Niniejszy protokół opisuje metody wytwarzania nanocząsteczek lipidowych zintegrowanych z werteporfiną, które są aktywowane światłem widzialnym lub promieniowaniem rentgenowskim w celu spatiotemporalnie kontrolowanego dostarczania rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 oraz środków chemioterapeutycznych, z potencjalnym zastosowaniem translacyjnym w okulistyce i onkologii.
Artykuł metodologiczny
Liposomy aktywowane światłem i promieniowaniem rentgenowskim do kontrolowanej edycji genów i dostarczania leków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Terapia fotodynamiczna (PDT) wykorzystuje aktywację fotouczulacza do generowania reaktywnych form tlenu (ROS), przede wszystkim tlenu singletowego. Poza bezpośrednią cytotoksycznością, ta fotochemia może zostać wykorzystana do uwalniania ładunku na żądanie z lipidowych systemów nanonośników, co umożliwia przestrzenną i czasową kontrolę dostarczania terapeutyków, nieosiągalną w przypadku konwencjonalnych nanocząsteczek lipidowych. Niniejszy protokół przedstawia metody wytwarzania i charakteryzacji dwóch odrębnych formulacji nanocząsteczek lipidowych zintegrowanych z werteporfiną (VP): (1) liposomów aktywowanych światłem, składających się z DOTAP, DOPE, cholesterolu i VP, do dostarczania kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP) CRISPR-Cas9; oraz (2) liposomów aktywowanych promieniami X, składających się z DOTAP, DOPC, VP i nanocząsteczek złota, do kontrolowanego uwalniania leków chemioterapeutycznych. Po aktywacji przy 690 nm (światło widzialne) lub promieniowaniem rentgenowskim o energii 6 MeV, VP generuje tlen singletowy, który utlenia nienasycone składniki lipidowe, destabilizując błonę nanocząsteczki i uwalniając enkapsulowany ładunek. Przedstawiono protokoły formulacji liposomów metodą hydratacji cienkiej warstwy i ekstruzji błon, charakteryzację fizykochemiczną, ocenę uwalniania ładunku aktywowanego światłem i promieniami X, in vitro knockout genów w ludzkich komórkach oraz walidację in vivo z wykorzystaniem ilościowego systemu raportującego wzrokowego u danio pręgowanego oraz modelu ksenograftu nowotworowego u myszy. Reprezentatywne wyniki wykazują knockout do około 326 włókien mięśni wolnokurczliwych na embrion danio pręgowanego poprzez aktywację światłem oraz znaczną supresję wzrostu guza poprzez uwalnianie doksorubicyny aktywowane promieniami X. Kliniczny precedens aktywacji werteporfiny przy 689–690 nm w oku motywuje do oceny tej platformy w dostarczaniu leków do okulistyki, choć biodystrybucja w siatkówce, farmakokinetyka i bezpieczeństwo u dużych zwierząt wymagają jeszcze ustalenia. Metody te stanowią podejście eksperymentalne z potencjałem translacyjnym dla zewnętrznie kontrolowanego uwalniania ładunku terapeutycznego.
Wprowadzenie
Nanocząsteczki lipidowe (LNP) stały się najbardziej zweryfikowaną klinicznie niewirusową platformą dostarczania terapeutyków kwasów nukleowych, co udowodniono poprzez ich zastosowanie w szczepionkach mRNA przeciwko COVID-191. Jednak konwencjonalne LNP uwalniają swój ładunek po wchłonięciu komórkowym poprzez ucieczkę z endosomów, co nie zapewnia zewnętrznej kontroli nad czasem, miejscem ani zakresem dostarczenia ładunku2. Brak tej kontroli czasowo-przestrzennej ogranicza ich użyteczność w zastosowaniach, w których precyzyjne uwalnianie na żądanie jest korzystne terapeutycznie, w tym w specyficznej dla miejsca edycji genów, celowanej chemioterapii w guzach heterogenicznych oraz w tytrowanym wyciszaniu genów w anatomicznie dostępnych narządach, takich jak oko3,4.
Terapia fotodynamiczna (PDT) zapewnia uznany mechanizm wywoływania efektów biologicznych za pomocą zewnętrznego wyzwalacza. Po aktywacji przy określonych długościach fal, fotouczulacze generują tlen singletowy (1O2) oraz inne reaktywne formy tlenu (ROS), które mogą utleniać pobliskie biomolekuły5. Verteporfina (VP), pochodna benzoporfiryny zatwierdzona klinicznie pod nazwą Visudyne do fotodynamicznego leczenia podsiatkowej naczyniowej błony choroidalnej w przebiegu zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem (AMD), jest szczególnie odpowiednia jako komponent fotouczulający w nanocząstkach6. W terapii fotodynamicznej stosowanej w okulistyce VP jest aktywowana klinicznie przy 689 nm, co stanowi uznany precedens w zakresie dostarczania światła do oka6,7,8. VP wykazuje około czterokrotnie większą aktywność fotodynamiczną niż pochodne hematoporfiryny pierwszej generacji przy długościach fal penetrujących tkanki6.
Ta podwójna funkcjonalność, dzięki której VP służy jednocześnie jako zatwierdzony klinicznie fotouczulacz i jako światłoczuły wyzwalacz uwalniania ładunku z nanocząsteczek, stanowi podstawę mechanistyczną opisanych tutaj protokołów. Po wbudowaniu w dwuwarstwę lipidową w niskich stosunkach molowych, VP pod wpływem oświetlenia generuje 1O2, co zgodnie z wcześniejszą literaturą ma prowadzić do utleniania nienasyconych łańcuchów acylowych fosfolipidów, destabilizacji błony i uwalniania enkapsulowanego ładunku9. Krótki promień dyfuzji 1O2 (~20 nm w środowiskach biologicznych) ogranicza destabilizację błony do bezpośredniego sąsiedztwa fotouczulacza, minimalizując uszkodzenia ładunku przy jednoczesnym efektywnym rozrywaniu dwuwarstwy9,10. Ponadto metoda aktywacji promieniami X pozwala przezwyciężyć ograniczenie głębokości penetracji tkanek charakterystyczne dla światła widzialnego. Gdy nanocząstki złota (3–5 nm) są współosadzone w dwuwarstwie lipidowej, kliniczne napromieniowanie promieniami X (6 MeV) wzmacnia aktywację VP poprzez transfer energii pośredniczony przez elektrony Augera, rozszerzając możliwość zastosowania metody w przypadku głęboko położonych guzów11,12. Bezpośrednie pomiary tlenu singletowego z użyciem Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) potwierdzają, że generowanie 1O2 wzrasta wraz z dawką promieniowania X i jest zwiększone około 1,4-krotnie przy współładowaniu nanocząstkami złota w porównaniu do samego VP11.
Platforma ta ma szczególne znaczenie translacyjne dla okulistycznej terapii genowej. Obecne leczenie AMD z użyciem przeciwciał anty-VEGF wymaga częstych iniekcji dopasmałowitralnych, przy czym wyniki w warunkach rzeczywistych pogarszzają się w przypadku chronicznego niedoleczenia13,14, podczas gdy rozwijane terapie genowe oparte na AAV zmniejszają to obciążenie, lecz wykazują konstytutywną ekspresję anty-VEGF15,16, co uniemożliwia ich miareczkowanie lub odstawienie – jest to istotna kwestia, biorąc pod uwagę związek między długotrwałym tłumieniem VEGF a zanikiem geograficznym, niedokrwieniem siatkówki i włóknieniem17,18. Podejście oparte na CRISPR wyzwalane światłem z wykorzystaniem liposomów VP mogłoby zamiast tego umożliwić kontrolowany przez klinicystę, przestrzennie ograniczony knockout VEGF-A, zapewniając sterowaną przestrzennie i czasowo aktywację pierwotnego zdarzenia edycji przy zachowaniu trwałości edycji genów. Ta sama zasada kontrolowanego uwalniania znajduje zastosowanie w przypadku dystrofii siatkówki z dużymi genami, takich jak choroba Stargardta (ABCA4)19,20, oraz w czerniaku naczyniówkowym, gdzie konwergentne mechanizmy VP są dobrze dopasowane do biologii nowotworu21,22.
Ogólnym celem niniejszego protokołu jest dostarczenie kompleksowych i powtarzalnych metod wytwarzania zintegrowanych z VP nanocząsteczek lipidowych przy użyciu dwóch różnych formulacji – jednej aktywowanej światłem widzialnym (690 nm), a drugiej promieniowaniem rentgenowskim – oraz oceny skuteczności dostarczania w modelach in vitro i in vivo. Ze względu na różnice w składzie lipidowym, strategii ładowania ładunku oraz sposobie aktywacji, formulacje te zostały przedstawione jako oddzielne protokoły. Protokół ten jest przeznaczony dla badaczy analizujących platformy nanocząsteczek z uwalnianiem wyzwalanym, strategie dostarczania oparte na PDT, spatiotemporalnie kontrolowaną edycję genów oraz aktywowane światłem dostarczanie leków w okulistyce i onkologii.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach z wykorzystaniem rybek danio (*zebrafish*) były przeprowadzane w standardowych warunkach zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Badań nad Zwierzętami na Macquarie University (ARA: 2015-034). Eksperymenty z ksenoprzeszczepami u myszy przeprowadzano zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Badań nad Zwierzętami Macquarie University (nr zatwierdzenia 2017/001). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z ustawą Animal Research Act 1985 oraz rozporządzeniem Animal Research Regulation 2010.
Część A: Aktywowane światłem liposomy VP do dostarczania CRISPR-Cas9 (na podstawie Aksoy et al.9)
1. Przygotowanie wyzwalanych światłem liposomów VP enkapsulujących RNP CRISPR-Cas9
- Rozpuścić DOTAP, DOPE, cholesterol (Chol) i VP w 500 µL chloroformu w stosunku molowym 1:0,94:1:0,06 w szklanej kolbie okrągłodennej9.
OSTROŻNIE: Chloroform jest toksyczny i lotny. Wszystkie etapy z użyciem chloroformu należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice nitrylowe i okulary ochronne. - Odparować chloroform w strumieniu argonu, aż na ściance kolby utworzy się cienka warstwa lipidowa.
- Umieścić kolbę w próżni (np. w liofilizatorze lub eksyكاتهorze podłączonym do pompy próżniowej) na noc (≥12 h), aby całkowicie usunąć pozostałości rozpuszczalnika.
- Przygotować roztwór do hydratacji, łącząc sgRNA (stężenie końcowe 0,01 µM) i białko Cas9 (stężenie końcowe 0,1 mg/mL) w 500 µL wody wolnej od nukleaz. Przed hydratacją inkubować sgRNA i Cas9 w temperaturze pokojowej przez 5 min, aby umożliwić utworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP).
UWAGA: Kompleks RNP jest wprowadzany podczas etapu hydratacji, a nie dodawany po jego zakończeniu. Zapewnia to enkapsulację w wodnym rdzeniu liposomu. - Zhydratować wysuszoną warstwę lipidową, dodając 500 µL roztworu RNP bezpośrednio na warstwę i mieszając do uzyskania homogenicznej zawiesiny. Pozostawić zhydratowaną zawiesinę lipidową na 2 h w temperaturze pokojowej, aby zapewnić pełną hydratację lipidów.
- Wytłoczyć powstałą zawiesinę wielowarstwową 11 razy przez membranę poliwęglanową o rozmiarze 200 nm za pomocą mini-ekstrudera, aby otrzymać jednowarstwowe liposomy o jednolitym rozmiarze9.
UWAGA: Metodą redukcji rozmiaru w tej formulacji jest ekstruzja, a nie sonikacja. Zawiesinę należy przepuścić nieparzystą liczbę razy (11), aby produkt końcowy znalazł się po przeciwnej stronie membrany niż materiał wyjściowy, co ogranicza zanieczyszczenie nieekstrudowanymi pęcherzykami. - Przechowywać liposomy VP w temperaturze 4°C, chroniąc je przed światłem. W celu uzyskania optymalnej aktywności wykorzystać w ciągu 48 h od przygotowania. Ten 48-godzinny limit użytkowania jest konserwatywny: uwalnianie VP pozostaje poniżej 3% przez 96 h w 10% FBS9.
UWAGA: W zastosowaniach in vitro i in vivo przygotowywać i manipulować liposomami zgodnie ze standardową techniką aseptyczną oraz sterylizować końcową zawiesinę poprzez przepuszczenie przez filtr 0,22 µm przed użyciem.
2. Charakterystyka fizykochemiczna liposomów VP
- Rozcieńczyć zawiesinę liposomów w stosunku 1:100 w wodzie wolnej od nukleaz. Zmierzyć średnicę hydrodynamiczną, indeks polidyspersyjności (PDI) oraz potencjał zeta metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Wszystkie pomiary DLS przeprowadzić w trzech powtórzeniach (n = 3 powtórzenia techniczne) dla każdej próbki i podać wartości jako średnia ± odchylenie standardowe.
UWAGA: Oczekiwane charakterystyki prawidłowo przygotowanej formulacji z części A to średnica hydrodynamiczna 167,5 ± 1,9 nm, PDI < 0,3, potencjał zeta +28 ± 1,1 mV oraz wydajność enkapsulacji Cas9 na poziomie około 75,09%. Reprezentatywne charakterystyki fizykochemiczne prawidłowych formulacji podsumowano w Tabeli 1.9 - Do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) nałożyć 10 µL rozcieńczonej zawiesiny liposomów na miedzianą siatkę powlekaną węglem. Barwić 2% octanem uranylu przez 20 s. Wykonać obrazowanie przy napięciu 100 kV9, pozyskując co najmniej 10 reprezentatywnych obrazów z każdej partii.
| Parametr | Część A: Liposomy VP (wyzwalany światłem) | Część B: liposom VP/AuNP (wyzwalane promieniami rentgenowskimi) | |||
| Średnica hydrodynamiczna | 167,5 ± 1,9 nm | ~100–150 nm | |||
| Wskaźnik polidyspersyjności (PDI) | <0.3 | < 0,3 (typowo) | |||
| Potencjał zeta | +28 ± 1,1 mV | Dodatnie (na bazie DOTAP) | |||
| Wydajność enkapsulacji | Cas9 RNP: 75,09% | Doksorubicyna: zdalne ładowanie za pomocą siarczanu amonu; ilościowo określona po lizie w 0,1% Triton X-100 | |||
| Obciążanie nanocząsteczkami złota | Nie dotyczy | 156 ± 24 AuNP na liposom (ICP-MS) | |||
| Stabilność uwalniania ładunku | <uwalnianie 3% VP w ciągu 96 h w 10% FBS | Stabilna przez 48 h przy stężeniach FBS wynoszących 0%, 10%, 25% i 50% oraz przy pH 7,4, 6,0 i 5,0 | |||
| Warunki aktywacji | naświetlanie diodą LED o długości fali 690 nm i gęstości mocy 0,15 mW/cm² | kliniczne napromieniowanie rentgenowskie o energii 6 MeV | |||
| Główny ładunek | kompleks RNP CRISPR-Cas9 | Doksorubicyna | |||
| Modalność aktywacji | Światło widzialne | Promieniowanie rentgenowskie | |||
| Przeznaczenie | Kierowana edycja genów | Wyzwalane uwalnianie leków chemioterapeutycznych | |||
Tabela 1: Wartości odniesienia charakterystyki fizykochemicznej i profile stabilności dwóch formulacji liposomów z werteporfiną (VP). Reprezentatywne charakterystyki formulacji, parametry obciążenia, profile stabilności i warunki aktywacji dla formulacji liposomów VP wyzwalanych światłem (część A) oraz formulacji liposomów VP/AuNP wyzwalanych promieniami rentgenowskimi (część B). Wartości te stanowią oczekiwane punkty odniesienia dla kontroli jakości w celu prawidłowego przygotowania i charakterystyki formulacji i mogą być wykorzystywane jako kryteria referencyjne podczas powielania opisanych w niniejszym dokumencie protokołów.
3. Wyzwalane światłem uwalnianie ładunku i pomiar tlenu singletowego
- W celu przeprowadzenia testów uwalniania wyzwalanego światłem, przygotować liposomy VP, stosując tę samą formulację lipidową oraz protokół hydratacji/ekstruzji. Napełnić urządzenie dializacyjne 100 µL zawiesiny liposomów w PBS, zawieszając je w 12 mL PBS przy mieszaniu z prędkością 80 rpm.
- Naświetlać próbki źródłem światła LED o długości fali 690 nm z natężeniem 0,15 mW/cm2 w określonych odstępach czasu (2, 4 i 6 min)9.
- Pobrać próbki zewnętrznego dialyzatu w czasie 0, 1, 3, 6 i 24 h oraz określić ilość uwolnionego VP za pomocą fluorescencji; całkowitą ilość VP wyznaczyć poprzez lizę równoważnej porcji za pomocą 0,1% Triton X-100.
- Obliczyć uwalnianie VP według wzoru Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100, gdzie Ft, F0 oraz Fmax to odpowiednio wartości fluorescencji w czasie t, wartość bazowa oraz wartość po lizie Tritonem (n = 3).
- Potwierdzić destabilizację błony, mierząc zmianę średnicy hydrodynamicznej za pomocą DLS przed i po naświetlaniu.
UWAGA: Wszystkie próbki zawierające VP należy chronić przed światłem otoczenia podczas przygotowywania i przechowywania. Należy stosować probówki bursztynowe lub owijanie folią aluminiową.
4. Transfekcja in vitro i test knockoutu genu
- Wysiać komórki HEK293-GFP (lub równoważną linię reporterową) na płytki 96-dołkowe w gęstości odpowiedniej do uzyskania ~70% konfluencji w momencie traktowania. Hodować komórki w medium kompletnym (DMEM + 10% FBS + 1% penicylina–streptomycyna) w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- Dodać do dołków VP-liposomy enkapsulujące kompleks RNP sgRNA/Cas9 przeciwko GFP w stężeniu 50 ug/mL. W przypadku analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej inkubować przez 2 h; w przypadku analizy cytometrią przepływową inkubować przez 1 h.
- Wymienić medium na świeże medium kompletne. Naświetlać traktowane dołki światłem LED o długości fali 690 nm z natężeniem 0,15 mW/cm2. W przypadku analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej naświetlać przez 2, 4 lub 6 min; w przypadku analizy cytometrią przepływową naświetlać przez 4 min. Uwzględnić kontrole ciemne (liposomy bez naświetlania) oraz kontrole tylko z naświetlaniem (naświetlanie bez liposomów).
- Ocenić knockout GFP 48 h po traktowaniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.
UWAGA: RNA przewodnie powinny zostać zwalidowane przed użyciem. W badaniu źródłowym kandydackie sgRNA dla eGFP przesiewano pod kątem wydajności cięcia za pomocą analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP), a wybrany przewodnik (sg_eGFP_06) osiągnął 88,24% cięcia. Ryzyko efektów off-target zminimalizowano in silico, potwierdzając unikalność przewodnika (BLASTN względem genomu referencyjnego przy użyciu Bowtie/Bowtie2, bez tolerowania niedopasowań w pierwszych dziesięciu zasadach końca 3’). Nie przeprowadzono sekwencjonowania off-target w całym genomie, co jest zalecanym krokiem w przypadku translacji terapeutycznej9. - Aby zmierzyć wydajność enkapsulacji, odwirować próbkę liposomów przy 15 000 rpm przez 1 h w temperaturze 4 °C, a następnie przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy Whatman Anotop 10 o rozmiarze porów 20 nm.
- Ilościowo oznaczyć wolne (nieenkapsulowane) białko Cas9 w filtracie za pomocą testu białkowego BCA.
- Obliczyć wydajność enkapsulacji jako EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctot] × 100, gdzie Ctot to całkowita ilość dodanego Cas9, a Csup to ilość nieenkapsulowanego Cas9 odzyskanego z supernatantu. Reprezentatywne parametry wydajności formulacji oraz oczekiwane wydajności enkapsulacji przedstawiono w Tabeli 1.
5. Walidacja in vivo: test reportera wizualnego u rybek zebrafish
- Przygotować MasterMix do iniekcji, łącząc liposomy VP enkapsulujące sgRNA celujące w eGFP oraz białko Cas9 w proporcjach określonych w oryginalnym protokole9. Końcowy 8 uL MasterMix zawiera 3,5 uL sgRNA (75 ng/uL), 1,0 uL białka Cas9 (500 ng/uL), 2,5 uL liposomów VP oraz 1,0 uL czerwieni fenolowej. W przypadku kontrolnego MasterMixu zastąpić 2,5 uL liposomów wodą wolną od nukleaz.
- Mikroiniekować 2 nL MasterMixu do komórki (nie do żółtka) zarodków zebrafish w stadium jednej komórki, używając skalibrowanego systemu mikroiniekcyjnego9.
OSTRZEŻENIE: Wszystkie prace z zebrafish należy prowadzić zgodnie z zatwierdzonymi protokołami etycznymi dotyczącymi zwierząt. Zarodki należy traktować delikatnie, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne podczas iniekcji. - W 2 godzinie po zapłodnieniu (hpf) naświetlać iniektywane zarodki światłem LED o długości fali 690 nm z mocą 0,15 mW/cm2 przez określony czas (np. 0, 1, 2 i 5 min), aby aktywować uwalnianie ładunku9.
- W 72 hpf znieczulić zarodki w Tricainie i zamontować je w 1% agarozie niskotopliwej. Wykorzystując transgeniczną linię reporterową smyhc1:eGFP, określić stopień nokautu włókien mięśni wolnokurczliwych jako utratę fluorescencji eGFP przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego oraz mikroskopu konfokalnego.
- Wykonać obrazy z nakładaniem ostrości (focus-stacking) i policzyć włókna mięśni wolnokurczliwych negatywne pod kątem eGFP (znokautowane) w każdym zarodku, analizując zazwyczaj 16 zarodków w grupie (np. w programie Imaris)9.
UWAGA: Ten test zapewnia ilościowy, wizualny odczyt wydajności nokautu genu. W linii reporterowej smyhc1:eGFP włókna mięśni wolnokurczliwych są normalnie eGFP-dodatnie; pomyślny nokaut ocenia się jako utratę fluorescencji eGFP w tych włóknach9.
Część B: Liposomy VP aktywowane promieniami rentgenowskimi do dostarczania leków chemioterapeutycznych (na podstawie Deng et al.11)
6. Przygotowanie liposomów VP/AuNP naładowanych doksorubicyną, aktywowanych promieniami rentgenowskimi
- Połączyć 350 µL DOTAP (100 mg/mL w chloroformie) i 370 µL DOPC (100 mg/mL w chloroformie) w szklanej kolbie okrągłodnnej i uzupełnić chloroformem do całkowitej objętości 1,0 mL11.
UWAGA: W części B stosuje się DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocholinę), a nie DOPE. Dwie formulacje różnią się zastosowanym lipidem pomocniczym, a rozróżnienie to jest kluczowe dla odtwarzalności wyników. - Do mieszaniny lipidowej dodać 50 µL VP (2,3 mg/mL w DMSO) oraz 40 µL zawiesiny nanocząsteczek złota (średnica 3–5 nm). Pozwala to uzyskać około 156 ± 24 nanocząsteczek złota na liposom, co zostało określone metodą ICP-MS11.
UWAGA: Nanocząsteczki złota muszą mieć średnicę 3–5 nm, aby mogły zostać wbudowane w lipidową dwuwarstwę. Większe cząsteczki (np. 50 nm) nie zostaną włączone do błony i nie będą pośredniczyć w transferze energii elektronów Augera niezbędnym do aktywacji promieniami Rentgena11.
UWAGA: Opisana tutaj formulacja bazowa jest nietargetowana. W badaniu źródłowym wprowadzono opcjonalną modyfikację ukierunkowania aktywnego poprzez post-insercję DSPE-PEG2000-Folate w celu skierowania liposomów do komórek nowotworowych wykazujących ekspresję receptorów folanowych; etap ten można dodać bez zmiany podstawowego mechanizmu uwalniania VP/AuNP11. - Odparować chloroform w atmosferze argonu i suszyć w próżni przez noc, zgodnie z opisem w krokach 1.2–1.3.
- Nawodnić film lipidowy za pomocą 1,0 mL buforu siarczanowo-amonowego 250 mM (pH 5.5). Poddać mieszaninę działaniu wortexa, pozostawić nawodnioną zawiesinę na noc, a następnie przeprowadzić ekstruzję 11 razy przez membranę poliwęglanową o rozmiarze porów 200 nm11.
- Usunąć wolny siarczan amonu poprzez dializę przeciwko PBS (pH 7.4) w temperaturze 4 C z czterokrotną wymianą buforu, aby ustanowić transmembrane gradient siarczanu amonu.
- Załadować doksorubicynę (Dox) poprzez inkubację dializowanych liposomów przy stosunku masowym leku do lipidów 1:10 w temperaturze 60°C przez 1 h11. Gradient siarczanu amonu wymusza akumulację Dox wewnątrz liposomu.
- Usunąć nieinkapsulowaną doksorubicynę poprzez dializę przeciwko PBS w temperaturze 4 C z czterokrotną wymianą buforu.
- Przeprowadzić charakterystykę załadowanych liposomów za pomocą DLS (oczekiwany rozmiar: ~100–150 nm) i zmierzyć wydajność enkapsulacji, lizując liposomy przy użyciu 0,1% Triton X-100 i określając ilościowo fluorescencję Dox (wzbudzenie 485 nm, emisja 590 nm).
UWAGA: Poprawne formulacje z części B zazwyczaj wykazują średnicę hydrodynamiczną około 100–150 nm, PDI < 0,3 oraz włączenie około 156 ± 24 nanocząsteczek złota na liposom. Reprezentatywne charakterystyki fizykochemiczne zestawiono w Tabeli 1.11
7. Uwalnianie leku wyzwalane promieniami rentgenowskimi i cytotoksyczność in vitro
- Naświetlaj liposomy VP/AuNP obciążone kalceiną za pomocą klinicznego akceleratora liniowego (wiązka fotonów 6 MeV) przy określonych dawkach (1, 2 i 4 Gy)11. Ilościowo określ uwalnianie ładunku poprzez pomiar fluorescencji kalceiny (wzbudzenie 485 nm, emisja 510 nm), a całkowite uwalnianie uzyskaj po rozbiciu liposomów za pomocą 0,1% Triton X-100."
- Do testów cytotoksyczności wysiej ludzkie komórki raka jelita grubego HCT116 na płytki 96-dołkowe (np. 2 × 104 komórek/mL w 10% FBS).
- Potraktuj komórki liposomami VP/AuNP obciążonymi doksorubicyną i naświetl promieniami rentgenowskimi zgodnie z powyższym opisem, uwzględniając kontrole: tylko LipoDox, tylko promieniowanie rentgenowskie oraz grupę nieleczoną. Oceń żywotność komórek za pomocą testu MTS w czasie 0, 2, 4 i 24 h po naświetlaniu dawką 4 Gy11.
8. Walidacja in vivo: mysi model ksenoprzeszczepu guza
- Wprowadź podskórnie w okolicę boku samicom myszy BALB/c nude w wieku 6–7 tygodni 5 × 106 komórki HCT116 w 100 µL pożywki McCoy’s 5A bez surowicy11.
- Gdy guzy osiągną rozmiar ~100 mm3, wstrzyknąć wewnątrzguzowo liposomy VP/AuNP obciążone doksorubicyną (10 mg/kg równoważnika doksorubicyny) w objętości 20 µL11.
- W 24 h po wstrzyknięciu naświetlić guzy promieniowaniem rentgenowskim o dawce 4 Gy (6 MeV) przy użyciu klinicznego akceleratora liniowego, stosując odpowiednie osłonięcie tkanek niebędących celem naświetlania.
- Monitoruj objętość guza co 2 dni, używając cyfrowego suwmiarki. Oblicz objętość guza według wzoru V = (π/6) × L × W2, gdzie L oznacza najdłuższy wymiar, a W szerokość prostopadłą11.
- Po zakończeniu eksperymentu wyciąć guzy, utrwalić je w 10% neutralnie buforowanym formalinie i przygotować krioprzekroje o grubości 6 µm do analizy histologicznej (H&barwienie E)11.
9. Analiza statystyczna
- Dane ilościowe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD), chyba że wskazano inaczej.
- Analizy statystyczne dla badań nad knockoutem genów u danio prążkowanego przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), natomiast porównania między dwiema grupami analizowano za pomocą dwustronnego testu t Studenta, zgodnie z opisem w badaniach źródłowych. Istotność statystyczną określono jako p < 0.05.
- W przypadku badań nad liposomami aktywowanymi promieniami rentgenowskimi, zbiory danych dotyczące wzrostu guza, masy ciała, uwalniania ładunku oraz badania histologiczne analizowano za pomocą testów t Studenta, zgodnie z opisem w oryginalnej publikacji.
- Definicja n dla każdego eksperymentu została podana w odpowiednich legendach do rycin.
- Analizy statystyczne wykonano przy użyciu programu GraphPad Prism w wersji 7.0 (GraphPad Software).
UWAGA: Niniejszy protokół odtwarza przebiegi eksperymentalne i reprezentatywne zbiory danych z wcześniej opublikowanych badań. W celu uzyskania pełnych szczegółów dotyczących analiz statystycznych czytelnicy powinni odnieść się do oryginalnych publikacji, jeśli dotyczy9,11.
Wyniki
Edycja genów wyzwalana światłem (część A):
Zgodnie z protokołem z Części A, liposomy VP enkapsulujące RNP CRISPR-Cas9 wykazywały zależne od światła uwalnianie ładunku. Minimalne uwalnianie zaobserwowano w warunkach ciemności, natomiast naświetlanie przy 690 nm (0.15 mW/cm2) wywołało zależne od dawki uwalnianie, które zwiększało się wraz z czasem iluminacji (Rycina 1A)9. Test reporterowy eGFP u danio pręgowanego dostarczył ilościowego odczytu wizualnego wydajności nokautu genów. Zarodki aktywowane światłem wykazały nokaut 308,37 ± 40,21 dodatnich pod kątem eGFP włókien mięśni wolnokurczliwych na zarodek, w porównaniu do 53,15 ± 35,38 włókien w kontrolach w ciemności (n = 80), co wzrosło do 326,12 ± 36,55 włókien po 5 min naświetlania (n = 60) (Rycina 1B,C)9. In vitro aktywowane światłem liposomy VP osiągnęły knockdown GFP porównywalny z Lipofectamine 2000 (redukcja około 53% w stosunku do 50%), zapewniając jednocześnie unikalną, sterowaną światłem kontrolę czasoprzestrzenną (Rycina 1C)9. Wyniki te demonstrują kontrolę czasoprzestrzenną, ponieważ ta sama formulacja nanocząstek wykazała wyraźnie różną wydajność nokautu w zależności od ekspozycji na światło (Rycina 1A–C).
Rysunek 1. Wyzwalane światłem dostarczanie CRISPR-Cas9 i spatiotemporalny nokaut genu w embrionach danio pręgowanego. (A) Schematyczne przedstawienie liposomów z werteporfiną (VP) (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06) enkapsulujących kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP) Cas9/sgRNA. Po naświetlaniu światłem o długości fali 690 nm, VP generuje reaktywne formy tlenu, które destabilizują błonę liposomalną i wyzwalają wewnątrzkomórkowe uwalnianie ładunku CRISPR-Cas9. (B) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne embrionów danio pręgowanego smyhc1:eGFP w 72 h po zapłodnieniu (hpf) po zastosowaniu liposomów VP i zwiększaniu czasu ekspozycji na światło (0, 1, 2 i 5 min; 690 nm, 0,15 mW/cm2). Utrata fluorescencji eGFP wskazuje na nokaut włókien mięśni wolnokurczliwych. Wstawki pokazują powiększone widoki zaznaczonych obszarów. (C) Ilościowe oznaczenie natężenia fluorescencji oraz liczby znokautowanych włókien mięśni wolnokurczliwych na embrion, wykazujące zależną od światła aktywację CRISPR-Cas9 i nokaut genu. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Eksperymenty na danio pręgowanym analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (n = 80 embrionów dla pomiarów natężenia fluorescencji i n = 60 embrionów dla analizy liczby włókien; p < 0,0001). Eksperymenty walidacyjne na liniach HEK293-GFP analizowano za pomocą obustronnego testu t (n = 4). Paski skali = 500 µm (obrazy ogólne) i 100 µm (obrazy powiększone). Zaadaptowano za zgodą Aksoy et al.9 Copyright © 2020 American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Nieoptymalne wyniki w teście na zebrafish mogą obejmować: (a) mniej niż 50 uszkodzonych włókien na embrion, co wskazuje na niską jakość liposomów, niewystarczającą aktywność Cas9 lub nieoptymalną dawkę światła; (b) śmiertelność embrionów przekraczającą 20%, co sugeruje uszkodzenia mechaniczne podczas mikroiniekcji lub nadmierną fototoksyczność VP; lub (c) uszkodzone włókna w nienaświetlonych kontrolach, co wskazuje na przedwczesny wyciek ładunku z formulacji liposomalnej.
Uwalnianie leku wyzwalane promieniami rentgenowskimi (część B):
Liposomy VP/AuNP przygotowane zgodnie z protokołem w części B wykazały zależne od dawki uwalnianie kalceiny w zakresie 1–4 Gy (Rycina 2A,B)11. W modelu ksenoprzeszczepu HCT116 myszy otrzymujące liposomy VP/AuNP obciążone Dox, a następnie poddane napromieniowaniu rentgenowskiemu 4 Gy, wykazały znaczące zahamowanie wzrostu guza w porównaniu z grupami kontrolnymi otrzymującymi wolny Dox, samo napromieniowanie rentgenowskie oraz nienapromieniowane liposomy (Rycina 2C)11. Analiza histologiczna przekrojów guza, przeprowadzona za pomocą barwienia H&E, ujawniła większe obszary nekrotyczne w grupie poddanej terapii skojarzonej (Rycina 2D).
Rysunek 2. Uwalnianie doksorubicyny wyzwalane promieniami rentgenowskimi i hamowanie wzrostu guza. (A) Schematyczne przedstawienie liposomów zintegrowanych z werteporfiną (VP) i nanocząsteczkami złota (AuNP), zawierających doksorubicynę (Dox). Ekspozycja na promieniowanie rentgenowskie aktywuje VP poprzez transfer energii pośredniczony przez AuNP, co generuje tlen singletowy, który destabilizuje dwuwarstwę lipidową i wyzwala uwalnianie ładunku. (B) Profile uwalniania kalceiny z liposomów poddanych rosnącym dawkom promieniowania rentgenowskiego (0–4 Gy), wykazujące zależne od dawki uwalnianie ładunku z liposomów VP/AuNP. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z czterech pomiarów. (C) Pomiary objętości guza (lewo) i masy ciała (prawo) u myszy z ksenoprzeszczepami HCT116 leczonych PBS, LipoDox, samym promieniowaniem rentgenowskim lub LipoDox z wyzwalaniem rentgenowskim. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 4 myszy na grupę). Istotność statystyczną oceniono za pomocą testu t (P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001). (D) Reprezentatywne przekroje guza barwione hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz analiza morfometryczna średniego obszaru nekrozy guza. Strzałki wskazują reprezentatywne obszary nekrozy. Wykresy pudełkowe pokazują medianę i rozstęp międzykwartylny, z wąsami sięgającymi 1,5 × IQR. Dane analizowano za pomocą testu t (n = 5). Pasek skali = 50 µm. Adaptacja z Deng et al.11 na warunkach licencji Creative Commons Attribution 4.0 International License. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Nieoptymalne wyniki w modelu ksenoprzeszczepu mogą obejmować: (a) brak różnic w tempie wzrostu guza między grupami liposomów napromieniowanych i nienapromieniowanych, co wskazuje na niewystarczające uwalnianie pośredniczone przez VP lub nieodpowiednią inkorporację nanocząsteczek złota; lub (b) toksyczność systemową (utrata masy ciała > 15%), co sugeruje wyciek Dox z liposomów przed aktywacją promieniami X.
Dyskusja
Kilka etapów w tych protokołach ma kluczowe znaczenie dla powodzenia doświadczenia. W Części A należy precyzyjnie utrzymać molowy stosunek lipidów (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06), ponieważ stężenie VP bezpośrednio determinuje poziom generowania 1O2 i w konsekwencji efektywność uwalniania ładunku9. Wprowadzenie RNP Cas9/sgRNA podczas etapu hydratacji, a nie poprzez kompleksowanie po sformowaniu pęcherzyków, jest niezbędne dla enkapsulacji w wodnym rdzeniu. Ekstruzja przez membranę poliwęglanową o rozmiarze 200 nm (11 przejść) pozwala uzyskać jednorodne pęcherzyki jednowarstwowe; nie należy zastępować jej sonikacją, ponieważ może ona doprowadzić do denaturacji białka Cas9. W Części B kluczowy jest rozmiar nanocząsteczek złota (3–5 nm), gdyż cząstki muszą być wystarczająco małe, aby zostać wbudowane w dwuwarstwę lipidową, co umożliwia efektywny transfer energii do VP za pośrednictwem elektronów Augera pod wpływem promieniowania rentgenowskiego11. Metoda gradientu siarczanu amonu stosowana do ładowania Dox wymaga całkowitej dializy zewnętrznego siarczanu amonu przed dodaniem leku; niepełna dializa obniży efektywność ładowania.
Skład lipidowy można dostosować do różnych zastosowań, zachowując mechanizm uwalniania pośredniczony przez VP. Na przykład zastąpienie części DOTAP lipidem pegylowanym (np. DSPE-PEG2000 w stężeniu 5 mol%) może wydłużyć czas krążenia w przypadku podaży systemowej, choć zmniejszy to dodatni ładunek powierzchniowy i może obniżyć wychwyt komórkowy in vitro2. Jeśli pomiary DLS wykażą PDI > 0,3, należy zwiększyć liczbę przejść przez ekstrudery lub sprawdzić szczelność membrany. Jeśli generowanie tlenu singletowego jest niskie mimo prawidłowego wbudowania VP, należy zweryfikować długość fali i gęstość mocy źródła światła LED za pomocą skalibrowanego miernika mocy, ponieważ aktywacja VP jest specyficzna dla długości fali (szczyt pobudzenia przy 425 nm dla pasma Soreta i aktywacja terapeutyczna przy 689–690 nm dla pasma Q)9. W przypadku testów na rybkach danio-ostrogon, jeśli śmiertelność zarodków w grupach traktowanych przekroczy 20%, należy zmniejszyć objętość iniekcji lub stężenie liposomów, aby zminimalizować fototoksyczność związaną z VP. Ustrukturyzowany schemat rozwiązywania problemów, oparty na punktach odniesienia w Tabeli 1, przedstawia się następująco. PDI > 0,3: zwiększyć liczbę przejść przez ekstrudery i sprawdzić szczelność membrany. Niskie lub brak wyzwolonego uwalniania mimo prawidłowego wbudowania VP: potwierdzić emisję 690 nm za pomocą skalibrowanego miernika mocy i zweryfikować molowy stosunek VP. Mniej niż ~50 znokautowanych włókien mięśni wolnokurczliwych na zarodek: ponownie przygotować liposomy, potwierdzić aktywność RNP lub wydłużyć czas naświetlania. Utrata sygnału eGFP w nienaświetlonych kontrolach: sprawdzić warunki przechowywania, używając liposomów w ciągu 48 h od przygotowania i przechowując je w 4°C w ciemności, oraz potwierdzić stabilność membrany. W modelu ksenoprzeszczepu brak różnicy między grupami z liposomami naświetlanymi i nienaświetlanymi wskazuje na konieczność potwierdzenia obecności nanocząsteczek złota o rozmiarze 3–5 nm oraz weryfikacji dostarczonej dawki promieniowania rentgenowskiego.
Głównym ograniczeniem metody wyzwalanej światłem (Część A) jest głębokość penetracji światła o długości fali 690 nm, co ogranicza bezpośrednią aktywację do tkanek powierzchniowo dostępnych lub takich, do których można doprowadzić światło za pomocą światłowodu5. Metoda wyzwalana promieniami X (Część B) pokonuje to ograniczenie głębokości, lecz wymaga dostępu do klinicznego akceleratora liniowego i naraża otaczające tkanki na promieniowanie jonizujące, choć w dawkach terapeutycznych11,12. Obie formulacje opierają się obecnie na DOTAP, kationowym lipidzie powiązanym z cytotoksycznością zależną od dawki, co może ograniczać okno terapeutyczne przy podawaniu ogólnoustrojowym2. Przejściowy charakter edycji genów za pośrednictwem RNP jest korzystny ze względów bezpieczeństwa, ale oznacza, że niepełny knockout w docelowej populacji komórek nie może być wzmocniony poprzez powtarzanie dawek w tym samym miejscu bez ponownego podania nanocząsteczek. Dodatkowo protokoły te zostały zwalidowane w liniach komórkowych i modelach zwierząt laboratoryjnych; przeniesienie ich na większe modele zwierzęce i ostatecznie do zastosowań klinicznych u ludzi będzie wymagało optymalizacji formulacji, badań farmakokinetycznych oraz formalnej oceny toksykologicznej w warunkach GLP. W szczególności protokół ten nie zawiera danych dotyczących farmakokinetyki, biodystrybucji ani penetracji siatkówki. Choć penetracja światła przez tkanki oka i inne tkanki jest dobrze opisana w literaturze jako zależna od długości fali, pigmentacji i rodzaju tkanki (i może być zwiększana za pomocą środków do przejrzyszczania optycznego), ilościowe badania farmakokinetyczne, biodystrybucyjne oraz badania dostarczania do siatkówki pozostają istotnymi kolejnymi krokami, zanim będą można uzasadnić twierdzenia dotyczące zastosowań translacyjnych.
Konwencjonalne systemy LNP, w tym te stosowane w szczepionkach mRNA, uwalniają ładunek pasywnie po wchłonięciu komórkowym poprzez ucieczkę z endosomów i nie oferują kontroli czasowej ani przestrzennej nad dostarczaniem1,2. Wektory wirusowe, takie jak AAV, zapewniają efektywną dostawę genów, lecz są ograniczone pojemnością opakowania (~4,7 kb), immunogennością przy ponownym dawkowaniu oraz konstytutywną ekspresją transgenu, której nie można modulować po podaniu3. Platforma VP-liposomów rozwiązuje te ograniczenia, zapewniając zewnętrznie sterowany mechanizm uwalniania, który jest niezależny od rodzaju ładunku, kompatybilny z dużymi ładunkami (białka, kompleksy RNP i małe cząsteczki), nie wirusowy i potencjalnie odpowiedni do wielokrotnego podawania, zależnie od wyników badań nad immunogennością i toksykologią przy wielokrotnym dawkowaniu. W przeciwieństwie do systemów optogenetycznych lub termoodpowiednich, podejście oparte na VP wykorzystuje zatwierdzony klinicznie fotosensybilizator z ustalonymi danymi dotyczącymi bezpieczeństwa i istniejącą kliniczną infrastrukturą laserową, szczególnie w okulistyce, gdzie laser Visudyne o długości fali 689 nm jest już standardowym wyposażeniem6. Sang i wsp. wykazali ponadto, że hybrydowe nanocząsteczki lipidowo-polimerowe zawierające VP zwiększają skuteczność terapii radiodynamicznej w modelach raka jelita grubego, potwierdzając adaptacyjność generowania ROS za pośrednictwem VP w różnych architekturach nanocząsteczek12.
Opisane tutaj metody mają szczególne znaczenie w trzech schorzeniach okulistycznych. W przypadku naczyniówkowej postaci zwyrodnienia plamki żółtej (nAMD), obciążenie związane z zastrzykami przeciwciał anty-VEGF pozostaje krytyczną barierą dla osiągnięcia optymalnych wyników. Dane z rejestrów rzeczywistych wykazują wyraźne niedostateczne leczenie w porównaniu z protokołami badań klinicznych (średnio 7,3 w przeciwieństwie do 12 zastrzyków w pierwszym roku, przy czym 38,8% pacjentów przerwało leczenie, a zysk w ostrości wzroku był minimalny)14, a także długofalowy spadek funkcji wzrokowych mimo częstego dawkowania23. Terapie genowe oparte na AAV opracowywane w celu zmniejszenia tego obciążenia — ixoberogene soroparvovec15, ABBV-RGX-31416 oraz wyznaczony jako RMAT 4D-150 (redukcja liczby zastrzyków o 83%)24 — wykazują jednak konstytutywną ekspresję transgenów anty-VEGF i nie mogą być miareczkowane ani odcofane. Jest to potencjalna kwestia problematyczna w świetle dowodów łączących ciągłe hamowanie VEGF z zanikiem geograficznym (CATT17; metaanaliza obejmująca 4 609 oczu18; oraz wzrost zapadalności na zanik do 78,3% w ciągu ośmiu lat25). System liposomów VP aktywowanych światłem, przenoszący CRISPR-Cas9 celujący w VEGF-A, mógłby zamiast tego umożliwić przestrzennie ograniczone wyciszenie genu, zapewniając kontrolowane przez klinicystę przestrzenne i czasowe sterowanie początkowym zdarzeniem edycji, przy zachowaniu trwałości edycji genów. Badania przedkliniczne potwierdzają wykonalność tego podejścia. Współ dostarczenie za pomocą LNP mRNA Cas9 oraz sgRNA celującego w VEGFA zredukowało laserowo indukowaną naczyniówkową neowaskularyzację (CNV) u myszy26, warianty LNP z PEG pozwoliły na edycję genomu w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE)27, a LNPs sterowane peptydami dostarczyły mRNA do fotoreceptorów u naczelnych niebędących ludźmi28. Jednakże do początku 2026 roku żadna terapia genowa siatkówki oparta na LNP nie weszła w fazę badań klinicznych29, co podkreśla potencjał translacyjny. W chorobie Stargardta sekwencja kodująca ABCA4 o długości około 6,8 kb przekracza pojemność pakowania AAV, co wymusza stosowanie strategii dwuwektorowych o obniżonej wydajności transdukcji19. Kandydaci kliniczni obejmują platformy dual-AAV SB-007 i VG80130, a także terapię modyfikującą, niezależną od konkretnego genu, OCU410ST31. Nieviralne dostarczanie kwasów nukleinowych może ominąć ograniczenia pakowania AAV. Nanocząsteczki PEG-ECO przenoszące plazmid ABCA4 zredukowały akumulację A2E u myszy Abca4-/-20, podczas gdy oddzielne badania wykazały możliwość dostarczenia dużych konstruktów DNA do siatkówki32 oraz ekspresję mRNA za pośrednictwem LNP w tkankach oka33. Ponieważ miejscowe leczenie plamki i dołka jest wystarczające do zachowania widzenia centralnego, liposomy VP są dobrze dostosowane do dostarczania wysokich stężeń ładunku terapii genowej precyzyjnie do tych obszarów. W przypadku czerniaka naczyniówkowego verteporfina działa poprzez trzy komplementarne mechanizmy: cytotoksyczność indukowaną przez PDT, hamowanie szlaku YAP/TAZ (przy czym ekspresja YAP1 koreluje z najsilniejszymi markerami przerzutowymi, monosomią 3 i utratą BAP1)21 oraz immunogeniczną śmierć komórek poprzez aktywację cGAS-STING. Połączenie hamowania YAP za pomocą VP i PDT z terapią anty-PD-L1 przekształciło immunologicznie „zimne” guzy w guzy immunologicznie aktywne, co wyraźnie zahamowało wzrost nowotworu i przedłużyło przeżycie w modelach ortotopowych22. Wyniki te są spójne z raportowanym 80-procentowym wskaźnikiem odpowiedzi na PDT opartą na verteporfinie jako leczenie pierwszego rzutu w czerniaku naczyniówkowym34. Dostępność optyczna oka dla aktywacji falą 689 nm, wraz z precyzyjną lokalizacją większości czerniaków naczyniówkowych, pozycjonuje liposomy VP jako obiecującą platformę do dostarczania miejscowego leczenia, co potencjalnie zmniejsza zachorowalność związaną z obecnymi metodami brachyterapii i protonoterapii.
Poza omówionymi powyżej zastosowaniami w okulistyce i onkologii, platforma liposomów VP znajduje zastosowanie w każdym kontekście terapeutycznym wymagającym zewnętrznie kontrolowanego, uwalnianego na żądanie ładunku. Potencjalne zastosowania obejmują wyzwalaną światłem edycję genów w schorzeniach dermatologicznych dostępnych dla iluminacji przezskórnej, wyzwalane promieniami Rentgena uwalnianie chemioterapeutyków zsynchronizowane z klinicznymi harmonogramami frakcjonowania radioterapii oraz przestrzennie ukierunkowany knockout genów w badaniach nad biologią rozwojową. Kilka fotoaktywowalnych systemów edycji genów zostało zademonstrowanych w tkankach pozasiatkówkowych, w tym fotoaktywowalny edytor zasad Mag-ABE do spatiotempelnie kontrolowanej edycji genomu in vivo35 oraz system nanocząsteczek upkonwersyjnych aktywowanych bliską podczerwienią (NIR) do spatiotempelnie kontrolowanej edycji CRISPR-Cas9 i terapii fotodynamicznej36. W okulistyce rosnące zainteresowanie strategiami trwałości supresji VEGF dodatkowo podkreśla potrzebę stosowania systemów dostarczania, które łączą długoterminową skuteczność terapeutyczną z zewnętrzną kontrolą nad czasem i miejscem aktywności biologicznej37. Integracja tych metod wytwarzania z wyłaniającymi się technologiami dostarczania LNP do siatkówki oraz fotoaktywowalnymi systemami edycji genów stanowi konwergencję indywidualnie zwalidowanych komponentów, których połączone zastosowanie w oku pozostaje otwartym i potencjalnie wysokowpływowym obszarem badawczym. Bieżące prace w naszej grupie są skierowane na optymalizację formulacji dla dróg podania podsiatkówkowego i domiszczowego, ocenę profilu bezpieczeństwa w okulistycznych modelach na dużych zwierzętach oraz adaptację metody wyzwalanej promieniami Rentgena do jednoczesnego stosowania ze standardowymi protokołami radioterapii w onkologii klinicznej.
Oświadczenia
Y.A.A. jest dyrektorem i współzałożycielem firmy EosGene Therapeutics Pty Ltd, która posiada patenty związane z opisaną w niniejszym dokumencie technologią nanocząsteczek lipidowych aktywowanych światłem. E.M.G. i W.D. są współzałożycielami firmy EosGene Therapeutics.
Podziękowania
Autorzy wyrażają wdzięczność za udostępnienie zaplecza oraz pomoc techniczną zapewnioną przez Macquarie University Zebrafish Facility (prace z rybkami zebrafish) oraz Macquarie University Animal Ethics Committee. Praca ta była częściowo finansowana przez ARC Centre of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CE140100003). Autorzy dziękują również za wsparcie udzielone przez EosGene Therapeutics Pty Ltd.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| membrana filtracyjna 20 nm (Anotop 10 lub odpowiednik) | Whatman (Cytiva) | N/A | Stosowana do oddzielania wolnego Cas9 podczas pomiarów wydajności enkapsulacji |
| źródło światła LED 690 nm | Thorlabs | M690L4 | Źródło światła do wyzwalania uwalniania ładunku z liposomów za pośrednictwem VP; regulowana gęstość mocy |
| antybiotyk–antymykotyk (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Suplement do hodowli komórkowej; stężenie końcowe 1% |
| butla z argonem i regulator | N/A | N/A | Stosowane do odparowania rozpuszczalnika podczas przygotowywania filmu lipidowego |
| Avanti Mini Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | Ręczny system ekstruzji stosowany z membranami poliwęglanowymi 200 nm do standaryzacji rozmiaru liposomów |
| myszy BALB/c nude (samice, 5–6 tygodni) | Animal Resources Centre | N/A | Myszy immunodeficyjne stosowane w modelu ksenoprzeszczepu guza HCT116 |
| Zestaw do oznaczania białek BCA | Thermo Fisher Scientific | N/A | Stosowany do ilościowego oznaczenia wolnego Cas9 i pomiarów wydajności enkapsulacji |
| System obrazowania Bio-Rad ChemiDoc MP | Bio-Rad Laboratories | 12003154 | System obrazowania żeli i western blotów |
| Kalceina | Sigma-Aldrich | C0875 | Barwnik fluorescencyjny do testów uwalniania; samogaszenie przy wysokich stężeniach |
| Spektrofotometr Cary 5000 UV-Vis-NIR | Agilent Technologies | N/A | Spektroskopia absorpcyjna UV-Vis liposomów i werteporfiny |
| komórki CCD841 CoN (ludzki normalny nabłonek jelita grubego) | ATCC | CRL-1790 | Linia komórkowa normalnego nabłonka jelita grubego; stosowana jako kontrola nienowotworowa |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Rozpuszczalnik organiczny do przygotowywania filmu lipidowego |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | Składnik membrany liposomów stosowany w formulacji wyzwalanej światłem |
| Kliniczny liniowy akcelerator (wiązka fotonów 6 MeV) | Varian Medical Systems | N/A | Kliniczne źródło promieni rentgenowskich do badań napromieniowania |
| Suwmiarka cyfrowa | N/A | N/A | Stosowana do pomiarów objętości guza ksenoprzeszczepu |
| Dimetylosulfoksyd (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Rozpuszczalnik do przygotowania roztworu zapasowego werteporfiny |
| DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocholina) | Avanti Polar Lipids | 850375P | Składnik lipidowy stosowany w formulacji wyzwalanej promieniami X |
| DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) | Sigma-Aldrich | P1223 | Lipid pomocniczy stosowany w formulacji wyzwalanej światłem |
| DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetyloamoniowo-propan) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Lipid kationowy stosowany w obu formulacjach |
| Wodorochlorek doksorubicyny | Sigma-Aldrich | D1515 | Lek chemioterapeutyczny wprowadzony do liposomów wyzwalanych promieniami X |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Polar Lipids | 880120P | Lipid pegylowany stosowany w formulacji wyzwalanej promieniami X |
| Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Podłoże do hodowli komórek HEK293 i PC12 |
| Sól fizjologiczna DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | Bufor do płukania |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | Suplement do hodowli komórkowej; stężenie końcowe 10% |
| Spektrofluorometr Fluorolog-Tau3 | HORIBA Scientific | N/A | Spektroskopia fluorescencyjna do charakteryzacji werteporfiny |
| Oprogramowanie do składania ostrości (np. Zerene Stacker) | N/A | N/A | Stosowane do generowania obrazów typu focus-stack w obrazowaniu danio-pręgowanych |
| Liofilizator (Alpha 1-4 LDplus) | Martin Christ / John Morris Scientific | N/A | Stosowany do suszenia próżniowego i usuwania rozpuszczalnika |
| sgRNA GFP | Thermo Fisher Scientific | A35943 | Pojedyncze przewodniczące RNA celujące w eGFP; stosowane do walidacji nokautu |
| Nanocząstki złota (3–5 nm, stabilizowane cytrynianem) | NanoComposix | N/A | Radiosensybilizator stosowany w formulacji wyzwalanej promieniami X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 7.0 | Analiza statystyczna i wizualizacja danych |
| komórki HCT116 (ludzki rak jelita grubego) | ATCC | CCL-247 | Linia komórkowa raka jelita grubego stosowana w badaniach in vitro i in vivo |
| komórki HEK293/GFP | GenTarget | SC001 | Stabilna linia komórkowa ekspresująca GFP stosowana do walidacji nokautu CRISPR |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Barwnik jądrowy; stężenie robocze 5 µg/mL |
| Oprogramowanie do analizy obrazu (np. Imaris) | Bitplane (Oxford Instruments | N/A | Stosowane do ilościowego oznaczenia znokautowanych włókien mięśni wolnokurczliwych |
| ImageJ/Fiji | National Institutes of Health (NIH) | Open source | Oprogramowanie do analizy obrazu |
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny | Leica Microsystems | DMi3000 | Stosowany do obrazowania reporterów u danio-pręgowanych i oceny fluorescencji GFP |
| System obrazowania in vivo IVIS SpectrumCT | PerkinElmer | 128201 | System fluorescencyjnego obrazowania in vivo |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy JEOL JEM-1400 | JEOL | JEM-1400 | Obrazowanie TEM liposomów |
| Konfokalny mikroskop Leica SP2 | Leica Microsystems | N/A | Obrazowanie konfokalne poboru komórkowego |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | N/A | N/A | Stosowana do mocowania zarodków danio-pręgowanych podczas obrazowania |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Odczynnik do transfekcji stosowany jako kontrola pozytywna |
| Oprogramowanie Living Image | PerkinElmer | N/A | Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu |
| Podłoże McCoy's 5A | Thermo Fisher Scientific | 16600082 | Podłoże do hodowli komórek HCT116 |
| System mikroiniekcji | N/A | N/A | Stosowany do mikroiniekcji zarodków danio-pręgowanych na etapie jednej komórki |
| Test proliferacji komórek MTS | Promega | G3582 | Test żywotności komórek |
| Spektrofotometr NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Pomiary czystości i stężenia RNA |
| Woda wolna od nukleaz | Thermo Fisher Scientific | R0582 | Stosowana do przygotowania kompleksów RNP CRISPR-Cas9 |
| Podłoże Opti-MEM z obniżoną zawartością surowicy | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Podłoże do transfekcji |
| Paraformaldehyd (4%) | Sigma-Aldrich | P6148 | Utrwalacz do analiz histologicznych |
| komórki PC12 (szczurzy feochromocytoma) | ATCC | CRL-1721 | Linia komórkowa o charakterze neuronalnym stosowana w badaniach poboru |
| Membranowe filtry poliwęglanowe (200 nm) | Avanti Polar Lipids | 610006 | Membrany do ekstruzji w celu ustalenia rozmiaru liposomów |
| Zestaw RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | Zestaw do ekstrakcji RNA |
| Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) | Thermo Fisher Scientific | S36002 | Sonda fluorescencyjna do detekcji tlenu singletowego |
| Urządzenia do dializy Slide-A-Lyzer MINI (MWCO 10 kDa) | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Urządzenia do dializy stosowane przy przygotowywaniu liposomów i ładowaniu leku |
| Barwnik do żeli kwasów nukleinowych SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | Barwnik do żeli kwasów nukleinowych |
| danio-pręgowane Tg(ubi:EGFP) | Zebrafish International Resource Center | ZDB-GENO-080606-2 | Transgeniczne danio-pręgowane stosowane do walidacji CRISPR in vivo |
| TNF-α (rekombinowany ludzki) | Life Technologies | RTNFAI | Cytokina stosowana w badaniach indukcji TNFAIP3 |
| sgRNA TNFAIP3 | Thermo Fisher Scientific | N/A | sgRNA celująca w TNFAIP3 |
| Metansulfonian tricainy (MS-222) | N/A | N/A | Środek anestetyczny dla danio-pręgowanych stosowany przed obrazowaniem |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent stosowany do lizy liposomów i testów uwalniania |
| Białko TrueCut Cas9 v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | Nukleaza Cas9 stosowana do przygotowania kompleksów RNP CRISPR-Cas9 |
| Trypsyna-EDTA (0,25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | Odczynnik do dysocjacji komórek |
| Octan uranylu (2%) | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Barwnik negatywny do obrazowania TEM |
| Werteporfina | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Fotosensybilizator włączony do formulacji liposomowych |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | ZEN3600 | Pomiary dynamicznego rozpraszania światła i potencjału zeta |
Bibliografia
- Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-15.
- Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Mol Ther. 2017;25(7):1467-75.
- Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-78.
- Kim S et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-19.
- Wilson BC, Patterson MS. The physics, biophysics and technology of photodynamic therapy. Phys Med Biol. 2008;53(9):R61-R109.
- Scott LJ, Goa KL. Verteporfin. Drugs Aging. 2000;16(2):139-46.
- Treatment of Age-related Macular Degeneration With Photodynamic Therapy (TAP) Study Group. Photodynamic therapy of subfoveal choroidal neovascularization in age-related macular degeneration with verteporfin: one-year results of 2 randomized clinical trials—TAP Report 1. Arch Ophthalmol. 1999;117(10):1329-45. doi:10.1001/archopht.117.10.1329.
- Boettner EA, Wolter JR. Transmission of the ocular media. Invest Ophthalmol. 1962;1(6):776–83.
- Aksoy YA et al. Spatial and temporal control of CRISPR-Cas9-mediated gene editing delivered via a light-triggered liposome system. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52433-44.
- Ogilby PR. Singlet oxygen: there is indeed something new under the sun. Chem Soc Rev. 2010;39(8):3181-209.
- Deng W et al. Controlled gene and drug release from a liposomal delivery platform triggered by X-ray radiation. Nat Commun. 2018;9(1):2713.
- Sang R et al. Unlocking the in vivo therapeutic potential of radiation-activated photodynamic therapy for locally advanced rectal cancer with lymph node involvement. EBioMedicine. 2025;116:105724.
- Fleckenstein M, Schmitz-Valckenberg S, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration: a review. JAMA. 2024;331(2):147-57.
- Wykoff CC et al. Impact of anti-VEGF treatment and patient characteristics on vision outcomes in neovascular age-related macular degeneration: up to 6-year analysis of the AAO IRIS Registry. Ophthalmol Sci. 2024;4(2):100421.
- Khanani AM et al. Safety and efficacy of ixoberogene soroparvovec in neovascular age-related macular degeneration in the United States (OPTIC): a prospective, two-year, multicentre phase 1 study. EClinicalMedicine. 2024;67:102394.
- Campochiaro PA et al. Gene therapy for neovascular age-related macular degeneration by subretinal delivery of RGX-314: a phase 1/2a dose-escalation study. Lancet. 2024;403(10436):1563-73.
- Maguire MG et al. Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials. Ophthalmology. 2016;123(8):1751-61.
- Eshtiaghi A et al. Geographic atrophy incidence and progression after intravitreal injections of anti-vascular endothelial growth factor agents for age-related macular degeneration: a meta-analysis. Retina. 2021;41(12):2424-35.
- Li R et al. Split AAV8 mediated ABCA4 expression for gene therapy of mouse Stargardt disease (STGD1). Hum Gene Ther. 2023;34(13-14):616-28.
- Sun D et al. Effective gene therapy of Stargardt disease with PEG-ECO/pGRK1-ABCA4-S/MAR nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids. 2022;29:823-35.
- Brouwer NJ et al. Targeting the YAP/TAZ pathway in uveal and conjunctival melanoma with verteporfin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2021;62(4):3.
- Zhang S et al. Combination of YAP inhibition and photodynamic therapy induces dual DNA damage and activates STING pathway to enhance immunotherapy in uveal melanoma. Redox Biol. 2026;89:103965. doi:10.1016/j.redox.2025.103965.
- Cheema MR, DaCosta J, Talks J. Ten-year real-world outcomes of anti-vascular endothelial growth factor therapy in neovascular age-related macular degeneration. Clin Ophthalmol. 2021;15:279-87.
- Kay C et al. Interim results from the phase 2b population extension cohort in the PRISM clinical trial evaluating 4D-150 in adults with neovascular (wet) age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025;66(8):1861.
- Vofo BN et al. Long-term macular atrophy growth in neovascular age-related macular degeneration: influential factors and role of genetic variants. Eye (Lond). 2025;39(9):1717-23.
- Cao D et al. Dynamically covalent lipid nanoparticles mediate CRISPR-Cas9 genome editing against choroidal neovascularization in mice. Sci Adv. 2025;11(28):eadj0006.
- Gautam M et al. Lipid nanoparticles with PEG-variant surface modifications mediate genome editing in the mouse retina. Nat Commun. 2023;14(1):6468.
- Herrera-Barrera M et al. Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates. Sci Adv. 2023;9(2):eadd4623.
- Wu H et al. Innovative gene delivery systems for retinal disease therapy. Neural Regen Res. 2026;21(2):542-52.
- Riedmayr LM et al. mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy. Nat Commun. 2023;14(1):6578.
- Khanani AM et al. A novel modifier gene therapy to treat Stargardt disease: Phase 1 GARDian1 Trial Insights. Eye (Lond). 2026;40:429–30.
- Goddaer S et al. Overcoming size barriers in retinal gene therapy via lipid nanoparticle-mediated delivery of full-length EYS DNA. Drug Deliv Transl Res. 2026;16(8):2921–36. doi:10.1007/s13346-025-02036-y.
- Chambers CZ et al. Lipid nanoparticle-mediated delivery of mRNA into the mouse and human retina and other ocular tissues. Transl Vis Sci Technol. 2024;13(7):7.
- Yordi S, Soto H, Bowen RC, Singh AD. Photodynamic therapy for choroidal melanoma: What is the response rate? Surv Ophthalmol. 2021;66(4):552-59.
- Zou Q et al. Photoactivatable base editors for spatiotemporally controlled genome editing in vivo. Biomaterials. 2023;302:122328.
- Zeng J et al. Near-infrared optogenetic nanosystem for spatiotemporal control of CRISPR-Cas9 gene editing and synergistic photodynamic therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(1):701-10.
- Campochiaro PA. Sustained suppression of VEGF for treatment of retinal and choroidal vascular diseases. Am J Ophthalmol. 2025;277:1-6.
Przedruki i uprawnienia
