Niniejszy protokół opisuje sposób ustanowienia mysiego modelu astmy alergicznej (AA) indukowanej owalbuminią (OVA) w celu oceny mechanizmów terapeutycznych terapii plastrami na punkty akupunkturowe Kechuanting (KAST) w odniesieniu do stanu zapalnego dróg oddechowych typu 2, poprzez modulowanie płucnych wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 (ILC2s) za pośrednictwem szlaku peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP)/białka modyfikującego aktywność receptora 1 (RAMP1).
Artykuł badawczy
Terapia naklejkami na punkt akupunktu Kechuanting łagodzi zapalenie dróg oddechowych typu 2 u myszy z astmą alergiczną poprzez modulowanie liczby komórek ILC2
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykazano, że terapia plastrowania punktów akupunktu Kechuanting (KAST) skutecznie łagodzi zapalenie dróg oddechowych u pacjentów z astmą alergiczną (AA); jednak mechanizmy leżące u podstaw tego działania pozostają niejasne. Celem niniejszego badania było zbadanie mechanizmów terapeutycznych KAST w modelu mysim AA z perspektywy neuroimmunologicznej. Utworzono model astmy alergicznej u myszy indukowanej owalbumina (OVA), a następnie zastosowano u nich terapię KAST. Wpływ KAST na płucne wrodzone limfocyty tkankowe grupy 2 (ILC2s) oraz zapalenie dróg oddechowych typu 2 oceniono za pomocą cytometrii przepływowej, barwienia hematoksyliną i eozyną (HE) oraz immunohistochemii. Do oceny poziomu białka peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) w tkankach płuc wykorzystano metodę Western blotting (WB) oraz test ELISA. U myszy z astmą alergiczną przeprowadzono donosową administrację CGRP lub inhibitora receptora CGRP BIBN-4096, aby zbadać rolę regulacyjną ścieżki CGRP/białka modyfikującego aktywność receptora 1 (RAMP1) w odniesieniu do ILC2s i zapalenia dróg oddechowych typu 2. KAST zmniejszyła liczbę ILC2s i złagodziła zapalenie dróg oddechowych typu 2, czemu towarzyszył spadek ekspresji CGRP w tkankach płuc. Donosowe podanie CGRP zwiększyło liczbę RAMP1+ILC2s oraz całkowitą liczbę ILC2s w płucach i nasiliło zapalenie dróg oddechowych typu 2. Odwrotnie, donosowe podanie BIBN-4096 zmniejszyło liczbę płucnych ILC2s i złagodziło zapalenie dróg oddechowych typu 2. KAST redukuje zapalenie dróg oddechowych w astmie alergicznej, co jest ściśle związane z downregulation ścieżki CGRP/RAMP1 i następującą po niej supresją płucnych ILC2s, co potwierdzono za pomocą inhibicji farmakologicznej.
Wprowadzenie
Astma alergiczna (AA) jest najczęstszym fenotypem astmy, stanowiąc 60–80% wszystkich przypadków astmy w Chinach1. Charakteryzuje się wysoką rozpowszechnieniem i suboptymalną kontrolą choroby, co poważnie upośledza jakość życia pacjentów i nakłada znaczne obciążenia ekonomiczne2,3,4,5. Chociaż glikokortykosteroidy wziewne (ICS) pozostają głównym filarem leczenia klinicznego6, niektórzy pacjenci wykazują ograniczoną odpowiedź na leczenie, a długotrwałe stosowanie często wiąże się z efektami niepożądanymi i niezdolnością do zatrzymania progresji choroby7. W związku z tym opracowanie bezpiecznych i skutecznych, nowych strategii terapeutycznych pozostaje priorytetem zarówno w praktyce klinicznej, jak i badawczej. Terapia plastrami na punkty akupunkturowe Kechuanting (KAST), będąca zewnętrzną metodą stosowania tradycyjnej medycyny chińskiej, dostarcza związki aktywne przezskórnie, co potencjalnie pozwala uniknąć efektu pierwszego przejścia przez wątrobę i minimalizuje systemowe reakcje niepożądane8,9. Badania kliniczne wykazały, że KAST może łagodzić objawy astmy, przywracać częściowo funkcję płuc i poprawiać jakość życia pacjentów10,11,12. Jednocześnie metabolomika surowicy, farmakologia sieciowa oraz badania na zwierzętach z wykorzystaniem modeli astmy sugerują, że KAST łagodzi zapalenie dróg oddechowych poprzez obniżenie poziomu mediatorów zapalnych w surowicy i płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), w tym poprzez obniżenie ekspresji IgE, IL-4 i IL-139,13,14. Łącznie wyniki te dostarczają dowodów wspierających skuteczność terapeutyczną KAST w astmie. Jednak precyzyjne mechanizmy jego działania pozostają niejasne.
Jednym z głównych mechanizmów patologicznych napędzających nawroty AA jest zapalenie dróg oddechowych typu 2, w którym kluczową rolę odgrywają wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2s)15. Pod wpływem stymulacji alergenami ILC2s wydzielają cytokiny, takie jak IL-5 i IL-13, napędzając tym samym stan zapalny dróg oddechowych16,17. Badania wykazały, że usunięcie ILC2s znacznie łagodzi zapalenie dróg oddechowych u myszy z astmą, co podkreśla ich centralną rolę w progresji choroby18. Co istotne, aktywacja i funkcja ILC2s są ściśle regulowane przez wiele mechanizmów, a interakcje neuroimmunologiczne przyciągają w ostatnich latach coraz większą uwagę. Pojawiające się dowody wskazują, że peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) może wiązać się z białkiem modyfikującym aktywność receptora 1 (RAMP1) na powierzchni ILC2s, indukując ich aktywację i następujący po niej wyrzut cytokin typu 2, co zaostrza zapalenie dróg oddechowych w AA19,20,21. W niniejszym badaniu nasze przesiewowe sekwencjonowanie RNA (RNA-seq) o wysokiej przepustowości zidentyfikowało CGRP jako krytyczny, responsywny neuropeptyd silnie modulowany przez interwencję KAST. Dlatego, koncentrując się na ścieżce CGRP/RAMP1, zastosowaliśmy KAST jako interwencję u myszy z AA, aby zbadać potencjalne mechanizmy modulowania aktywności ILC2 oraz łagodzenia zapalenia dróg oddechowych typu 2.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals opublikowanymi przez National Academies of Sciences. Protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Zwierząt w szpitalu afiliowanym Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie (nr zatwierdzenia 2023DW-059-01). Pełna lista wszystkich materiałów, odczynników, narzędzi i oprogramowania wykorzystanego w tej badaniu znajduje się w Tabeli Materiałów.
Zwierzęta doświadczalne i grupowanie
Zdrowe samice myszy BALB/c (klasa SPF, w wieku 8–10 tygodni) pozyskano z Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie (licencja nr SYXK (Su) 2018-0049). Zwierzęta utrzymywano w standardowych warunkach, z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności, w temperaturze 24–26 °C. Sterylna karma i woda były dostępne ad libitum, ściółkę wymieniano regularnie, a klatki czyszczono rutynowo. Po 7 dniach adaptacji myszy losowo podzielono na sześć grup (n = 7/grupa): grupę normalną, grupę modelową, grupę CGRP, grupę BIBN-4096, grupę KAST oraz grupę KAST + CGRP. Zwierzęta przydzielano do grup za pomocą komputerowo wygenerowanej tabeli liczb losowych. Przydział do grup pozostawał utajniony przed badaczami do momentu wprowadzenia interwencji. Aby zoptymalizować wykorzystanie tkanek, próbki płuc z randomizowanej kohorty (n = 7 na grupę) systematycznie przydzielano do różnych ścieżek przetwarzania, przy czym dokładna liczba analizowanych próbek (n = 5, 4 lub 3) dla poszczególnych analiz histologicznych i molekularnych została wyraźnie wskazana w odpowiednich legendach rysunków. Żadne dane nie zostały wykluczone z analizy.
Przygotowanie formulacji KAST
Preparat został przygotowany przez Wydział Farmacji Szpitala Powiązanego z Uniwersytetem Medycyny Chińskiej w Nankinie22. Wykorzystano dziewięć tradycyjnych chińskich ziół leczniczych: Semen Brassicae (2 części), Rhizoma Corydalis (2 części), Radix Kansui przetworzony octem (1 część), Asarum (1 część), Ephedra (1 część), Semen Lepidii (1 część), goździki (1 część), korę cynamonową (1 część) oraz Gleditsia sinensis (1 część). Każde zioło zmielono na drobny proszek i przesiano przez sito o oczkach 80 mesh. Na każde 100 g mieszaniny proszków dodano 70 mL świeżego soku z imbiru i 30 mL parafiny ciekłej, dokładnie wymieszano i sformowano w plastry o masie 0,3 g ± 5% i średnicy 0,5 cm. W szczególności wszystkie składniki roślinne oraz świeży imbir zostały uwierzytelnione przez głównego farmaceutę Lin-gang Zhao i przechowywane w temperaturze 4 °C w ciemnym i suchym środowisku przed użyciem9. Aby zagwarantować powtarzalność interwencji i stabilność między partiami, wdrożono rygorystyczny standard kontroli jakości oparty na opracowanych przez nasz zespół metodach UPLC-Q-TOF-MS i HPLC, potwierdzając stałą obecność głównych markerów aktywnych, takich jak tiocyjanian sinapiny23. W praktyce plastry o średnicy 0,5 cm mocowano za pomocą medycznej, oddychającej i hipoalergicznej taśmy klejącej o wymiarach 2,5 cm × 5,5 cm, aby zapewnić optymalne dostarczanie transdermalne.
Ustanowienie mysiego modelu AA
Model AA indukowano zgodnie z uznanym protokołem literaturowym, stosując sensytyzację OVA i wyzwanie donosowe24. Z wyjątkiem grupy Normal, wszystkie myszy poddano sensytyzacji poprzez dożylne wstrzyknięcie 200 µL soli fizjologicznej zawierającej 100 µg OVA i 2 mg wodorotlenku glinu w dniach 0 i 12. Od 18 do 23 dnia myszy poddawano codziennemu wyzwaniu donosowemu z zastosowaniem 50 µg OVA w 50 µL soli fizjologicznej. Od 24 do 53 dnia OVA podawano donosowo co drugi dzień. W 54 dniu, po zważeniu myszy, wykonano eutanazję poprzez zwichnięcie karku i pobrano tkanki. Następnie wyznaczono współczynnik płuc, dzieląc całkowitą masę płuc przez masę ciała.
Interwencje
Od 40. do 53. dnia myszy w grupie KAST oraz w grupie KAST + CGRP zostały ogolone na grzbietowym obszarze o wymiarach 3 cm × 6 cm. Plastry przyłożono nad obustronne punkty akupunkturowe Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) i Shenshu (BL23), mocując je taśmą klejącą przez 1,5 h raz dziennie przez 14 kolejnych dni. Myszy w grupach CGRP oraz KAST + CGRP otrzymywały donosowo 10 µL roztworu kalcytoniny/CALCA (1 pg/µL) co drugi dzień od 40. do 53. dnia. Myszy w grupie BIBN-4096 otrzymywały donosowo 10 µL roztworu BIBN-4096 (0,3 mg/mL, antagonista receptora CGRP) co drugi dzień. Grupy prawidłowej i modelowej otrzymywały standardowe pożywienie bez interwencji. KAST stosowano od 40. do 53. dnia, po wywołaniu alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych (rozpoczynając od 40. dnia, co przypada 22 dni po pierwszej ekspozycji na OVA w 18. dniu). W związku z tym KAST w niniejszym badaniu służyło jako interwencja terapeutyczna, a nie profilaktyczna.
W ramach przygotowania skóry, owłosienie w wyznaczonym obszarze grzbietowym usunięto za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Lokalizacja punktów akupunkturowych była ściśle zgodna ze standardem Nomenclature and Location of Acupoints for Laboratory Animals - Part 3: Mice (T/CAAM 0002-2020), wydanym przez Chinese Acupuncture-Moxibustion Society. Precyzyjnie zaznaczono cztery pary bilateralnych miejsc na grzbiecie, zdefiniowane następująco: Feishu (BL13: między żebrami poniżej wyrostka kolczystego 3. kręgu piersiowego, 3 mm bocznie od linii pośrodkowej posterior), Geshu (BL17: poniżej wyrostka kolczystego 7. kręgu piersiowego, 3 mm bocznie od linii pośrodkowej), Pishu (BL20: poniżej wyrostka kolczystego 12. kręgu piersiowego, 3 mm bocznie od linii pośrodkowej) oraz Shenshu (BL23: poniżej wyrostka kolczystego 2. kręgu lędźwiowego, 3 mm bocznie od linii pośrodkowej). Aby zapewnić stabilną adhezję, użyto mocno owiniętej taśmy 3M, co zapobiegało przesunięciu plastrów lub wtórnej erozji skóry podczas 1,5 h okresu retencji.
Dawki CGRP/CALCA (1 pg/µL, 10 µL na mysz) oraz BIBN-4096 (0,3 mg/mL, 10 µL na mysz) dobrano na podstawie opublikowanych badań25. W szczególności, dla interwencji z CGRP, przygotowano 0,1% roztwór BSA poprzez rozpuszczenie 1 mg BSA w 1 mL ddH2O, a następnie zastosowano mieszanie w wortexie do uzyskania końcowego stężenia 1 mg/mL. Przed rekonstytucją liofilizowany proszek białka Calcitonin/CALCA odwirowano przy 12 000 × g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Następnie dodano 20 µL przygotowanego 0,1% roztworu BSA, aby uzyskać roztwór stokowy o stężeniu 1 µg/µL. Fiolkę delikatnie odwracano kilka razy (bez mieszania w wortexie), odwirowano przez kilka sekund i pozostawiono w temperaturze pokojowej przez kilka minut, aby zapewnić pełną rekonstytucję białka. Aby przygotować roztwór roboczy 1 pg/µL bez generowania niepraktycznie dużej objętości w jednym kroku, zastosowano standardowe dwustopniowe rozcieńczenie seryjne: 1 µL roztworu stokowego 1 µg/µL rozcieńczono najpierw w 999 µL sterylnej soli fizjologicznej w celu przygotowania roztworu pośredniego 1 ng/µL, a następnie 1 µL tego roztworu pośredniego zmieszano z kolejnymi 999 µL sterylnej soli fizjologicznej, aby uzyskać końcowy roztwór roboczy 1 pg/µL. Roztwór roboczy przechowywano w temperaturze 4 °C, natomiast pozostałe aliquoty przechowywano w -20 °C przez maksymalnie 2–3 miesiące. Dla grupy BIBN-4096 1 mg proszku BIBN-4096 rozpuszczono w 333 µL ddH2O, aby uzyskać roztwór stokowy 3 mg/mL, który podzielono na aliquoty po 50 µL na fiolkę i przechowywano w -80 °C. Aby przygotować roztwór roboczy 0,3 mg/mL, każdą 50 µL aliquot roztworu stokowego dokładnie zmieszano z 450 µL sterylnej soli fizjologicznej. Od 40. do 53. dnia objętość 10 µL roztworu CGRP (1 pg/µL) lub roztworu BIBN-4096 (0,3 mg/mL) podawano donosowo każdej myszy co drugi dzień przy łagodnej imobilizacji, bez znieczulenia.
Kryteria oceny i metody detekcji
Testy behawioralne
W 53. dniu, po ostatniej stymulacji donosowej, częstość występowania epizodów pocierania nosa i kichania monitorowano i rejestrowano za pomocą cyfrowego systemu wideo przez okres 10 min. Częstotliwość zachowań na nagraniach była niezależnie zliczana przez dwóch badaczy w sposób podwójnie ślepy. W przypadku wystąpienia istotnych rozbieżności w zliczeniach, trzeci badacz ponownie oceniał nagranie, a do analizy statystycznej ostatecznie wybrano dane o najwyższej spójności.
Test prowokacyjny oskrzeli
W ciągu 24 h po ostatniej ekspozycji na antygen oceniono reaktywność dróg oddechowych, stosując nebulizację acetylocholiny (ACh) w stężeniach 0, 5, 10, 20 i 40 mg/mL (300 µL na stężenie, nebulizowane przez 1 min). Wartości wzmocnionej pauzy (Penh), będącej bezwymiarowym wskaźnikiem służącym do empirycznego określania skurczu dróg oddechowych i oceny nadreaktywności dróg oddechowych (AHR), rejestrowano przez 5 min po każdej nebulizacji przy użyciu nieinwazyjnej pletyzmografii całego ciała. Myszy aklimatyzowano w komorze przez 10 min przed rozpoczęciem pomiarów. Wartość Penh była obliczana automatycznie przez oprogramowanie zintegrowanego systemu przechowywania/przesyłania danych zgodnie z wzorem empirycznym bilansującym czas wydechu/wdechu oraz przepływy szczytowe.
Histopatologia (barwienie H&E)
Tkanki płuc utrwalone w 4% paraformaldehydzie odwodniono w gradowanych seriach alkoholi, przejaśniono w ksylenie i zatopiono w blokach parafinowych przy użyciu automatycznego procesora. Bloki pocięto na skrawki o grubości 4 µm, wypłukano w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C i naniesiono na szkiełka przedmiotowe. Szkiełka wypalano w temperaturze 80 °C przez 2 h i suszono przez noc przed schłodzeniem do temperatury pokojowej. W celu barwienia skrawki odparafinowano w ksylenie (I i II, po 20 min), rehydratowano w gradowanych seriach etanolu (100% I/II i 75%, po 5 min) i przepłukano wodą z kranu. Szkiełka barwiono hematoksyliną przez 3–5 min, różnicowano 1% alkoholowym roztworem kwasu i poddano procesowi niebienia w roztworze niebiącym. Po przemyciu skrawki odwodniono w 85% i 95% etanolu (po 5 min) i zabarwiono kontrastowo eozyną przez 5 min. Na koniec szkiełka odwodniono w etanolu bezwodnym (I, II i III, po 5 min), przejaśniono w ksylenie (I i II, po 5 min), zamontowano w balsamie neutralnym i wysuszono na powietrzu. Obrazy rejestrowano z losowych pól przy powiększeniu 200× za pomocą mikroskopu świetlnego i systemu CaseViewer. Stan zapalny płuc oraz pogrubienie nabłonka oceniano w sposób zaślepiony w skali 0–4: 0, brak stanu zapalnego; 1, sporadyczne komórki zapalne; 2, kilka (<3) ognisk zapalnych; 3, liczne (≥3) ogniska zapalne; 4, naciek rozlany w całym płucu. Pogrubienie nabłonka oceniano następująco: 0, prawidłowe; 1, widoczne pogrubienie; 2, częściowe pogrubienie dróg oddechowych; 3, prawie całkowita niedrożność; 4, brak prawidłowej struktury. Dla każdej grupy eksperymentalnej obrazowano i oceniano łącznie 20 losowych pól mikroskopowych, aby uzyskać surowe wyniki histopatologiczne. Dane z każdych czterech pól uśredniano, aby uzyskać jeden niezależny punkt danych, co w efekcie dało końcową wielkość próby n = 5 powtórzeń na grupę do analizy statystycznej. Ocena była przeprowadzana w sposób zaślepiony.
Sekwencjonowanie RNA (RNA-seq)
Całkowite RNA wyekstrahowano z tkanek płuc myszy przy użyciu odczynnika TRIzol zgodnie z protokołem producenta. Czystość, stężenie i integralność RNA oceniono za pomocą spektrofotometru oraz platformy opartej na mikroprzepływach. Biblioteki transkryptomu przygotowano przy użyciu komercyjnego zestawu do przygotowania bibliotek, a następnie zsekwencjonowano na platformie do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, generując odczyty parzysto-końcowe o długości 150 bp. Surowe dane poddano kontroli jakości przy użyciu odpowiedniego oprogramowania filtrującego w celu uzyskania czystych odczytów, które zmapowano do genomu referencyjnego za pomocą narzędzia do dopasowania z uwzględnieniem miejsc splicingowych. Poziomy ekspresji genów obliczono jako FPKM, a liczbę odczytów zestawiono za pomocą narzędzia do zliczania odczytów. Analizę ekspresji różnicowej przeprowadzono przy użyciu specjalistycznego pakietu statystycznego, przyjmując progi |log2 Fold Change| ≥ 1 oraz skorygowane p < 0,05.
ELISA
Świeże tkanki płuc myszy zostały precyzyjnie odważone i homogenizowane w buforze PBS w ścisłym stosunku 20 mg tkanki na 200 µL buforu. Homogenaty odwirowano przy prędkości około 13 400 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w celu pozyskania nadsączów białkowych. Do normalizacji wykorzystano metodę BCA w celu skalibrowania całkowistej zawartości białka w nadsączach. Procedurę ELISA przeprowadzono w trzech powtórzeniach technicznych przy użyciu komercyjnych zestawów zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, do płytek 96-dołkowych pokrytych przeciwciałami dodano 50 µL rozcieńczeń standardu lub 50 µL wstępnie rozcieńczonych próbek (10 µL próbki białka zmieszanej z 40 µL rozcieńczalnika do próbek, co dało końcowe 5-krotne rozcieńczenie). Płytki uszczelniono i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 min. Po pięciokrotnym przemyciu buforem do mycia rozcieńczonym 1:30, do każdego dołka (z wyjątkiem dołków kontrolnych/blanków) dodano 50 µL odczynnika koniugatu sprzężonego z enzymem, a następnie mieszaninę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 min. Po kolejnych pięciu przemyciach do każdego dołka dodano 50 µL roztworu chromogenu A i 50 µL roztworu chromogenu B, a płytkę inkubowano w ciemności w temperaturze 37 °C przez 10 min. Reakcję zatrzymano poprzez dodanie 50 µL roztworu stop, co spowodowało zmianę barwy z niebieskiej na żółtą. Absorbancję (wartość OD) każdego dołka zmierzono przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek w ciągu 15 min. Krzywe wzorcowe wykreślono przy użyciu modelu logistycznego czteroparametrowego lub modelu regresji liniowej (zapewniając R2 > 0,99), na podstawie których obliczono stężenia białek docelowych w homogenatach tkanki płucnej.
Cytometria przepływowa
Tkanki płuc wycięto, posiekano i poddano trawieniu w 5 mL pożywki RPMI-1640 zawierającej 10% FBS, 50 µL Liberase TM oraz 5 µL DNase I w temperaturze 37 °C przez 45 min przy wytrząsaniu z prędkością 80 rpm. Przetrawioną zawiesinę przepuszczono przez sito komórkowe o gęstości 400 mesh i odwirowano przy 300 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Osad resuspendowano w 2 mL buforu do lizy erytrocytów na 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Po przemyciu komórki resuspendowano i barwiono Ghost Dye Red 780 (1,25 µL na próbkę) przez 20 min w temperaturze 4 °C w ciemności w celu wykluczenia martwych komórek. Po przemyciu komórki blokowano za pomocą 10 µL odczynnika FcR Blocking Reagent przez 10 min w temperaturze 4 °C. Następnie przeprowadzono barwienie powierzchniowe komórek przy użyciu następujących przeciwciał sprzężonych z fluorochromami przez 30 min w temperaturze 4 °C: FITC anty-mysie CD45 (0,5 µL), PE anty-mysie/ludzkie KLRG1 (1,25 µL), BB700 szczurze anty-mysie CD90.2 (0,5 µL) oraz biotynilowanej mieszaniny lineage zawierającej anty-mysie CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (wszystkie po 0,5 µL) oraz anty-mysie CD19 (2 µL). Po przemyciu komórki inkubowano z Brilliant Violet 605 Streptavidin (2 µL) przez 30 min w temperaturze 4 °C. Dane pozyskano na platformie cytometrii przepływowej BD i analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo. Macierze kompensacji przelewów fluorescencji były automatycznie monitorowane i korygowane przez skalibrowane oprogramowanie akwizycyjne instrumentu. Hierarchiczna strategia bramkowania w celu identyfikacji płucnych ILC2 została wdrożona sekwencyjnie w następujący sposób: najpierw wyizolowano całkowitą populację limfocytów na podstawie morfologii rozproszonego światła przedniego i bocznego (FSC-A/SSC-A), a następnie przeprowadzono dyskryminację dubletów poprzez bramkowanie singletów (FSC-H/FSC-A). Żywe komórki zidentyfikowano następnie poprzez wykluczenie martwych komórek (Ghost Dye-), po czym progresywnie stosowano standardowe bramki w celu wyselekcjonowania populacji CD45+ oraz Lineage-. W oknie bramkowania żywych komórek CD45+ Lineage- płucne ILC2 zostały jednoznacznie zdefiniowane i ilościowo określone na podstawie kolejnych, kaskadowych bramek dodatnich dla klastrów CD90.2+ oraz KLRG1+.
Immunofluorescencja (IF)
Zamrożone przekroje płuc rozmrażano w temperaturze pokojowej przez 15–30 min, a następnie płukano trzykrotnie PBST (PBS zawierający 0,05% Tween-20) przez 6 min każde płukanie w celu usunięcia związku OCT. Po odsączeniu nadmiaru cieczy, wokół tkanki wyznaczono barierę hydrofobową za pomocą pisaka do immunohistochemii. Przekroje inkubowano w buforze blokującym i permeabilizującym zawierającym 0,3% Triton X-100 oraz 5% surowicy koziej w temperaturze 37 °C przez 100 min, a następnie inkubowano przez noc (16–20 h) w temperaturze 4 °C z przeciwciałem pierwszorzędowym. Następnego dnia przekroje doprowadzono do temperatury pokojowej przez 30 min, płukano trzykrotnie PBST i inkubowano z dopasowanym gatunkowo przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fluoroforem w temperaturze 37 °C w ciemności przez 60–90 min. Po trzech dodatkowych płukaniach PBST, jądra komórkowe barwiono kontrastowo DAPI (rozcieńczonym 1:1 lub 2:1 w PBS) przez 8 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Po końcowej serii płukań PBST (3 × 6 min), przekroje zamykano za pomocą medium montażowego anti-fade, uszczelniano w celu zapobiegania powstawaniu pęcherzyków powietrza i przechowywano w ciemności. Obrazy zarejestrowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego z powiększeniem 400×. Liczbę komórek pozytywnych w każdym polu liczono ręcznie za pomocą oprogramowania Leica LAS X. Dla każdej grupy eksperymentalnej wykonano zdjęcia 15 losowych pól mikroskopowych, aby uzyskać surowe dane dotyczące liczby komórek. Dane z każdych trzech pól uśredniano, aby uzyskać pojedynczy niezależny punkt danych, co dało końcową wielkość próby n = 5 powtórzeń na grupę do analizy statystycznej. Liczenie przeprowadzono metodą ślepej próby.
Immunohistochemia (IHC)
Przekroje parafiniowe odparafinizowano w trzech zmianach ksylenu (po 15 min każda), rehydratowano w serii alkoholi o malejącym stężeniu (dwukrotnie 100%, 85% i 75%; po 5 min każda) i wypłukano wodą destylowaną. Odmaskowanie antygenów przeprowadzono w buforze cytrynianowym (pH 6.0) przy użyciu szybkowaru (3 min pod wysokim ciśnieniem po zagotowaniu), a następnie schłodzono i trzykrotnie przemyto przez 5 min w PBS (pH 7.4). Endogenną peroksydazę zablokowano 3% H2O2 przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Po przemyciu przekroje obrysowano pisakiem hydrofobowym i zablokowano 3% surowicą kozią przez 30 min. Następnie przekroje inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w PBS: anty-IL-4 (1:400), anty-IL-5 (1:300) lub anty-IL-13 (1:150). Następnego dnia przekroje przemyto i inkubowano z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP (anty-mysie dla IL-4; anty-królicze dla IL-5 i IL-13) przez 50 min w temperaturze pokojowej. Sygnały wizualizowano przy użyciu świeżo przygotowanego roztworu DAB pod kontrolą mikroskopową, a reakcję przerwano wodą z kranu. Na koniec przekroje dobarwiono hematoksyliną, zróżnicowano, poddano procesowi niebieszczenia, odwodniono w serii alkoholi i ksylenie, a następnie zamontowano w balsamie neutralnym do badania mikroskopowego. Średnią gęstość optyczną (IOD/Area) określono za pomocą platformy oprogramowania do analizy obrazu przy powiększeniu 200×. Dla każdej grupy eksperymentalnej wykonano zdjęcia 15 losowych pól mikroskopowych w celu uzyskania wartości surowych. Dane z każdych trzech pól uśredniono, aby uzyskać pojedynczy niezależny punkt danych, co dało końcową wielkość próby n = 5 powtórzeń na grupę do analizy statystycznej. Oceny dokonało dwóch oślepionych obserwatorów.
Western blot (WB)
Do przygotowania próbek wykorzystano tkankę płuc mysich (około 30 mg), którą drobno posiekano i zhomogenizowano w 300 µL schłodzonego buforu do lizy RIPA z dodatkiem 1% koktajlu inhibitorów proteaz i fosfataz. Homogenizację przeprowadzono za pomocą homogenizatora tkankowego przy częstotliwości 60 Hz przez cztery cykle (60 s na cykl). Następnie lizaty odwirowano przy około 13 400 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C w celu zebrania supernatantu. Całkowite stężenie białek określono za pomocą standardowego zestawu do analizy białek BCA. Próbki znormalizowano, zmieszano z 5x buforem do ładowania w stosunku objętości 4:1 i denaturowano w temperaturze 95 °C przez 7 min. W przypadku SDS-PAGE próbki białek (20 µg na studzienkę) naniesiono wraz z wstępnie zabarwionym markerem masy cząsteczkowej białek, rozdzielono przy stałym napięciu 80 V przez 20 min, a następnie przy 120 V przez 70 min. Białka przeniesiono metodą mokrą na membrany PVDF 0,22 µm przy stałym prądzie 300 mA przez 120 min w kąpieli lodowej. Membrany blokowano 5% BSA w TBST przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc (do 18 h) w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko CGRP (1:500) i GAPDH (1:2000). Po trzykrotnym przemyciu TBST (po 10 min każde), membrany inkubowano z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (1:10000) przez 1–2 h w temperaturze pokojowej. Po kolejnych trzech przemyciach prążki białkowe wizualizowano przy użyciu wzmocnionego substratu chemiluminescencyjnego (ECL) w systemie obrazowania VILBER Fusion FX. Intensywność prążków ilościowo określono za pomocą programu ImageJ 1.8, a ekspresję białka docelowego znormalizowano względem wewnętrznej kontroli GAPDH.
Analiza statystyczna
Wszystkie dane eksperymentalne przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Analiza danych oraz opracowanie wykresów statystycznych zostały wykonane przy użyciu specjalistycznej platformy programistycznej do statystyki. Przed porównaniami między grupami zestawy danych poddano systematycznym testom normalności. Dla danych o rozkładzie normalnym i jednorodnych wariancjach zastosowano jednoczynnikową lub dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie testy post hoc Tukeya, Šídáka, Holm-Šídáka lub Fishera (LSD) dla wielokrotnych porównań parzystych. W przypadku porównywania wielu grup z jedną grupą kontrolną zastosowano test Dunnetta. Dla zestawów danych o niejednorodnych wariancjach wykorzystano test ANOVA Browna-Forsythe'a, a następnie test post hoc Dunnetta T3. W przypadku zestawów danych, które nie spełniały kryterium normalności, zastosowano nieparametryczny test Kruskala-Wallisa, a następnie test post hoc Dunna dla porównań wielokrotnych. Wartość P < 0,05 uznano za wskazującą na istotne statystycznie różnice. Różne poziomy istotności oznaczono dynamicznie jako *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 oraz ****p < 0,0001. Wszystkie oceny wyników eksperymentalnych, w tym ocena histologiczna, analiza cytometrii przepływowej oraz kwantyfikacja obrazów, zostały przeprowadzone w sposób całkowicie zaślepiony.
Wyniki
KAST redukuje liczbę płucnych komórek ILC2 i łagodzi zapalenie dróg oddechowych typu 2
Aby zbadać efekty terapeutyczne KAST, opracowano model myszy z AA indukowaną OVA, które leczono za pomocą plastrów aplikowanych w punktach akupunkturowych Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) i Shenshu (BL23) (Rycina 1A). Po wywołaniu modelu u myszy z AA odnotowano spadek masy ciała, natomiast u myszy leczonych KAST zaobserwowano istotny wzrost masy ciała w porównaniu z grupą modelową (Rycina 1B). Współczynnik płuc, będący wskaźnikiem stanu zapalnego płuc, był podwyższony u myszy z AA, ale uległ wyraźnemu obniżeniu po zastosowaniu KAST (Rycina 1C). Ocena behawioralna wykazała zwiększoną częstotliwość drapania nosa i kichania u myszy z AA, co zostało istotnie złagodzone przez KAST (Rycina 1D–E). Pletyzmografia całego ciała wykazała, że wartości Penh, wskazujące na nadreaktywność dróg oddechowych, były podwyższone u myszy z AA, lecz uległy obniżeniu po leczeniu, co sugeruje poprawę funkcji płuc (Rycina 1F). Analiza histopatologiczna z barwieniem HE ujawniła nacieki komórek zapalnych w obrębie okołubronchialnym i okołopęcherzykowym w grupie modelowej w porównaniu z normalną grupą kontrolną. W przeciwieństwie do niej, w grupie KAST naciek zapalny był zredukowany (Rycina 2A–B). Immunohistochemia wykazała, że IL-4, IL-5 i IL-13 lokalizowały się głównie w cytoplazmie naciekających komórek zapalnych oraz w niektórych komórkach nabłonkowych, z potencjalnym gromadzeniem się w przestrzeniach śródmiąższowych. W porównaniu z normalną grupą kontrolną, w grupie modelowej odnotowano wyraźnie zwiększoną liczbę sygnałów dodatnich oraz wyższe wartości średniej gęstości optycznej, które uległy istotnemu zmniejszeniu w grupie KAST (Rycina 2C–H). Cytometria przepływowa dodatkowo wykazała, że liczba ILC2 była istotnie zwiększona w płucach myszy z AA w porównaniu z normalną grupą kontrolną, podczas gdy KAST wyraźnie zredukowała liczbę ILC2 (Rycina 2I–J).
KAST łagodzi zapalenie dróg oddechowych typu 2 poprzez supresję osi CGRP/RAMP1
Hiperaktywacja ILC2 jest regulowana przez wiele czynników. Analiza RNA-seq wykazała, że ekspresja CGRP była istotnie podwyższona u myszy z AA, a KAST wyraźnie obniżył poziomy CGRP w płucach (Rycyna 3A). Western blot i test ELISA potwierdziły podwyższone poziomy białka CGRP w grupie modelowej w porównaniu z grupami kontrolnymi, które uległy redukcji pod wpływem KAST (Rycina 3B–D). Wyniki te sugerują, że KAST łagodzi ekspresję CGRP w płucach w AA, modulując tym samym odpowiedzi immunologiczne ILC2. Wspólnie te różnice w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym i przesiewaniu białek wskazują na silny związek między interwencją terapeutyczną KAST a obniżeniem poziomów CGRP w płucach myszy z AA.
Aby dalej zbadać rolę CGRP, myszy AA leczono egzogennym CGRP, antagonistą receptora CGRP BIBN-4096 lub KAST w połączeniu z CGRP. Wyniki testu ELISA wykazały znacznie obniżone poziomy białka CGRP w grupach KAST i BIBN-4096, podwyższone poziomy w grupie CGRP oraz wyższe poziomy w grupie KAST + CGRP w porównaniu z samą grupą KAST (Rycina 4A). Cytometria przepływowa wykazała, że liczba komórek ILC2 była zmniejszona w grupach KAST i BIBN-4096, natomiast zwiększona w grupach CGRP i KAST + CGRP w stosunku do grupy modelowej (Rycina 4B–C). Barwienie HE wykazało zmniejszoną infiltrację komórek zapalnych wokół dróg oddechowych i pęcherzyków płucnych w grupach KAST i BIBN-4096, podczas gdy infiltracja uległa nasileniu w grupach CGRP i KAST + CGRP (Rycina 4D–E). Test ELISA dodatkowo potwierdził obniżone poziomy IL-4, IL-5 i IL-13 w grupach KAST i BIBN-4096, ale zwiększone poziomy w grupach CGRP i KAST + CGRP (Rycina 4F–H).
Liczbę płucnych komórek RAMP1+ILC2 w różnych grupach oceniono za pomocą wielokolorowego barwienia immunofluorescencyjnego. Wyniki wykazały, że w porównaniu z grupą kontrolną, w tkankach płuc grupy modelowej nastąpił istotny wzrost całkowitej liczby komórek RAMP1+ILC2. W porównaniu z grupą modelową, liczba płucnych komórek RAMP1+ILC2 uległa dalszemu istotnemu zwiększeniu w grupie CGRP, natomiast była wyraźnie zmniejszona zarówno w grupie BIBN-4096, jak i w grupie KAST. Co istotne, w porównaniu z grupą KAST, w grupie KAST + CGRP odnotowano istotny wzrost liczby płucnych komórek RAMP1+ILC2, co wskazuje, że egzogenna suplementacja CGRP skutecznie odwróciła hamujący wpływ KAST na populacje całkowitych komórek RAMP1+ILC2 (Rycina 5A–B).
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Pełne, surowe zbiory danych wygenerowane i przeanalizowane podczas niniejszego badania zostały zdeponowane w publicznie dostępnym repozytorium. W szczególności te kompleksowe materiały obejmują wszystkie pełne, oryginalne skany błon dla analiz Western blot (WB), wszystkie pełne, surowe, wysokorozdzielcze obrazy mikroskopowe dla analiz histologicznych (HE i IHC) oraz immunofluorescencyjnych (IF), a także poszczególne zbiory danych z powtórzeń oraz arkusze Excel z kwantyfikacją. Wszystkie surowe dane są otwarcie dostępne pod następującym trwałym identyfikatorem DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. Kolejność bramkowania dla cytometrii przepływowej została przedstawiona na Rysunku uzupełniającym 1. Dwa pełne obrazy blotów zostały przesłane jako Rysunki uzupełniające 2–3, a dane ilościowe zostały przesłane w Tabeli uzupełniającej 1.
Rycina 1: Wpływ KAST na objawy i funkcje płuc u myszy z AA. (A) Protokół indukcji astmy alergicznej z użyciem OVA. (B) Statystyki masy ciała myszy w każdej grupie, n = 5. (C) Współczynnik płuc myszy w każdej grupie, n = 5. (D) Liczba pocierań nosa w ciągu 10 min po ostatniej ekspozycji, n = 5. (E) Częstotliwość kichania w ciągu 10 min po ostatniej ekspozycji, n = 5. (F) Wartości Penh myszy w każdej grupie po stymulacji różnymi stężeniami acetylocholiny, n = 5. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Porównania statystyczne wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA) lub dwuczynnikowej analizy wariancji (two-way ANOVA), a następnie, w stosownych przypadkach, przeprowadzono test wielokrotnych porównań post hoc. n = powtórzenia biologiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Regulacja liczby ILC2 i stanu zapalnego dróg oddechowych typu 2 przez KAST u myszy AA. (A) Zmiany morfologiczne płuc badane za pomocą barwienia HE. Pasek skali = 50 µm. Powiększenie: 200×. Ocena stopnia stanu zapalnego była przeprowadzana w sposób zaślepiony. (B) Analiza statystyczna stopni stanu zapalnego w różnych grupach, n = 5. (C–H) Reprezentatywne obrazy IHC i wartości średniej gęstości optycznej ekspresji białek IL-4 (C, D), IL-5 (E, F) oraz IL-13 (G, H) w tkance płucnej różnych grup, n = 5. Pasek skali = 50 µm. Powiększenie: 200×. (I) Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej przedstawiające końcowe bramkowanie płucnych ILC2 w grupach Normal, Model i KAST. Pojedyncze, żywe komórki były bramkowane sekwencyjnie jako CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19), następnie CD90.2+, a płucne ILC2 zostały ostatecznie zidentyfikowane na podstawie pozytywnej ekspresji KLRG1+. Dane zostały pozyskane na wysokowydajnej platformie cytometrii przepływowej i przeanalizowane przy użyciu specjalistycznego pakietu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. (J) Analiza ILC2 określona jako procent komórek CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ wśród żywych komórek, n = 5. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Porównania statystyczne wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie odpowiednich testów wielokrotnych porównań post hoc. n = powtórzenia biologiczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: KAST hamuje ekspresję CGRP w tkankach płuc myszy AA. (A) Mapa ciepła ekspresji genów w różnych grupach, n = 4. (B) Reprezentatywne obrazy WB ekspresji CGRP (10 kDa) i GAPDH (37 kDa) w tkankach płuc z każdej grupy. (C) Analiza WB ekspresji białka CGRP w tkankach płuc, przedstawiona jako względna ekspresja CGRP (stosunek CGRP/GAPDH), n = 3. (D) Analiza ELISA ekspresji białka CGRP w tkankach płuc, n = 4. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Porównania statystyczne wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań post hoc. n = powtórzenia biologiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Wpływ KAST na liczbę komórek ILC2 i zapalenie dróg oddechowych typu 2 za pośrednictwem CGRP u myszy z AA. (A) Analiza ELISA ekspresji białka CGRP w tkankach płuc w różnych grupach, n = 4. (B) Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej dla komórek ILC2 (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) w każdej grupie. (C) Analiza komórek ILC2 określona jako procent komórek CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ wśród żywych komórek, n = 5. (D) Zmiany morfologiczne płuc badane za pomocą barwienia HE. Pasek skali = 50 µm. Powiększenie: 200×. (E) Analiza statystyczna wskaźników stanu zapalnego w różnych grupach, n = 5. (F–H) Analiza ELISA ekspresji białek IL-4 (F), IL-5 (G) i IL-13 (H) w tkankach płuc w różnych grupach, n = 4. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Porównania statystyczne wykonano przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie odpowiednich testów wielokrotnych porównań post hoc. n = powtórzenia biologiczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Wpływ KAST na liczbę komórek ILC2 w tkankach płuc poprzez szlak CGRP/RAMP1. (A) Liczba komórek RAMP1⁺ ILC2 (zdefiniowanych jako komórki potrójnie dodatnie KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) na pole widzenia przy powiększeniu 400× w tkankach płuc, n = 5. (B) Reprezentatywne barwienie fluorescencyjne tkanek płuc. Jądra komórkowe zabarwiono DAPI (niebieski), a barwienie immunohistochemiczne wykonano dla KLRG1 (fioletowy), GATA3 (czerwony) i RAMP1 (zielony). Pasek skali = 50 µm. Kwantyfikacja: ręczne liczenie komórek RAMP1⁺ ILC2 (komórek KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) metodą ślepej próby z wykorzystaniem specjalistycznej platformy do analizy obrazu. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań post hoc. n = powtórzenia biologiczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina uzupełniająca 1: Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej przedstawiające sekwencyjną strategię bramkowania w celu izolacji płucnych ILC2s. W pierwszej kolejności wszystkie zdarzenia bramkowano w oparciu o rozproszenie przednie (FSC-A) i rozproszenie boczne (SSC-A). Dublety wykluczono poprzez analizę FSC-A vs. FSC-H w celu uzyskania pojedynczych komórek. Żywe komórki zidentyfikowano jako Ghost Dye Red 780⁻, aby wyeliminować populacje martwych komórek. Następnie bramkowano leukocyty na CD45⁺, po czym wyselekcjonowano komórki lineage-ujemne (Lin⁻). W obrębie podgrupy CD45⁺ Lin⁻ komórki dodatkowo bramkowano na CD90.2⁺, a płucne ILC2s ostatecznie zdefiniowano poprzez pozytywną ekspresję KLRG1 (KLRG1⁺).Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina uzupełniająca 2: Reprezentatywny obraz Western blot dla wewnętrznej referencji GAPDH (37 kDa) z próbek tkanki płuc myszy. Zintegrowaną gęstość optyczną prążków wyznaczono za pomocą oprogramowania ImageJ w celu późniejszej normalizacji.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina uzupełniająca 3: Reprezentatywny obraz Western blot białka docelowego CGRP (10 kDa) z próbek tkanki płuc myszy. Względną ekspresję CGRP obliczono poprzez podzielenie zintegrowanej gęstości optycznej prążków CGRP przez odpowiadające im wartości zintegrowanej gęstości optycznej GAPDH.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 1: Wartości danych surowych. Wartości danych surowych, które posłużyły do wykreślenia wykresów.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Leczenie AA wiąże się z kilkoma ograniczeniami, w tym z efektami ubocznymi związanymi z długotrwałym stosowaniem leków, niepełną kontrolą objawów oraz częstymi nawrotami. Chociaż konwencjonalna farmakoterapia jest skuteczna, często towarzyszą jej niepożądane skutki, takie jak zależność od steroidów26,27. W przeciwieństwie do niej, KAST stanowi bezpieczną, ekonomiczną i wygodną alternatywę w leczeniu AA. Dowody kliniczne wykazały, że KAST może skutecznie łagodzić objawy astmy poprzez modulowanie funkcji odpornościowej płuc28. W niniejszym badaniu wykazaliśmy ponadto, że KAST łagodzi zapalenie dróg oddechowych typu 2 u myszy z AA poprzez hamowanie szlaku CGRP/RAMP1 i redukcję liczby komórek ILC2.
Odporność wrodzona, w szczególności komórki ILC2, odgrywa niezastąpioną rolę w inicjacji, amplifikacji i utrzymywaniu stanu zapalnego dróg oddechowych typu 2 w AA29. Po ekspozycji na alergen komórki ILC2 szybko reagują na alarminy pochodzenia nabłonkowego, wydzielając w ciągu kilku godzin duże ilości IL-5 i IL-13, co wyzwala odpowiedzi zapalne typu 230,31. Ponadto ILC2 promują różnicowanie Th2 oraz syntezę IgE, co dodatkowo nasila adaptacyjne odpowiedzi odpornościowe i zaostrza zapalenie dróg oddechowych32. Badania wykazały, że genetyczna ablacja ILC2 znacznie skraca czas trwania stanu zapalnego dróg oddechowych w modelach AA, co podkreśla ich centralną rolę w podtrzymywaniu zapalenia typu 218. ILC2 są regulowane przez cytokiny (np. IL-25, IL-33, TSLP), mediatory zapalne (np. leukotrieny) oraz neuropeptydy (np. CGRP, VIP, NMU)33. Wśród nich neuropeptydy odgrywają kluczową rolę w regulacji odporności wrodzonej. Neuromedyna U (NMU) bezpośrednio zwiększa aktywność ILC2, szybko indukując uwalnianie IL-5 i IL-1334. Peptyd jelitowy aktywny naczyniowo (VIP) przyczynia się do pobierania składników odżywczych i regulacji rytmu dobowego, promując produkcję IL-5 przez ILC2 oraz utrzymując homeostazę eozynofilów33. CGRP wyraźnie zwiększa uwalnianie IL-5 z ILC2, promując tym samym zapalenie dróg oddechowych w AA. Co istotne, RAMP1, podjednostka receptora dla CGRP, jest ekspresowana na ILC2 na znacznie wyższym poziomie niż receptory dla innych neuropeptydów, co sugeruje, że CGRP jest najsilniejszym ligandem aktywującym ILC235. W niniejszym badaniu analiza transkryptomiczna zidentyfikowała CGRP jako jeden z neuropeptydów o najwyższej różnicy w ekspresji u myszy z AA, a analizy na poziomie białka potwierdziły jego nadekspresję w tkankach płuc. Egzogenna administracja CGRP dodatkowo zwiększyła liczbę ILC2 oraz uwalnianie cytokin typu 2, zaostrzając zapalenie dróg oddechowych.
Pod względem mechanistycznym CGRP wiąże się z RAMP1 na komórkach ILC2, aby regulować ich kaskady odpowiedzi immunologicznej. Choć w części dostępnej literatury CGRP opisuje się jako negatywny regulator ograniczający ekspansję ILC2 w celu ochrony przed nadmiernym stanem zapalnym20,21, dowody przeciwne wskazują, że CGRP może współpracować z alarmynami, aby silnie prowokować wrodzoną odporność grupy 2 w specyficznych mikrośrodowiskach patologicznych. Nasze punkty końcowe eksperymentu są zgodne z tą drugą kaskadą, wykazując indukowany przez CGRP wzrost infiltracji płucnej ILC2 w mikrośrodowisku alergicznym wywołanym przez OVA. I odwrotnie, blokada szlaku CGRP za pomocą antagonisty receptora BIBN-4096 znacząco łagodzi zapalenie dróg oddechowych zapośredniczone przez ILC2. Zamiast dostarczać bezpośrednich dowodów z ablacji genetycznej, nasze wyniki opierają się na asocjacyjnych wariacjach transkryptomicznych oraz równoległych eksperymentach z interwencją farmakologiczną (z wykorzystaniem egzogennego CGRP oraz antagonisty BIBN-4096), aby wykazać, że ochrona terapeutyczna KAST jest ściśle skorelowana z supresją klastrów sygnalizacyjnych CGRP/RAMP1 na komórkach ILC2.
Mimo tych obiecujących wyników należy uznać kilka nieodzownych ograniczeń. Po pierwsze, choć indukowany OVA mysi model dostarcza cennych informacji mechanistycznych, może on nie w pełni odwzorowywać złożonego krajobrazu patofizjologicznego i immunologicznego ludzkiej astmy alergicznej ze względu na różnice międzygatunkowe. Po drugie, stosunkowo mała liczebność próby w niektórych badaniach eksploracyjnych sprawia, że do uzyskania szerszej generalizacji statystycznej wymagane są większe kohorty. Po trzecie, w badaniu tym priorytetowo potraktowano oś sygnalizacyjną CGRP/RAMP1/ILC2, co oznacza, że inne potencjalnie istotne szlaki interakcji neuro-immunologicznych oraz nakładające się sieci cytokin wymagają głębszej eksploracji w przyszłości. Co najważniejsze, głównym ograniczeniem technicznym jest brak dedykowanej kontrolnej grupy z pozorowaniem nakłuć punktów akupunkturowych z wykorzystaniem plastrów bez leku lub lokalizacji poza punktami akupunkturowymi. W konsekwencji potencjalne nieswoiste czynniki zakłócające — takie jak stres mechaniczny wynikający z golenia, manipulacje eksperymentalne oraz stymulacja adhezyjna samego plastra — nie mogą zostać całkowicie oddzielone od specyficznych właściwości terapeutycznych KAST. Aby rozwiązać te problemy, nasze przyszłe plany badawcze będą ściśle uwzględniać rygorystycznie zaprojektowane kontrole pozorowane oraz walidacje wielościżkowe, aby dalej konsolidować specyficzność i powtarzalność tych wyników. Odnośnie zaobserwowanego obniżenia poziomów białka CGRP po interwencji BIBN-4096, należy wyjaśnić, że choć BIBN-4096 funkcjonuje przede wszystkim jako konkurencyjny antagonista celujący w kompleks receptorowy RAMP1/CRLR, a nie jako bezpośredni inhibitor syntezy CGRP, jego podanie in vivo może obniżać miejscową akumulację liganda w tkankach. To wtórne zjawisko jest prawdopodobnie mediowane poprzez przerwanie neuro-immunologicznej pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego. Poprzez blokowanie RAMP1 na docelowych komórkach odpornościowych, takich jak ILC2s, BIBN-4096 hamuje kaskadowe uwalnianie cytokin efektorowych, co z kolei zmniejsza wsteczną aktywację zapalną zakończeń nerwów sensorycznych i płucnych komórek neuroendokrynnych (PNECs), tym samym pośrednio osłabiając kaskadową syntezę CGRP i jego retencję tkankową.
Podsumowując, nasze ustalenia empiryczne dowodzą, że KAST skutecznie przekształca mikrośrodowisko wrodzonej odporności płuc poprzez oddziaływanie na neuronową oś CGRP/RAMP1. Choć zdajemy sobie sprawę, że bezpośrednia ekstrapolacja kliniczna wymaga ostrożnej optymalizacji ze względu na różnice biologiczne między gryzoniami a ludźmi, punkty końcowe te stanowią kluczowy, wcześniej brakujący fundament mechanistyczny, który uzasadnia tradycyjną teorię „Fei Wai He Pi Mao” (Płuca łączące się ze skórą i włosami). Oferując doprecyzowaną perspektywę neuroimmunologiczną, protokół ten ustanawia wiarygodną bazę naukową, która będzie prowadzić i wspierać przyszłe prospektywne, wieloośrodkowe translacje kliniczne tradycyjnych terapii naklejek ziołowych na punkty akupkturowe w leczeniu astmy alergicznej.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez National Natural Science Foundation of China (nr 82274632), Jiangsu Province Leading Talents Cultivation Project for Traditional Chinese Medicine (nr SLJ0309), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (nr BK20231381), Jiangsu Province Traditional Chinese Medicine Science and Technology Development Plan Project (nr ZT202205) oraz Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education at Nanjing University of Chinese Medicine (nr AML202304).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Oddychająca taśma medyczna 3M | 3M, USA | 1530C | Mocowanie plastrów |
| Chlorek acetylocholiny | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | Prowokacja oskrzelowa |
| Bioanalizator Agilent 2100 | Agilent Technologies, USA | G2939BA | Ocena jakości i integralności RNA |
| Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, USA | (zamówienie indywidualne) | Immunofluorescencja (wtórne) |
| Wodorotlenek glinu | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | Adiuwant |
| Przeciwciało anty-CGRP (królicze) | Abcam, UK | ab81887 | Western blot / IF |
| Mysz BALB/c (samica, SPF, 8–10 tygodni, 18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | Model zwierzęcy |
| BB700 szczurze przeciwciało anty-mysie CD90.2 (klon 53-2.1) | BD Biosciences, USA | 566465 | Cytometria przepływowa |
| Cytometr przepływowy BD FACSCanto II | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | Cytometria przepływowa |
| BIBN-4096 (Wodorochlorek olcegantu) | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | Antagonista receptora CGRP |
| Biotynowy koktajl linii komórkowych (Biotin-Lineage Cocktail) | BD Biosciences, USA | (Indywidualne, klony opisane w tekście) | Cytometria przepływowa |
| Brilliant Violet 605 Streptawidyna | BD Biosciences, USA | 563260 | Cytometria przepływowa |
| BSA Albumin Fraction V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Germany | 4240GR100 | Blokowanie |
| Białko kalcytoniny/CALCA | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | Interwencja CGRP |
| Przeciwciało CD11c/ITGAX (królicze) | Abmart, Shanghai, China | MU115408S | Immunofluorescencja |
| Bufor cytrynianowy do odzyskiwania antygenów | Boster, China | AR0024 | Immunohistochemia |
| Roztwór barwiący DAPI | Beyotime, Shanghai, China | C1006 | Barwienie jąder komórkowych |
| ddH2O (Woda dwukrotnie destylowana) | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | Rekonstytucja białek i rozpuszczanie proszków |
| DESeq2 | Bioconductor (pakiet R) | Wersja 1.42.0 | Oprogramowanie do analizy ekspresji różnicowej |
| DNaza I | Roche Diagnostics, Germany | 10104159001 | Trawienie tkanki płucnej |
| Osiołkowe przeciwciało anty-mysie IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, UK | ab150106 | Immunofluorescencja (wtórne) |
| Substrat ECL (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, China | – | Chemiluminescencja w Western blot |
| Zestaw do ulepszonego pomiaru białka BCA | Beyotime, Shanghai, China | P0010 | Kwantyfikacja białka |
| Roztwór barwiący Eozyna Y | Sigma-Aldrich, USA | HT110216 | Histologia (barwienie HE) |
| Etanol (bezwodny, stopień analityczny) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10009218 | Odwadnianie tkanek i histologia |
| Przeciwciało F4/80 (mysie, klon C-7) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | Immunofluorescencja |
| fastp | Open Source (GitHub) | Wersja 0.23.4 | Oprogramowanie do kontroli jakości surowych danych RNA-seq |
| FITC przeciwciało anty-mysie CD45 (klon 30-F11) | BD Biosciences, USA | 553080 | Cytometria przepływowa |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | Analiza cytometrii przepływowej |
| Monoklonalne przeciwciało GAPDH (mysie) | Proteintech, Wuhan, China | 60004-1-Ig | Western blot |
| Przeciwciało GATA3 (mysie, klon L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | Immunofluorescencja |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | Eliminacja martwych komórek |
| Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H+L) z adsorpcją krzyżową | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | Immunofluorescencja (wtórne) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | Analiza statystyczna |
| Roztwór hematoksyliny (Harris) | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | Histologia (barwienie HE) |
| HISAT2 | Johns Hopkins University (Open Source) | Wersja 2.2.1 | Oprogramowanie do dopasowania genomu referencyjnego RNA-seq |
| Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) sprzężone z HRP | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-1 | Western blot (wtórne) |
| Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) sprzężone z HRP | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-2 | Western blot (wtórne) |
| HTSeq-count | EMBL (narzędzie Python) | Wersja 2.0.3 | Narzędzie do zliczania odczytów cech genomowych RNA-seq |
| Nadtlenek wodoru (H2O2, roztwór 3%) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Blokowanie endogennej peroksydazy |
| Kozie przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z iFluor™ 488 | Huabio, China | HA1121 | Immunofluorescencja (wtórne) |
| Monoklonalne przeciwciało IL-4 | Proteintech, Wuhan, China | 66142-1-Ig | Western blot |
| Przeciwciało IL13 | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | Western blot |
| Przeciwciało IL5 | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | Western blot |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, USA | – | Sekwencjonowanie RNA |
| ImageJ | NIH, USA | 1.8 | Kwantyfikacja Western blot |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | Wersja 6.0 | Kwantyfikacja gęstości optycznej obrazu |
| Ziołowa formulacja KAST | Pharmacy Department, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine | – | Interwencja |
| Monoklonalne przeciwciało KLRG1 (2F1) | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | Immunofluorescencja |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Germany | 4.5 | Kwantyfikacja immunofluorescencji |
| Konfokalny mikroskop Leica STELLARIS 8 DIVE | Leica Microsystems, Germany | STELLARIS 8 | Obrazowanie immunofluorescencyjne |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Germany | 5401119001 | Trawienie tkanki płucnej |
| Marker (Prestained Protein Ladder) | NCM Biotech, Suzhou, China | P9001 | Western blot |
| Zestaw ELISA dla mysiego CGRP | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF2491-A | ELISA |
| Zestaw ELISA dla mysiego IL-13 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02456M1 | ELISA |
| Zestaw ELISA dla mysiego IL-4 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02448M1 | ELISA |
| Zestaw ELISA dla mysiego IL-5 | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-11729M1 | ELISA |
| Neutralny balsam jako medium montażowe | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10014061 | Montowanie preparatów histologicznych |
| Normalne surowicze kozie (do blokowania) | Abcam, UK | ab7481 | Blokowanie immunohistochemiczne/IF |
| Związek zatapiający OCT | Sakura, USA | 4583 | Zatapianie do kriosiekcji |
| Zestaw do szybkiego przygotowania żelu PAGE w jednym kroku | Vazyme, Nanjing, China | E303-01 | Przygotowanie żelu SDS-PAGE |
| Owalbumina (OVA) | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | Sensytyzacja/wyzwalanie |
| Paraformaldehyd (4% w PBS) | Biosharp, China | BL539A | Fiksacja tkanek |
| PE przeciwciało anty-mysie/ludzkie KLRG1 (klon 2F1) | BD Biosciences, USA | 564022 | Cytometria przepływowa |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy (50×) | Beyotime, Shanghai, China | P1092 | Ekstrakcja białek |
| Roztwór poli-L-lizyny | Boster, China | AR0003 | Powlekanie szkiełek histologicznych |
| Inhibitor proteaz i fosfataz | NCM Biotech, Suzhou, China | P002 | Ekstrakcja białek |
| Membrana PVDF (0.22 μm) | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | Western blot |
| Poliklonalne przeciwciało RAMP1 (królicze) | Proteintech, Wuhan, China | 10327-1-AP | Immunofluorescencja |
| Bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC) | Beyotime, Shanghai, China | C3702 | Przygotowanie próbek do cytometrii przepływowej |
| Bufor do lizy RIPA (silny) | Beyotime, Shanghai, China | P0013B | Ekstrakcja białek |
| Podłoże RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11875093 | Podstawa do trawienia komórek tkankowych |
| SuperKine™ Enhanced Antifade Mounting Medium | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | Montowanie w immunofluorescencji |
| Triton X-100 (detergent) | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | Permeabilizacja w immunofluorescencji |
| Odczynnik TRIzol | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | Ekstrakcja RNA |
| Zestaw do przygotowania bibliotek VAHTS Universal V10 RNA-seq | Vazyme, Nanjing, China | NR605-01 | Konstrukcja biblioteki RNA-seq |
| System pletyzmografii całego ciała | Guangyuanda, Beijing, China | WBP-4 | Funkcja płuc (Penh) |
| Ksylen (stopień analityczny) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10023418 | Deparafinizacja i przejrzystość |
Bibliografia
- Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
- Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
- Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
- Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
- Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
- Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
- Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
- Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
- Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
- Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
- Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
- Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
- Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
- Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
- Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
- Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
- Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
- Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
- Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
- Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
- Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
- Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
- Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
- Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
- Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
- Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
- Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
- Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
- van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
- Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
- Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
- Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
- Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
- Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
- Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.