Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

102 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71732

⸱

10 lipca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine and Offspring Health, Nanjing Medical University, 2Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 3School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 4School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Streszczenie

Długie niekodujące RNA (lncRNA) stały się ważnymi regulatorami różnorodnych procesów biologicznych. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw funkcji większości lncRNA pozostają słabo poznane. Identyfikacja oddziałujących białek, szczególnie białek wiązających RNA (RBP), jest kluczową strategią w celu wyjaśnienia funkcji lncRNA. Wśród dostępnych metod, kompleksowa identyfikacja białek wiązających RNA (ChIRP) połączona ze spektrometrią mas jest szeroko stosowana ze względu na prosty projekt sondy i prosty przebieg. Konwencjonalna ChIRP opiera się na fiksacji paraformaldehydem (PFA), która rejestruje zarówno bezpośrednie kontakty RNA-białko, jak i pośrednie interakcje pośredniczone przez czynniki łączące. W przeciwieństwie do tego, fiksacja UV połączona ze ścisłymi warunkami płukania preferencyjnie zachowuje bezpośrednie interakcje RNA-białko. Wykorzystując lncRNA Tug1 jako model, fiksacja UV i fiksacja PFA zostały porównane w ramach ChIRP w hodowlach komórkowych, co wykazało, że metoda ChIRP oparta na UV wzbogaca bezpośrednie interakcje lncRNA-białko. Ta metoda oparta na UV została następnie rozszerzona na jądra myszy, gdzie tkanki zostały rozdrobnione do zawiesiny jednokomórkowych przed fiksacją UV, umożliwiając identyfikację białek wiążących Tug1 w naturalnym kontekście tkankowym. Porównanie z interaktoma pochodzącymi z linii komórkowych ujawniło zarówno wspólne, jak i specyficzne dla tkanki interaktory. Dwie wspólne bezpośrednie interakcje zostały niezależnie zweryfikowane przez wzmocnioną immunoprecypitację krzyżową (eCLIP). Ta metoda ChIRP oparta na UV jest określana jako cPDiRT (przechwytywanie białek bezpośrednio współpracujących z celem RNA). Razem, cPDiRT umożliwia identyfikację białek wiążących lncRNA zarówno w hodowlach komórkowych, jak i w naturalnych tkankach. Połączenie dysocjacji tkankowej i fiksacji UV zapewnia szeroko stosowalną strategię do badania bezpośrednich interakcji lncRNA-białko w różnych układach narządowych.

Wprowadzenie

Ostatnio przeprowadzone badania transkryptomiczne o wysokiej wydajności odkryły tysiące długich niekodujących RNA (lncRNA), które biorą udział w różnorodnych procesach biologicznych, od organizacji chromatyny po sygnalizację komórkową1,2. Mimo ich szerokiego występowania i funkcjonalnego znaczenia, mechanizmy molekularne większości lncRNA pozostają słabo poznane. Główną przeszkodą jest identyfikacja ich fizycznych partnerów białkowych, szczególnie białek wiążących RNA (RBP)3,4,5.

Obecne metody RNA-centryczne opierają się głównie na chemicznym skraplaniu, które wychwytuje zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie interakcje RNA-białko. W rezultacie, podejścia te są bardziej odpowiednie do globalnego mapowania interaktomu niż do identyfikacji prawdziwych bezpośrednich kontaktów6. Kompleksowe identyfikowanie białek wiążących RNA z kolejnym spektrometrią mas (ChIRP-MS) to szeroko stosowana technika do mapowania interakcji lncRNA-RBP ze względu na prosty projekt sondy i efektywny przepływ pracy7,8. Konwencjonalny ChIRP-MS używa skraplacza paraformaldehydowego (PFA), który wychwytuje zarówno bezpośrednie kontakty RNA-białko, jak i pośrednie skojarzenia pośredniczone przez czynniki mostujące9,10.

Natomiast skraplanie UV przy 254 nm oferuje kluczową zaletę. Łączy ono kowalemnie RNA i białka tylko wtedy, gdy znajdują się w odległości niemal zerowej (zazwyczaj < 1 Å)11. Proces ten zamienia wiązania wodorowe w stabilne wiązania kowalencyjne i umożliwia rygorystyczne warunki mycia w wysokiej zasadowości, które usuwają niekowalencyjnie związane pośrednie interaktory. W rezultacie, podejścia UV-oparte zapewniają większą specyficzność dla bezpośrednich interakcji RNA-białko niż metody skraplania chemicznego12,13. Niemniej, podejścia UV-oparte są nadal niedostatecznie wykorzystywane w badaniach interaktomu lncRNA pochodzących z tkanek, głównie ze względu na obawy dotyczące efektywności skraplania i ograniczonego przenikania UV.

Aby zbadać bezpośrednie interakcje lncRNA-białko w fizjologicznie istotnym kontekście, lncRNA Tug1 został wybrany jako system modelowy. Tug1 stanowi idealny punkt odniesienia do walidacji tkankowego przepływu pracy dotyczącego bezpośrednich interakcji ze względu na jego poważny fenotyp knockout i wysokie stężenie w jądrach. Genetyczne wyłączenie Tug1 powoduje całkowitą bezpłodność u samców, upośledzenie spermatogenezy i nieprawidłową morfologię plemników14. Ponadto, Tug1 wspiera funkcję komórek Sertolego i integralność bariery krew-jądro w myszy na wysokotłuszczowej diecie15. Pomimo tych dobrze ustalonych fenotypów, bezpośrednie partnerzy białkowi, którzy mediują funkcję Tug1 w jądrach – organie wyrażającym dużą liczbę RBP, które zostały niedawno eksperymentalnie opisane16 – pozostają nieznani. Ta luka w wiedzy w dużej mierze odzwierciedla fakt, że większość metod mapowania interakcji lncRNA-białko została opracowana dla układów komórkowych.

Aby zmierzyć się z tą ograniczeniem, struktura ChIRP została zmodyfikowana poprzez zastąpienie skraplania PFA skraplaniem UV w celu uchwycenia białek, które bezpośrednio współpracują z Tug1. Kandydatki do interakcji zostały niezależnie zweryfikowane przez ulepszoną immunoprecypitację z krzyżowaniem poprzez sekwencjonowanie głębokie (eCLIP-seq)17. Przepływ pracy został następnie rozszerzony na zastosowania tkankowe poprzez odizolowanie świeżej tkanki jądrowej myszy na pojedyncze komórki przed skraplaniem UV. Ten zoptymalizowany podejście został oznaczony jako cPDiRT (uchwytywanie białek bezpośrednio współpracujących z docelowymi RNA).

Zastosowanie cPDiRT do Tug1 w jądrze myszy umożliwiło mapowanie bezpośrednich interakcji w natywnym kontekście tkankowym. Równoległe eksperymenty na hodowanych komórkach zapewniły bezpośrednie porównanie profili interakcji opartych na PFA i UV. W połączeniu z niezależną walidacją eCLIP, to podejście wygenerowało wysoko-zaufaną zbiór partnerów molekularnych, które mogą przyczyniać się do funkcji Tug1 podczas spermatogenezy. Przedstawiony tutaj protokół umożliwia uchwytywanie białek, które bezpośrednio współpracują z docelowym lncRNA zarówno w komórkach hodowanych, jak i w natywnych tkankach. Definiując bezpośrednie interaktomu Tug1 w jądrze, ta metoda poszerza badania mechanistyczne lncRNA niezbędnego dla płodności i zapewnia ogólną platformę do badania interakcji lncRNA-białko w tkankach rozrodczych i innych złożonych tkankach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie roztwory zostały przygotowane z wykorzystaniem ultraczystej wody i reagentów bez nukleazy i proteazy. Wszystkie reagenty i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (Numer zgody: IACUC-1812003-4) i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi (National Research Council, 8. wydanie). Utrzymuj samce myszy C57BL/6 (w wieku 4 tygodni) w cyklu 12 h światło/12 h ciemność z dostępem do żywności i wody ad libitum. Minimalizuj cierpienie zwierząt, stosując najmniejszą liczbę zwierząt niezbędną do osiągnięcia istotności statystycznej. Zabijanie myszy odbywało się poprzez wdychanie CO₂, a następnie przez ścięcie szyjne zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi. 

1. Przygotuj bufory

  1. Przygotuj bufor lizaty komórkowej
    1. Przygotuj bufor lizaty komórkowej zawierający 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM EDTA i 1% SDS.
    2. Natychmiast przed użyciem dodaj 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteaz i specjalistyczny inhibitor RNazy.
      UWAGA: SDS jest podrażniającym skórę i oczy środkiem. Unikaj wdychania pyłu lub aerozoli. PMSF jest wysoce toksyczny, działa jako inhibitor cholinesterazy i jest niestabilny w roztworze wodnym. Przygotuj PMSF natychmiast przed użyciem. Podczas postępowania z tymi reagentami należy nosić rękawiczki i okulary ochronne. Obsługę PMSF należy prowadzić w komorze wentylacyjnej.
  2. Przygotuj bufor hybrydyzacji
    1. Przygotuj bufor hybrydyzacji zawierający 750 mM NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA i 15% formamidu.
    2. Natychmiast przed użyciem dodaj 1 mM PMSF, koktajl inhibitorów proteaz i specjalistyczny inhibitor RNazy.
      UWAGA: Przechowuj formamid w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Formamid jest teratogenny i zagrożeniem dla rozrodczości. Obsługę formamidu należy prowadzić w komorze wentylacyjnej, używając rękawic, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych. Unikaj wdychania i kontaktu ze skórą.
  3. Przygotuj bufor wash
    1. Przygotuj bufor wash zawierający 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS i 0,5% deoxycholate sodu.
    2. Chroń bufor wash przed światłem podczas przechowywania.
  4. Przygotuj bufor proteinazy K (PK)
    1. Przygotuj bufor PK zawierający 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA i 0,5% SDS.
    2. Dodaj proteinazę K do końcowego stężenia 5% natychmiast przed użyciem.

2. Zaprojektuj i przygotuj sondy

  1. Zaprojektuj sondy antysens
    1. Zaprojektuj sondy oligonukleotydowe antysens, korzystając z dostępnego online projektanta sond dostępnego na stronie singlemoleculefish.com18.
  2. Uzyskaj sondy z biotiną
    1. Zamów sondy DNA antysens zawierające modyfikację 3'-BiotinTEG.
  3. Przygotuj pulę sond
    1. Rozcieńcz każdą sondę indywidualnie do 100 μM.
    2. Wymieszaj równe objętości wszystkich sond, aby uzyskać pulę sond. Utrzymaj ostateczne łączne stężenie oligonukleotydów na poziomie 100 μM.
    3. Przechowuj pulę sond w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zalecane parametry projektowania sond to: (i) jedna sonda na 100 bp RNA docelowego, (ii) zawartość GC docelowego RNA na poziomie 45%, (iii) długość sondy 20 nt i (iv) odstęp 60-80 nt między sondami.
      UWAGA: Jeśli RNA przekracza limit wielkości akceptowany przez projektanta sond, podziel sekwencję na mniejsze segmenty przed projektowaniem. Wyklucz regiony repetytywne i regiony o rozległej homologii sekwencji.

3. Przeprowadź zbiór komórek, dysocjację tkanki i wiązanie UV

  1. Przygotuj kontrole no-UV
    1. Przygotuj próbki kontrolne równolegle z próbkami eksperymentalnymi.
    2. Pomiń krok wiązania UV w próbkach kontrolnych.
    3. Przeprowadź wszystkie kolejne procedury, w tym sonicację, RNA-Protein pull-down, ekstrakcję RNA i ekstrakcję białka, identycznie dla obu grup.
      UWAGA: Użyj kontroli no-UV, aby odróżnić RNA-białko zależne od UV od niespecyficznego wiązania tła.
  2. Zbierz komórki i przeprowadź wiązanie UV
    1. Przepłucz hodowanych komórek
      1. Przepłucz komórki trzy razy PBS, aby usun

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zidentyfikować białka wiążące Tug1, do procedury ChIRP włączono sieciowanie UV, ustanawiając metodę nazwaną cPDiRT (Rysunek 1). W pierwszej kolejności przeprowadzono konwencjonalny ChIRP w komórkach GC2, aby wzbogacić białka oddziałujące z Tug1 (Rysunek 2A, B). Analiza spektrometrią mas zidentyfikowała ponad 190 białek wzbogaconych w stosunku do kontroli negatywnej (Rysunek 2C; Tabela u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

cPDiRT został opracowany jako zmodyfikowany protokół oparty na ChIRP, który zastępuje wiązanie krzyżowe paraformaldehydem (PFA) wiązaniem krzyżowym UV w celu selektywnego wychwytywania bezpośrednich interakcji lncRNA-białko. Poprzez połączenie enzymatycznego dysocjacji świeżego tkanki jądrowej na pojedyncze komórki z wiązaniem krzyżowym UV, mapowanie bezpośrednich interakcji zostało rozszerzone z linii komórek hodowanych do tkanek naturalnych. Równoległe eksperymenty na hodowane komórki umożliwiły bezpośrednie porównanie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Qiangfeng Zhang (Uniwersytet Tsinghua) i Ci Chu (laboratorium Howard Chang) za pomocne dyskusje dotyczące oryginalnego protokołu ChIRP. K.Z. był wspierany przez Narodowe Fundusz Nauki Przyrodniczej Chin (32170858) i Program Doskonałych Liderów Akademickich Programu Wschodnich Talentów Szanghaju (BJKJ2025057). L.Y. był wspierany przez Narodowe Fundusz Nauki Przyrodniczej Chin (82571836, 32070843 i 82371617).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.25% Trypsin-EDTA SolutionGibco25200056do dysocjacji tkanki i przygotowania pojedynczej zawiesiny komórkowej
100% EthanolSigma-Aldrich459844do oczyszczania RNA
AffinityScript Reverse TranscriptaseAgilent600107do syntezy eCLIP cDNA
Anti-CCT3 AntibodyAbcamAb225878przeciwciało do eCLIP
Anti-PABPC1 AntibodyAbcamAb312314przeciwciało do eCLIP
ChloroformSigma-AldrichC2432do ekstrakcji RNA
Collagenase Type IVSigma-AldrichC5138do enzymatycznej dysocjacji tkanki jąder
Dephosphorylation reagents (T4 PNK)New England BiolabsM0201Sdo defosforylacji RNA eCLIP
DMEM High Glucose MediumGibco11965092do hodowli komórkowej i buforu dysocjacji tkanki
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetic BeadsThermo Fisher Scientific65001do wychwytywania związków probe-RNA-białko z biotinylacją
DynaMag-15 MagnetThermo Fisher Scientific12301Ddo separacji magnesowych cząstek
DynaMag-2 MagnetThermo Fisher Scientific12321Ddo separacji magnesowych cząstek
EDTASigma-AldrichE9884do chelatacji dwuwalencyjnych kationów w buforach lizy i płukania
Exonuclease INew England BiolabsM0293Sdo oczyszczania eCLIP cDNA
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099141Cdo zatrzymania trawienia trypsyną
FormamideThermo Fisher ScientificAM9342do przygotowania buforu hybrydyzacji
Hybridization OvenTUOHELF-Ido hybrydyzacji sond i płukania cząstek
Low-Melting-Temperature AgaroseSigma-AldrichA9414do selekcji wielkości biblioteki eCLIP
MinElute Gel Extraction KitQiagen28604do selekcji wielkości biblioteki eCLIP
miRNeasy Mini KitQiagen217004do oczyszczania RNA
NaClSigma-AldrichS7653do przygotowania buforu płukania z wysokim stężeniem soli
Nitrocellulose MembraneGE Healthcare / Amersham10600002do transferu zachodów eCLIP
NP-40Thermo Fisher Scientific85125do detergentu buforu płukania
Nuclease- and protease-free waterThermo Fisher Scientific10977035do przygotowania roztworów wolnych od nukleazy
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelThermo Fisher ScientificNP0322BOXdo selekcji wielkości eCLIP
NuPAGE Bis-Tris Precast GelsThermo Fisher ScientificNP0321BOXdo separacji białek SDS-PAGE
PBS (pH 7.4)Thermo Fisher Scientific10010023do mycia i resuspensji komórek
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626inhibitor proteaz serinowych do buforu lizy komórek; dodaje się świeżo przed użyciem
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001inhibitor proteaz o szerokim spektrum do buforu lizy komórek; dodaje się świeżo przed użyciem
Proteinase KSigma-AldrichP4850do trawienia białek w ekstrakcji RNA
qRT-PCR Master MixThermo Fisher Scientific11704044do ilościowego RT-PCR w celu potwierdzenia wzbogacenia RNA
RNase/Protease-Free DNase I SolutionThermo Fisher ScientificEN0521do dysocjacji tkanki
RNeasy Mini KitQiagen74104do oczyszczania RNA
SDS-PAGE Sample Loading BufferBeyotimeP0286do przygotowania próbek białkowych
Shrimp Alkaline PhosphataseNew England BiolabsM0371Sdo oczyszczania eCLIP cDNA
Silver Stain KitBeyotimeP00175do wizualizowania białek w żelach SDS-PAGE
Sodium DeoxycholateSigma-AldrichD6750do detergentu buforu płukania
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-AldrichL3771do lizy komórek i denaturacji białek
Superase-in RNase InhibitorThermo Fisher ScientificAM2694specjalizowany inhibitor RNase; dodaje się świeżo przed użyciem
T4 RNA LigaseNew England BiolabsM0204do łączenia adapterów eCLIP
Tris–HCl (pH 7.0)Sigma-AldrichT5941do przygotowania buforów lizy, hybrydyzacji i płukania
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNdo ekstrakcji RNA
Ultrasonic cell crusherATPIOATPIO-650Ddo lizy komórek i fragmentacji DNA
Ultraviolet CrosslinkerAnalytik JenaUVP CL-1000do UV crosslinking interakcji RNA-białko
ureaSigma-AldrichU5128do degradacji białek eCLIP na membranie

Bibliografia

  1. Mattick JS, et al. Long non-coding RNAs: definitions, functions, challenges and recommendations. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(6):430-447.
  2. Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: past, present, and future. Cell. 2024;187(23):6451-6485.
  3. Ferrè F, Colantoni A, Helmer-Citterich M. Revealing protein-lncRNA interaction. Brief Bioinform. 2016;17(1):106-116.
  4. Yi W, Yan J. Decoding RNA-protein interactions: Methodological advances and emerging challenges. Adv Genet (Hoboken). 2025;6(2):2500011.
  5. Elguindy MM, Mendell JT. NORAD-induced PUMILIO phase separation is required for genome stability. Nature. 2021;595(7866):303-308.
  6. Gräwe C, Stelloo S, Van Hout FAH, Vermeulen M. RNA-centric methods: Toward the interactome of specific RNA transcripts. Trends Biotechnol. 2021;39(9):890-900.
  7. Chu C, Chang HY. ChIRP-MS: RNA-directed proteomic discovery. Methods Mol Biol. 2018;1861:37-45.
  8. Chu C, et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 2015;161(2):404-416.
  9. Suryo Rahmanto A, et al. K6-linked ubiquitylation marks formaldehyde-induced RNA-protein crosslinks for resolution. Mol Cell. 2023;83(23):4272-4289.e10.
  10. Sun W, et al. Genetically encoded chemical crosslinking of RNA in vivo. Nat Chem. 2023;15(1):21-32.
  11. Esteban-Serna S, McCaughan H, Granneman S. Advantages and limitations of UV cross-linking analysis of protein-RNA interactomes in microbes. Mol Microbiol. 2023;120(4):477-489.
  12. Welp LM, et al. Chemical crosslinking extends and complements UV crosslinking in analysis of RNA/DNA nucleic acid-protein interaction sites by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 2025;53(15).
  13. McHugh CA, Guttman M. RAP-MS: A method to identify proteins that interact directly with a specific RNA molecule in cells. Methods Mol Biol. 2018;1649:473-488.
  14. Lewandowski JP, et al. The Tug1 lncRNA locus is essential for male fertility. Genome Biol. 2020;21(1):237.
  15. Wang S, et al. LncRNA Tug1 maintains blood-testis barrier integrity by modulating ccl2 expression in high-fat diet mice. Cell Mol Life Sci. 2022;79(2):114.
  16. Li Y, et al. The landscape of RNA binding proteins in mammalian spermatogenesis. Science. 2024;386(6720).
  17. Xu Q, et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. J Vis Exp. 2019;(147):59681. 
  18. Raj A, Van Den Bogaard P, Rifkin SA, Van Oudenaarden A, Tyagi S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 2008;5(10):877-879.
  19. Urdaneta EC, et al. Purification of cross-linked RNA-protein complexes by phenol-toluol extraction. Nat Commun. 2019;10(1):990.
  20. Van Nostrand EL, et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nat Methods. 2016;13(6):508-514.
  21. Van Nostrand EL, et al. A large-scale binding and functional map of human RNA-binding proteins. Nature. 2020;583(7818):711-719.
  22. Dun MD, Aitken RJ, Nixon B. The role of molecular chaperones in spermatogenesis and the post-testicular maturation of mammalian spermatozoa. Hum Reprod Update. 2012;18(4):420-435.
  23. Urdaneta EC, Beckmann BM. Fast and unbiased purification of RNA-protein complexes after UV cross-linking. Methods. 2020;178:72-82.
  24. Greenberg JR. Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins. Nucleic Acids Res. 1979;6(2):715-732.
  25. Rinn JL, et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 2007;129(7):1311-1323.
  26. Clemson CM, et al. An architectural role for a nuclear noncoding RNA: NEAT1 RNA is essential for the structure of paraspeckles. Mol Cell. 2009;33(6):717-726.
  27. Chen H, et al. Dissecting mammalian spermatogenesis using spatial transcriptomics. Cell Rep. 2021;37(5):109915.
  28. Hafner M, et al. CLIP and complementary methods. Nat Rev Methods Primers. 2021;1(1):20.
  29. Ramanathan M, Porter DF, Khavari PA. Methods to study RNA-protein interactions. Nat Methods. 2019;16(3):225-234.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

BiochemiaNumer 233Numer 233Warto pustaNumerTug1Bia ko wi ce RNA RBPeCLIPsieciowanie UVbezpo rednia interakcjawalidacja ortogonalna
Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.