Niniejszy protokół opisuje standaryzowaną laminektomię lędźwiową L5 u starszych myszy C57BL/6J w celu stworzenia modelu pooperacyjnych zaburzeń poznawczych przy jednoczesnym zminimalizowaniu upośledzenia funkcji lokomocyjnych, co umożliwia prowadzenie badań behawioralnych, histologicznych i mechanistycznych nad okołoperacyjnymi zaburzeniami neuropoznawczymi.
Artykuł metodologiczny
Laminektomia lędźwiowa na poziomie L5 u starszych myszy C57BL/6J w celu modelowania pooperacyjnego zaburzenia funkcji poznawczych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pooperacyjne zaburzenia poznawcze (POCD) są częstym powikłaniem neurologicznym po zabiegach chirurgicznych i znieczuleniu, szczególnie u osób starszych, i wiążą się z opóźnionym powrotem do zdrowia, przedłużoną hospitalizacją oraz obniżoną jakością życia. Procedury ortopedyczne i kręgosłupowe są powiązane z relatywnie wysokim ryzykiem wystąpienia POCD; jednak modele przedkliniczne, które ściśle odzwierciedlają cechy okołoperacyjne chirurgii kręgosłupa, pozostają ograniczone. Powszechnie stosowane modele, w tym laparotomia i złamania kości piszczelowej, mogą powodować trwałe upośledzenie lokomocyjne i przedłużający się stan zapalny obwodowy, co może zakłócać interpretację wyników behawioralnych w zakresie funkcji poznawczych. W niniejszej pracy opisany protokół przedstawia ustandaryzowaną, niskokosztową metodę modelowania POCD z wykorzystaniem laminektomii lędźwiowej L5 w znieczuleniu sewofluranem u 18-miesięcznych samców myszy C57BL/6J. Procedura jest wykonywana przy użyciu rutynowych narzędzi chirurgicznych i powoduje kontrolowany uraz chirurgiczny przy jednoczesnym minimalizowaniu trwałych deficytów ruchowych. Funkcje poznawcze ocenia się za pomocą testu rozpoznawania nowych obiektów, labiryntu Y z nowym ramieniem oraz labiryntu Barnesa, natomiast uszkodzenia neuronów hipokampa i zmiany neurozapalne ocenia się odpowiednio za pomocą barwienia Nissla i immunofluorescencji Iba1. Reprezentatywne wyniki wykazują zachowaną aktywność lokomocyjną, upośledzone funkcje poznawcze, zmniejszoną integralność neuronów hipokampa oraz nasilony stan zapalny w obrębie hipokampa po operacji. Ten ustandaryzowany i dostępny model stanowi klinicznie istotną platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń poznawczych związanych z chirurgią kręgosłupa oraz do oceny potencjalnych okołoperacyjnych interwencji neuroprotekcyjnych.
Wprowadzenie
Pozabiegowe zaburzenia poznawcze (POCD) definiuje się jako spadek zdolności uczenia się i pamięci, uwagi, szybkości przetwarzania oraz funkcji wykonawczych po znieczuleniu i operacji1, co dotyczy przede wszystkim pacjentów w podeszłym wieku, a zgłaszana częstość występowania wydaje się różnić w zależności od kontekstu chirurgicznego i populacji pacjentów2,3. Doniesienia wskazują, że POCD często występuje u osób starszych poddawanych planowym zabiegom ortopedycznym4. Klinicznie POCD może utrzymywać się od kilku tygodni do kilku miesięcy po operacji i wiąże się z przedłużoną hospitalizacją oraz zwiększoną śmiertelnością5,6,7. W obliczu postępującego starzenia się społeczeństw i rosnącej liczby zabiegów chirurgicznych na całym świecie, POCD stało się istotnym problemem zdrowia publicznego i opieki okołozabiegowej.
Pod kątem patofizjologicznym POCD jest uważane za zespół wieloczynnikowy wywołany urazem chirurgicznym i ekspozycją na środki znieczulające, przy czym wśród proponowanych mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji neuronalnej w obszarach istotnych dla poznania, takich jak hipokamp, wymienia się neurostan zapalny, stres oksydacyjny, zaburzenia autofagii oraz dysfunkcję synaptyczną8. Aby przeanalizować te mechanizmy i ocenić potencjalne interwencje, opracowano szereg preklinicznych paradygmatów POCD. Paradygmaty prekliniczne obejmują modele oparte wyłącznie na znieczuleniu, modele oparte na operacjach w obrębie jamy brzusznej oraz modele urazów ortopedycznych, takich jak złamanie kości piszczelowej9. Choć modele te przyczyniły się do rozwoju tej dziedziny, mogą one nie w pełni oddawać cechy okołoperacyjne istotne dla chirurgii kręgosłupa, a niektóre z nich mogą wprowadzać czynniki zakłócające, takie jak trwałe deficyty lokomocyjne i przedłużający się stan zapalny tkanek, co komplikuje odczyty poznawcze i interpretację mechanizmów.
Spośród dostępnych strategii chirurgicznych wybraliśmy model laminektomii lędźwiowej L5, aby zbadać wczesne pooperacyjne upośledzenie poznawcze w zestandaryzowanym i istotnym dla kręgosłupa kontekście chirurgicznym. Procedura ta zapewnia kontrolowany, miejscowy uraz chirurgiczny w znieczuleniu wziewnym, umożliwiając badanie pooperacyjnych odpowiedzi neurozapalnych i dysfunkcji poznawczych bez wywoływania wyraźnych zaburzeń motorycznych. Dzięki dopracowaniu kluczowych etapów operacyjnych, protokół ten oferuje zestandaryzowaną, praktyczną i kosztowo efektywną metodę badania upośledzenia poznawczego związanego z operacjami kręgosłupa oraz oceny okołoperoperacyjnych strategii neuroprotekcyjnych.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Zhejiang (numer zgody etycznej: ZJU20260153).
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Zwierzęta doświadczalne, przydział do grup, analgezja i ślepa próba
- Wykorzystać 18-miesięczne samce myszy C57BL/6J o masie 30–34 g. Myszy powinny być utrzymywane w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności z swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
- Pozostawić myszy do aklimatyzacji w warunkach chowu przez co najmniej 7 dni przed operacją. Po aklimatyzacji losowo przydzielić myszy do grupy laminektomii L5 lub grupy kontrolnej.
- Przed procedurami eksperymentalnymi przypisać każdej myszy zakodowany numer identyfikacyjny. Zachować kod przydziału do grup, aby oceny behawioralne mogły być przeprowadzone metodą ślepej próby względem zastosowanego leczenia.
- Myszy w grupie laminektomii L5 poddać znieczuleniu sewofluranem, a następnie laminektomii lędźwiowej L5. Myszy w grupie kontrolnej nie powinny być poddawane znieczuleniu sewofluranem, przygotowaniu miejsca operacyjnego ani interwencji chirurgicznej.
- Podawać meloksykam podskórnie w dawce 2 mg/kg myszom w obu grupach. Pierwszą dawkę podać po indukcji znieczulenia w grupie laminektomii L5 oraz w czasie odpowiadającym zakończeniu operacji w grupie kontrolnej.
- Kolejne dawki meloksykamu podawać podskórnie w dawce 2 mg/kg co 24 h przez 48 h myszom w obu grupach. Obie grupy powinny być utrzymywane, obsługiwane i monitorowane w tych samych warunkach przez cały okres eksperymentu.
- Wszystkie oceny behawioralne przeprowadzać zgodnie z tym samym harmonogramem eksperymentalnym dla obu grup. Upewnić się, że badacz przeprowadzający oceny behawioralne nie zna przydziału myszy do grup.
- Zisterylizować wszystkie instrumenty chirurgiczne i zdezynfekować przestrzeń operacyjną. Podgrzać podkładkę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała podczas znieczulenia. Przygotować meloksykam do podania w okresie okołoperacyjnym.
- Włączyć aparat do znieczulenia gazowego i umieścić mysz w komorze indukcyjnej. Wywołać znieczulenie ogólne 3–5% sewofluranem przez 3–5 min, utrzymując przepływ tlenu na poziomie 1 L/min.
- Przenieść znieczuloną mysz na platformę chirurgiczną. Utrzymywać znieczulenie 1,5–3% sewofluranem podawanym przez maskę znieczuleniową przy przepływie tlenu 0,5–0,8 L/min. Podać meloksykam podskórnie w dawce 2 mg/kg. Całkowity czas znieczulenia, mierzony od rozpoczęcia indukcji sewofluranem, wynosi około 4 h. Dostosować stężenie sewofluranu w razie potrzeby, aby utrzymać stabilną płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego.
- Ułożyć mysz w pozycji brzusznej z kręgosłupem lędźwiowym skierowanym ku górze. Delikatnie przymocować przednie kończyny taśmą, aby ustabilizować zwierzę i zapewnić niezakłócony dostęp do pola operacyjnego na poziomie L5.
- Potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez weryfikację braku odruchu wycofania łapy. Nałożyć maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
- Usunąć sierść z linii środkowej regionu lędźwiowego (około L3–S1) za pomocą trymera dla małych zwierząt. Zdezynfekować odsłoniętą skórę 75% etanolem, a następnie powidonem jodowym, powtarzając procedurę 2–3 razy w celu zapewnienia warunków aseptycznych.
2. Operacja laminektomii lędźwiowej L5
UWAGA: W niniejszym protokole wszystkie etapy chirurgiczne wykonano pod bezpośrednią wizualizacją, bez użycia stereomikroskopu lub lup powiększających.
- Umieścić znieczoloną mysz w pozycji brzusznej na uprzednio podgrzanej platformie chirurgicznej. Unieruchomić przednie kończyny za pomocą taśmy, aby ustabilizować ciało i w pełni odsłonić odcinek lędźwiowy (Rycina 1).
- Zidentyfikować poziom kręgu L5, korzystając z punktów orientacyjnych powierzchniowych. Zbadzając palpacyjnie obustronnie grzebienie biodrowe, wyznaczyć urojoną linię poprzeczną łączącą ich najwyższe punkty.
- Wykorzystać linię poprzeczną jako przybliżony punkt orientacyjny dla przestrzeni międzykręgowej L5–L6. Wycentrować planowane nacięcie skóry nieco kranialnie w stosunku do tej linii, aby celować w blaszkę L5.
- Zdezynfekować pole operacyjne. Wykonać w linii środkowej podłużne nacięcie skóry o długości około 1,5–2,0 cm nad wyznaczonym poziomem L5, aby odsłonić obszar L4–L6.
- Odciągnąć brzegi skóry za pomocą sterylnej pęsety. Odsłonić powięź grzbietową i zidentyfikować szew powięziowy w linii środkowej.
- Potwierdzić poziom kręgowy po odsłonięciu kręgosłupa. Zidentyfikować połączenie lędźwiowo-krzyżowe oraz najbardziej kaudalny kręg lędźwiowy.
- Zidentyfikować L5 jako kręg znajdujący się bezpośrednio kranialnie względem L6, ponieważ myszy C57BL/6 zazwyczaj posiadają sześć kręgów lędźwiowych. Potwierdzić poziom, odliczając dwa kręgi kranialnie od połączenia lędźwiowo-krzyżowego.
- Utworzyć niewielki otwór wzdłuż szwu powięziowego w linii środkowej. Odsunąć obustronnie mięśnie przykręgosłupowe pod bezpośrednią kontrolą wzrokową.
- Rozdzielić mięśnie sąsiadujące z wyrostkiem kolczystym L5, aby odsłonić leżącą pod nimi blaszkę. Rozszerzyć obszar odsłonięcia kranialnie do wyrostka kolczystego L4 i kaudalnie do wyrostka kolczystego L6, aż wszystkie trzy wyrostki kolczyste będą wyraźnie widoczne.
- Wykonć przede wszystkim tępe rozcięcie w sąsiedztwie kości, używając patyczków bawełnianych lub delikatnej pęsety. Stosować rozcięcie ostre tylko wtedy, gdy jest to konieczne do uwolnienia zrostów powięziowych i zminimalizowania krwawienia.
- Utrzymać boczny odciąg za pomocą patyczków bawełnianych, aby całkowicie odsłonić blaszkę L5 oraz przestrzeń międzyblaszkową L5–L6. Ponownie potwierdzić poziom kręgowy przed kontynuowaniem procedury.
- Delikatnie chwycić wyrostek kolczysty L5 pęsetą i unieść wyrostek oraz przyległy odcinek lędźwiowy kręgosłupa pod kątem około 30° w stosunku do platformy chirurgicznej, aby poszerzyć przestrzeń międzyblaszkową L5–L6.
- Wprowadzić zamknięte końcówki nożyczek okulistycznych do przestrzeni międzyblaszkowej L5–L6 pod bezpośrednią kontrolą wzrokową. Przesunąć nożyczki wzdłuż płytkiej płaszczyzny bezpośrednio pod kaudalnym brzegiem blaszki L5.
- Lekko rozwarzyć nożyczki, aby stworzyć początkowy otwór w kości. Powiększyć okno laminektomii, usuwając kolejno małe fragmenty kości wzdłuż krawędzi blaszki. Ograniczyć usuwanie kości do grzbietowej części blaszki L5 i unikać rozszerzania okna kostnego bocznie w stronę obustronnych stawów międzywyrostkowych.
- Unikać nadmiernej głębokości wprowadzenia narzędzi oraz zbyt dużej siły cięcia, aby zapobiec uszkodzeniu opony twardej.
- Kontynuować usuwanie blaszki etapami, aż opona twarda stanie się wyraźnie widoczna przez okno kostne.
- Uważnie obejrzeć pole operacyjne. Potwierdzić brak aktywnego krwawienia i zweryfikować, czy opona twarda pozostała nienaruszona.
- Przepłukać miejsce operacyjne ciepłą sterylną solą fizjologiczną. Uzyskać hemostazę za pomocą delikatnego ucisku.
- Zamknąć ranę warstwowo. Zaszyć skórę szwami nylonowymi 6-0 i zdezynfekować miejsce nacięcia.
- Po zamknięciu rany kontynuować znieczulenie sewofluranem, aż całkowity czas anestezji wyniesie około 4 h. Następnie zaprzestać podawania sewofluranu i przejść do opieki pooperacyjnej.
3. Opieka pooperacyjna
- W punkcie czasowym odpowiadającym zakończeniu operacji w grupie laminektomii, podaj meloksykam podskórnie w dawce 2 mg/kg myszom w grupie kontrolnej. Umieść każdą mysz z grupy laminektomii na matach grzewczych z kontrolą temperatury i utrzymuj temperaturę ciała do momentu, aż mysz odzyska przytomność i wykaże stabilny oddech spontaniczny oraz aktywność motoryczną.
- Po pełnym wybudzeniu z narkozy przenieś każdą mysz z grupy laminektomii z powrotem do klatki macierzystej. Następnie monitoruj zwierzę do czasu zaobserwowania prawidłowego poruszania się. Podawaj kolejne dawki meloksykamu podskórnie w dawce 2 mg/kg co 24 h przez 48 h myszom w obu grupach.
- Codziennie do 3. dnia po operacji sprawdzaj cięcie chirurgiczne oraz szczelność szwów. W razie potrzeby ponów narkozę u myszy i zastąp wszelkie poluzowane lub przerwane szwy.
- Codziennie badać miejsce nacięcia pod kątem obrzęku, krwawienia, wydzieliny lub oznak miejscowego stanu zapalnego.
- Przez cały okres pooperacyjny monitoruj masę ciała, zachowania pielęgnacyjne, aktywność spontaniczną oraz spożycie pokarmu i wody.
- Humanitarnie uśmierć każdą mysz przed planowanym końcem eksperymentu, jeśli spełnione zostanie którekolwiek z poniższych zdefiniowanych kryteriów punktu końcowego: utrata ≥20% przedoperacyjnej masy ciała; całkowita anoreksja przez 24 h lub spożycie pokarmu poniżej 50% normalnej ilości przez 3 kolejne dni; niezdolność lub wyraźna niechęć do stania lub dostania się do pokarmu i wody utrzymująca się przez 24 h po wybudzeniu z narkozy; lub stan agonalny charakteryzujący się wyraźną depresją organizmu połączoną z temperaturą ciała poniżej 37 °C.
4. Ocena behawioralna POCD
- Test otwartego pola (Kontrola lokomocyjna; 3. doba pooperacyjna)
- Przeprowadzić test otwartego pola w arenie o wymiarach 45 cm × 45 cm ze ściankami o wysokości 40 cm przy poziomie oświetlenia 20 lux. Umieścić kamerę wideo bezpośrednio nad centrum areny w taki sposób, aby cały obszar testowy znajdował się w polu widzenia.
- Umieścić mysz w centrum areny i niezwłocznie po umieszczeniu uruchomić śledzenie wideo. Pozwolić myszy na swobodną eksplorację przez 5 min. Przeanalizować całą 5-minutową sesję i obliczyć całkowity przebyty dystans oraz średnią prędkość poruszania się za pomocą systemu śledzenia wideo.
- Analiza chodu
- Przeprowadzić analizę chodu w 3. dobie pooperacyjnej przy użyciu zautomatyzowanego systemu analizy chodu.
- Umieścić każdą mysz na jednym końcu ścieżki i pozwolić jej na swobodne przejście przez ścieżkę. Rejestrować odciski łap podczas lokomocji za pomocą kamery wysokiej rozdzielczości zintegrowanej z systemem analizy chodu.
- Zarejestrować próby chodu dla każdej myszy i zebrać trzy poprawne przebiegi z ciągłym ruchem do przodu przez ścieżkę do późniejszej analizy.
- Przeanalizować zarejestrowane dane o odciskach łap za pomocą oprogramowania do analizy chodu. Przejrzeć automatycznie zidentyfikowane odciski łap i w razie potrzeby ręcznie skorygować klasyfikację prawej przedniej łapy, lewej przedniej łapy, prawej tylnej łapy i lewej tylnej łapy przed wyodrębnieniem parametrów chodu.
- Ilościowo określić długość kroku, czas podporu, prędkość przenoszenia oraz powierzchnię odcisku, a następnie obliczyć wartość średnią z trzech poprawnych przebiegów dla każdej myszy do analizy statystycznej.
- Labirynt Barnesa (Uczenie się przestrzenne i pamięć; 4–6. doby pooperacyjne)
UWAGA: Testy w labiryncie Barnesa należy przeprowadzać raz dziennie przez trzy kolejne dni, zaczynając od 4. doby pooperacyjnej. Testy należy przeprowadzać w tym samym przedziale czasowym każdego dnia, aby zminimalizować zmienność okołodobową.- Umieścić skrzynkę ucieczki pod wyznaczonym otworem docelowym. Przez cały eksperyment zachować tę samą lokalizację celu.
- Każdą próbę rozpocząć od umieszczenia myszy w centrum labiryntu. Pozwolić myszy szukać skrzynki ucieczki przez maksymalnie 3 min. Zakończyć próbę w momencie wejścia myszy do skrzynki ucieczki.
- Jeśli mysz nie zdoła zlokalizować skrzynki ucieczki w ciągu 3 min, delikatnie poprowadzić ją do otworu docelowego. Pozwolić myszy pozostać przez chwilę w skrzynce ucieczki, aby wzmocnić naukę zadania.
- Zarejestrować czas ucieczki (latencję) i przebyty dystans za pomocą systemu śledzenia wideo. W próbach, w których mysz nie weszła do skrzynki ucieczki w ciągu 3 min, przypisać czas ucieczki wynoszący 180 s. Do analizy statystycznej włączyć wyłącznie czas ucieczki i dystans zarejestrowane podczas ostatniej sesji w 3. dniu.
- Rozpoznawanie nowego obiektu (Pamięć rozpoznawcza; 3–4. doby pooperacyjne)
UWAGA: Należy użyć tej samej areny i systemu śledzenia wideo, co opisano w przypadku testu otwartego pola. Sesję w otwartym polu w 3. dobie pooperacyjnej należy wykorzystać do habituacji myszy do areny testowej przed treningiem rozpoznawania nowego obiektu.- Podczas sesji treningowej umieścić dwa identyczne obiekty cylindryczne w symetrycznych pozycjach w arenie. Pozwolić myszy na swobodną eksplorację przez 5 min.
- Po 1 h odstępu (interwał retencji) zastąpić jeden znany obiekt cylindryczny nowym obiektem w kształcie sześcianu. Zrównoważyć pozycję nowego obiektu pomiędzy myszami, aby zminimalizować potencjalną preferencję strony. Pozwolić myszy na eksplorację przez 5 min.
- Zarejestrować czas eksploracji obiektów znanych i nowych za pomocą systemu śledzenia wideo. Do analizy włączyć tylko te myszy, których całkowity czas eksploracji obiektów wynosił co najmniej 3 s.
- Obliczyć indeks preferencji (PI) według wzoru:
Przyjąć Tnovel i Tfamiliar jako czasy spędzone odpowiednio na eksploracji nowego i znanego obiektu podczas sesji testowej.
- Labirynt Y z nowym ramieniem (Przestrzenna pamięć rozpoznawcza; 5. doba pooperacyjna)
- Test przeprowadzić w labiryncie w kształcie litery Y, składającym się z trzech identycznych ramion oddzielonych od siebie o 120°. Losowo zablokować jedno ramię nieprzezrozystymi drzwiami i wyznaczyć to ramię jako ramię nowe.
- Losowo wybrać jedno z dwóch otwartych ramion jako ramię startowe. Pozostałe otwarte ramię wyznaczyć jako ramię znane. Umieścić mysz na końcu ramienia startowego i pozwolić jej na swobodną eksplorację dwóch dostępnych ramion przez 5 min.
- Po 1 h odstępu między próbami usunąć nieprzezrozyste drzwi i ponownie umieścić mysz na końcu tego samego ramienia startowego.
- Pozwolić myszy na swobodną eksplorację wszystkich trzech ramion przez 5 min.
- Wejście do ramienia zdefiniować jako wejście śledzonego centrum ciała z strefy centralnej do zdefiniowanej strefy ramienia. Zarejestrować liczbę wejść i czas spędzony w każdym ramieniu za pomocą systemu śledzenia wideo.
- Obliczyć czasowy indeks preferencji ramienia nowego według wzoru:
Przyjąć Tnovel, Tstart i Tfamiliar jako czas spędzony odpowiednio w ramieniu nowym, startowym i znanym. - Obliczyć indeks preferencji oparty na liczbie wejść według wzoru:
Przyjąć Enovel jako liczbę wejść do ramienia nowego, a Etotal jako całkowitą liczbę wejść do wszystkich trzech ramion podczas próby testowej.
5. Obróbka tkanek, barwienie metodą Nissla i barwienie immunofluorescencyjne
- Obróbka tkanek
- W wyznaczonym punkcie końcowym eksperymentu głęboko z narkozą mysz za pomocą 3% sewofluranu podawanego przy przepływie tlenu 2 L/min.
- Potwierdzić odpowiednią głębokość narkozy poprzez brak odruchu wycofania kończyny. Zachowując głęboką narkozę i przed zatrzymaniem akcji serca, przeprowadzić perfuzję transkardialną 20 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w celu usunięcia krwi z naczyń.
- Natychmiast przeprowadzić perfuzję myszy 20 mL 4% paraformaldehydem (PFA).
- Ostrożnie wypreparować cały mózg. Zanurzyć mózg w 4% PFA na 24 h w temperaturze 4 °C w celu postfiksacji.
- Przenieść mózg do 30% sacharozy, aż tkanka całkowicie opadnie na dno.
- Zatopić mózg w związku OCT (optimal cutting temperature compound).
- Szybko zamrozić zatopioną tkankę i przechowywać w temperaturze −80 °C do czasu wykonania kriosiecji.
- Barwienie metodą Nissla
- Dociągnąć kriosiekcje o grubości 16 µm do temperatury pokojowej. Suszyć preparaty na powietrzu przez 20 min.
- Płukać preparaty w PBS przez 2 min.
UWAGA: Przed barwieniem upewnić się, że sekcje tkankowe pozostają mocno przylegające do szkiełek. - Przykryć sekcje całkowicie roztworem barwiącym błękitem toluidyny. Inkubować przez 30 min w temperaturze 55 °C.
UWAGA: Optymalizować czas barwienia empirycznie dla sekcji 16 µm, aby zapobiec nadmiernemu zabarwieniu. - Krótko płukać preparaty w wodzie destylowanej przez 10–30 s.
- Odbarwiać sekcje sekwencyjnie w etanolu 95%, 85% i 75% przez 2 min w każdym roztworze.
UWAGA: W razie potrzeby dostosować czas odbarwiania, aby zoptymalizować intensywność barwienia. - Oczyszczać preparaty dwukrotnie w świeżym ksylenie po 5 min każdorazowo.
UWAGA: Wszystkie etapy z użyciem ksylenu przeprowadzać w dygestorium. - Zamontować sekcje za pomocą balsamowania neutralnego. Delikatnie nałożyć szkiełko cover-slip na każdą sekcję.
- Wykonać obrazowanie zabarwionych sekcji za pomocą mikroskopu świetlnego z obiektywem 20×. Zidentyfikować obszar CA1 na podstawie charakterystycznej, zwartej warstwy komórek piramidalnych w koronalnym przekroju hipokampa. Dla każdej myszy przeanalizować jeden przekrój koronalny i pobrać dwa niepokrywające się pola z obszaru CA1 każdej półkuli hipokampa.
- Ręcznie policzyć morfologicznie nienaruszone neurony Nissl-dodatnie oraz ciałka Nissla, korzystając z wtyczki do liczenia komórek w oprogramowaniu do analizy obrazu. Nienaruszone neurony identyfikować po zachowanym somie, okrągłym jądrze z widocznym jąderkiem oraz obfitej substancji Nissla w cytoplazmie; ciałka Nissla identyfikować jako intensywnie bazofilne struktury ziarniste lub grudkowate w cytoplazmie neuronalnym.
- Wyciągnąć średnią z wartości uzyskanych ze wszystkich analizowanych pól, aby otrzymać jedną wartość na zwierzę. Upewnić się, że obserwator wykonujący liczenie nie zna przydziału zwierząt do grup.
- Barwienie immunofluorescencyjne Iba1
- Pozwolić sekcjom mózgu wyrównać temperaturę do pokojowej przed barwieniem.
- Zanurzyć preparaty w roztworze do odzyskiwania antygenu z cytrynianem sodu i przeprowadzić odzyskiwanie antygenu w kąpieli wodnej o temperaturze 80 °C przez 25 min. Po odzyskaniu antygenu pozwolić preparatom i roztworowi ostygnąć naturalnie do temperatury pokojowej.
- Przemyć sekcje trzy razy solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS) po 3 min każdorazowo.
- Zpermeabilizować sekcje za pomocą 0,2% Triton X-100 w PBS przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przemyć w PBS po 3 min każdorazowo.
- Zablokować wiązanie niespecyficzne, inkubując sekcje w 3% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej w komorze nawilżanej.
- Przemyć sekcje trzy razy w PBS po 3 min każdorazowo.
- Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko cząsteczce adaptorowej wiążącej jony wapnia 1 (Iba1; 1:100) w roztworze blokującym (3% BSA w PBS) i inkubować sekcje z rozcieńczonym przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C w komorze nawilżanej.
- Przemyć sekcje trzy razy w PBS po 3 min każdorazowo.
- Inkubować sekcje z kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG (H+L) sprzężonym z fluorochromem 488 (1:1000) przez 90 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Przemyć sekcje trzy razy w PBS po 3 min każdorazowo w ciemności.
- Przeciwbarwić jądra za pomocą DAPI (1:8000) przez 5 min w ciemności.
- Przemyć sekcje trzy razy w PBS po 3 min każdorazowo w ciemności.
- Zamontować sekcje w medium montażowym zapobiegającym zanikowi fluorescencji, nałożyć szkiełka cover-slip i chronić sekcje przed światłem do czasu obrazowania.
- Pozyskać obrazy fluorescencyjne obszaru CA1 hipokampa za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 20×. Użyć identycznych ustawień akwizycji obrazu dla wszystkich sekcji uwzględnionych w porównaniach ilościowych. Dla każdej myszy przeanalizować jeden przekrój koronalny i pobrać dwa niepokrywające się pola z obszaru CA1 każdej półkuli hipokampa.
- Ilościowo określić średnią intensywność fluorescencji Iba1 w obszarze CA1 hipokampa przy zastosowaniu identycznych ustawień progu (threshold) dla wszystkich obrazów. Wyciągnąć średnią z wartości ze wszystkich pól, aby uzyskać jedną wartość na zwierzę.
6. Analiza statystyczna
- Wszystkie analizy statystyczne należy przeprowadzić przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej. Dane należy przedstawić jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).
- Normalność rozkładu danych należy ocenić za pomocą testu Shapiro-Wilka. Równość wariancji należy ocenić za pomocą testu F.
- Grupy kontrolną oraz grupę po laminektomii L5 należy porównać za pomocą nieparzystego obustronnego testu t Studenta, jeśli założenie o równości wariancji zostanie spełnione. W przypadku niespełnienia tego założenia należy zastosować test t Welcha.
- Jako n definiuje się liczbę zwierząt uwzględnionych w każdej analizie. Wartość P < 0,05 należy uznać za statystycznie istotną.
Wyniki
Wszystkie myszy przeżyły do planowanego punktu końcowego eksperymentu, żadna z nich nie spełniła wcześniej określonych kryteriów humanitarnego punktu końcowego i wszystkie zostały uwzględnione w analizach końcowych. Funkcje motoryczne oceniano w 3. dobie po operacji za pomocą analizy pola otwartego oraz analizy chodu. Zarówno całkowity dystans, jak i średnia prędkość w teście pola otwartego nie różniły się między grupami, co wskazuje na porównywalną spontaniczną aktywność lokomocyjną (Rysunek 2A). Analiza chodu nie wykazała również istotnych różnic międzygrupowych w długości kroku, czasie stania, prędkości przeniesienia kończyny ani powierzchni odcisku łapy (Rysunek 2B). Wspólnie wyniki te wskazują, że procedura laminektomii poziomu L5 nie spowodowała jawnych zaburzeń motorycznych w stopniu wystarczającym do wyjaśnienia późniejszych różnic w sprawności poznawczo-behawioralnej.
Wydajność poznawczą oceniano za pomocą testu rozpoznawania nowych obiektów (NOR), labiryntu Y z nowym ramieniem oraz labiryntu Barnesa. W teście NOR grupa po laminektomii L5 wykazała istotnie niższy indeks preferencji nowych obiektów (PI) niż grupa kontrolna (Rysunek 3A). W labiryncie Y z nowym ramieniem grupa po laminektomii L5 wykazała istotnie niższe wartości PI zarówno dla czasu spędzonego w nowym ramieniu, jak i liczby wejść do niego (Rysunek 3B). W labiryncie Barnesa grupa po laminektomii L5 wykazała dłuższą latencję ucieczki oraz większą przebyty dystans w trzecim dniu testowania w labiryncie Barnesa (Rysunek 3C). Wspólnie te wyniki behawioralne wskazują na upośledzenie funkcji poznawczych po laminektomii L5.
W obszarze CA1 hipokampa w grupie po laminektomii L5 stwierdzono znacznie mniejszą liczbę neuronów Nissl-dodatnich oraz znacznie mniejszą liczbę ciałek Nissla niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na uszkodzenia strukturalne neuronów (Rycina 4A, B). Ponadto średnia intensywność fluorescencji Iba1 była znacznie wyższa w grupie po laminektomii L5, co jest zgodne ze zwiększoną aktywacją mikrogleju (Rycina 4C, D).
Rysunek 1: Procedura laminektomii L5 w modelu pooperacyjnej dysfunkcji poznawczej (POCD) u myszy. (A) Ilustracja celu chirurgicznego na poziomie łuku kręgu L5 oraz zakresu odsłonięcia obejmującego sąsiednie poziomy kręgów (L4–L6). (B) Obrazy śródoperacyjne ilustrujące kluczowe etapy procedury laminektomii lędźwiowej L5. (a) Region lędźwiowy po zgoleniu, z wyznaczoną linią środkową kręgosłupa; strzałki wskazują kierunek planowanego nacięcia skóry. (b) Nacięcie skóry w linii środkowej nad lędźwiowym odcinkiem kręgosłupa. (c) Nacięcie powięzi z następczym etapowym oddzieleniem mięśni przykręgosłupowych w celu odsłonięcia wyrostków kolczystych oraz dalszego oczyszczenia tkanek wokół wyrostka kolczystego i łuku kręgu L5, aby w pełni odsłonić łuk kręgu L5. (d) Laminektomia L5 po usunięciu łuku kręgu L5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Ocena aktywności lokomotorycznej i chodu po laminektomii lędźwiowej L5. (A) Test otwartego pola pokazujący całkowity przebyty dystans i średnią prędkość (n = 10). (B) Analiza chodu pokazująca długość kroku, czas stania, prędkość wymachu i powierzchnię odcisku łapy (n = 6). Dane przedstawiają średnią ± SD. Istotność statystyczna oznaczona jest jako ns (brak istotności). Skróty: Control = grupa kontrolna; Laminectomy = grupa po laminektomii L5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3: Oceny behawioralno-poznawcze po laminektomii lędźwiowej L5. (A) Test rozpoznawania nowych obiektów (n = 10). (B) Test labiryntu Y z nowym ramieniem (n = 10). (C) Test labiryntu Barnesa (n = 10). Dane przedstawiają średnią ± SD. Istotność statystyczną oznaczono jako *P < 0.05, **P < 0.01 oraz ***P < 0.001. Skróty: Control = grupa kontrolna; Laminectomy = grupa po laminektomii L5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Ocena histologiczna obszaru CA1 hipokampa po laminektomii lędźwiowej na poziomie L5. (A) Reprezentatywne obrazy barwienia Nissla w obszarze CA1 hipokampa. (B) Kwantyfikacja neuronów Nissl-dodatnich (lewo) i ciałek Nissla (prawo) (n = 5). (C) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencji Iba1 w obszarze CA1 hipokampa. Pasek skali = 100 µm. (D) Kwantyfikacja średniego natężenia fluorescencji Iba1 (n = 6). Dane przedstawiają średnią ± SD. Istotność statystyczną oznaczono jako **P < 0,01 oraz ***P < 0,001. Skróty: Control = grupa kontrolna; Laminectomy = grupa po laminektomii L5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
U starszych osób poddawanych operacjom kręgosłupa zgłaszano występowanie pooperacyjnej dysfunkcji poznawczej10. Dowody eksperymentalne wskazują ponadto, że starzenie się zwiększa podatność na związane z operacją upośledzenie funkcji poznawczych oraz odpowiedzi neurozapalne1,12. Niniejszy protokół łączy około 4 h znieczulenia sewofluranem z laminektomią na poziomie L5 u starych myszy w celu modelowania wczesnego pooperacyjnego upośledzenia funkcji poznawczych. Jego główna wartość metodologiczna polega na zapewnieniu praktycznej i dostępnej procedury do badania zmian behawioralnych i histologicznych w hipokampie po operacji kręgosłupa.
Przedkliniczne modele POCD obejmują paradygmaty ekspozycji wyłącznie na znieczulenie, operacje jamy brzusznej oraz urazy ortopedyczne13. Paradygmaty z samym znieczuleniem pozwalają na ocenę efektów anestezji w nieobecności urazu chirurgicznego14, lecz nie odtwarzają połączonej ekspozycji na znieczulenie i uszkodzenie tkanek. Modele operacji jamy brzusznej i złamania kości piszczelowej obejmują uraz chirurgiczny i były wykorzystywane do badania upośledzenia funkcji poznawczych powiązanych z operacją15,16. Jednak miejsca operacyjne i wzorce uszkodzeń tkanek różnią się w nich od tych występujących podczas zabiegów kręgosłupa. Ponieważ rodzaj i intensywność urazu chirurgicznego mogą wpływać na pooperacyjne wyniki poznawcze oraz centralne odpowiedzi zapalne9, przy wyborze modelu przedklinicznego należy wziąć pod uwagę kontekst chirurgiczny. Przedstawiony protokół laminektomii L5 dostarcza zatem eksperymentalnego paradygmatu powiązanego z operacją kręgosłupa do badania wczesnego pooperacyjnego upośledzenia funkcji poznawczych u starych myszy.
Kluczowym wyzwaniem technicznym w niniejszym protokole jest usunięcie odpowiedniej ilości kostnej z blaszki łuku kręgu L5 w celu wyraźnego odsłonięcia opony twardej, przy jednoczesnym unikaniu jej uszkodzenia. Podczas laminektomii wykonywanej pod bezpośrednią wizualizacją wymagana jest staranna kontrola głębokości wprowadzania narzędzi, siły cięcia oraz kąta wprowadzania nożyczek okulistycznych. Kość należy usuwać stopniowo, wykonując niewielkie, kontrolowane nacięcia wzdłuż krawędzi blaszki łuku. Chwycenie wyrostka kolczystego L5 pęsetą i uniesienie operowanego odcinka lędźwiowego pod kątem około 30° względem platformy chirurgicznej poszerza przestrzeń międzyblaszkową L5–L6. Manewr ten umożliwia płytkie wprowadzenie końcówek nożyczek pod krawędź kostną i zmniejsza ryzyko kontaktu z oponą twardą. Niepełne usunięcie kości może ograniczyć ekspozycję chirurgiczną, natomiast zbyt agresywne cięcie lub nadmierna głębokość wprowadzania narzędzia mogą spowodować uszkodzenie opony twardej. Niekontrolowany krwawienie może przesłonić pole operacyjne, upośledzić rekonwalescencję pooperacyjną i zwiększyć zmienność w wynikach behawioralnych. Gdy przestrzeń międzyblaszkowa jest niewystarczająca do bezpiecznego wprowadzenia końcówek nożyczek, należy skorygować pozycję i kąt uniesienia operowanego odcinka lędźwiowego, zamiast zwiększać głębokość wprowadzania narzędzia. Jeśli krwawienie przesłania pole operacyjne, usuwanie kości należy przerwać do czasu przywrócenia odpowiedniej wizualizacji, po czym pozostałą kość należy usuwać stopniowo.
Oddzielenie mięśni przykręgosłupowych oraz laminektomia na poziomie L5 mogą przyczyniać się do przejściowego bólu pooperacyjnego, a nadwrażliwość mechaniczna została udokumentowana po eksperymentalnej laminektomii u myszy17. Meloksykam podawano zgodnie z wcześniej określonym schematem przeciwbóliczym. Donoszono, że mimika twarzy związana z bólem pooperacyjnym u myszy utrzymuje się przez około 36–48 h18. 48-godzinny schemat przeciwbóliczy miał na celu osłonę tego wczesnego okresu pooperacyjnego, a poznawcze testy behawioralne rozpoczęto w 3. dobie po operacji, po zakończeniu leczenia przeciwbóliczego, aby zmniejszyć potencjalny wpływ bezpośredniego bólu pooperacyjnego. Test otwartego pola był stosowany w eksperymentalnych badaniach nad POCD w celu oceny spontanicznej aktywności lokomocyjnej oraz ustalenia, czy ograniczona lokomocja może zakłócać wyniki testów poznawczo-behawioralnych19,20. W związku z tym w 3. dobie po operacji, przed oceną poznawczą, przeprowadzono test otwartego pola oraz analizę chodu. Nie zaobserwowano istotnych różnic międzygrupowych w aktywności lokomocyjnej w teście otwartego pola ani w parametrach chodu, co sugeruje, że późniejsze różnice poznawczo-behawioralne prawdopodobnie nie wynikały głównie z jawnych zaburzeń ruchowych. Jednakże, ponieważ nie oceniano bezpośrednio spontanicznego bólu pooperacyjnego i dyskomfortu w ranie, nie można całkowicie wykluczyć ich resztkowego wpływu na wyniki behawioralne. Przyszłe badania mogłyby obejmować bezpośrednią ocenę spontanicznego bólu pooperacyjnego.
Podsumowując, niniejszy protokół zapewnia praktyczne podejście eksperymentalne do badania wczesnych zaburzeń poznawczych po operacji u starych myszy po laminektomii na poziomie L5. Może on zostać wykorzystany do badania wyników behawioralnych i mechanizmów leżących u podstaw upośledzenia poznawczego związanego z operacją kręgosłupa, a także do oceny interwencji mających na celu zapobieganie lub redukcję pooperacyjnych zaburzeń poznawczych. Walidacja w większych kohortach oraz w niezależnych laboratoriach pozwoliłaby na dalsze potwierdzenie stabilności i odtwarzalności tego modelu.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie stwierdzono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Sanhua Fang z platformy zaplecza rdzeniowego Zhejiang University School of Medicine oraz Yanhong Chen i Xuliang Zhang z centrum zwierząt Zhejiang University za wsparcie techniczne. Badanie to było finansowane z następujących funduszy: National Natural Science Foundation of China (nr 82575196, 82074535 oraz U23A20508).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Myszy samce C57BL/6J | Suzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd. | SYXK2023-05 | Model zwierzęcy |
| ANY-maze Video Tracking Software | Stoelting Co., USA | 600 | Wideotorakowanie i analiza behawioralna |
| Erythromycin ophthalmic ointment | Beijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd. | H1021270 | Zapobieganie wysychaniu oczu |
| Pęseta precyzyjna | NA | NA | Uchwycenie skóry |
| Mata grzewcza | NA | NA | Kontrola temperatury |
| Iba1/AIF-1 (E4O4W) Rabbit Monoclonal Antibody | Cell Signaling Technology | 17198 | Barwienie immunofluorescencyjne Iba1 |
| Sprzęt do anestezji inhalacyjnej | RWD Life Science Co., Ltd. | R581S | Znieczulenie |
| MGT-PR | Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., China | MJY202512704 | Analiza chodu |
| Mikronożyce okulistyczne | NA | NA | Usuwanie kości |
| Nissl staining solution | Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK203 | Barwienie Nissla |
| Nożyczki | Shang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,Corp | Y030 | Nacięcie skóry |
| Sevoflurane | Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd. | 2506231 | Znieczulenie |
| Single Use Surgical Drape | Jiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd. | 2021214021 | Podłoże do operacji chirurgicznych |
| Trymer do małych zwierząt | Yiwu Leiben Trading Co., Ltd. | 2504KFZB3592-03310 | Usuwanie sierści |
| Surgical Suture Needles with Thread | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD. | F603 | Szycie skóry |
| Veet hair removal cream | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | NA | Usuwanie sierści |
Bibliografia
- Zhao Q, Wan H, Pan H, Xu Y. Postoperative cognitive dysfunction-current research progress. Front Behav Neurosci. 2024;18:1328790.
- Kong H, Xu LM, Wang DX. Perioperative neurocognitive disorders: A narrative review focusing on diagnosis, prevention, and treatment. CNS Neurosci Ther. 2022;28(8):1147-1167.
- Monk TG, et al. Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery. Anesthesiology. 2008;108(1):18-30.
- Li X, et al. Risk factors for postoperative cognitive decline after orthopedic surgery in elderly Chinese patients: A retrospective cohort study. Clin Interv Aging. 2024;19:491-502.
- Krenk L, et al. Cognitive dysfunction after fast-track hip and knee replacement. Anesth Analg. 2014;118(5):1034-1040.
- Yang X, et al. Identification of individuals at risk for postoperative cognitive dysfunction (POCD). Ther Adv Neurol Disord. 2022;15:17562864221114356.
- Suraarunsumrit P, et al. Outcomes associated with postoperative cognitive dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Age Ageing. 2024;53(7):afae160.
- Lin X, et al. The potential mechanism of postoperative cognitive dysfunction in older people. Exp Gerontol. 2020;130:110791.
- Lu B, et al. Effects of different types of non-cardiac surgical trauma on hippocampus-dependent memory and neuroinflammation. Front Behav Neurosci. 2022;16:950093.
- Park S, et al. Preoperative mild cognitive impairment as a risk factor of postoperative cognitive dysfunction in elderly patients undergoing spine surgery. Front Aging Neurosci. 2024;16:1292942.
- Xu Z, et al. Age-dependent postoperative cognitive impairment and Alzheimer-related neuropathology in mice. Sci Rep. 2014;4:3766.
- Zhang ZJ, et al. Aging alters Hv1-mediated microglial polarization and enhances neuroinflammation after peripheral surgery. CNS Neurosci Ther. 2020;26(3):374-384.
- Eckenhoff RG, et al. Perioperative neurocognitive disorder: State of the preclinical science. Anesthesiology. 2020;132(1):55-68.
- Guo LY, et al. Cognitive deficits after general anaesthesia in animal models: A scoping review. Br J Anaesth. 2023;130(2):e351-e360.
- Qiu LL, et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species in the hippocampus might contribute to microglial activation in postoperative cognitive dysfunction in aged mice. Brain Behav Immun. 2016;51:109-118.
- Cibelli M, et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 2010;68(3):360-368.
- Yamamoto S, et al. Intraoperative spinal cord stimulation mitigates central sensitization after spine surgery in mice. Spine (Phila Pa 1976). 2023;48(11):E169-E176.
- Matsumiya LC, et al. Using the mouse grimace scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012;51(1):42-49.
- Sun L, et al. Activation of cannabinoid receptor type 2 attenuates surgery-induced cognitive impairment in mice through anti-inflammatory activity. J Neuroinflammation. 2017;14(1):138.
- Zhan G, et al. Anesthesia and surgery induce cognitive dysfunction in elderly male mice: The role of gut microbiota. Aging (Albany NY). 2019;11(6):1778-1790.
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny