Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

Lingxiu Tong; Yiting Ye; Wanyin Jiang; Yingying Ye; Xiaolian Shi; Siyuan Song; Lumei Zhou; Lan Ye; Yang Li; Ke Zheng

doi:10.3791/71732

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

301 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71732

⸱

10 lipca 2026

Lingxiu Tong^*¹^,² , Yiting Ye^*¹^,² , Wanyin Jiang^*¹^,² , Yingying Ye^*¹^,³ , Xiaolian Shi¹ , Siyuan Song¹^,² , Lumei Zhou¹^,² , Lan Ye³ , Yang Li⁴ , Ke Zheng¹^,²^,³

¹State Key Laboratory of Reproductive Medicine and Offspring Health, Nanjing Medical University, ²Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, ³School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, ⁴School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Streszczenie

Długie niekodujące RNA (lncRNA) stały się ważnymi regulatorami różnorodnych procesów biologicznych. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw funkcji większości lncRNA pozostają słabo poznane. Identyfikacja oddziałujących białek, szczególnie białek wiązających RNA (RBP), jest kluczową strategią w celu wyjaśnienia funkcji lncRNA. Wśród dostępnych metod, kompleksowa identyfikacja białek wiązających RNA (ChIRP) połączona ze spektrometrią mas jest szeroko stosowana ze względu na prosty projekt sondy i prosty przebieg. Konwencjonalna ChIRP opiera się na fiksacji paraformaldehydem (PFA), która rejestruje zarówno bezpośrednie kontakty RNA-białko, jak i pośrednie interakcje pośredniczone przez czynniki łączące. W przeciwieństwie do tego, fiksacja UV połączona ze ścisłymi warunkami płukania preferencyjnie zachowuje bezpośrednie interakcje RNA-białko. Wykorzystując lncRNA Tug1 jako model, fiksacja UV i fiksacja PFA zostały porównane w ramach ChIRP w hodowlach komórkowych, co wykazało, że metoda ChIRP oparta na UV wzbogaca bezpośrednie interakcje lncRNA-białko. Ta metoda oparta na UV została następnie rozszerzona na jądra myszy, gdzie tkanki zostały rozdrobnione do zawiesiny jednokomórkowych przed fiksacją UV, umożliwiając identyfikację białek wiążących Tug1 w naturalnym kontekście tkankowym. Porównanie z interaktoma pochodzącymi z linii komórkowych ujawniło zarówno wspólne, jak i specyficzne dla tkanki interaktory. Dwie wspólne bezpośrednie interakcje zostały niezależnie zweryfikowane przez wzmocnioną immunoprecypitację krzyżową (eCLIP). Ta metoda ChIRP oparta na UV jest określana jako cPDiRT (przechwytywanie białek bezpośrednio współpracujących z celem RNA). Razem, cPDiRT umożliwia identyfikację białek wiążących lncRNA zarówno w hodowlach komórkowych, jak i w naturalnych tkankach. Połączenie dysocjacji tkankowej i fiksacji UV zapewnia szeroko stosowalną strategię do badania bezpośrednich interakcji lncRNA-białko w różnych układach narządowych.

Wprowadzenie

Ostatnio przeprowadzone badania transkryptomiczne o wysokiej wydajności odkryły tysiące długich niekodujących RNA (lncRNA), które biorą udział w różnorodnych procesach biologicznych, od organizacji chromatyny po sygnalizację komórkową¹^,². Mimo ich szerokiego występowania i funkcjonalnego znaczenia, mechanizmy molekularne większości lncRNA pozostają słabo poznane. Główną przeszkodą jest identyfikacja ich fizycznych partnerów białkowych, szczególnie białek wiążących RNA (RBP)³^,⁴^,⁵.

Obecne met....