsługę PMSF należy prowadzić w komorze wentylacyjnej.
2. Przygotuj bufor hybrydyzacji
   1. Przygotuj bufor hybrydyzacji zawierający 750 mM NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA i 15% formamidu.
   2. Natychmiast przed użyciem dodaj 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteaz i specjalistyczny inhibitor RNazy.
      UWAGA: Przechowuj formamid w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Formamid jest teratogenny i zagrożeniem dla rozrodczości. Obsługę formamidu należy prowadzić w komorze wentylacyjnej, używając rękawic, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych. Unikaj wdychania i kontaktu ze skórą.
3. Przygotuj bufor wash
   1. Przygotuj bufor wash zawierający 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS i 0,5% deoxycholate sodu.
   2. Chroń bufor wash przed światłem podczas przechowywania.
4. Przygotuj bufor proteinazy K (PK)
   1. Przygotuj bufor PK zawierający 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA i 0,5% SDS.
   2. Dodaj proteinazę K do końcowego stężenia 5% natychmiast przed użyciem.

2. Zaprojektuj i przygotuj sondy

1. Zaprojektuj sondy antysens
   1. Zaprojektuj sondy oligonukleotydowe antysens, korzystając z dostępnego online projektanta sond dostępnego na stronie singlemoleculefish.com¹⁸.
2. Uzyskaj sondy z biotiną
   1. Zamów sondy DNA antysens zawierające modyfikację 3'-BiotinTEG.
3. Przygotuj pulę sond
   1. Rozcieńcz każdą sondę indywidualnie do 100 μM.
   2. Wymieszaj równe objętości wszystkich sond, aby uzyskać pulę sond. Utrzymaj ostateczne łączne stężenie oligonukleotydów na poziomie 100 μM.
   3. Przechowuj pulę sond w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zalecane parametry projektowania sond to: (i) jedna sonda na 100 bp RNA docelowego, (ii) zawartość GC docelowego RNA na poziomie 45%, (iii) długość sondy 20 nt i (iv) odstęp 60-80 nt między sondami.
      UWAGA: Jeśli RNA przekracza limit wielkości akceptowany przez projektanta sond, podziel sekwencję na mniejsze segmenty przed projektowaniem. Wyklucz regiony repetytywne i regiony o rozległej homologii sekwencji.

3. Przeprowadź zbiór komórek, dysocjację tkanki i wiązanie UV

1. Przygotuj kontrole no-UV
   1. Przygotuj próbki kontrolne równolegle z próbkami eksperymentalnymi.
   2. Pomiń krok wiązania UV w próbkach kontrolnych.
   3. Przeprowadź wszystkie kolejne procedury, w tym sonicację, RNA-Protein pull-down, ekstrakcję RNA i ekstrakcję białka, identycznie dla obu grup.
      UWAGA: Użyj kontroli no-UV, aby odróżnić RNA-białko zależne od UV od niespecyficznego wiązania tła.
2. Zbierz komórki i przeprowadź wiązanie UV
   1. Przepłucz hodowanych komórek
      1. Przepłucz komórki trzy razy PBS, aby usun

Wyniki

Aby zidentyfikować białka wiążące Tug1, łączenie UV zostało wprowadzone do przepływu pracy ChIRP, ustanawiając metodę oznaczoną jako cPDiRT (Rysunek 1). Konwencjonalna ChIRP została jako pierwsza przeprowadzona w komórkach GC2, aby wzbogacić białka współdziałające z Tug1 (Rysunek 2A, B). Analiza spektrometrii masowej wykryła ponad 190 białek wzbogaconych w stosunku do kontroli ujemnej (Rysunek 2C; ...

Dyskusja

cPDiRT został opracowany jako zmodyfikowany protokół oparty na ChIRP, który zastępuje wiązanie krzyżowe paraformaldehydem (PFA) wiązaniem krzyżowym UV w celu selektywnego wychwytywania bezpośrednich interakcji lncRNA-białko. Poprzez połączenie enzymatycznego dysocjacji świeżego tkanki jądrowej na pojedyncze komórki z wiązaniem krzyżowym UV, mapowanie bezpośrednich interakcji zostało rozszerzone z linii komórek hodowanych do tkanek naturalnych. Równoległe eksperymenty na hodowane komórki umożliwiły bezpośrednie porównanie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	do dysocjacji tkanki i przygotowania pojedynczej zawiesiny komórkowej
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	do oczyszczania RNA
AffinityScript Reverse Transcriptase	Agilent	600107	do syntezy eCLIP cDNA
Anti-CCT3 Antibody	Abcam	Ab225878	przeciwciało do eCLIP
Anti-PABPC1 Antibody	Abcam	Ab312314	przeciwciało do eCLIP
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	do ekstrakcji RNA
Collagenase Type IV	Sigma-Aldrich	C5138	do enzymatycznej dysocjacji tkanki jąder
Dephosphorylation reagents (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	do defosforylacji RNA eCLIP
DMEM High Glucose Medium	Gibco	11965092	do hodowli komórkowej i buforu dysocjacji tkanki
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetic Beads	Thermo Fisher Scientific	65001	do wychwytywania związków probe-RNA-białko z biotinylacją
DynaMag-15 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12301D	do separacji magnesowych cząstek
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	do separacji magnesowych cząstek
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	do chelatacji dwuwalencyjnych kationów w buforach lizy i płukania
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S	do oczyszczania eCLIP cDNA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141C	do zatrzymania trawienia trypsyną
Formamide	Thermo Fisher Scientific	AM9342	do przygotowania buforu hybrydyzacji
Hybridization Oven	TUOHE	LF-I	do hybrydyzacji sond i płukania cząstek
Low-Melting-Temperature Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	do selekcji wielkości biblioteki eCLIP
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	do selekcji wielkości biblioteki eCLIP
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	do oczyszczania RNA
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	do przygotowania buforu płukania z wysokim stężeniem soli
Nitrocellulose Membrane	GE Healthcare / Amersham	10600002	do transferu zachodów eCLIP
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	do detergentu buforu płukania
Nuclease- and protease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035	do przygotowania roztworów wolnych od nukleazy
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	do selekcji wielkości eCLIP
NuPAGE Bis-Tris Precast Gels	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	do separacji białek SDS-PAGE
PBS (pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	do mycia i resuspensji komórek
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	inhibitor proteaz serinowych do buforu lizy komórek; dodaje się świeżo przed użyciem
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	inhibitor proteaz o szerokim spektrum do buforu lizy komórek; dodaje się świeżo przed użyciem
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850	do trawienia białek w ekstrakcji RNA
qRT-PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	11704044	do ilościowego RT-PCR w celu potwierdzenia wzbogacenia RNA
RNase/Protease-Free DNase I Solution	Thermo Fisher Scientific	EN0521	do dysocjacji tkanki
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	do oczyszczania RNA
SDS-PAGE Sample Loading Buffer	Beyotime	P0286	do przygotowania próbek białkowych
Shrimp Alkaline Phosphatase	New England Biolabs	M0371S	do oczyszczania eCLIP cDNA
Silver Stain Kit	Beyotime	P00175	do wizualizowania białek w żelach SDS-PAGE
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	do detergentu buforu płukania
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	do lizy komórek i denaturacji białek
Superase-in RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	specjalizowany inhibitor RNase; dodaje się świeżo przed użyciem
T4 RNA Ligase	New England Biolabs	M0204	do łączenia adapterów eCLIP
Tris–HCl (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	T5941	do przygotowania buforów lizy, hybrydyzacji i płukania
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	do ekstrakcji RNA
Ultrasonic cell crusher	ATPIO	ATPIO-650D	do lizy komórek i fragmentacji DNA
Ultraviolet Crosslinker	Analytik Jena	UVP CL-1000	do UV crosslinking interakcji RNA-białko
urea	Sigma-Aldrich	U5128	do degradacji białek eCLIP na membranie