Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Znormalizowany protokół cytometrii przepływowej wielobarwnej do oceny choroby rezydualnej w ostrej białaczce

143 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71756

⸱

7 sierpnia 2026

1Department of Clinical Laboratory, The Second People's Hospital of Neijiang

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje standaryzowany wielokolorowy przepływ cytometrii przepływowej dla oceny pozostałej choroby w ostrej białaczce, integrując kontrolowane przetwarzanie próbek, skonsolidowane parametry pozyskiwania, sekwencyjne strategie bramkowań oraz interpretację skorygowaną względem mianownika, aby poprawić analityczną reprodykowalność w rutynowych laboratoriach klinicznych.

Streszczenie

Choroba rezydualna wykrywalna (MRD) jest ważnym wskaźnikiem prognostycznym w leczeniu ostrej białaczki. Jednak rutynowa ocena wielokolorowa cytometrią przepływową (MFC) pozostaje podatna na zmienności przed analityczną i analityczną, w tym hemodilucję, niespójną głębokość nabywania oraz subiektywną interpretację. Ten artykuł przedstawia standaryzowany proces operacyjny dla rutynowej oceny MRD w ostrym białaczku limfoblastycznym limfocytów B (B-ALL) i ostrym białaczku szpikowym (AML). Protokół zawiera rygorystyczne kryteria akceptacji próbek, ze zintegrowaną oceną hemodilucji i stosuje metodę masowej lizy krwinek czerwonych dla próbek szpiku kostnego i krwi obwodowej. Standardyzacja analityczna osiągana jest poprzez chorobowo specyficzne panele przeciwciał ośmiokolorowe z dwóch probówek, zharmonizowane cele nabywania wymagające co najmniej 500 000 zdarzeń CD45-dodatnich oraz sztywne sekwencyjne strategie bramek. Ponadto, proces stosuje dostosowanie granic wykrywalności (LOD) i ilościowania (LOQ) względem mianownika, aby wspierać obiektywny trójpoziomowy system raportowania. Walidacja na 197 klinicznych próbkach wykazała mocną powtarzalność, solidną liniowość rozcieńczania i wysoką zgodność z powiązanymi ortogonalnymi badaniami molekularnymi. W sumie, ten protokół zapewnia praktyczną ramę dla standaryzowanego monitorowania MRD. dla standaryzowanego monitorowania MRD w rutynowych laboratoriach klinicznych poprzez integrację kontrolowanego przetwarzania przed-analitycznego i zharmonizowanych parametrów analitycznych.

Wprowadzenie

Nawet po osiągnięciu remisji morfologicznej, pacjenci z ostrą białaczką wymagają ciągłego monitorowania w kierunku mierzalnej choroby resztkowej (MRD), aby dokładnie ocenić ryzyko nawrotu. Konwencjonalne badania morfologiczne i cytopatologiczne nie posiadają czułości niezbędnej do wykrycia nisko licznych resztkowych populacji białaczkowych. W konsekwencji ocena MRD stała się niezbędnym elementem monitorowania choroby zarówno w ostrej białaczce szpiczastej (AML), jak i ostrej białaczce limfoblastycznej z komórek B (B-ALL). Niedawne zalecenia European LeukemiaNet podkreślają, że wiarygodna ocena MRD w AML zależy od standaryzacji technicznej i odtwarzalności międzyobserwatorowej, a nie od samej dostępności testu1,2. W przypadku B-ALL wielokolorowa cytometria przepływowa (MFC) pozostaje szczególnie istotna dla pacjentów bez stabilnych celów molekularnych. Poprzednie badania wykazały, że standaryzowane podejścia wielokolorowej cytometrii przepływowej z wykorzystaniem ustrukturyzowanych paneli przeciwciał mogą zapewnić odtwarzalne i czułe wykrywanie choroby resztkowej3. Cytometria przepływowa jest szeroko stosowana ze względu na jej szerokie zastosowanie, krótki czas oczekiwania na wynik oraz efektywność kosztową. Wydajność testu pozostaje w wysokim stopniu zależna od standaryzowanego przygotowania próbek, parametrów akwizycji i interpretacji danych4.

Jednym z głównych wyzwań technicznych w ocenie MRD metodą cytometrii przepływowej jest detekcja rzadkich zdarzeń, na którą silny wpływ mają głębokość akwizycji oraz całkowita liczba zdarzeń. Identyczne panele przeciwciał mogą wykazywać różną czułość analityczną, jeśli próbki są pozyskiwane przy niespójnej liczbie zdarzeń całkowitych (mianowniku)5. Standaryzacja wykracza zatem poza sam dobór przeciwciał i wymaga zharmonizowanego przygotowania próbek, masowej lizy erytrocytów, kompensacji instrumentu, celów akwizycyjnych oraz strategii bramkowania. W przypadku próbek szpiku kostnego istotną zmienną przedanalityczną jest hemodylucja, ponieważ zanieczyszczenie krwią obwodową może sztucznie obniżyć pozorne obciążenie leukemiczne6,7. Ponadto interpretacja zdarzeń o niskiej częstotliwości wymaga jasno określonych progów raportowania opartych na specyficznej dla danej próbki głębokości akwizycji. Niedawne badania podkreśliły znaczenie granic detekcji (LOD) i kwantyfikacji (LOQ) skorygowanych o liczbę zdarzeń całkowitych w celu poprawy spójności interpretacji MRD w cytometrii przepływowej8.

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie zestandaryzowanego schematu postępowania w rutynowej ocenie MRD w oparciu o MFC w przypadku B-ALL i AML. Protokół integruje kryteria akceptacji próbek, ocenę hemodylucji, projekt paneli przeciwciał specyficznych dla danej choroby, przygotowanie próbek z liza masowa, zharmonizowane cele akwizycji, stałe sekwencyjne strategie bramkowania oraz kryteria raportowania skorygowane o mianownik w ramach jednej struktury operacyjnej9,10. Dzięki połączeniu zestandaryzowanych procedur przedanalitycznych i analitycznych metoda ta zapewnia praktyczne i powtarzalne podejście do rutynowego wdrożenia monitorowania MRD w laboratorium klinicznym. Rysunek 1 ilustruje ogólny zestandaryzowany schemat postępowania przedanalitycznego i analitycznego wdrożony w niniejszym badaniu. Tabela 1 podsumowuje charakterystykę kohorty i próbek pacjentów z ostrą limfoblastyczną białaczką B-komórkową (B-ALL) oraz ostrą białaczką szpikową (AML) włączonych w okresie walidacji w ramach zdefiniowanych okien monitorowania (koniec indukcji, konsolidacja i przed HSCT).

Rutynowe schematy oceny MRD: Schemat blokowy przetwarzania próbek i ścieżek testowych.
Rysunek 1: Standaryzowany schemat rutynowej wielobarwnej oceny MRD metodą cytometrii przepływowej. (A) Schemat przedanalityczny przedstawiający przesiew próbek i ocenę jakości w zdefiniowanych odstępach czasu monitorowania. (B) Schemat analityczny od masowej lizy erytrocytów i barwienia przeciwciałami, poprzez sekwencyjne bramkowanie, interpretację skorygowaną o mianownik, aż po końcowe raportowanie MRD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Zbiorcze dane demograficzne pacjentów, charakterystyka próbek klinicznych i rutynowe parametry pozyskiwania danych. Ta jedna zrewidowana tabela podsumowuje wyjściowe cechy kliniczne objętej badaniem kohorty obejmującej przypadki ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek B (B-ALL) oraz ostrej białaczki szpikowej (AML) i łączy dane demograficzne na poziomie pacjenta z charakterystyką próbek, odstępami w monitorowaniu leczenia, żywotnością, wskaźnikami hemodylucji, głębokością sekwencjonowania oraz klasyfikacjami minimalnej choroby resztkowej skorygowane o mianownik. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem próbek ludzkich zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Komisję Etyki Drugiego Szpitala Ludowego w Neijiang (numer zatwierdzenia PXTS887192). W badaniu wykorzystano zanonimizowane pozostałości próbek klinicznych pozyskane po rutynowych badaniach diagnostycznych. Zrezygnowano z uzyskania świadomej zgody, ponieważ badanie nie wpływało na opiekę nad pacjentem, przydział leczenia ani procedury pobierania próbek. Odczynniki chemiczne, substancje i sprzęt użyte w protokole są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Pobieranie próbek i ocena przedanalityczna

  1. W celu oceny minimalnej choroby resztkowej (MRD) jako preferowany typ materiału należy pobierać aspiraty szpiku kostnego. Próbek krwi obwodowej należy używać wyłącznie w przypadkach, gdy aspiracja szpiku jest klinicznie przeciwwskazana lub podczas wybranych analiz nadzorujących i porównawczych.
  2. Materiał ze szpiku kostnego należy pobrać podczas pierwszego zasysania aspiratu, jeśli to możliwe. Należy unikać kolejnych zasysania w celu zminimalizowania kontaminacji krwią obwodową i niedoszacowania niskiego poziomu choroby resztkowej.
  3. Bezpośrednio po pobraniu należy przenieść próbki do probówek z antykoagulantem w postaci etylenediaminotetraoctanu dipotasu (K2-EDTA) lub heparyny sodowej. Próbki należy przechowywać i transportować w temperaturze pokojowej (18–25 °C), chroniąc je przed bezpośrednim działaniem promieni słonecznych.
    OSTRZEŻENIE: Nie chłodzić próbek w lodówce.
  4. Wszystkie próbki należy przetworzyć w ciągu 24 h od pobrania. Na potrzeby badań stabilności należy zachować aliquoty do ponownej analizy po 24 h i 48 h, zachowując warunki przechowywania w temperaturze pokojowej.
  5. Przy odbiorze próbki należy zweryfikować identyfikator pacjenta, rodzaj antykoagulanta, integralność próbki oraz czas pobrania. Należy odrzucić próbki wykazujące rozległe krzepnięcie, silną hemolizę lub wyraźną degenerację komórkową.
  6. Przed ostateczną interpretacją należy ocenić stopień hemodylucji próbek szpiku kostnego. Należy obliczyć półilościowy wskaźnik hemodylucji w zakresie od 0,00 do 1,00, aby oszacować stopień kontaminacji krwią obwodową.
  7. Wartość tę wyznacza się poprzez podzielenie proporcji dojrzałych limfocytów przez sumę progenitorów CD34-dodatnich, niedojrzałych granulocytów i dojrzałych limfocytów; wyższy iloraz wskazuje na większy efekt rozcieńczenia.
    UWAGA: Wskaźnik należy obliczyć zgodnie z poniższym wzorem:
      Równanie do obliczenia wskaźnika hemodylucji; formuła obejmuje procenty limfocytów i progenitorów.
    gdzie wyższy wynik oznacza większą kontaminację krwią obwodową.
  8. Wskaźniki hemodylucji klasyfikuje się następująco: <0,20 – akceptowalne; 0,20–0,39 – lekko hemodyluowane; oraz ≥0,40 – istotnie hemodyluowane.
    UWAGA: W przypadku próbek istotnie hemodyluowanych nie należy formułować definitywnej interpretacji MRD-ujemnej, chyba że potwierdzono odpowiednią wielkość mianownika i zachowanie architektury prekursorów szpiku.

2. Przygotowanie panelu przeciwciał specyficznych dla danej choroby

  1. Przygotuj zestandaryzowane, specyficzne dla danej choroby dwuprobówkowe, ośmiokolorowe panele przeciwciał do analizy B-ALL i AML. Standaryzację paneli osiągnięto poprzez ścisłe przestrzeganie stałych markerów szkieletowych (backbone) we wszystkich probówkach w celu stabilnego wyznaczania bramkowania populacji.
  2. Stosuj spójne koniugaty fluorochromów dla odpowiadających im antygenów linii komórkowych i ściśle przestrzegaj zalecanych przez producenta objętości miareczkowania, aby zminimalizować zmienność fluorescencji między partiami.
  3. Kombinacje markerów, przypisania fluorochromów, klony przeciwciał, objętości barwienia oraz parametry akwizycji znajdują się w Tabeli uzupełniającej 1.
  4. W przypadku oceny B-ALL, w obu probówkach zastosuj CD19, CD45, CD34, CD10 i CD20 jako markery szkieletowe w celu zdefiniowania populacji prekursorowych i wzorców dojrzewania. Do probówki 1 dodaj CD38, CD58 i CD81.
  5. Do probówki 2 dodaj CD66c, CD123 oraz CD73 lub CD304, zgodnie z immunofenotypem związanym z białaczką diagnostyczną ustalonym podczas oceny wyjściowej.
  6. W przypadku oceny AML, w obu probówkach zastosuj CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 i HLA-DR jako markery szkieletowe w celu zdefiniowania blastów i niedojrzałych populacji mieloidalnych.
  7. Do probówki 1 dodaj CD7 i CD56 w celu oceny ekspresji antygenów między liniami. Do probówki 2 dodaj CD11b i CD15 w celu oceny nieprawidłowości dojrzewania mieloidalnego.

3. Przygotowanie do lizy masowej i barwienie

  1. Przenieś 2,0 mL dobrze wymieszanego materiału z szpiku kostnego lub krwi obwodowej do 15 mL polipropylenowej probówki. W przypadku ograniczonej objętości materiału, użyj minimalnej objętości wejściowej wynoszącej 1,0 mL.
  2. Dodaj do materiału 10 mL podgrzanego buforu lizującego z chlorkiem amonu. Inkubuj zawiesinę przez 10 min w temperaturze pokojowej w celu lizy krwinek czerwonych.
  3. Odwiruj materiał przy 500 × g przez 5 min. Ostrożnie odlej supernatant, nie naruszając granulatu komórek jądrzastych.
  4. Resuspenduj granulat w 2 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) zawierającej 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Powtórz etap płukania raz, jeśli nadal widoczne jest zanieczyszczenie resztkową hemoglobiną.
  5. Wyznacz stężenie komórek jądrzastych za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego lub ręcznego liczenia w komorze hemocytometrycznej z wykluczeniem błękitu trypanu. Za optymalne dla standardowej akwizycji uznaje się minimalne stężenie komórek jądrzastych na poziomie 5 × 106 komórek/mL.
    UWAGA: Jeśli wydajność komórkowa spadnie poniżej tego progu, zagęść materiał poprzez dodatkowe wirowanie przy 500 × g przez 5 min i ostrożnie zmniejsz objętość buforu do resuspensji, aby zmaksymalizować gęstość komórkową.
  6. Odlicz 5 × 106 komórek jądrzastych na probówkę do rutynowego barwienia. W przypadku wysokiej czułości analizy, jeśli odzysk materiału na to pozwala, zwiększ ilość wejściową do maksymalnie 1 × 107 komórek na probówkę6,7.
  7. Do każdej probówki dodaj indywidualnie mianowany koktajl przeciwciał oraz utrwalany barwnik żywotności określony w Tabeli Materiałów, zgodnie z zatwierdzoną konfiguracją panelu barwienia. Standardowy zatwierdzony panel wykorzystuje 5 µL na przeciwciało sprzężone z fluorochromem, chyba że mianowanie zalecane przez producenta wskazuje inną objętość specyficzną dla danego przeciwciała.
  8. Upewnij się, że końcowa objętość reakcji barwienia jest ściśle utrzymana na poziomie 100 µL na test, aby zachować optymalną stechiometrię przeciwciała do antygenu. Inkubuj materiały przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Przepłucz raz zbarwione komórki, używając buforu płuczącego, i resuspenduj końcowy granulat w 500 µL buforu do akwizycji.
  10. Przygotuj kontrolne próbki jednobarwne do kompensacji, używając kulek kompensacyjnych w tym samym dniu, w którym odbywa się akwizycja materiału.

4. Konfiguracja instrumentu i akwizycja danych

  1. Przed analizą próbek pacjentów należy przeprowadzić codzienną kontrolę jakości rozruchu cytometru przepływowego. Zgodnie z instrukcjami producenta należy zweryfikować układ hydrauliczny, wyrównanie laserów, sprawność detektorów oraz wartości docelowe fluorescencji przy użyciu kulek kalibracyjnych.
  2. Należy przygotować kontrolki kompensacyjne z pojedynczym barwieniem, używając tych samych fluorochromów, które znajdują się w panelach przeciwciał. Przed analizą próbek pacjentów należy dostosować macierz kompensacyjną i potwierdzić, że markery bazowe pozostają w zdefiniowanych zakresach docelowych fluorescencji.
  3. Dla wszystkich próbek analizowanych w okresie walidacji należy stosować ten sam szablon akwizycji, ustawienia detektorów, strategię kompensacji oraz hierarchię bramowania.
    UWAGA: Aby zapewnić właściwą harmonizację między instrumentami, należy ustalić zestandaryzowane docelowe wartości mediany intensywności fluorescencji (MFI) dla wszystkich detektorów przy użyciu specjalistycznych kulek kalibracyjnych oraz potwierdzić, że identyczne próbki dają porównywalne profile fluorescencji na różnych platformach przed rozpoczęciem akwizycji danych klinicznych.
  4. Dane należy pozyskiwać przy niskim lub umiarkowanym przepływie, aby zredukować liczbę zdarzeń koincydentnych i zachować dokładność wykrywania rzadkich zdarzeń. Należy stale monitorować szybkość zdarzeń podczas akwizycji.
  5. Dla każdego raportowanego wyniku MRD należy pozyskać co najmniej 500 000 zdarzeń jądrzastych CD45-dodatnich. Jeśli jakość preparatu i stabilność zdarzeń na to pozwalają, należy rozszerzyć akwizycję do 1,0–1,5 miliona zdarzeń całkowitych, szczególnie w przypadku podejrzenia niskiego poziomu choroby resztkowej.
  6. Należy wstrzymać lub przerwać akwizycję w przypadku wystąpienia niestabilności hydraulicznej, zatorów w próbce, gwałtownych zmian szybkości zdarzeń lub widocznego pogorszenia jakości rozproszenia. W razie potrzeby należy ponownie przefiltrować lub wymieszać preparat i ponownie przeprowadzić akwizycję próbki dopiero po przywróceniu stabilnego przepływu.

5. Sekwencyjne bramkowanie i interpretacja z korektą mianownika

  1. Przeanalizuj dane z cytometrii przepływowej przy użyciu zwalidowanego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. Zastosuj tę samą sekwencyjną strategię bramkowania dla wszystkich próbek, aby zredukować zmienność międzyoperatorową.
  2. Ustal wzorce dojrzewania prawidłowego i regeneracyjnego poprzez niezależne pozyskanie i analizę banku referencyjnego z co najmniej 20 próbek prawidłowego lub regenerującego szpiku kostnego, które posłużą jako szablony ekspresji podstawowej.
  3. Wyklucz debris, korzystając z parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter) i rozproszenia bocznego (side scatter). Wyizoluj pojedyncze komórki, stosując bramkowanie pola rozproszenia w przód versus wysokości rozproszenia w przód.
  4. Wyklucz komórki nieżywe, korzystając z bramy dla barwnika żywotności wymienionego w tabeli materiałów. Rutynowo eliminuj te nieżywe komórki, ponieważ wykazują one niespecyficzne wiązanie przeciwciał i mogą sztucznie podwyższać szum tła lub imitować rzadkie populacje aberrantne.
    UWAGA: Wymagany jest minimalny próg żywotności na poziomie 75% dla optymalnej analizy w dalszych etapach; należy pamiętać, że próbki o wartości poniżej tego progu wymagają ostrożnej interpretacji pod kątem potencjalnych artefaktów rzadkich zdarzeń. Zdefiniuj mianownik leukocytów poprzez bramkowanie żywych zdarzeń CD45-dodatnich o odpowiednich charakterystykach rozproszenia bocznego.
  5. W przypadku próbek B-ALL ogranicz analizę do przedkomórkowej frakcji CD19-dodatniej. Wdróż alternatywny schemat bramkowania dla pacjentów otrzymujących terapie celowane anty-CD19.
  6. Przenieś główną ocenę na frakcje CD22, CD24 lub CD34-dodatnie, aby uchwycić populację leukemiczną niezależnie od ekspresji CD19. Oceń wzorce dojrzewania CD34, CD10 i CD20 oraz zidentyfikuj populacje aberrantne, korzystając ze wzorców ekspresji CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123 oraz CD73 lub CD304.
  7. W przypadku próbek AML zdefiniuj region blastów lub prekursorów, korzystając z ekspresji CD45, rozproszenia bocznego, CD34 i CD117.
  8. Oceń aberrantną lub asynchroniczną ekspresję markerów mieloidalnych i przekreślnych, w tym CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b i CD15.
  9. Oblicz specyficzną dla próbki granicę detekcji (LOD) i granicę oznaczania (LOQ), przyjmując całkowitą liczbę pozyskanych żywych zdarzeń CD45-dodatnich jako mianownik: 
     równowaga statyczna, formuła LOD (%), diagram wyników, zdarzenia CD45-dodatnie, analiza cytometrii przepływowej
      formuła obliczania LOQ dla badania CD45, równanie matematyczne dla ilościowego oznaczenia eksperymentalnego.
  10. Zaklasyfikuj końcową interpretację MRD do jednej z trzech kategorii: MRD-dodatnia, poniżej LOD lub ograniczona analitycznie.
    1. Wynik określ jako MRD-dodatni, gdy wyraźna, ciągła grupa aberrantnych zdarzeń przekracza specyficzną dla próbki granicę LOD i wykazuje wewnętrznie spójny immunofenotyp odróżnialny od prawidłowych lub regenerujących populacji krwiotwórczych.
      UWAGA: Nie klasyfikuj rozproszonych, nietworzących grup zdarzeń jako MRD-dodatnich. Zastosuj zintegrowane podejście analityczne, łącząc immunofenotyp związany z białaczką (LAIP) śledzony z diagnostycznej próbki wyjściowej oraz strategie rozpoznawania wzorców różniących się od normy (DfN).
    2. Wynik określ jako poniżej LOD, gdy obecne są rzadkie podejrzane zdarzenia, ale nie osiągają one specyficznego dla próbki progu raportowania.
    3. Wynik określ jako ograniczony analitycznie, gdy wielkość mianownika jest niewystarczająca, występuje znaczne hemodilucja, jakość próbki jest słaba lub ograniczenia przedanalityczne bądź analityczne uniemożliwiają pewną interpretację negatywną.
  11. Wszystkie przypadki MRD-dodatnie i graniczne o niskim poziomie powinny zostać niezależnie zweryfikowane przez drugiego wykwalifikowanego analityka.
  12. Sfinalizuj interpretację cytometrii przepływowej przed przeanalizowaniem sparowanych danych z porównawczych badań molekularnych, w tym wyników ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub sekwencjonowania nowej generacji.  

6. Metodyka walidacji analitycznej

  1. Oceń powtarzalność analityczną, przygotowując podwójne alikwoty z tej samej zawiesiny komórkowej po lizie. Niezależnie pozyskaj i przeanalizuj co najmniej 30 par próbek.
  2. Oceń liniowość rozcieńczeń, przygotowując rozcieńczenia seryjne na sześciu poziomach w oczekiwanym zakresie niskiego obciążenia. Porównaj obserwowane wartości MRD z oczekiwanymi wartościami MRD w serii rozcieńczeń.
  3. Oceń odtwarzalność międzyoperatorową i międzyinstrumentalną, analizując próbki referencyjne przy udziale wielu wykwalifikowanych operatorów i zharmonizowanych cytometrów przepływowych.
  4. Przekształć procentowe wartości MRD uzyskane metodą cytometrii przepływowej i metodą molekularną za pomocą transformacji log10 przed porównaniem statystycznym. Oceń zgodność ilościową, stosując analizę korelacji oraz analizę Blanda-Altmana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystyka zbioru danych z rutynowej implementacji

W okresie badania 197 kolejnych próbek przeszło weryfikację kwalifikowalności oraz przedanalityczną ocenę jakości i weszło do etapu raportowania. Kohorta badawcza obejmowała 98 pacjentów, z czego 62 (63,3%) chorowało na ostrą białaczkę limfoblastyczną z predominance komórek B (B-ALL), a 36 (36,7%) na ostrą białaczkę szpikową (AML). Kohorta składała się z 64 mężczyzn (65,3%) i 34 kobiet (34,7%), przy średnim wieku 32 lata ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Głównym celem niniejszej pracy było ustalenie znormalizowanego przepływu pracy dla wielobarwnej cytometrii przepływowej oceny choroby resztkowej (MRD) w ostrej białaczce. Niezawodna ocena MRD zależy nie tylko od wyboru panelu przeciwciał, ale również od spójnego postępowania z próbkami, parametrów nabywania i interpretacji danych11. Wyniki tej pracy wykazują, że zharmonizowane przetwarzanie próbek, kontrolowana głębokość nabywania i kryteria raportowania dostosowane do mianownika mogą poprawić rep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.

Podziękowania

Autor dziękuje Działowi Laboratorium Klinicznego w Drugim Szpitalu Ludowym w Neijiang za zapewnienie obiektów laboratoryjnych i wsparcia technicznego dla tego badania. Autor wyraża również uznanie dla personelu laboratorium i personelu klinicznego za pomoc w przetwarzaniu próbek i zbieraniu danych. Na koniec autor dziękuje pacjentom, których resztkowe próbki kliniczne przyczyniły się do tej pracy. Badanie to nie otrzymało żadnego szczególnego finansowania ze środków publicznych, komercyjnych lub organizacji non-profit.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor akwizycjiPrzygotowane w laboratoriumPBS zawierające 0,5% BSA i 2 mM EDTA; końcowa objętość resuspendencji 500 µLOstatnia resuspendencja przed akwizycją cytometrią przepływową
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD117-APCBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 104D2; fluorochrom: APC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaWczesne zidentyfikowanie mieloidów/blastów
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD13-FITCBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: L138; fluorochrom: FITC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaKotwica linii mieloidowej
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD33-PEBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: P67.6; fluorochrom: PE; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaKotwica linii mieloidowej
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD34-PerCP-Cy5.5BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 8G12; fluorochrom: PerCP-Cy5.5; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaMarker niedojrzałości
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD45-APC-H7BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 2D1; fluorochrom: APC-H7; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaMarker szkieletu leukocytów i definicja mianownika
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD56-V500BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: NCAM16.2; fluorochrom: V500; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaFenotypowanie aberracyjnych blastów
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD7-V450BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: M-T701; fluorochrom: V450; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaWykrywanie aberracji międzyliniowych
AML Rurka 1 przeciwciało anty-HLA-DR-PE-Cy7BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: G46-6; fluorochrom: PE-Cy7; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaDyskryminacja dojrzewania i podtypów
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD117-APCBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 104D2; fluorochrom: APC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaWczesne zidentyfikowanie mieloidów/blastów
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD11b-V450BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: ICRF44; fluorochrom: V450; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaOcenianie niespójności dojrzewania
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD13-FITCBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: L138; fluorochrom: FITC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaKotwica linii mieloidowej
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD15-V500BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: HI98; fluorochrom: V500; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaOcenianie wzorca mieloidowego różnego od normalnego
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD33-PEBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: P67.6; fluorochrom: PE; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaKotwica linii mieloidowej
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD34-PerCP-Cy5.5BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 8G12; fluorochrom: PerCP-Cy5.5; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaMarker niedojrzałości
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD45-APC-H7BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 2D1; fluorochrom: APC-H7; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytula

Bibliografia

  1. Heuser M, et al. 2021 update on measurable residual disease in acute myeloid leukemia: A consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2021;138(26):2753–67.
  2. Cloos J, Heuser M, Freeman SD. 2025 update on MRD in acute myeloid leukemia: A consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2025;147(11):1147–64.
  3. Verbeek MWC, Lucio P, Szczepański T. Minimal residual disease assessment in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia by standardized next-generation flow cytometry. eJHaem. 2024;5(2):110–20.
  4. Virk H, Jain P, Sengar M. Flow cytometric MRD assessment in acute lymphoblastic leukemia: Practical advantages and interpretive considerations. Indian J Hematol Blood Transfus. 2023;39(3):350–62.
  5. Brando B. Rules in rare event acquisition: An overview. Cytometry B Clin Cytom. 2019;96(6):448–53.
  6. EuroFlow Consortium. Standardized EuroFlow Protocols [Internet]. EuroFlow; 2025. Available from: https://euroflow.org/protocols/ (accessed 2026 Jan 15).
  7. Tettero JM, Heidinga ME, Mocking TR. Impact of hemodilution on flow cytometry-based measurable residual disease assessment in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2024;38(2):297–305.
  8. Buccisano F, et al. Prognostic and therapeutic implications of measurable residual disease in acute myeloid leukemia. Blood. 2012;119(2):332–41.
  9. Schuurhuis GJ, Heuser M, Freeman S. Minimal/measurable residual disease in AML: A consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2018;131(12):1275–91.
  10. Terwijn M, van Putten WLJ, Kelder A. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: Data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 2013;31(31):3889–97.
  11. Smith AB, Jones CD. Computational models, and tools for future development in flow cytometry. Cancer Metastasis Rev. 2026;45(1):88–102.
  12. Jum’ah HA, Ali S, Hwang Y. Measurable residual disease analysis by flow cytometry: Assay validation and characterization of 385 consecutive cases of acute myeloid leukemia. Cancers. 2025;17(7):1155.
  13. Theunissen P, et al. Standardized EuroFlow flow cytometric method for B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL) MRD assessment. Blood. 2017;129(3):347–57.
  14. Haaksma LH, Mocking TR, Kelder A. Flow cytometric and molecular measurable residual disease in acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma. 2025;66(1):45–55.
  15. Das N, Yadav P, Seth T. Analytical appraisal of hematogones in B-ALL MRD assessment using multidimensional dot-plots by multiparametric flow cytometry: A critical review and update. Indian J Hematol Blood Transfus. 2024;40(1):12–24.
  16. Korkina YS, Popov AM, Tserenov DG. False-positive flow cytometric measurable residual disease in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Cytometry B Clin Cytom. 2024;106(2):120–31.
  17. Mocking TR, et al. Computational measurable residual disease assessment in acute myeloid leukemia: a retrospective validation in the HOVON-SAKK-132 trial. Leukemia. 2025;39(10):2559–62.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

MedycynaWydanie 234Wydanie 234Warto pustaWydanieB ALLAML
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.