Artykuł metodologiczny

Laminektomia lędźwiowa na poziomie L5 u starszych myszy C57BL/6J w celu modelowania pooperacyjnego zaburzenia funkcji poznawczych

4 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71733

⸱

22 września 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje standaryzowaną laminektomię lędźwiową L5 u starszych myszy C57BL/6J w celu stworzenia modelu pooperacyjnych zaburzeń poznawczych przy jednoczesnym zminimalizowaniu upośledzenia funkcji lokomocyjnych, co umożliwia prowadzenie badań behawioralnych, histologicznych i mechanistycznych nad okołoperacyjnymi zaburzeniami neuropoznawczymi.

Streszczenie

Pooperacyjne zaburzenia poznawcze (POCD) są częstym powikłaniem neurologicznym po zabiegach chirurgicznych i znieczuleniu, szczególnie u osób starszych, i wiążą się z opóźnionym powrotem do zdrowia, przedłużoną hospitalizacją oraz obniżoną jakością życia. Procedury ortopedyczne i kręgosłupowe są powiązane z relatywnie wysokim ryzykiem wystąpienia POCD; jednak modele przedkliniczne, które ściśle odzwierciedlają cechy okołoperacyjne chirurgii kręgosłupa, pozostają ograniczone. Powszechnie stosowane modele, w tym laparotomia i złamania kości piszczelowej, mogą powodować trwałe upośledzenie lokomocyjne i przedłużający się stan zapalny obwodowy, co może zakłócać interpretację wyników behawioralnych w zakresie funkcji poznawczych. W niniejszej pracy opisany protokół przedstawia ustandaryzowaną, niskokosztową metodę modelowania POCD z wykorzystaniem laminektomii lędźwiowej L5 w znieczuleniu sewofluranem u 18-miesięcznych samców myszy C57BL/6J. Procedura jest wykonywana przy użyciu rutynowych narzędzi chirurgicznych i powoduje kontrolowany uraz chirurgiczny przy jednoczesnym minimalizowaniu trwałych deficytów ruchowych. Funkcje poznawcze ocenia się za pomocą testu rozpoznawania nowych obiektów, labiryntu Y z nowym ramieniem oraz labiryntu Barnesa, natomiast uszkodzenia neuronów hipokampa i zmiany neurozapalne ocenia się odpowiednio za pomocą barwienia Nissla i immunofluorescencji Iba1. Reprezentatywne wyniki wykazują zachowaną aktywność lokomocyjną, upośledzone funkcje poznawcze, zmniejszoną integralność neuronów hipokampa oraz nasilony stan zapalny w obrębie hipokampa po operacji. Ten ustandaryzowany i dostępny model stanowi klinicznie istotną platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń poznawczych związanych z chirurgią kręgosłupa oraz do oceny potencjalnych okołoperacyjnych interwencji neuroprotekcyjnych.

Wprowadzenie

Pozabiegowe zaburzenia poznawcze (POCD) definiuje się jako spadek zdolności uczenia się i pamięci, uwagi, szybkości przetwarzania oraz funkcji wykonawczych po znieczuleniu i operacji1, co dotyczy przede wszystkim pacjentów w podeszłym wieku, a zgłaszana częstość występowania wydaje się różnić w zależności od kontekstu chirurgicznego i populacji pacjentów2,3. Doniesienia wskazują, że POCD często występuje u osób starszych poddawanych planowym zabiegom ortopedycznym4. Klinicznie POCD może utrzymywać się od kilku tygodni do kilku miesięcy po operacji i wiąże się z przedłużoną hospitalizacją oraz zwiększoną śmiertelnością5,6,7. W obliczu postępującego starzenia się społeczeństw i rosnącej liczby zabiegów chirurgicznych na całym świecie, POCD stało się istotnym problemem zdrowia publicznego i opieki okołozabiegowej.

Pod kątem patofizjologicznym POCD jest uważane za zespół wieloczynnikowy wywołany urazem chirurgicznym i ekspozycją na środki znieczulające, przy czym wśród proponowanych mechanizmów leżących u podstaw dysfunkcji neuronalnej w obszarach istotnych dla poznania, takich jak hipokamp, wymienia się neurostan zapalny, stres oksydacyjny, zaburzenia autofagii oraz dysfunkcję synaptyczną8. Aby przeanalizować te mechanizmy i ocenić potencjalne interwencje, opracowano szereg preklinicznych paradygmatów POCD. Paradygmaty prekliniczne obejmują modele oparte wyłącznie na znieczuleniu, modele oparte na operacjach w obrębie jamy brzusznej oraz modele urazów ortopedycznych, takich jak złamanie kości piszczelowej9. Choć modele te przyczyniły się do rozwoju tej dziedziny, mogą one nie w pełni oddawać cechy okołoperacyjne istotne dla chirurgii kręgosłupa, a niektóre z nich mogą wprowadzać czynniki zakłócające, takie jak trwałe deficyty lokomocyjne i przedłużający się stan zapalny tkanek, co komplikuje odczyty poznawcze i interpretację mechanizmów.

Spośród dostępnych strategii chirurgicznych wybraliśmy model laminektomii lędźwiowej L5, aby zbadać wczesne pooperacyjne upośledzenie poznawcze w zestandaryzowanym i istotnym dla kręgosłupa kontekście chirurgicznym. Procedura ta zapewnia kontrolowany, miejscowy uraz chirurgiczny w znieczuleniu wziewnym, umożliwiając badanie pooperacyjnych odpowiedzi neurozapalnych i dysfunkcji poznawczych bez wywoływania wyraźnych zaburzeń motorycznych. Dzięki dopracowaniu kluczowych etapów operacyjnych, protokół ten oferuje zestandaryzowaną, praktyczną i kosztowo efektywną metodę badania upośledzenia poznawczego związanego z operacjami kręgosłupa oraz oceny okołoperoperacyjnych strategii neuroprotekcyjnych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Zhejiang (numer zatwierdzenia etycznego: ZJU20260153).

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Zwierzęta doświadczalne, przydział do grup, analgezja i ślepa próba
    1. Należy wykorzystać 18-miesięczne samce myszy C57BL/6J o masie ciała 30–34 g. Myszy powinny być utrzymywane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z wolnym dostępem do pokarmu i wody.
    2. Przed zabiegiem należy pozwolić myszom na aklimatyzację do warunków utrzymania przez co najmniej 7 dni. Po aklimatyzacji myszy należy losowo przydzielić do grupy laminektomii L5 lub grupy kontrolnej.
    3. Przed procedurami eksperymentalnymi każdej myszy należy przypisać zakodowany numer identyfikacyjny. Kod przydziału do grup należy zachować w taki sposób, aby oceny behawioralne mogły być przeprowadzone w warunkach ślepej próby względem zastosowanego leczenia.
    4. Myszy w grupie laminektomii L5 należy poddać znieczuleniu sewofluranem, a następnie laminektomii lędźwiowej L5. Myszy w grupie kontrolnej nie powinny być poddawane znieczuleniu sewofluranem, przygotowaniu pola operacyjnego ani interwencji chirurgicznej.
    5. Myszom w obu grupach należy podać meloksykam podskórnie w dawce 2 mg/kg. Pierwszą dawkę należy podać po indukcji znieczulenia w grupie laminektomii L5 oraz w czasie odpowiadającym zakończeniu operacji w grupie kontrolnej.
    6. Kolejne dawki meloksykamu należy podawać podskórnie w dawce 2 mg/kg co 24 h przez 48 h myszom w obu grupach. Obie grupy należy utrzymywać, obchodzić się z nimi i monitorować w tych samych warunkach przez cały okres eksperymentu.
    7. Wszystkie oceny behawioralne należy przeprowadzić zgodnie z tym samym harmonogramem eksperymentalnym dla obu grup. Należy dopilnować, aby badacz przeprowadzający oceny behawioralne nie znał przydziału zwierząt do grup.
  2. Należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne i zdezynfekować przestrzeń operacyjną. Należy rozgrzać matę grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała podczas znieczulenia. Należy przygotować meloksykam do podania w okresie okołoperacyjnym.
  3. Należy włączyć aparat do znieczulenia gazowego i umieścić mysz w komorze indukcyjnej. Znieczulenie ogólne należy indukować 3–5% sewofluranem przez 3–5 min, utrzymując przepływ tlenu na poziomie 1 L/min.
  4. Znieczuloną mysz należy przenieść na platformę chirurgiczną. Znieczulenie należy podtrzymywać 1,5–3% sewofluranem podawanym przez maskę anestezjologiczną przy przepływie tlenu 0,5–0,8 L/min. Należy podać meloksykam podskórnie w dawce 2 mg/kg. Całkowity czas znieczulenia, mierzony od rozpoczęcia indukcji sewofluranem, wynosi około 4 h. Stężenie sewofluranu należy dostosować w razie potrzeby, aby utrzymać stabilny poziom znieczulenia chirurgicznego.
  5. Mysz należy ułożyć na brzuchu z kręgosłupem lędźwiowym skierowanym ku górze. Przednie kończyny należy delikatnie przymocować taśmą, aby ustabilizować zwierzę i zapewnić niezakłócony dostęp do pola operacyjnego w odcinku L5.
  6. Odpowiednią głębokość znieczulenia należy potwierdzić, sprawdzając brak odruchu wycofania łapy. Należy zastosować maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
  7. Sierść z linii środkowej odcinka lędźwiowego (około L3–S1) należy usunąć za pomocą trymera do małych zwierząt. Odsłoniętą skórę należy zdezynfekować 75% etanolem, a następnie povidonem z jodem, powtarzając procedurę 2–3 razy w celu zapewnienia warunków aseptycznych.

2. Operacja laminektomii lędźwiowej L5

UWAGA: W niniejszym protokole wszystkie kroki chirurgiczne zostały wykonane pod bezpośrednią wizualizacją, bez użycia stereomikroskopu lub lup powiększających.

  1. Umieść znieczuloną mysz w pozycji brzusznej na podgrzanej platformie chirurgicznej. Przymocuj przednie kończyny taśmą, aby ustabilizować ciało i w pełni odsłonić obszar lędźwiowy (Rysunek 1).
  2. Zidentyfikuj poziom kręgu L5, korzystając z punktów orientacyjnych na powierzchni ciała. Wybadaj palcówo obustronnie grzebienie biodrowe i wyznacz urojoną linię poprzeczną łączącą ich najwyższe punkty.
  3. Wykorzystaj linię poprzeczną jako przybliżony punkt orientacyjny dla przestrzeni międzykręgowej L5–L6. Zaplanuj nacięcie skóry nieco kranialnie względem tej linii, aby celować w łuk kręgu L5.
  4. Zdezynfekuj pole operacyjne. Wykonaj wzdłuż linii środkowej podłużne nacięcie skóry o długości około 1,5–2,0 cm nad wyznaczonym poziomem L5, aby odsłonić obszar L4–L6.
  5. Odsunie brzegi skóry za pomocą sterylnych pęset. Odsłoń powięź grzbietową i zidentyfikuj linię środkową powięzi.
  6. Potwierdź poziom kręgów po odsłonięciu kręgosłupa. Zidentyfikuj przejście lędźwiowo-krzyżowe oraz najbardziej kaudalny kręg lędźwiowy.
  7. Zidentyfikuj L5 jako kręg znajdujący się bezpośrednio kranialnie względem L6, ponieważ myszy szczepu C57BL/6 zazwyczaj posiadają sześć kręgów lędźwiowych. Potwierdź poziom, odliczając dwa kręgi w kierunku kranialnym od przejścia lędźwiowo-krzyżowego.
  8. Wykonaj niewielki otwór wzdłuż linii środkowej powięzi. Odsuń mięśnie przykręgosłupowe obustronnie pod bezpośrednią kontrolą wzrokową.
  9. Rozdziel mięśnie przylegające do wyrostka kolczystego L5 , aby odsłonić leżący pod nimi łuk kręgu. Rozszerz pole odsłonięcia kranialnie do wyrostka kolczystego L4 oraz kaudalnie do wyrostka kolczystego L6, aż wszystkie trzy wyrostki kolczyste będą wyraźnie widoczne.
  10. Wykonaj głównie rozwarstwienie tępe w sąsiedztwie kości, używając patyczków bawełnianych lub cienkich pęset. Rozwarstwianie ostre stosuj tylko wtedy, gdy jest to konieczne do uwolnienia zrostów powięziowych i zminimalizowania krwawienia.
  11. Utrzymuj odsuniecie baczne za pomocą patyczków bawełnianych, aby całkowicie odsłonić łuk kręgu L5 oraz przestrzeń międzyłukową L5–L6. Ponownie potwierdź poziom kręgów przed kontynuacją.
  12. Delikatnie chwyć wyrostek kolczysty L5 pęsetą i unieś go wraz z przyległym odcinkiem lędźwiowym kręgosłupa pod kątem około 30° względem platformy chirurgicznej, aby poszerzyć przestrzeń międzyłukową L5–L6.
  13. Wprowadź zamknięte końce nożyczek oftalmicznych do przestrzeni międzyłukowej L5–L6 pod bezpośrednią kontrolą wzrokową. Przesuwaj nożyczki wzdłuż płytkiej płaszczyzny bezpośrednio pod kaudalną krawędzią łuku L5.
  14. Lekko otwórz nożyczki, aby stworzyć początkowy otwór w kości. Powiększ okno laminektomii, usuwając sekwencyjnie małe fragmenty kości wzdłuż krawędzi łuku. Ogranicz usuwanie kości do grzbietowej części łuku L5 i unikaj rozszerzania okna kostnego bocznie w stronę obustronnych stawów facetowych.
  15. Unikaj zbyt głębokiego wprowadzania narzędzia oraz nadmiernej siły cięcia, aby zapobiec uszkodzeniu opony twardej.
  16. Kontynuuj usuwanie łuku kręgu etapami, aż opona twarda będzie wyraźnie widoczna przez otwór kostny.
  17. Dokładnie obejrzyj pole operacyjne. Potwierdź brak aktywnego krwawienia i zweryfikuj, czy opona twarda pozostała nienaruszona.
  18. Przepłucz miejsce operacyjne ciepłą sterylną solą fizjologiczną. Uzyskaj hemostazę poprzez delikatny ucisk.
  19. Zamknij ranę warstwowo. Zaszyj skórę szwem nylonowym 6-0 i zdezynfekuj miejsce nacięcia.
  20. Po zamknięciu rany kontynuuj znieczulenie sewofluranem, aż całkowity czas znieczulenia wyniesie około 4 h. Następnie przerwij podawanie sewofluranu i przejdź do opieki pooperacyjnej.

3. Opieka pooperacyjna

  1. W punkcie czasowym odpowiadającym zakończeniu operacji w grupie laminektomii, podać meloksykam podskórnie w dawce 2 mg/kg myszom w grupie kontrolnej. Umieścić każdą mysz z grupy laminektomii na podgrzewaczu z kontrolą temperatury i utrzymywać temperaturę ciała, aż mysz odzyska przytomność oraz wykaże stabilny oddech spontaniczny i aktywność motoryczną.
  2. Po pełnym wybudzeniu z narkozy przenieść każdą mysz z grupy laminektomii do klatki domowej. Następnie monitorować zwierzę do momentu zaobserwowania prawidłowej lokomocji. Podawać kolejne dawki meloksykamu podskórnie w dawce 2 mg/kg co 24 h przez 48 h myszom w obu grupach.
  3. Codziennie do 3. doby pooperacyjnej kontrolować miejsce nacięcia chirurgicznego oraz szczelność szwów. W razie potrzeby ponownie poddać mysz znieczuleniu i zastąpić wszelkie poluzowane lub przerwane szwy.
  4. Codziennie badać nacięcie pod kątem obrzęku, krwawienia, wysięku lub oznak miejscowego stanu zapalnego.
  5. Przez cały okres pooperacyjny monitorować masę ciała, zachowania pielęgnacyjne, aktywność spontaniczną oraz spożycie pokarmu i wody.
  6. Humanitarnie uśmiercić każdą mysz przed planowanym końcem eksperymentu, jeśli spełnione zostanie którekolwiek z następujących zdefiniowanych kryteriów humanitarnego punktu końcowego: utrata ≥20% przedoperacyjnej masy ciała; całkowita anoreksja przez 24 h lub spożycie pokarmu poniżej 50% normalnej ilości przez 3 kolejne dni; niezdolność lub wyraźna niechęć do stania lub dostania się do pokarmu bądź wody utrzymująca się przez 24 h po wybudzeniu z narkozy; lub stan agonalny charakteryzujący się wyraźną depresją organizmu połączoną z temperaturą ciała poniżej 37 °C.

4. Ocena behawioralna POCD

  1. Test otwartego pola (Kontrola lokomocji; 3. dzień po operacji)
    1. Przeprowadź test otwartego pola w obszarze o wymiarach 45 cm × Arena o średnicy 45 cm ze ściankami o wysokości 40 cm przy poziomie oświetlenia 20 luksów. Kamerę wideo należy umieścić bezpośrednio nad środkiem areny w taki sposób, aby cały obszar testowy znajdował się w polu widzenia.
    2. Umieść mysz w centrum areny i niezwłocznie po umieszczeniu uruchom śledzenie wideo. Pozostaw mysz do swobodnej eksploracji przez 5 min. Przeanalizuj całą 5-minutową sesję i oblicz całkowity przebyty dystans oraz średnią prędkość poruszania się za pomocą systemu śledzenia wideo.
  2. Analiza chodu
    1. Przeprowadź analizę chodu w 3. dobie po operacji, wykorzystując zautomatyzowany system analizy chodu.
    2. Umieść każdą mysz na jednym końcu ścieżki i pozwól jej swobodnie przejść przez całą jej długość. Rejestruj odciski łap podczas lokomocji za pomocą kamery wysokiej rozdzielczości zintegrowanej z systemem analizy chodu.
    3. Należy zarejestrować próby chodu dla każdej myszy i zebrać trzy poprawne przejścia z ciągłym ruchem do przodu wzdłuż ścieżki w celu przeprowadzenia dalszej analizy.
    4. Przeanalizuj zarejestrowane dane dotyczące odcisków łap za pomocą oprogramowania do analizy chodu. Przejrzyj automatycznie zidentyfikowane odciski łap i w razie potrzeby ręcznie skoryguj klasyfikację prawej przedniej łapy, lewej przedniej łapy, prawej tylnej łapy i lewej tylnej łapy przed wyodrębnieniem parametrów chodu.
    5. Należy określić długość kroku, czas stania, prędkość przenoszenia kończyny oraz powierzchnię odcisku, a następnie obliczyć wartość średnią z trzech prawidłowych prób dla każdej myszy w celu przeprowadzenia analizy statystycznej.
  3. Labirynt Barnesa (uczenie się przestrzenne i pamięć; 4–6. doba pooperacyjna)
    ​UWAGA: Testowanie w labiryncie Barnesa należy przeprowadzać raz dziennie przez trzy kolejne dni, zaczynając od 4. dnia po operacji. Badania powinny być prowadzone w tym samym przedziale czasowym każdego dnia, aby zminimalizować zmienność okołodobową.
    1. Umieść pudełko ucieczkowe pod wyznaczonym otworem docelowym. Przez cały czas trwania eksperymentu zachowaj tę samą lokalizację celu.
    2. Na początku każdej próby umieść mysz w centrum labiryntu. Pozostaw mysz w celu odnalezienia skrzynki ucieczkowej przez maksymalnie 3 min. Zakończ próbę w momencie wejścia myszy do skrzynki ucieczkowej.
    3. Jeśli mysz nie zdoła zlokalizować skrzynki ucieczkowej w ciągu 3 min, należy ją delikatnie poprowadzić do otworu docelowego. Pozostawienie myszy w skrzynce ucieczkowej na krótką chwilę służy wzmocnieniu procesu uczenia się zadania.
    4. Należy zarejestrować latencję ucieczki oraz przebyty dystans za pomocą systemu śledzenia wideo. W przypadku prób, w których mysz nie wejdzie do skrzynki ucieczkowej w ciągu 3 min, należy przypisać latencję ucieczki wynoszącą 180 s. Do analizy statystycznej należy włączyć wyłącznie latencję ucieczki oraz przebyty dystans zarejestrowane podczas ostatniej sesji w dniu 3.
  4. Rozpoznawanie nowego obiektu (pamięć rozpoznawcza; 3–4 dni po operacji)
    ​UWAGA: Należy użyć tej samej areny i systemu śledzenia wideo, które opisano w przypadku testu otwartego pola. Sesję w otwartym polu w 3. dobie po operacji należy wykorzystać do habituacji myszy z areną testową przed rozpoczęciem treningu rozpoznawania nowych obiektów.
    1. Podczas sesji treningowej należy umieścić dwa identyczne obiekty cylindryczne w symetrycznych pozycjach w arenie. Następnie należy pozwolić myszy na swobodną eksplorację przez 5 min.
    2. Po 1-godzinnym odstępie czasu (interwale retencji) należy zastąpić jeden znany przedmiot cylindryczny nowym przedmiotem w kształcie sześcianu. Pozycję nowego przedmiotu należy zrównoważyć (skontrastować) pomiędzy myszami, aby zminimalizować potencjalną preferencję strony. Następnie należy pozwolić myszy na eksplorację przez 5 min.
    3. Zarejestruj czas eksploracji obiektów znanych i nowych za pomocą systemu śledzenia wideo. Do analizy włącz tylko te myszy, u których całkowity czas eksploracji obiektów wynosił co najmniej 3 s.
    4. Oblicz indeks preferencji (PI) według wzoru:
      figure-protocol-1
      Zdefiniuj Tnowatorski oraz Tznany jako czas spędzony odpowiednio na eksploracji nowego i znanego obiektu podczas sesji testowej.
  5. Nowe ramię labiryntu Y (przestrzenna pamięć rozpoznawcza; 5. doba pooperacyjna)
    1. Przeprowadź test w labiryncie w kształcie litery Y, składającym się z trzech identycznych ramion oddzielonych przez 120°Losowo zablokuj jedno ramię nieprzezrozystymi drzwiczkami i wyznacz to ramię jako ramię nowym.
    2. Losowo wybierz jedno z dwóch otwartych ramion jako ramię startowe. Pozostałe otwarte ramię wyznacz jako ramię znane. Umieść mysz na końcu ramienia startowego i pozwól jej swobodnie eksplorować dwa dostępne ramiona przez 5 min.
    3. Po 1-godzinnym odstępie między próbami należy zdjąć nieprzezroczyste drzwiczki i umieścić mysz ponownie na końcu tego samego ramienia startowego.
    4. Pozostaw mysz do swobodnej eksploracji wszystkich trzech ramion przez 5 min.
    5. Wejście do ramienia definiuje się jako przemieszczenie się śledzonego środka ciała z strefy centralnej do zdefiniowanej wcześniej strefy ramienia. Przy użyciu systemu śledzenia wideo należy zarejestrować liczbę wejść oraz czas spędzony w każdym ramieniu.
    6. Oblicz czasowy nowatorski indeks preferencji ramienia według wzoru:
      figure-protocol-2
      Zdefiniuj Tnowatorski, TProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia., oraz Tznajomy odpowiednio jako czas spędzony w nowym, startowym i znanym ramieniu labiryntu.
    7. Oblicz wskaźnik preferencji oparty na wpisach według wzoru:
      figure-protocol-3
      Zdefiniuj Enowy jako liczba osób włączonych do nowej grupy badawczej oraz Ełącznie jako całkowitą liczbę wejść do wszystkich trzech ramion podczas próby testowej.

5. Obróbka tkanek, barwienie Nissla i barwienie immunofluorescencyjne

  1. Opracowanie tkanki
    1. W wyznaczonym punkcie końcowym eksperymentu poddaj mysz głębokiej narkozie, stosując 3% sewofluranu przy przepływie tlenu 2 L/min.
    2. Potwierdź odpowiednią głębokość narkozy poprzez brak odruchu wycofania łapy. Utrzymując głęboką narkozę i przed zatrzymaniem akcji serca, wykonaj perfuzję transkardialną 20 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w celu usunięcia krwi z naczyń.
    3. Niezwłocznie przeprowadź perfuzję myszy 20 mL 4% paraformaldehydu (PFA).
    4. Ostrożnie wypreparuj cały mózg. Zanurz mózg w 4% PFA na 24 h w temperaturze 4 °C w celu postfiksacji.
    5. Przenieś mózg do 30% sacharozy, aż tkanka całkowicie opadnie na dno.
    6. Zatop mózg w związku OCT (optimal cutting temperature).
    7. Szybko zamroź zatopioną tkankę i przechowuj ją w temperaturze −80 °C do czasu wykonania kriosiekcji.
  2. Barwienie metodą Nissla
    1. Doprowadź kriosiekcje o grubości 16 µm do temperatury pokojowej. Susz preparaty na powietrzu przez 20 min.
    2. Płucz preparaty w PBS przez 2 min.
      UWAGA: Przed barwieniem upewnij się, że sekcje tkanki są mocno przytwierdzone do szkiełek.
    3. Przykryj sekcje całkowicie roztworem barwiącym błękitem toluidynowym. Inkubuj przez 30 min w temperaturze 5 °C.
      UWAGA: Czas barwienia dla sekcji 16 µm należy zoptymalizować empirycznie, aby zapobiec nadmiernemu zabarwieniu.
    4. Krótko płucz preparaty w wodzie destylowanej przez 10–30 s.
    5. Odróżniaj sekcje sekwencyjnie w etanolu 95%, 85% i 75% przez 2 min w każdym roztworze.
      UWAGA: W razie potrzeby dostosuj czas różnicowania, aby zoptymalizować intensywność barwienia.
    6. Przejaśniaj preparaty dwukrotnie w świeżym ksylenie przez 5 min w każdym cyklu.
      UWAGA: Wszystkie etapy z użyciem ksylenu należy przeprowadzać w dygestorium.
    7. Zamontuj sekcje za pomocą balsamu neutralnego. Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na każdą sekcję.
    8. Wykonaj obrazowanie zabarwionych sekcji przy użyciu mikroskopu świetlnego z obiektywem 20×. Zidentyfikuj obszar CA1 na podstawie charakterystycznej, zwartej warstwy komórek piramidalnych w koronalnym przekroju hipokampa. Dla każdej myszy przeanalizuj jeden przekrój koronalny i pobierz dwa niezakładające się pola z obszaru CA1 z każdej półkuli hipokampa.
    9. Ręcznie policz morfologicznie nienaruszone neurony Nissl-dodatnie oraz ciałka Nissla, korzystając z wtyczki do liczenia komórek w oprogramowaniu do analizy obrazu. Nienaruszone neurony identyfikuj po nienaruszonej somie, okrągłym jądrze z widocznym jąderkiem oraz obfitej substancji Nissla w cytoplazmie; ciałka Nissla identyfikuj jako intensywnie bazofilne struktury ziarniste lub skupione w obrębie cytoplazmy neuronalnej.
    10. Wyciągnij średnią z wartości uzyskanych ze wszystkich analizowanych pól, aby otrzymać jedną wartość na zwierzę. Upewnij się, że osoba wykonująca liczenie pozostaje zaślepiona w kwestii przydziału do grup.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne Iba1
    1. Pozostaw sekcje mózgu do wyrównania temperatury z temperaturą pokojową przed barwieniem.
    2. Zanurz preparaty w roztworze do odsłaniania antygenów z cytrynianem sodu i przeprowadź odsłanianie antygenów w kąpieli wodnej o temperaturze 80 °C przez 25 min. Po odsłonięciu antygenów pozwól preparatom i roztworowi powoli ostygnąć do temperatury pokojowej.
    3. Przemyj sekcje trzy razy solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS) po 3 min każdorazowo.
    4. Przeprowadź permeabilizację sekcji, stosując 0,2% Triton X-10 w PBS przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj je trzy razy w PBS po 3 min każdorazowo.
    5. Zablokuj wiązania niespecyficzne, inkubując sekcje z 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnej.
    6. Przemyj sekcje trzy razy w PBS po 3 min każdorazowo.
    7. Rozcieńcz przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko cząsteczce adaptorowej wiążącej jony wapnia 1 (Iba1; 1:10) w roztworze blokującym (3% BSA w PBS) i inkubuj sekcje z rozcieńczonym przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnej.
    8. Przemyj sekcje trzy razy w PBS po 3 min każdorazowo.
    9. Inkubuj sekcje z przeciwciałem kozim anty-króliczym IgG (H+L) sprzężonym z fluorophore 48 (1:10) przez 90 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    10. Przemyj sekcje trzy razy w PBS po 3 min każdorazowo w ciemności.
    11. Przebarw jądra barwnikiem DAPI (1:80) przez 5 min w ciemności.
    12. Przemyj sekcje trzy razy w PBS po 3 min każdorazowo w ciemności.
    13. Zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego zapobiegającego blaknięciu (antifade), nałóż szkiełka nakrywkowe i chroń sekcje przed światłem do momentu obrazowania.
    14. Wykonaj obrazy fluorescencyjne obszaru CA1 hipokampa przy użyciu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 20×. Stosuj identyczne ustawienia akwizycji obrazu dla wszystkich sekcji uwzględnionych w porównaniach ilościowych. Dla każdej myszy przeanalizuj jeden przekrój koronalny i pobierz dwa niezakładające się pola z obszaru CA1 z każdej półkuli hipokampa.
    15. Ilościowo określ średnią intensywność fluorescencji Iba1 w obszarze CA1 hipokampa, stosując identyczne ustawienia progu dla wszystkich obrazów. Wyciągnij średnią z wartości ze wszystkich pól, aby uzyskać jedną wartość na zwierzę.

6. Analiza statystyczna

  1. Wszystkie analizy statystyczne należy przeprowadzić przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej. Dane należy przedstawić jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).
  2. Normalność rozkładu danych należy ocenić za pomocą testu Shapiro–Wilka. Równość wariancji należy ocenić za pomocą testu F.
  3. Grupy kontrolną oraz grupę po laminektomii L5 należy porównać za pomocą nieparzystego dwustronnego testu t Studenta w przypadku spełnienia założenia o równości wariancji. W przypadku niespełnienia tego założenia należy zastosować test t Welcha.
  4. Jako n definiuje się liczbę zwierząt uwzględnionych w każdej analizie. Wartość P < 0,05 należy uznać za statystycznie istotną.

Wyniki

Wszystkie myszy przeżyły do zaplanowanego punktu końcowego eksperymentu, żadna z nich nie spełniła zdefiniowanych kryteriów humanitarnego punktu końcowego i wszystkie zostały uwzględnione w analizach końcowych. Funkcje motoryczne oceniono w 3. dobie pooperacyjnej, wykorzystując test otwartego pola oraz analizę chodu. Ani całkowity dystans, ani średnia prędkość w teście otwartego pola nie różniły się między grupami, co wskazuje na porównywalną spontaniczną aktywność lokomocyjną (Rycina 2A). Analiza chodu również nie wykazała istotnych różnic międzygrupowych w długości kroku, czasie stania, prędkości wymachu lub powierzchni odcisku łapy (Rycina 2B). Wspólnie wyniki te wskazują, że procedura laminektomii L5 nie spowodowała wyraźnych zaburzeń motorycznych wystarczających do wyjaśnienia późniejszych różnic w wynikach poznawczo-behawioralnych.

Wydajność poznawczą oceniono za pomocą testu rozpoznawania nowych obiektów (NOR), labiryntu Y z nowym ramieniem oraz labiryntu Barnesa. W teście NOR grupa po laminektomii L5 wykazała istotnie niższy wskaźnik preferencji (PI) dla nowego obiektu niż grupa kontrolna (Ryc. 3A). W labiryncie Y z nowym ramieniem grupa po laminektomii L5 wykazała istotnie niższe wartości PI zarówno dla czasu spędzonego w nowym ramieniu, jak i liczby wejść do niego (Ryc. 3B). W labiryncie Barnesa grupa po laminektomii L5 wykazała dłuższą latencję ucieczki i większą przebytą odległość w 3. dniu testowania w labiryncie Barnesa (Ryc. 3C). Wspólnie te wyniki behawioralne wskazują na upośledzenie funkcji poznawczych po operacji laminektomii L5.

W obszarze CA1 hipokampa w grupie po laminektomii L5 stwierdzono znacznie mniejszą liczbę neuronów Nissl-dodatnich oraz znacznie mniejszą liczbę ciałek Nissla niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na uszkodzenia strukturalne neuronów (Rycina 4A, B). Ponadto w grupie po laminektomii L5 odnotowano istotny wzrost średniej intensywności fluorescencji Iba1, co jest spójne ze zwiększoną aktywacją mikrogleju (Rycina 4C, D).

figure-results-1
Rysunek 1Procedura laminektomii lędźwiowej na poziomie L5 w celu modelowania pooperacyjnych zaburzeń poznawczych (POCD) u myszy. (A) Ilustracja celu chirurgicznego na poziomie łuku L5 oraz zakresu odsłonięcia obejmującego sąsiednie poziomy kręgów (L4–L6). (B) Obrazy śródoperacyjne ilustrujące kluczowe etapy procedury laminektomii lędźwiowej L5. (a) Region lędźwiowy po goleniu z wyznaczoną linią środkową kręgosłupa; strzałki wskazują kierunek planowanego nacięcia skóry. (b) Środkowe nacięcie skóry nad kręgosłupem lędźwiowym. (c) Nacięcie powięzi z etapowym odsuwaniem mięśni przykręgosłupowych w celu odsłonięcia wyrostków kolczystych oraz dalszego oczyszczenia tkanek wokół wyrostka kolczystego i łuku L5, aby w pełni odsłonić łuk L5. (d) Laminektomia L5 po usunięciu łuku L5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2Ocena aktywności lokomotorycznej i chodu po laminektomii lędźwiowej na poziomie L5. (A) Test otwartego pola wykazujący całkowity dystans oraz średnią prędkość (n = 10). (B) Analiza chodu przedstawiająca długość kroku, czas stania, prędkość przenoszenia kończyny i powierzchnię odcisku (n = 6). Dane reprezentują średnią ± SD. Istotność statystyczna jest oznaczona jako ns (brak istotności). Skróty: Control = grupa kontrolna; Laminectomy = grupa po laminektomii L5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3Oceny poznawczo-behawioralne po laminektomii lędźwiowej na poziomie L5. (A) Test rozpoznawania nowego obiektu (n = 10). (B) Test labiryntu w kształcie litery Y z nowym ramieniem (n = 10). (C) test labiryntu Barnesa (n = 10). Dane przedstawiają średnią ± SD. Istotność statystyczną oznaczono jako *P < 0.05, **P < 0,01 oraz ***P < 0.01. Skróty: Control = grupa kontrolna; Laminectomy = grupa laminektomii L5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4Ocena histologiczna obszaru CA1 hipokampa po laminektomii lędźwiowej na poziomie L5. (A) Reprezentatywne obrazy barwienia Nissla w obszarze CA1 hipokampa. (B) Ilościowe oznaczenie neuronów Nissl-dodatnich (lewo) oraz ciałek Nissla (prawo) (n = 5). (C) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencji Iba1 w obszarze CA1 hipokampa. Pasek skali = 100 µm. (D) Ilościowe oznaczenie średniej intensywności fluorescencji Iba1 (n = 6). Dane przedstawiają średnią ± SD. Istotność statystyczną oznaczono jako **P < 0,01 oraz ***P < 0.01. Skróty: Control = grupa kontrolna; Laminectomy = grupa laminektomii L5. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

U starszych osób poddawanych operacjom kręgosłupa zgłaszano występowanie pooperacyjnej dysfunkcji poznawczej10. Dowody eksperymentalne wskazują ponadto, że starzenie się zwiększa podatność na związane z operacją upośledzenie funkcji poznawczych oraz odpowiedzi neurozapalne1,12. Niniejszy protokół łączy około 4 h znieczulenia sewofluranem z laminektomią na poziomie L5 u starych myszy w celu modelowania wczesnego pooperacyjnego upośledzenia funkcji poznawczych. Jego główna wartość metodologiczna polega na zapewnieniu praktycznej i dostępnej procedury do badania zmian behawioralnych i histologicznych w hipokampie po operacji kręgosłupa.

Przedkliniczne modele POCD obejmują paradygmaty ekspozycji wyłącznie na znieczulenie, operacje jamy brzusznej oraz urazy ortopedyczne13. Paradygmaty z samym znieczuleniem pozwalają na ocenę efektów anestezji w nieobecności urazu chirurgicznego14, lecz nie odtwarzają połączonej ekspozycji na znieczulenie i uszkodzenie tkanek. Modele operacji jamy brzusznej i złamania kości piszczelowej obejmują uraz chirurgiczny i były wykorzystywane do badania upośledzenia funkcji poznawczych powiązanych z operacją15,16. Jednak miejsca operacyjne i wzorce uszkodzeń tkanek różnią się w nich od tych występujących podczas zabiegów kręgosłupa. Ponieważ rodzaj i intensywność urazu chirurgicznego mogą wpływać na pooperacyjne wyniki poznawcze oraz centralne odpowiedzi zapalne9, przy wyborze modelu przedklinicznego należy wziąć pod uwagę kontekst chirurgiczny. Przedstawiony protokół laminektomii L5 dostarcza zatem eksperymentalnego paradygmatu powiązanego z operacją kręgosłupa do badania wczesnego pooperacyjnego upośledzenia funkcji poznawczych u starych myszy.

Kluczowym wyzwaniem technicznym w niniejszym protokole jest usunięcie odpowiedniej ilości kostnej z blaszki łuku kręgu L5 w celu wyraźnego odsłonięcia opony twardej, przy jednoczesnym unikaniu jej uszkodzenia. Podczas laminektomii wykonywanej pod bezpośrednią wizualizacją wymagana jest staranna kontrola głębokości wprowadzania narzędzi, siły cięcia oraz kąta wprowadzania nożyczek okulistycznych. Kość należy usuwać stopniowo, wykonując niewielkie, kontrolowane nacięcia wzdłuż krawędzi blaszki łuku. Chwycenie wyrostka kolczystego L5 pęsetą i uniesienie operowanego odcinka lędźwiowego pod kątem około 30° względem platformy chirurgicznej poszerza przestrzeń międzyblaszkową L5–L6. Manewr ten umożliwia płytkie wprowadzenie końcówek nożyczek pod krawędź kostną i zmniejsza ryzyko kontaktu z oponą twardą. Niepełne usunięcie kości może ograniczyć ekspozycję chirurgiczną, natomiast zbyt agresywne cięcie lub nadmierna głębokość wprowadzania narzędzia mogą spowodować uszkodzenie opony twardej. Niekontrolowany krwawienie może przesłonić pole operacyjne, upośledzić rekonwalescencję pooperacyjną i zwiększyć zmienność w wynikach behawioralnych. Gdy przestrzeń międzyblaszkowa jest niewystarczająca do bezpiecznego wprowadzenia końcówek nożyczek, należy skorygować pozycję i kąt uniesienia operowanego odcinka lędźwiowego, zamiast zwiększać głębokość wprowadzania narzędzia. Jeśli krwawienie przesłania pole operacyjne, usuwanie kości należy przerwać do czasu przywrócenia odpowiedniej wizualizacji, po czym pozostałą kość należy usuwać stopniowo.

Oddzielenie mięśni przykręgosłupowych oraz laminektomia na poziomie L5 mogą przyczyniać się do przejściowego bólu pooperacyjnego, a nadwrażliwość mechaniczna została udokumentowana po eksperymentalnej laminektomii u myszy17. Meloksykam podawano zgodnie z wcześniej określonym schematem przeciwbóliczym. Donoszono, że mimika twarzy związana z bólem pooperacyjnym u myszy utrzymuje się przez około 36–48 h18. 48-godzinny schemat przeciwbóliczy miał na celu osłonę tego wczesnego okresu pooperacyjnego, a poznawcze testy behawioralne rozpoczęto w 3. dobie po operacji, po zakończeniu leczenia przeciwbóliczego, aby zmniejszyć potencjalny wpływ bezpośredniego bólu pooperacyjnego. Test otwartego pola był stosowany w eksperymentalnych badaniach nad POCD w celu oceny spontanicznej aktywności lokomocyjnej oraz ustalenia, czy ograniczona lokomocja może zakłócać wyniki testów poznawczo-behawioralnych19,20. W związku z tym w 3. dobie po operacji, przed oceną poznawczą, przeprowadzono test otwartego pola oraz analizę chodu. Nie zaobserwowano istotnych różnic międzygrupowych w aktywności lokomocyjnej w teście otwartego pola ani w parametrach chodu, co sugeruje, że późniejsze różnice poznawczo-behawioralne prawdopodobnie nie wynikały głównie z jawnych zaburzeń ruchowych. Jednakże, ponieważ nie oceniano bezpośrednio spontanicznego bólu pooperacyjnego i dyskomfortu w ranie, nie można całkowicie wykluczyć ich resztkowego wpływu na wyniki behawioralne. Przyszłe badania mogłyby obejmować bezpośrednią ocenę spontanicznego bólu pooperacyjnego.

Podsumowując, niniejszy protokół zapewnia praktyczne podejście eksperymentalne do badania wczesnych zaburzeń poznawczych po operacji u starych myszy po laminektomii na poziomie L5. Może on zostać wykorzystany do badania wyników behawioralnych i mechanizmów leżących u podstaw upośledzenia poznawczego związanego z operacją kręgosłupa, a także do oceny interwencji mających na celu zapobieganie lub redukcję pooperacyjnych zaburzeń poznawczych. Walidacja w większych kohortach oraz w niezależnych laboratoriach pozwoliłaby na dalsze potwierdzenie stabilności i odtwarzalności tego modelu.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie stwierdzono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Sanhua Fang z platformy zaplecza rdzeniowego Zhejiang University School of Medicine oraz Yanhong Chen i Xuliang Zhang z centrum zwierząt Zhejiang University za wsparcie techniczne. Badanie to było finansowane z następujących funduszy: National Natural Science Foundation of China (nr 82575196, 82074535 oraz U23A20508).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy samce C57BL/6JSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-05Model zwierzęcy
ANY-maze Video Tracking SoftwareStoelting Co., USA600Wideotorakowanie i analiza behawioralna
Erythromycin ophthalmic ointmentBeijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H1021270Zapobieganie wysychaniu oczu
Pęseta precyzyjnaNANAUchwycenie skóry
Mata grzewczaNANAKontrola temperatury
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology17198Barwienie immunofluorescencyjne Iba1
Sprzęt do anestezji inhalacyjnejRWD Life Science Co., Ltd.R581SZnieczulenie
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY202512704Analiza chodu
Mikronożyce okulistyczneNANAUsuwanie kości
Nissl staining solutionHaoke Biotechnology Co., Ltd.HK203Barwienie Nissla
NożyczkiShang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY030Nacięcie skóry
SevofluraneShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.2506231Znieczulenie
Single Use Surgical DrapeJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.2021214021Podłoże do operacji chirurgicznych
Trymer do małych zwierzątYiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-03310Usuwanie sierści
Surgical Suture Needles with ThreadShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603Szycie skóry
Veet hair removal creamRECKITT BENCKISER (India) LtdNAUsuwanie sierści

Bibliografia

  1. Zhao Q, Wan H, Pan H, Xu Y. Postoperative cognitive dysfunction-current research progress. Front Behav Neurosci. 2024;18:1328790.
  2. Kong H, Xu LM, Wang DX. Perioperative neurocognitive disorders: A narrative review focusing on diagnosis, prevention, and treatment. CNS Neurosci Ther. 2022;28(8):1147-1167.
  3. Monk TG, et al. Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery. Anesthesiology. 2008;108(1):18-30.
  4. Li X, et al. Risk factors for postoperative cognitive decline after orthopedic surgery in elderly Chinese patients: A retrospective cohort study. Clin Interv Aging. 2024;19:491-502.
  5. Krenk L, et al. Cognitive dysfunction after fast-track hip and knee replacement. Anesth Analg. 2014;118(5):1034-1040.
  6. Yang X, et al. Identification of individuals at risk for postoperative cognitive dysfunction (POCD). Ther Adv Neurol Disord. 2022;15:17562864221114356.
  7. Suraarunsumrit P, et al. Outcomes associated with postoperative cognitive dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Age Ageing. 2024;53(7):afae160.
  8. Lin X, et al. The potential mechanism of postoperative cognitive dysfunction in older people. Exp Gerontol. 2020;130:110791.
  9. Lu B, et al. Effects of different types of non-cardiac surgical trauma on hippocampus-dependent memory and neuroinflammation. Front Behav Neurosci. 2022;16:950093.
  10. Park S, et al. Preoperative mild cognitive impairment as a risk factor of postoperative cognitive dysfunction in elderly patients undergoing spine surgery. Front Aging Neurosci. 2024;16:1292942.
  11. Xu Z, et al. Age-dependent postoperative cognitive impairment and Alzheimer-related neuropathology in mice. Sci Rep. 2014;4:3766.
  12. Zhang ZJ, et al. Aging alters Hv1-mediated microglial polarization and enhances neuroinflammation after peripheral surgery. CNS Neurosci Ther. 2020;26(3):374-384.
  13. Eckenhoff RG, et al. Perioperative neurocognitive disorder: State of the preclinical science. Anesthesiology. 2020;132(1):55-68.
  14. Guo LY, et al. Cognitive deficits after general anaesthesia in animal models: A scoping review. Br J Anaesth. 2023;130(2):e351-e360.
  15. Qiu LL, et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species in the hippocampus might contribute to microglial activation in postoperative cognitive dysfunction in aged mice. Brain Behav Immun. 2016;51:109-118.
  16. Cibelli M, et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 2010;68(3):360-368.
  17. Yamamoto S, et al. Intraoperative spinal cord stimulation mitigates central sensitization after spine surgery in mice. Spine (Phila Pa 1976). 2023;48(11):E169-E176.
  18. Matsumiya LC, et al. Using the mouse grimace scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012;51(1):42-49.
  19. Sun L, et al. Activation of cannabinoid receptor type 2 attenuates surgery-induced cognitive impairment in mice through anti-inflammatory activity. J Neuroinflammation. 2017;14(1):138.
  20. Zhan G, et al. Anesthesia and surgery induce cognitive dysfunction in elderly male mice: The role of gut microbiota. Aging (Albany NY). 2019;11(6):1778-1790.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model chirurgii kręgosłupaznieczulenie sewofluranemtest funkcji poznawczychuszkodzenie neuronów hipokampazmiany neurozapalnebarwienie metodą Nisslaimmunofluorescencja Iba1

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.