Artykuł metodologiczny

Znormalizowany protokół cytometrii przepływowej wielobarwnej do oceny choroby rezydualnej w ostrej białaczce

DOI:

10.3791/71756

⸱

7 sierpnia 2026

1Department of Clinical Laboratory, The Second People's Hospital of Neijiang

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje standaryzowany wielokolorowy przepływ cytometrii przepływowej dla oceny pozostałej choroby w ostrej białaczce, integrując kontrolowane przetwarzanie próbek, skonsolidowane parametry pozyskiwania, sekwencyjne strategie bramkowań oraz interpretację skorygowaną względem mianownika, aby poprawić analityczną reprodykowalność w rutynowych laboratoriach klinicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba rezydualna wykrywalna (MRD) jest ważnym wskaźnikiem prognostycznym w leczeniu ostrej białaczki. Jednak rutynowa ocena wielokolorowa cytometrią przepływową (MFC) pozostaje podatna na zmienności przed analityczną i analityczną, w tym hemodilucję, niespójną głębokość nabywania oraz subiektywną interpretację. Ten artykuł przedstawia standaryzowany proces operacyjny dla rutynowej oceny MRD w ostrym białaczku limfoblastycznym limfocytów B (B-ALL) i ostrym białaczku szpikowym (AML). Protokół zawiera rygorystyczne kryteria akceptacji próbek, ze zintegrowaną oceną hemodilucji i stosuje metodę masowej lizy krwinek czerwonych dla próbek szpiku kostnego i krwi obwodowej. Standardyzacja analityczna osiągana jest poprzez chorobowo specyficzne panele przeciwciał ośmiokolorowe z dwóch probówek, zharmonizowane cele nabywania wymagające co najmniej 500 000 zdarzeń CD45-dodatnich oraz sztywne sekwencyjne strategie bramek. Ponadto, proces stosuje dostosowanie granic wykrywalności (LOD) i ilościowania (LOQ) względem mianownika, aby wspierać obiektywny trójpoziomowy system raportowania. Walidacja na 197 klinicznych próbkach wykazała mocną powtarzalność, solidną liniowość rozcieńczania i wysoką zgodność z powiązanymi ortogonalnymi badaniami molekularnymi. W sumie, ten protokół zapewnia praktyczną ramę dla standaryzowanego monitorowania MRD. dla standaryzowanego monitorowania MRD w rutynowych laboratoriach klinicznych poprzez integrację kontrolowanego przetwarzania przed-analitycznego i zharmonizowanych parametrów analitycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nawet po osiągnięciu remisji morfologicznej pacjenci z ostrą białaczką wymagają ciągłego monitorowania w kierunku minimalnej choroby resztkowej (MRD), aby dokładnie ocenić ryzyko nawrotu. Konwencjonalne badania morfologiczne i cytopatologiczne nie posiadają czułości wymaganej do wykrycia populacji białaczkowych o niskim poziomie resztkowym. W związku z tym ocena MRD stała się niezbędnym elementem monitorowania choroby zarówno w ostrej białaczce szpikowej (AML), jak i ostrej białaczce limfoblastycznej z komórek B (B-ALL). Niedawne zalecenia European LeukemiaNet podkreślają, że wiarygodna ocena MRD w AML zależy od standaryzacji technicznej i powtarzalności międzyobserwatorowej, a nie od samej dostępności testu1,2. W przypadku B-ALL wielokolorowa cytometria przepływowa (MFC) pozostaje szczególnie istotna dla pacjentów bez stabilnych celów molekularnych. Poprzednie badania wykazały, że zstandaryzowane podejścia w wielokolorowej cytometrii przepływowej z wykorzystaniem ustrukturyzowanych paneli przeciwciał mogą zapewnić powtarzalne i czułe wykrywanie choroby resztkowej3. Cytometria przepływowa jest szeroko stosowana ze względu na jej szerokie zastosowanie, krótki czas oczekiwania na wynik oraz efektywność kosztową. Sprawność testu pozostaje wysoce zależna od zstandaryzowanego przygotowania preparatów, parametrów akwizycji oraz interpretacji danych4.

Jednym z głównych wyzwań technicznych w ocenie MRD za pomocą cytometrii przepływowej jest wykrywanie rzadkich zdarzeń, co jest w dużym stopniu uzależnione od głębokości akwizycji i całkowitej liczby zdarzeń. Identyczne panele przeciwciał mogą wykazać różną czułość analityczną, jeśli próbki są pozyskiwane przy niespójnych liczbach mianownika5. Standaryzacja wykracza zatem poza sam wybór przeciwciał i wymaga zharmonizowanego przetwarzania próbek, masowej lizy czerwonych krwinek, kompensacji instrumentu, celów akwizycji oraz strategii bramkowania. W przypadku próbek szpiku kostnego istotną zmienną przedanalityczną jest również hemodylucja, ponieważ zanieczyszczenie krwią obwodową może sztucznie obniżyć widoczne obciążenie leukemiczne6,7. Ponadto interpretacja zdarzeń o niskiej częstotliwości wymaga jasno określonych progów raportowania opartych na specyficznej dla próbki głębokości akwizycji. Niedawne badania podkreśliły znaczenie granic wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ) skorygowanych o mianownik w celu poprawy spójności interpretacji MRD w cytometrii przepływowej8.

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zapewnienie ustandaryzowanego schematu postępowania dla rutynowej oceny MRD w oparciu o MFC w przypadku B-ALL i AML. Protokół integruje kryteria akceptacji próbek, ocenę hemodylucji, projekt paneli przeciwciał specyficznych dla danej choroby, przygotowanie próbek z lizie masowej, zharmonizowane cele akwizycji, stałe sekwencyjne strategie bramkowania oraz kryteria raportowania skorygowane o mianownik w ramach jednej ramy operacyjnej9,10. Dzięki połączeniu ustandaryzowanych procedur przedanalitycznych i analitycznych metoda ta zapewnia praktyczne i powtarzalne podejście do rutynowego wdrożenia monitorowania MRD w laboratorium klinicznym. Rycina 1 przedstawia ogólny ustandaryzowany schemat postępowania przedanalitycznego i analitycznego wdrożony w niniejszym badaniu. Tabela 1 podsumowuje charakterystykę kohorty i próbek pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek B (B-ALL) i ostrą białaczką szpikową (AML) włączonych w okresie walidacji w ramach zdefiniowanych okien monitorowania (koniec indukcji, konsolidacja oraz przed HSCT).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Standaryzowany schemat rutynowej wielobarwnej oceny MRD metodą cytometrii przepływowej. (A) Schemat przedanalityczny przedstawiający przesiew próbek i ocenę jakości w określonych przedziałach monitorowania. (B) Schemat analityczny od masowej lizy erytrocytów i barwienia przeciwciałami, przez sekwencyjne bramkowanie (gating), interpretację z korektą mianownika, aż po końcowe raportowanie MRD. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Tabela 1: Skonsolidowane dane demograficzne pacjentów, charakterystyka próbek klinicznych i rutynowe wskaźniki pozyskiwania danych. Ta jedna zrewidowana tabela podsumowuje podstawowe cechy kliniczne włączonej kohorty, obejmującej przypadki ostrej białaczki limfoblastycznej typu B (B-ALL) oraz ostrej białaczki szpikowej (AML), i łączy dane demograficzne na poziomie pacjenta z charakterystyką próbek, interwałami monitorowania leczenia, żywotnością, wskaźnikami hemodilucji, głębokością sekwencjonowania oraz klasyfikacjami minimalnej choroby resztkowej skorygowanymi o mianownik. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury obejmujące próbki ludzkie były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Drugiego Szpitala Ludowego w Neijiang (Numer zatwierdzenia PXTS887192). W badaniu wykorzystano zanonimizowane resztkowe próbki kliniczne pozyskane po rutynowych badaniach diagnostycznych. Zrezygnowano z wymogu uzyskania świadomej zgody, ponieważ badanie nie miało wpływu na opiekę nad pacjentem, przydział leczenia ani procedury pobierania próbek. Odczynniki chemiczne, reagenty i sprzęt użyte w protokole wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Pobieranie próbek i ocena przedanalityczna

  1. Pobierz aspiraty szpiku kostnego jako preferowany typ materiału do oceny minimalnej choroby resztkowej (MRD). Próbki krwi obwodowej stosuj wyłącznie w przypadkach, gdy aspiracja szpiku jest przeciwwskazana klinicznie lub podczas wybranych analiz nadzorczych i porównawczych.
  2. Pobierz materiał ze szpiku kostnego podczas pierwszego zasysania aspiratu, jeśli to możliwe. Unikaj kolejnych zasysań, aby zminimalizować zanieczyszczenie krwią obwodową i uniknąć niedoszacowania niskiego poziomu choroby resztkowej.
  3. Przenieś materiały do probówek z antykoagulantem w postaci etylenodiaminotetraoctanu dipotasu (K2-EDTA) lub heparyny sodowej natychmiast po pobraniu. Przechowuj i transportuj materiały w temperaturze pokojowej (18–25 °C), chroniąc je przed bezpośrednim światłem słonecznym.
    OSTRZEŻENIE: Nie chłodzić materiałów w lodówce.
  4. Przetwórz wszystkie próbki w ciągu 24 h od pobrania. W badaniach stabilności zachowaj alikwoty do powtórnej analizy po 24 h i 48 h, utrzymując warunki przechowywania w temperaturze pokojowej.
  5. Po otrzymaniu materiału zweryfikuj identyfikator pacjenta, rodzaj antykoagulantu, integralność próbki oraz czas pobrania. Odrzuć próbki wykazujące rozległe skrzepy, silną hemolizę lub wyraźną degenerację komórkową.
  6. Oceń próbki szpiku kostnego pod kątem hemodylucji przed końcową interpretacją. Oblicz półilościowy wskaźnik hemodylucji w zakresie od 0,00 do 1,00, aby oszacować zanieczyszczenie krwią obwodową.
  7. Wyznacz tę wartość, dzieląc proporcję dojrzałych limfocytów przez sumę progenitorów CD34-dodatnich, niedojrzałych granulocytów i dojrzałych limfocytów, gdzie wyższy iloraz wskazuje na większy efekt rozcieńczenia.
    UWAGA: Oblicz wskaźnik, korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-1
    gdzie wyższy wynik wskazuje na większe zanieczyszczenie krwią obwodową.
  8. Klasyfikuj wyniki hemodylucji w następujący sposób: <0,20 – akceptowalne; 0,20–0,39 – lekko hemodyluowane; oraz ≥0,40 – znacznie hemodyluowane.
    UWAGA: Nie przypisuj definitywnej interpretacji MRD-ujemnej próbkom znacznie hemodyluowanym, chyba że potwierdzono odpowiednią wielkość mianownika i zachowanie architektury prekursorów szpiku.

2. Przygotowanie panelu przeciwciał specyficznych dla choroby

  1. Przygotuj zestandaryzowane, specyficzne dla danej choroby dwuprobówkowe, ośmiokolorowe panele przeciwciał do analizy B-ALL i AML. Standaryzację paneli osiągnij poprzez ścisłe przestrzeganie stałych markerów szkieletowych we wszystkich probówkach w celu stabilnego bramowania populacji.
  2. Stosuj spójne konjugaty fluorochromów dla odpowiadających im antygenów linii komórkowych i ściśle przestrzegaj zalecanych przez producenta objętości miareczkowania, aby zminimalizować zmienność fluorescencji między partiami.
  3. Kombinacje markerów, przypisania fluorochromów, klony przeciwciał, objętości barwienia oraz parametry akwizycji znajdują się w Tabeli uzupełniającej 1.
  4. Do oceny B-ALL wykorzystaj CD19, CD45, CD34, CD10 i CD20 jako markery szkieletowe w obu probówkach, aby zdefiniować populacje prekursorowe i wzorce dojrzewania. Do probówki 1 dodaj CD38, CD58 i CD81.
  5. Do probówki 2 dodaj CD66c, CD123 oraz CD73 lub CD304, zgodnie z diagnostycznym immunofenotypem związanym z białaczką ustalonym podczas oceny wyjściowej.
  6. Do oceny AML wykorzystaj CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 i HLA-DR jako markery szkieletowe w obu probówkach, aby zdefiniować blasty i niedojrzałe populacje mieloidalne.
  7. Do probówki 1 dodaj CD7 i CD56 w celu oceny ekspresji antygenów międzyliniowych. Do probówki 2 dodaj CD11b i CD15 w celu oceny nieprawidłowości dojrzewania mieloidalnego.

3. Przygotowanie lizatu masowego i barwienie

  1. Przenieś 2,0 mL dobrze wymieszanej próbki szpiku kostnego lub krwi obwodowej do polipropylenowej probówki o pojemności 15 mL. W przypadku ograniczonej objętości próbki zastosuj minimalną objętość wejściową 1,0 mL.
  2. Dodaj do próbki 10 mL uprzednio ogrzanego buforu lizującego z chlorkiem amonu. Inkubuj zawiesinę przez 10 min w temperaturze pokojowej, aby zlizować erytrocyty.
  3. Wirowaj próbkę przy 500 × g przez 5 min. Ostrożnie odlej nadsącz, nie naruszając osadu komórek zjądrzastych.
  4. Resuspenduj osad w 2 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) zawierającego 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Powtórz etap płukania raz, jeśli nadal widoczne jest zanieczyszczenie resztkową hemoglobiną.
  5. Określ stężenie komórek zjądrzastych za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego lub ręcznego liczenia w komorze Bürkera z zastosowaniem wykluczania błękitem trypanu. Przyjmij minimalne stężenie komórek zjądrzastych 5 × 106 komórek/mL jako optymalne dla standardowej akwizycji.
    UWAGA: Jeśli uzyskana liczba komórek spadnie poniżej tego progu, zagęść próbkę poprzez dodatkowe wirowanie przy 500 × g przez 5 min i ostrożnie zmniejsz objętość buforu do resuspensji, aby zmaksymalizować gęstość komórkową.
  6. Odlicz alikwoty zawierające 5 × 106 komórek zjądrzastych na probówkę dla rutynowego barwienia. Zwiększ ilość wejściową do maksymalnie 1 × 107 komórek na probówkę dla analizy o wysokiej czułości, o ile pozwala na to odzysk próbki6,7.
  7. Do każdej probówki dodaj indywidualnie mianowany koktajl przeciwciał oraz stabilny barwnik żywotności określone w Tabeli Materiałów, zgodnie z zatwierdzoną konfiguracją panelu barwienia. W rutynowym zatwierdzonym panelu stosuje się 5 µL na przeciwciało sprzężone z fluorochromem, chyba że mianowanie zalecane przez producenta wskazuje inną objętość specyficzną dla danego przeciwciała.
  8. Upewnij się, że końcowa objętość reakcji barwienia jest ściśle utrzymywana na poziomie 100 µL na test, aby zachować optymalną stechiometrię przeciwciało-antygen. Inkubuj próbki przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Przepłucz zabarwione komórki raz, używając buforu do płukania, a końcowy osad resuspenduj w 500 µL buforu do akwizycji.
  10. Przygotuj kontrole kompensacji pojedynczo barwione z użyciem kulek kompensacyjnych w tym samym dniu, w którym odbywa się akwizycja próbek.

4. Konfiguracja urządzenia i akwizycja danych

  1. Przed analizą próbek pacjentów należy przeprowadzić codzienną kontrolę jakości rozruchu cytometru przepływowego. Zgodnie z instrukcjami producenta należy zweryfikować układ hydrauliczny, wyrównanie laserów, wydajność detektorów oraz wartości docelowe fluorescencji przy użyciu kulek kalibracyjnych.
  2. Przygotować kontrolki kompensacyjne barwione pojedynczo, używając tych samych fluorochromów, które znajdują się w panelach przeciwciał. Przed analizą próbek pacjentów należy dostosować macierz kompensacji i potwierdzić, że markery podstawowe pozostają w zdefiniowanych zakresach docelowych fluorescencji.
  3. Dla wszystkich próbek analizowanych w okresie walidacji należy stosować ten sam szablon akwizycji, ustawienia detektorów, strategię kompensacji oraz hierarchię bramkowania.
    UWAGA: Aby zapewnić właściwą harmonizację między instrumentami, należy ustalić ustandaryzowane docelowe wartości mediany intensywności fluorescencji dla wszystkich detektorów przy użyciu specjalistycznych kulek kalibracyjnych oraz potwierdzić, że identyczne próbki dają porównywalne profile fluorescencji na różnych platformach przed rozpoczęciem akwizycji danych klinicznych.
  4. Dane należy pozyskiwać przy niskim lub umiarkowanym przepływie, aby zredukować liczbę zdarzeń koincydencyjnych i zachować dokładność wykrywania rzadkich zdarzeń. Prędkość przepływu zdarzeń należy monitorować w sposób ciągły podczas akwizycji.
  5. Dla każdego raportowanego wyniku MRD należy pozyskać co najmniej 500 000 zdarzeń jądrzastych CD45-dodatnich. Jeśli jakość próbki i stabilność zdarzeń na to pozwalają, należy rozszerzyć akwizycję do 1,0–1,5 miliona całkowitych zdarzeń, szczególnie w przypadku podejrzenia niskiego poziomu choroby resztkowej.
  6. Należy wstrzymać lub przerwać akwizycję w przypadku niestabilności hydraulicznej, zatkania próbki, gwałtownych zmian w tempie zdarzeń lub widocznego pogorszenia jakości rozproszenia. W razie potrzeby należy ponownie przefiltrować lub wymieszać próbkę, a następnie powtórzyć akwizycję dopiero po przywróceniu stabilnego przepływu.

5. Sekwencyjne bramkowanie i interpretacja z korektą mianownika

  1. Analizę danych z cytometrii przepływowej należy przeprowadzić przy użyciu zwalidowanego oprogramowania do analizy cytometrycznej. Aby zredukować zmienność międzyoperatorową, dla wszystkich próbek należy zastosować tę samą sekwencyjną strategię bramkowania.
  2. Wzorce dojrzewania prawidłowego i regeneracyjnego należy ustalić poprzez niezależne pozyskanie i analizę banku referencyjnego składającego się z co najmniej 20 próbek prawidłowego lub regenerującego szpiku kostnego, które będą służyć jako szablony ekspresji bazowej.
  3. Za pomocą parametrów rozproszonego światła przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter) należy wykluczyć zanieczyszczenia. Pojedyncze komórki należy izolować, stosując bramkowanie powierzchni rozproszenia przedniego versus wysokości rozproszenia przedniego.
  4. Komórki nieżywe należy wykluczyć za pomocą bramki dla barwnika żywotności wymienionego w tabeli materiałów. Komórki nieżywe należy rutynowo eliminować, ponieważ wykazują one nieswoiste wiązanie przeciwciał i mogą sztucznie podnosić szum tła lub imitować rzadkie populacje aberrantne.
    UWAGA: Dla optymalnej analizy w dalszych etapach wymagany jest próg żywotności na poziomie minimum 75%; należy pamiętać, że próbki poniżej tej wartości wymagają ostrożnej interpretacji ze względu na potencjalne artefakty rzadkich zdarzeń. Mianownik leukocytów należy zdefiniować poprzez bramkowanie żywotnych zdarzeń CD45-dodatnich o odpowiednich charakterystykach rozproszenia bocznego.
  5. W przypadku próbek B-ALL analizę należy ograniczyć do przedkomórkowej puli CD19-dodatniej. Dla pacjentów otrzymujących terapie celowane przeciwko CD19 należy zastosować alternatywny schemat bramkowania.
  6. Główną ocenę należy przenieść na pulle CD22-dodatnie, CD24-dodatnie lub CD34-dodatnie, aby uchwycić populację leukemiczną niezależnie od ekspresji CD19. Należy ocenić wzorce dojrzewania CD34, CD10 i CD20 oraz zidentyfikować populacje aberrantne, wykorzystując wzorce ekspresji CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123 oraz CD73 lub CD304.
  7. W przypadku próbek AML obszar blastów lub przedkomórek należy zdefiniować za pomocą ekspresji CD45, rozproszenia bocznego, CD34 i CD117.
  8. Należy ocenić aberrantną lub asynchroniczną ekspresję markerów mieloidalnych i międzylinearnych, w tym CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b i CD15.
  9. Granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) dla konkretnej próbki należy obliczyć, przyjmując całkowitą liczbę pozyskanych żywotnych zdarzeń CD45-dodatnich jako mianownik: 
     figure-protocol-2
      figure-protocol-3
  10. Końcową interpretację MRD należy zaklasyfikować do jednej z trzech kategorii: MRD-dodatnia, poniżej LOD lub ograniczenie analityczne.
    1. Wynik uznaje się za MRD-dodatni, gdy wyraźna, ciągła grupa zdarzeń aberrantnych przekracza LOD specyficzne dla próbki i wykazuje wewnętrznie spójny immunofenotyp odróżnialny od prawidłowych lub regenerujących populacji krwiotwórczych.
      UWAGA: Rozproszonych, niezgrupowanych zdarzeń nie należy klasyfikować jako MRD-dodatnich. Należy stosować zintegrowane podejście analityczne, łączące immunofenotyp związany z białaczką (LAIP) śledzony od diagnostycznej próbki bazowej oraz strategie rozpoznawania wzorców różniących się od normy (DfN).
    2. Wynik uznaje się za poniżej LOD, gdy obecne są rzadkie podejrzane zdarzenia, ale nie osiągają one raportowalnego progu specyficznego dla próbki.
    3. Wynik uznaje się za ograniczony analitycznie, gdy wielkość mianownika jest niewystarczająca, występuje znaczna hemodylucja, jakość próbki jest słaba lub ograniczenia przedanalityczne bądź analityczne uniemożliwiają pewną interpretację negatywną.
  11. Wszystkie przypadki MRD-dodatnie oraz graniczne o niskim poziomie powinny zostać niezależnie zweryfikowane przez drugiego wykwalifikowanego analityka.
  12. Interpretację cytometrii przepływowej należy sfinalizować przed analizą sparowanych danych porównawczych z badań molekularnych, w tym wyników ilościwej reakcji łańcuchowej polimerazy lub sekwencjonowania następnej generacji.  

6. Metodologia walidacji analitycznej

  1. Oceń powtarzalność analityczną, przygotowując dublety alikwotów z tej samej zawiesiny komórkowej po lizie. Niezależnie pozyskaj i przeanalizuj co najmniej 30 par próbek.
  2. Oceń liniowość rozcieńczeń, przygotowując rozcieńczenia seryjne na sześciu poziomach w przewidywanym zakresie niskiego obciążenia. Porównaj obserwowane wartości MRD z oczekiwanymi wartościami MRD w serii rozcieńczeń.
  3. Oceń odtwarzalność międzyoperatorową i międzyinstrumentalną, analizując próbki referencyjne przez wielu wykwalifikowanych operatorów na zharmonizowanych cytometrach przepływowych.
  4. Przekształć procentowe wartości MRD uzyskane metodą cytometrii przepływowej oraz powiązane wyniki molekularne za pomocą transformacji log10 przed porównaniem statystycznym. Oceń zgodność ilościową, stosując analizę korelacji oraz analizę Blanda-Altmana.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka zbioru danych z rutynowej implementacji

W okresie badania 197 kolejnych próbek przeszło weryfikację kwalifikowalności oraz przedanalityczną ocenę jakości i włączono je do analizowanego procesu. Kohorta badania obejmowała 98 pacjentów, z czego 62 (63,3%) chorowało na ostrą białaczkę limfoblastyczną z komórek B (B-ALL), a 36 (36,7%) na ostrą białaczkę szpikową (AML). Kohorta składała się z 64 mężczyzn (65,3%) i 34 kobiet (34,7%), przy medianie wieku wynoszącej 32 lata (rozstęp międzykwartylny [IQR], 13–49 lat; zakres, 2–73 lata). Mediana wyjściowego odsetka blastów wynosiła 67,2% (IQR, 56,9% – 80,2%).

Większość analizowanych próbek stanowiły aspiraty szpiku kostnego (174/197, 88,3%), natomiast próbki krwi obwodowej stanowiły 23/197 (11,7%). Zgodnie z predefined monitoring intervals, 86 próbek (43,7%) pobrano po zakończeniu terapii indukcyjnej, 65 (33,0%) podczas terapii konsolidacyjnej i 46 (23,4%) przed transplantacją hemodynamicznych komórek macierzystych (HSCT) (Tabela 1).

Mediana przeżywalności próbek wynosiła 88,3% (IQR, 84,4% – 92,6%). Przepływ pracy podczas akwizycji pozwolił uzyskać medianę 1 116 901 całkowitych zdarzeń (IQR, 908 521–1 258 946) przed oczyszczaniem danych. Po sekwencyjnym analitycznym wykluczeniu debris, dubletów koincydencyjnych oraz komórek nieżywych, strategia bramkowania pozwoliła uzyskać medianę 907 325 żywych, pojedynczych, CD45-dodatnich zdarzeń docelowych (IQR, 690 112–1 095 836), przy medianie czasu akwizycji wynoszącej 11,9 min. Mediana wskaźnika hemodylucji wynosiła 0,20 (IQR, 0,14–0,28). Po interpretacji z korektą mianownika, 41 próbek (20,8%) zaklasyfikowano jako MRD-dodatnie, a 156 próbek (79,2%) zaklasyfikowano poniżej granicy wykrywalności (LOD) specyficznej dla danej próbki (Tabela 1).

Walidacja analityczna: powtarzalność, liniowość i stabilność

Właściwości analityczne ustandaryzowanego schematu postępowania oceniono w badaniach powtarzalności, liniowości rozcieńczeń oraz stabilności krótkoterminowej (Rycina 2). Podwójne aliquoty przygotowane z tych samych próbek poddanych lizie masowej wykazały wysoką powtarzalność, przy medianie współczynnika zmienności (CV) dla pomiarów podwójnych wynoszącej 0,101% i 95. percentylu CV równym 0,222%.

figure-results-1
Rysunek 2: Walidacja analityczna ustandaryzowanego wielokolorowego przepływu cytometrycznego workflow MRD. (A) Rozkład żywotności próbek w analizowanych materiałach. (B) Korelacja między oczekiwanymi a obserwowanymi wartościami MRD w eksperymentach z rozcieńczeniami seryjnymi w analizie logarytmicznej. (C) Zgodność między niezależnymi analizami powtórzonymi podczas oceny powtarzalności. (D) Stabilność pomiarów MRD po przechowywaniu w temperaturze pokojowej w czasie 0 h, 24 h i 48 h. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Aby ocenić charakterystykę wykrywania niskich poziomów, przeanalizowano 12 eksperymentów z rozcieńczeniami seryjnymi, obejmujących łącznie 72 obserwacje w oczekiwanym dolnym zakresie MRD. Obserwowane wartości MRD wykazały silną zgodność z wartościami oczekiwanymi w analizie logarytmicznej (r = 0.999, skorygowane R2 = 0.998, nachylenie = 1.009, punkt przecięcia = 0.018), co wskazuje na zachowaną liniowość w zakresach zdarzeń o niskiej częstotliwości.

Badania stabilności krótkoterminowej wykazały progresywny spadek żywotności próbek w czasie, przy czym mediana żywotności zmniejszyła się z 89,1% w 0 h do 84,9% w 24 h oraz 80,6% w 48 h. W przeciwieństwie do tego, mediana bezwzględnej zmiany względnej obciążenia MRD pozostała ograniczona w 24 h (6,2%) i 48 h (12,0%), co potwierdza możliwość rutynowego przetwarzania próbek w odstępie do 24 h po pobraniu.

Powtarzalność międzyoperatorowa i międzyinstrumentalna

Powtarzalność międzyoperatorowa i międzyinstrumentalna została oceniona z wykorzystaniem 24 próbek referencyjnych analizowanych przez wielu operatorów na zharmonizowanych cytometrach przepływowych, co pozwoliło na przeprowadzenie łącznie 96 pomiarów. Mediana bezwzględnego odchylenia względnego od wartości referencyjnych wyniosła 13,7%. Wyniki te wykazują spójną wydajność analityczną po standaryzacji przygotowania próbek, ustawień akwizycji oraz sekwencyjnych strategii bramkowania (Tabela 2).

Tabela 2: Wskaźniki walidacji analitycznej i porównania metod dla zstandaryzowanego schematu badania mierzalnej choroby resztkowej. Tabela ta ogranicza się do wyników walidacji, w tym powtarzalności wewnątrz serii, liniowości rozcieńczeń, stabilności krótko-terminowej, odtwarzalności między operatorami i między urządzeniami oraz wskaźników porównania z ortogonalną metodą molekularną; nie powiela ona danych demograficznych pacjentów ani charakterystyki próbek przedstawionych w Tabeli 1. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Zastosowanie kliniczne i porównanie z metodą ortogonalną

Przeprowadzono porównanie ortogonalne z wykorzystaniem 117 par próbek, z czego 75 przeanalizowano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), a 42 za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Oceny qPCR koncentrowały się przede wszystkim na monitorowaniu specyficznych dla choroby transkrypcji fuzyjnych ustalonych podczas diagnozy, w tym BCR::ABL1, RUNX1::RUNX1T1 oraz PML::RARA. Metody NGS służyły do oceny klonalnych rearanżacji genów immunoglobulin lub receptorów limfocytów T w przypadku białaczki limfoblastycznej oraz do śledzenia nawrotowych mutacji somatycznych z wykorzystaniem celowanych paneli mieloidalnych w białaczce ostrej szpiczastej. Wartości MRD wyznaczone metodą cytometrii przepływowej wykazały silną korelację z wynikami molekularnymi dla par próbek na mierzalnych poziomach choroby (r = 0,893 w analizie logarytmicznej).

Analiza Blanda-Altmana wykazała średnią różnicę logarytmiczną wynoszącą −0.093, z granicami zgodności w zakresie od −0.848 do 0.663 (Rysunek 3). Wśród przypadków niezgodnych zidentyfikowano jeden wynik fałszywie ujemny spośród 25 próbek dodatnich w badaniu molekularnym. Procedura wykazała dodatnią zgodność procentową na poziomie 78,1%, ujemną zgodność procentową na poziomie 97,6% oraz ogólny stopień zgodności wynoszący 92,3%.

figure-results-2
Rysunek 3: Zastosowanie kliniczne i walidacja ortogonalna ustandaryzowanej oceny MRD. (A) Rozkład przypadków z obecnością MRD w grupach chorobowych i przedziałach monitorowania. (B) Korelacja między wartościami MRD uzyskanymi metodą cytometrii przepływowej a wynikami parowego porównania molekularnego w analizie logarytmicznej. (C) Analiza Blanda-Altmana porównująca pomiary MRD metodą cytometrii przepływowej i parowe pomiary molekularne, gdzie linie poziome oznaczają średnią różnicę (bias) oraz 95% granice zgodności w całym zakresie analitycznym. (D) Rozkład wyników MRD-dodatnich w przedziałach monitorowania leczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki te wykazują, że zestandaryzowany schemat wielokolorowej cytometrii przepływowej zapewnił wysoką zgodność z ortogonalnymi molekularnymi badaniami MRD w rutynowych próbkach klinicznych.

Tabela uzupełniająca 1: Kompleksowe parametry operacyjne dla zstandaryzowanego wielokolorowego przepływu cytometrycznego w badaniu minimalnej choroby resztkowej. Ta ujednolicona tabela określa kluczowe komponenty metodologiczne podzielone na poszczególne sekcje. Sekcja A szczegółowo opisuje konfiguracje paneli przeciwciał specyficznych dla danej choroby, w których wybór CD73 lub CD304 opiera się na wyjściowym diagnostycznym immunofenotypie związanym z białaczką. Sekcja B przedstawia zstandaryzowane przetwarzanie próbek przed analityczne oraz cele akwizycji cytometrii przepływowej. Sekcja C definiuje progi raportowania skorygowane o mianownik oraz końcowe kryteria interpretacji.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem niniejszej pracy było ustalenie znormalizowanego przepływu pracy dla wielobarwnej cytometrii przepływowej oceny choroby resztkowej (MRD) w ostrej białaczce. Niezawodna ocena MRD zależy nie tylko od wyboru panelu przeciwciał, ale również od spójnego postępowania z próbkami, parametrów nabywania i interpretacji danych11. Wyniki tej pracy wykazują, że zharmonizowane przetwarzanie próbek, kontrolowana głębokość nabywania i kryteria raportowania dostosowane do mianownika mogą poprawić reprodukcyjność analityczną w rutynowych warunkach laboratorium klinicznego. Te wyniki są zgodne z ostatnimi wysiłkami na rzecz standaryzacji oceny MRD cytometrią przepływową w różnych instytucjach i u różnych operatorów12.

Ważnym elementem tego przepływu pracy jest procedura lizy masowych czerwonych krwinek oparta na chlorku amonu. Wykrywanie rzadkich zdarzeń MRD wymaga nabywania dużej liczby komórek do osiągnięcia odpowiedniej wrażliwości analitycznej. Znormalizowana przygotka do lizy masowej umożliwiła spójne odzyskiwanie wystarczającej liczby komórek jądrzastych, często przekraczającej 1,0–1,5 miliona zarejestrowanych zdarzeń, przy zachowaniu akceptowalnej żywotności próbek. Poprzednie badania z Konsorcjum EuroFlow w podobny sposób podkreślały, że wysokie nabywanie zdarzeń jest niezbędne do wsparcia wrażliwej i powtarzalnej detekcji MRD13. W przypadku próbek o nieodpowiedniej wrażliwości analitycznej, procedura rozwiązywania problemów powinna obejmować ocenę objętości próbki, odzyskiwania komórek i głębokości nabywania.

Ten protokół obejmuje również rutynową ocenę hemodilucji przed interpretacją wyników MRD-negatywnych na niskim poziomie. Hemodilucja pozostaje głównym ograniczeniem przedanalizycznym w badaniach MRD opartych na szpiku kostnym, ponieważ zanieczyszczenie krwią obwodową może sztucznie zmniejszyć pozorną obciążenie białaczkowe. Włączenie półilościowej oceny hemodilucji bezpośrednio do przepływu raportowania zapewnia dodatkową ochronę przed błędną interpretacją jako fałszywie negatywną. Poprzednie badania wykazały, że hemodilucja znacząco wpływa na niezawodność cytometrii przepływowej MRD w ostrych białaczkach szpikowych7. Próbki wykazujące znaczną hemodilucję (≤0,40) powinny zatem być interpretowane ostrożnie, szczególnie gdy głębokość nabywania lub zachowanie prekursorów szpikowych jest nieodpowiednia.

Przeprowadzone w tej pracy ortogonalne porównanie wykazało silną ogólną zgodność między metodami oceny MRD cytometrią przepływową a metodami molekularnymi. Jednakże niespójne przypadki podkreślają również, że cytometria przepływowa i badania molekularne oceniają różne biologiczne aspekty choroby resztkowej. Poprzednie badania wykazały, że zmiany fenotypowe, ewolucja klonalna i regeneracyjna hematopoeza mogą przyczyniać się do rozbieżności między platformami analitycznymi14. W B-ALL, rozróżnienie pozostałych prekursorów białaczki od normalnych hematogonów pozostaje szczególnie trudne przy niskim obciążeniu chorobowym i wymaga zintegrowanej interpretacji wielowymiarowych wzorców immunofenotypowych, a nie izolowanych nieprawidłowości antygenowych15. Z tego powodu wszystkie przypadki graniczne i o niskim poziomie MRD w tym przepływie były niezależnie przeglądane przez drugiego analityka.

Niniejsza praca ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, walidacja została przeprowadzona w jednym centrum przy użyciu ograniczonej liczby zharmonizowanych instrumentów. Po drugie, próbki krwi obwodowej były uwzględnione tylko w wybranych sytuacjach klinicznych, ponieważ nie mogą zastąpić szpiku w rutynowej ocenie MRD po leczeniu w większości przypadków ostrej białaczki. Ponadto niektóre parametry analityczne, w tym ocena hemodilucji i interpretacja zdarzeń na niskim poziomie, nadal wymagają przeglądu przez doświadczonego operatora, mimo znormalizowanego przepływu pracy. Niemniej jednak, protokół zapewnia praktyczny rama dla rutynowego wdrożenia w praktyce klinicznej znormalizowanej oceny MRD cytometrią przepływową wielobarwną16,17. Integrując ocenę jakości przedanalizycznej, zharmonizowane strategie nabywania i kryteria interpretacji dostosowane do mianownika, ten przepływ pracy wspiera bardziej powtarzalne i klinicznie spójne raportowanie MRD w rutynowej praktyce laboratoryjnej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnięcia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor dziękuje Działowi Laboratorium Klinicznego w Drugim Szpitalu Ludowym w Neijiang za zapewnienie obiektów laboratoryjnych i wsparcia technicznego dla tego badania. Autor wyraża również uznanie dla personelu laboratorium i personelu klinicznego za pomoc w przetwarzaniu próbek i zbieraniu danych. Na koniec autor dziękuje pacjentom, których resztkowe próbki kliniczne przyczyniły się do tej pracy. Badanie to nie otrzymało żadnego szczególnego finansowania ze środków publicznych, komercyjnych lub organizacji non-profit.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor akwizycjiPrzygotowane w laboratoriumPBS zawierające 0,5% BSA i 2 mM EDTA; końcowa objętość resuspendencji 500 µLOstatnia resuspendencja przed akwizycją cytometrią przepływową
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD117-APCBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 104D2; fluorochrom: APC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaWczesne zidentyfikowanie mieloidów/blastów
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD13-FITCBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: L138; fluorochrom: FITC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaKotwica linii mieloidowej
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD33-PEBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: P67.6; fluorochrom: PE; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaKotwica linii mieloidowej
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD34-PerCP-Cy5.5BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 8G12; fluorochrom: PerCP-Cy5.5; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaMarker niedojrzałości
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD45-APC-H7BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 2D1; fluorochrom: APC-H7; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaMarker szkieletu leukocytów i definicja mianownika
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD56-V500BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: NCAM16.2; fluorochrom: V500; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaFenotypowanie aberracyjnych blastów
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD7-V450BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: M-T701; fluorochrom: V450; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaWykrywanie aberracji międzyliniowych
AML Rurka 1 przeciwciało anty-HLA-DR-PE-Cy7BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: G46-6; fluorochrom: PE-Cy7; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaDyskryminacja dojrzewania i podtypów
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD117-APCBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 104D2; fluorochrom: APC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaWczesne zidentyfikowanie mieloidów/blastów
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD11b-V450BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: ICRF44; fluorochrom: V450; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaOcenianie niespójności dojrzewania
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD13-FITCBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: L138; fluorochrom: FITC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaKotwica linii mieloidowej
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD15-V500BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: HI98; fluorochrom: V500; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaOcenianie wzorca mieloidowego różnego od normalnego
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD33-PEBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: P67.6; fluorochrom: PE; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaKotwica linii mieloidowej
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD34-PerCP-Cy5.5BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 8G12; fluorochrom: PerCP-Cy5.5; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różnaMarker niedojrzałości
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD45-APC-H7BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Klon: 2D1; fluorochrom: APC-H7; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytula

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heuser M, et al. 2021 update on measurable residual disease in acute myeloid leukemia: A consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2021;138(26):2753–67.
  2. Cloos J, Heuser M, Freeman SD. 2025 update on MRD in acute myeloid leukemia: A consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2025;147(11):1147–64.
  3. Verbeek MWC, Lucio P, Szczepański T. Minimal residual disease assessment in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia by standardized next-generation flow cytometry. eJHaem. 2024;5(2):110–20.
  4. Virk H, Jain P, Sengar M. Flow cytometric MRD assessment in acute lymphoblastic leukemia: Practical advantages and interpretive considerations. Indian J Hematol Blood Transfus. 2023;39(3):350–62.
  5. Brando B. Rules in rare event acquisition: An overview. Cytometry B Clin Cytom. 2019;96(6):448–53.
  6. EuroFlow Consortium. Standardized EuroFlow Protocols [Internet]. EuroFlow; 2025. Available from: https://euroflow.org/protocols/ (accessed 2026 Jan 15).
  7. Tettero JM, Heidinga ME, Mocking TR. Impact of hemodilution on flow cytometry-based measurable residual disease assessment in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2024;38(2):297–305.
  8. Buccisano F, et al. Prognostic and therapeutic implications of measurable residual disease in acute myeloid leukemia. Blood. 2012;119(2):332–41.
  9. Schuurhuis GJ, Heuser M, Freeman S. Minimal/measurable residual disease in AML: A consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2018;131(12):1275–91.
  10. Terwijn M, van Putten WLJ, Kelder A. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: Data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 2013;31(31):3889–97.
  11. Smith AB, Jones CD. Computational models, and tools for future development in flow cytometry. Cancer Metastasis Rev. 2026;45(1):88–102.
  12. Jum’ah HA, Ali S, Hwang Y. Measurable residual disease analysis by flow cytometry: Assay validation and characterization of 385 consecutive cases of acute myeloid leukemia. Cancers. 2025;17(7):1155.
  13. Theunissen P, et al. Standardized EuroFlow flow cytometric method for B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL) MRD assessment. Blood. 2017;129(3):347–57.
  14. Haaksma LH, Mocking TR, Kelder A. Flow cytometric and molecular measurable residual disease in acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma. 2025;66(1):45–55.
  15. Das N, Yadav P, Seth T. Analytical appraisal of hematogones in B-ALL MRD assessment using multidimensional dot-plots by multiparametric flow cytometry: A critical review and update. Indian J Hematol Blood Transfus. 2024;40(1):12–24.
  16. Korkina YS, Popov AM, Tserenov DG. False-positive flow cytometric measurable residual disease in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Cytometry B Clin Cytom. 2024;106(2):120–31.
  17. Mocking TR, et al. Computational measurable residual disease assessment in acute myeloid leukemia: a retrospective validation in the HOVON-SAKK-132 trial. Leukemia. 2025;39(10):2559–62.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MedycynaWydanie 234Wydanie 234Warto pustaWydanieB ALLAML

Powiązane artykuły