Sorafenib w połączeniu z gemcytabiną wykazuje wstępne dowody na addytywne hamowanie proliferacji komórek HepG2, powoduje korelujące zmiany w ekspresji p-ERK oraz VEGF i hamuje wzrost guza wątroby u myszy NOD/SCID.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
Sorafenib w połączeniu z gemcytabiną wykazuje wstępne dowody na addytywne hamowanie proliferacji komórek HepG2, powoduje korelujące zmiany w ekspresji p-ERK oraz VEGF i hamuje wzrost guza wątroby u myszy NOD/SCID.
Rak wątroby pozostaje jedną z głównych przyczyn śmiertelności związanej z nowotworami ze względu na oporność na leki i ograniczone opcje terapeutyczne. Istnieje pilna potrzeba zbadania strategii terapeutycznych w celu poprawy wyników leczenia. Niniejsze badanie pilotażowe przedstawia protokół oceny potencjalnych efektów i mechanizmów leżących u podstaw połączenia sorafenibu i gemcytabiny w raku wątroby. Wykorzystano linię komórkową raka wątroby HepG2 oraz ustanowiono model ksenotransplantatu w myszach z niedoborem immunologicznym (NOD/SCID). Przedstawiono kluczowe kroki procedury, w tym: (1) hodowlę komórek HepG2 i traktowanie lekami; (2) przygotowanie testu MTT, inkubację oraz odczyt absorbancji; (3) ekstrakcję białek, SDS-PAGE, transfer i immunoblotting dla ERK i p-ERK; (4) ustanowienie podskórnego ksenotransplantatu u myszy NOD/SCID; (5) pomiar guza i obliczenie jego objętości; oraz (6) immunohistochemię VEGF na sekcjach guza. Podano krytyczne kroki, wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów oraz specyfikację sprzętu. Połączenie sorafenibu (3 µmol/L) i gemcytabiny (10 µmol/L) doprowadziło do zahamowania wzrostu na poziomie 71,23% ± 6,76% po 72 h, przy wartości q wynoszącej 1,35, co sugeruje efekt synergistyczny przy tej konkretnej parze dawek w badanych warunkach. W porównaniu z grupą kontrolną, leczenie skojarzone wiązało się z obniżoną ekspresją p-ERK, zmniejszoną objętością guza oraz jakościowo słabszym barwieniem immunohistochemicznym VEGF. Dane te wykazują korelację między obniżoną ekspresją p-ERK a obserwowanym efektem antyproliferacyjnym, bez ustanawiania związku przyczynowo-skutkowego. W komórkach HepG2 i modelu ksenotransplantatu myszy NOD/SCID połączenie sorafenibu i gemcytabiny wykazuje wstępne dowody na potencjał antyproliferacyjny i wiąże się z obniżoną ekspresją VEGF; jednak wynik ten nie stanowi bezpośredniego dowodu na aktywność antyangiogenną, ponieważ nie przeprowadzono analizy gęstości mikronaczyń ani analiz funkcjonalnych naczyń krwionośnych. Ten powtarzalny protokół stanowi przydatne ramy do oceny kombinacji leków w modelach HCC i może być dostosowany do innych schematów terapii celowanej i chemioterapii, choć przed wyciągnięciem jakichkolwiek wniosków klinicznych wymagane są dalsze badania mechanistyczne i walidacja dawek.
Rak wątroby jest jednym z najczęstszych i najgroźniejszych nowotworów, a także jednym z najszybciej rosnących guzów złośliwych1,2. Mimo że zapadalność na raka wątroby spada, ogólne obciążenie tym schorzeniem nadal rośnie. Globalne dane epidemiologiczne z 2022 roku ujawniły, że standaryzowany według wieku wskaźnik zapadalności na raka wątroby w internetowej bazie danych Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022 wynosił 15,0 na 100 000 ludności, podczas gdy standaryzowany według wieku wskaźnik śmiertelności wynosił 26,7 na 100 000 ludności, co czyni go drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów3. Obecnie, z powodu braku skutecznego leczenia raka wątroby, w połączeniu z jego podstępnym początkiem, większość pacjentów umiera w ciągu roku od diagnozy. Sorafenib jest pierwszym zatwierdzonym do stosowania klinicznego wielocelowym inhibitorem kinazy, który celuje w kinazy tyrozynowe receptora, takie jak receptor epidermalnego czynnika wzrostu (EGFR), receptor czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFR) oraz kinazy serynowo-treoninowe4,5. Sorafenib, doustny inhibitor wielu kinaz, wykazuje działanie antyproliferacyjne i antyangiogenne w raku wątroby poprzez oddziaływanie na wiele szlaków czynników wzrostu. Historycznie sorafenib był pierwszą zatwierdzoną przez FDA systemową terapią pierwszego rzutu dla pacjentów z zaawansowanym lub nieoperacyjnym rakiem wątroby6. Jednakże obecny krajobraz leczenia pierwszego rzutu w zaawansowanym raku wątrobowokomórkowym (HCC) znacznie się rozszerzył. Rekomendowane opcje obejmują obecnie m.in. kombinację inhibitorów punktów kontrolnych układu immunologicznego atezolizumab plus bevacizumab, lenwatynib oraz podwójną immunoterapię durwalumab plus tremelimumab. Pomimo tych postępów, sorafenib pozostaje ważną opcją pierwszego rzutu, szczególnie w regionach, gdzie kombinacje immunoterapeutyczne nie są łatwo dostępne lub są przeciwwskazane. Ze względu na jego szerokie zastosowanie w raku wątroby, niepokojem stały się zdarzenia niepożądane związane z lekiem7. W analizie bazy danych FDA Adverse Event Reporting System (FAERS) z lat 2006–2023 zdarzenia niepożądane po zastosowaniu sorafenibu dotyczyły głównie układu pokarmowego, skóry i tkanek podskórnych, a także niespecyficznego dyskomfortu fizycznego, takiego jak infekcje i urazy7. Choć niektórzy pacjenci z zaawansowanym rakiem wątroby mogą odnieść korzyść z leczenia sorafenibem, u większości pacjentów ostatecznie rozwija się oporność lub następuje niepowodzenie terapii, co prowadzi do złego rokowania8,9,10. Mimo stosowania, sorafenib przynosi korzyść jedynie około 30% pacjentów z HCC; ponadto osoby odpowiadające na leczenie często rozwijają oporność w ciągu 6 miesięcy11. Szlaki molekularne zaangażowane w oporność na sorafenib obejmują kinazę regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK)/fosforylowaną ERK (p-ERK), kinazę białkową B (Akt), fosfoinosytydol 3-kinazę (PI3K)/AKT/ssaczy cel mTOR (mTOR), czynnik indukowany hipoksją 1α (HIF-1α)/HIF-2α oraz szlaki związane z autofagią, przy czym w niniejszych badaniach szczególnie wyróżniono i wybrano ERK/p-ERK11. Gemcytabina jest analogiem cytydyny, który po wprowadzeniu do organizmu przekształca się w difluorocytydynodifosforan i difluorocytidyntryfosforan, wywierając różne hamujące efekty na syntezę DNA12. W nowotworach hepatobiliarnych gemcytabinę oceniano jako składnik chemioterapii skojarzonej. Jednak w raportach klinicznych wskazano również, że gemcytabina wykazuje większą oporność na leki, co ogranicza jej skuteczność12,13. W związku z tym skuteczne i efektywne ustalenie optymalnego schematu leczenia jest niezwykle trudne. Niedawne badania wykazały, że gemcytabina w połączeniu z sorafenibem może wykazywać zwiększoną skuteczność terapeutyczną w oparciu o nowatorską predykcję biomarkera macierzystości guza14. Jednak z naszej wiedzy żadne badanie nie analizowało tej kombinacji specyficznie w raku wątroby z wykorzystaniem komórek HepG2 i modelu ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego u myszy NOD/SCID (non-obese diabetic/severe combined immunodeficient). W związku z tym nadal brakuje dowodów eksperymentalnych bezpośrednio potwierdzających efekty addytywne sorafenibu i gemcytabiny w raku wątroby.
Procedury opisane w niniejszym manuskrypcie są powszechnie stosowane, lecz rzadko prezentowane w szczegółowym, wizualnym formacie krok po kroku, który byłby odpowiedni do powtórzenia przez badaczy na wczesnym etapie kariery. Postawiliśmy hipotezę, że połączenie sorafenibu i gemcytabiny będzie addytywnie hamować proliferację komórek raka wątroby oraz wzrost guza, a efekt ten będzie związany z obniżeniem aktywności szlaku ERK/p-ERK oraz zredukowaną angiogenezą zależną od czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Niniejsze badanie ma na celu wstępne zbadanie hamującego wpływu sorafenibu w połączeniu z gemcytabiną na proliferację linii komórkowej raka wątroby HepG2 in vitro oraz in vivo i analiza mechanizmu tego procesu (Supplementary Figure 1). Nowatorstwo tego badania przejawia się w trzech aspektach: (1) jest to pierwsze badanie testujące kombinację sorafenibu i gemcytabiny specjalnie w raku wątroby z wykorzystaniem powszechnie stosowanej linii komórkowej HepG2 oraz odpowiadającego modelu myszy NOD/SCID; (2) bada mało poznany szlak ERK/p-ERK jako potencjalny mechanizm; oraz (3) dostarcza bezpośrednich dowodów eksperymentalnych — zamiast przewidywań obliczeniowych — na addytywny efekt tej kombinacji w raku wątroby. Cechy te odróżniają niniejszą pracę od wcześniejszych doniesień na temat terapii skojarzonej przeprowadzonych w innych typach nowotworów lub z wykorzystaniem różnych modeli eksperymentalnych, szczególnie w kontekście schematów opartych na sorafenibie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zgoda etyczna została udzielona przez Zhejiang University-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review (numer zgody ZJU20250049).
Zwierzęta i grupowanie
Łącznie 40 samic myszy NOD/SCID w wieku 4–5 tygodni o masie ciała 18–20 g zakupiono od licencjonowanego dostawcy komercyjnego (Licencja nr SCXK (Shanghai) 2013-0006) i zakwaterowano w pomieszczeniach dla zwierząt klasy SPF (wolnych od specyficznych patogenów). Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt były zgodne ze standardowymi wytycznymi. Podczas eksperymentu zwierzęta miały swobodny dostęp do pokarmu i wody, były przetrzymywane w grupach (5 myszy/klatka) w kontrolowanym pomieszczeniu SPF, w którym utrzymywano temperaturę 22 ± 2 °C, wilgotność 50%–60% oraz cykl światła/ciemności 12/12 h. Zwierzęta otrzymywały pokarm i wodę ad libitum, a ich masa ciała była monitorowana co 2 tygodnie. W przypadku wystąpienia u myszy uporczywego bólu, kacheksji, owrzodzeń nowotworowych, osiągnięcia przez guz maksymalnego wymiaru 2 cm lub innych nieodwracalnych problemów zdrowotnych, przeprowadzano eutanazję poprzez dostrzykiewnotrzewnikowe wstrzyknięcie 0,45% pentobarbitalu sodowego w dawce ≥150 mg/kg masy ciała, a następnie potwierdzano ustanie oddechu i bicia serca, brak odruchu rogówkowego lub stosowano wtórną metodę fizyczną, jeśli było to konieczne, zgodnie z kryteriami humanitarnego zakończenia eksperymentu zatwierdzonymi przez Komisję Etyki ds. Zwierząt. Wielkość próby (n = 10 na grupę) określono na podstawie analizy mocy, zakładając wielkość efektu 1,2 (wyznaczoną na podstawie eksperymentów pilotażowych), α = 0,05 oraz β = 0,20 (moc 80%), z uwzględnieniem 20% marginesu na ubytki. Procedury implantacji guzów przeprowadzono przed przydzieleniem do grup terapeutycznych (patrz poniżej w sekcji dotyczącej tworzenia ksenograftów).
Po implantacji guza i potwierdzeniu jego przyjęcia, myszy zostały losowo podzielone na 4 grupy z wykorzystaniem metody tablicy liczb losowych: grupę kontrolną, grupę sorafenibu, grupę gemcytabiny oraz grupę łączoną sorafenibu z gemcytabiną, po 10 myszy (5 myszy/klatka) w każdej grupie, w celu stworzenia modelu transplantacyjnego guza u myszy NOD/SCID. Ponieważ tkanki nowotworowe w procesie modelowania mogą powodować pogorszenie stanu ogólnego lub nawet śmierć myszy NOD/SCID, a biorąc pod uwagę, że analiza statystyczna zazwyczaj wymaga odpowiedniej wielkości próby, do każdej grupy włączono co najmniej 10 myszy. Losowy podział grup został przeprowadzony przez niezależnych techników, a klatki zostały oznakowane; podczas podawania leków lub pomiaru guza nie zastosowano maskowania, co stanowi istotne ograniczenie. Pozostałe pobrania tkanek, oceny biochemiczne i patologiczne były przeprowadzane przez personel laboratoryjny w warunkach maskowania. Dane były również analizowane w sposób zaślepy przez statystyków, którzy mieli dostęp wyłącznie do zakodowanych plików aż do momentu zakończenia obliczeń i odsłonięcia danych. Wszystkie zwierzęta zostały włączone do końcowej analizy. Dla obu leków wybrano drogę podania doszpikową, aby zapewnić wchłanianie systemowe i spójną biodostępność; dawkowanie raz na dobę oparto na wcześniejszych badaniach farmakokinetycznych, wykazujących utrzymujące się stężenia w osoczu przy takim schemacie. Grupa kontrolna (nośnik) otrzymała dożylnie 0,2 mL sterylnej soli fizjologicznej. W grupie sorafenibu wstrzyknięto dożylnie 0,2 mL sorafenibu w dawce 40 mg/kg. W grupie gemcytabiny wstrzyknięto dożylnie 0,2 mL gemcytabiny w dawce 100 mg/kg. Grupa leczenia łączonego: dożylnie podano po 0,2 mL sorafenibu (40 mg/kg) i gemcytabiny (100 mg/kg). Każda grupa otrzymywała leki raz dziennie przez 20 kolejnych dni. Wszystkie zwierzęta zostały włączone do końcowej analizy, żadna mysz nie została wykluczona z badania. W żadnej grupie nie zaobserwowano śmiertelności podczas 20-dniowego okresu leczenia. Harmonogram i dawki wybrano na podstawie opublikowanych badań w modelach raka dróg żółciowych i wątroby. Należy zauważyć, że codzienne podawanie gemcytabiny drogą doszpikową może wywoływać toksyczność. Długość i szerokość przeszczepionych guzów mierzono codziennie, a następnie obliczano ich objętość. Po 20 dniach zwierzęta uśpiono poprzez zwichnięcie szyi pod głęboką narkozą, a tkanki przeszczepionych guzów utrwalono w formalinie. Masę ciała mierzono co 2 dni przez cały okres trwania badania. Myszy monitorowano codziennie pod kątem klinicznych objawów toksyczności, w tym piloreksji, zgarbionej postawy, ograniczonej ruchomości, biegunki i letargu. Jednakże nie wykonano badań biochemicznych surowicy (np. aktywnościy aminotransferazy alaninowej, aminotransferazy asparaginianowej i poziomu kreatyniny) ani badania histopatologicznego głównych organów. W związku z tym nie można wykluczyć toksyczności subklinicznej.
Leki i odczynniki
Sorafenib rozpuszczono w 10% dimetylosulfoksydzie (DMSO) i przechowywano w temperaturze -20 °C. Przed użyciem roztwór rozmrożono i rozcieńczono do końcowego stężenia DMSO poniżej 0,5%, co nie miało wpływu na wzrost komórek. Gemcytabinę pozyskano z komercyjnego źródła. Bufor do lizy w teście immunoprecypitacji radioaktywnej (RIPA), błękit tiazolowy, przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko dehydrogenazie gliceraldehydu-3-fosforanu (GAPDH), ERK, p-ERK i VEGF, przeciwciała drugorzędowe, wysokoglukozowe pożywka DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), płodowa surowica bydlęca oraz linia komórkowa HepG2 zostały pozyskane z komercyjnych źródeł.
Sorafenib i gemcytabina są środkami cytotoksycznymi. Wszystkie procedury przygotowania i obchodzenia się z lekami powinny być wykonywane w wyznaczonej komorze z laminarnym przepływem powietrza przy zachowaniu odpowiednich środków ochrony indywidualnej (fartuch laboratoryjny, rękawiczki nitrylowe i okulary ochronne). DMSO, metanol, ksylen i inne rozpuszczalniki organiczne stosowane w niniejszym protokole są niebezpieczne i powinny być używane w dygestorium, aby uniknąć ich wdychania lub kontaktu ze skórą. Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki bezpieczeństwa (MSDS) wszystkich odczynników.
Hodowla komórkowa
Linia komórkowa HepG2 została rozmrożona i zaszczepiona do butelek hodowlanych zawierających 10 mL pożywki DMEM z wysoką zawartością glukozy (uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny-streptomycyny oraz 4 mmol/L glutaminy). Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z zawartością 5% CO₂. Pożywkę hodowlaną wymieniano co 2 dni, a pasażowanie komórek przeprowadzano co 4 dni w celu utrzymania wzrostu logarytmicznego. Linia komórkowa HepG2 została pozyskana z komercyjnego źródła; jednak w niniejszym badaniu nie przeprowadzono niezależnej autentykacji linii komórkowej (np. profilowania krótkich powtórzeń tandemowych) ani testów w kierunku obecności mikoplazmy.
Metoda MTT do wykrywania stopnia hamowania proliferacji
Do określenia stopnia hamowania proliferacji linii komórkowej HepG2 przez sorafenib i gemcytabinę zastosowano metodę z użyciem bromku 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliu (MTT). Komórki w fazie wzrostu logarytmicznego trawiono 0,25% trypsyną przez 2 min, a trawienie przerwano poprzez dodanie równiej objętości pożywki kompletnej. Po wirowaniu przy 1000 × g przez 10 min komórki zawieszono ponownie w pożywce kompletnej. Zagęszczenie komórek dostosowano do 1 × 105 komórek/mL, a 200 µL zawiesiny komórkowej naniesiono do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Gęstość wysiewu wybrano na podstawie wstępnych eksperymentów optymalizacyjnych, w których testowano zagęszczenia od 5 × 103 do 5 × 104 komórek/dołek. Zagęszczenie 2 × 104 komórek/dołek doprowadziło do liniowego wzrostu absorbancji w ciągu 96 h i pozwoliło utrzymać konfluencję poniżej 80% w punkcie końcowym, co potwierdzono podczas oględzin pod mikroskopem odwróconym. Aby zapewnić, że pomiary MTT pozostały w zakresie liniowym, w każdym punkcie czasowym przeprowadzono eksperymenty pilotażowe z dołkami kontrolnymi traktowanymi nośnikiem. Pożywkę wymieniano co 48 h, aby zapobiec wyczerpaniu składników odżywczych i gromadzeniu się produktów przemiany materii. Konfluencję monitorowano codziennie za pomocą mikroskopu odwróconego. Po 96 h dołki kontrolne osiągnęły konfluencję około 75%–80% i nie zaobserwowano wyraźnych oznak wyczerpania składników odżywczych. Po przytwierdzeniu komórek usunięto pożywkę i dodano pożywkę zawierającą lek. Do grupy kontrolnej nietraktowanej dodano pożywkę bez leku (kontrola nośnika dla eksperymentów in vivo). Eksperyment podzielono na grupę kontrolną nietraktowaną, grupę sorafenibu, grupę gemcytabiny oraz grupę leczenia skojarzonego. Dawki sorafenibu wynosiły 1,5 µmol/L, 3 µmol/L, 4,5 µmol/L i 6 µmol/L, a dawki gemcytabiny: 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L i 20 µmol/L. Dawki sorafenibu w połączeniu z gemcytabiną wynosiły 1,5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4,5 µmol/L + 15 µmol/L oraz 6 µmol/L + 20 µmol/L. Komórki w każdej grupie hodowano przez 24 h, 48 h, 72 h i 96 h. Po hodowli do każdego dołka dodano 20 µL MTT o stężeniu 5 mg/mL, a komórki inkubowano w inkubatorze komórkowym przez 4 h. Ostrożnie usunięto supernatant, a następnie do każdego dołka dodano 150 µL DMSO i wstrząsano płytką przez 10 min do całkowitego rozpuszczenia formazanu; wartość gęstości optycznej (OD) każdego dołka mierzono przy 490 nm za pomocą wielofunkcyjnego czytnika płytek mikrodołkowych. Eksperyment powtórzono trzykrotnie, a każda grupa obejmowała pięć powtórzeń w dołkach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech powtórzeń biologicznych. Stopień hamowania wzrostu komórek (%) = (1 - OD grupa eksperymentalna / OD grupa nietraktowana) × 100%. Interakcję między dwoma lekami oceniano na podstawie wartości q, którą obliczono według wzoru: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). Tutaj EA i EB to stopnie hamowania leków A i B stosowanych pojedynczo, a EAB to stopień hamowania przy jednoczesnym zastosowaniu obu leków. Wartość q większa niż 1,15 wskazuje na efekt synergistyczny między lekami; 0,85–1,15 wskazuje na efekt addytywny, a q mniejsze niż 0,85 wskazuje na efekt antagonistyczny. Metoda wartości q jest prostym narzędziem przesiewowym i nie zastępuje bardziej rygorystycznych analiz synergizmu. Przetestowano jedynie kilka par dawek o stałym stosunku, co ogranicza wiarygodność twierdzeń o synergii. Dlatego termin „synergia” w niniejszym badaniu odnosi się do q > 1,15 dla konkretnych par dawek i punktów czasowych, a nie do zwalidowanej interakcji addytywnej w pełnej macierzy odpowiedź-dawka.
Analiza Western blot ekspresji białek ERK i p-ERK
Hodowla komórek i podział na grupy eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z powyższym opisem. Do detekcji ERK i p-ERK metodą Western blotting zastosowano dawkę sorafenibu 3 µmol/L, dawkę gemcytabiny 10 µmol/L oraz dawkę łączoną 3 µmol/L + 10 µmol/L. Po 72 h inkubacji komórki lizowano buforem do lizy RIPA, a z każdej grupy eksperymentalnej wyekstrahowano całkowite białko. Stężenie białka określono metodą kwasu biczninkoniniowego (BCA). Na żel naniesiono równe ilości białka (30 µg na ścieżkę), które rozdzielono za pomocą 10% elektroforezy żelowej z dodecylosiarczanem sodu i poliakryloamidem (SDS-PAGE) przy napięciu 120 V przez 90 min. Białka przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (rozmiar porów 0,45 µm) przy natężeniu 300 mA przez 90 min w temperaturze 4 °C. Po blokowaniu 5% mlekiem odtłuszczonym w buforze TBS z 0,1% Tween-20 (TBST) przez 1 h w temperaturze pokojowej, membrany inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C przy delikatnym wstrząsaniu. Po trzech przemyciach w TBST (po 10 min każde), membrany inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 h w temperaturze pokojowej. Prążki białkowe wizualizowano przy użyciu substratu do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL), a obrazy zarejestrowano za pomocą cyfrowego systemu obrazowania żeli. Czas ekspozycji zoptymalizowano dla każdego przeciwciała, aby uniknąć nasycenia sygnału. Ilościową analizę densytometryczną przeprowadzono w oprogramowaniu ImageJ przy użyciu narzędzia do analizy żeli. Intensywność prążków wszystkich białek docelowych znormalizowano względem GAPDH jako kontroli załadunku, a ekspresję p-ERK dodatkowo znormalizowano względem całkowitej ekspresji ERK. Nie stosowano żadnych dodatkowych etapów blokowania poza użyciem 5% mleka odtłuszczonego. Wyniki ilościowe przedstawiono jako krotność zmiany względem grupy kontrolnej, przyjętej jako 1,0. Każdy eksperyment powtórzono niezależnie trzykrotnie. Przedstawiono reprezentatywne immunobloty.
Immunohistochemiczne wykrywanie ekspresji VEGF w ksenoprzeszczepach guzów HepG2 u myszy NOD/SCID
W celu utworzenia ksenoprzeszczepu: komórki HepG2 w fazie logarytmicznego wzrostu zebrać poprzez trypsynizację, przemyć dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i resuspendować w bezsurowiczym medium DMEM. Łącznie 2 × 106 komórek w 0,2 mL bezsurowiczego DMEM (bez Matrigelu) wstrzyknąć podskórnie w prawy obszar pachowy (obszar bogato unaczyniony) każdej myszy NOD/SCID za pomocą strzykawki 1 mL, aby stworzyć podskórny model ksenoprzeszczepu HepG2 u myszy NOD/SCID. Przyrost guza monitorować co 2 dni. Wielkość guza mierzyć co dwa dni, a gdy średnica guza osiągnie 0,3–0,5 cm (około 7–10 dni po wstrzyknięciu, co zdefiniowano jako punkt rozpoczęcia leczenia), myszy losowo podzielić na 4 grupy do eksperymentu. Długość (L) i szerokość (W) podskórnego ksenoprzeszczepu mierzyć codziennie za pomocą cyfrowego suwmiarki, a objętość guza (V) obliczyć według wzoru: V = (L × W2) / 2. Wszystkie pomiary przeprowadzić przez badacza zaślepionego na przydział do grup. Po 20 dniach zwierzęta poddać eutanazji poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych w głębokiej anestezji, a tkankę ksenoprzeszczepu utrwalić w 10% neutralnym buforowanym formalinie przez 24 h w temperaturze pokojowej, a następnie zalać parafiną. Przekroje tkankowe (o grubości 5 µm) wykonać za pomocą mikrotomu obrotowego i osadzić na szkiełkach przedmiotowych powlekanych poli-L-lizyną. W badaniu immunohistochemicznym przekroje odparafinizować w ksylenie (trzykrotnie, po 5 min każdorazowo) i rehydratować w serii rozcieńczeń etanolu (100%, 95%, 70%, 50%; po 3 min każdorazowo). Odzyskiwanie antygenu przeprowadzić poprzez ogrzewanie przekrojów w 10 mM buforze cytrynianu sodu w kuchence mikrofalowej przez 15 min, a następnie schłodzić w temperaturze pokojowej przez 20 min. Aktywność endogennej peroksydazy zablokować 3% nadtlenkiem wodoru w metanolu przez 10 min w temperaturze pokojowej. Wiązania niespecyficzne zablokować 5% normalną surowicą kozią w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej. Następnie przekroje inkubować z pierwotnym przeciwciałem anty-VEGF (rozcieńczenie 1 : 200) przez noc w 4 °C w komorze nawilżonej. Po przemyciu PBS (trzykrotnie, po 5 min każdorazowo), przekroje inkubować z wtórnym przeciwciałem kozim anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (1 : 500) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Sygnał wykryć za pomocą substratu 3,3′-diaminobenzydyny (DAB). Przekroje dobarwić hematoksyliną przez 30 s, odwodnić, odbarwić i zamknąć szkiełkami okularowymi przy użyciu trwałego medium montażowego. Obrazowanie przeprowadzić za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w trybie światła przechodzącego przy powiększeniu ×100. Reprezentatywne obrazy przedstawiono w celu ilustracji jakościowej.
Wszystkie zanieczyszczone końcówki, probówki oraz odpady z hodowli komórkowych gromadzono jako odpady biologiczne i autoklawowano przed utylizacją. Odpady chemiczne, w tym roztwory zawierające leki, DMSO, ksylen i metanol, zbierano w oddzielnych, oznakowanych pojemnikach na odpady i utylizowano zgodnie z lokalnymi przepisami instytucjonalnymi dotyczącymi niebezpiecznych odpadów chemicznych.
Analiza statystyczna
Do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie SPSS 19.0. Dane eksperymentalne przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych powtórzeń biologicznych dla eksperymentów in vitro oraz jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) z n = 10 myszy na grupę dla eksperymentów in vivo. Do porównań między dwiema grupami zastosowano dwustronne nieparzyste testy t. Do porównań między wieloma grupami zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Tukeya. Zgłoszono wartości p < 0,05, p < 0,01 oraz p < 0,001.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Hamujący wpływ sorafenibu i gemcytabiny na proliferację komórek HepG2
Sorafenib i gemcytabina hamowały proliferację komórek HepG2 w sposób zależny od dawki, co przedstawiono w Tabeli 1. Terapia skojarzona wykazała znacznie wyższe wskaźniki hamowania we wszystkich punktach czasowych w porównaniu do monoterapii. Test MTT mierzy aktywność metaboliczną, która koreluje z liczbą komórek, ale nie mierzy bezpośrednio proliferacji ani cytotoksyczności. W związku z tym ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Rak wątroby charakteryzuje się wysokim wskaźnikiem śmiertelności ze względu na podstępny początek, szybką progresję oraz niewielką liczbę skutecznych metod leczenia3,15. Zaawansowany rak wątroby często wykazuje oporność na chemioterapię i radioterapię, a obecne opcje, w tym resekcja chirurgiczna i przeszczepienie wątroby, pozostają niewystarczające15,16. Dobrze opracowano łączenie dwóch lub więcej leków c...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cyfrowy system obrazowania żeli | Bio-Rad Laboratories, Inc., USA | 1708280 | |
| pożywka DMEM z wysoką zawartością glukozy | HyClone, USA | SH30243.01 | |
| króliczy przeciwciało monoklonalne przeciwko ERK | Santa Cruz, USA | sc-94 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., Chiny | 11011-8611/11011-8615 | |
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny | Olympus, Japonia | IX73 | |
| przeciwciało królicze poliklonalne przeciwko GAPDH | Santa Cruz, USA | sc-25778 | |
| Gemcytabina | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| Przeciwciało wtórne kozie antykrólicze | Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., Chiny | D111018 | |
| oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Wersja 1.8.0_112 | |
| Czytnik mikropłytek | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | MK3 | |
| króliczy przeciwciało monoklonalne przeciwko p-ERK | Santa Cruz, USA | 9106 | |
| Wirówka z chłodzeniem | Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd. | DL-5M | |
| bufor do lizy RIPA | Instytut Badań nad Technologią Biologiczną Biyuntian, Chiny | P0013B | |
| Mikrotom obrotowy | Leica, Niemcy | CM3050 | |
| Sorafenib | Firma Bayer, Niemcy | 284461-73-0 | |
| Błękit Tiazolowy (MTT) | Sigma, USA | M5655 | |
| Inkubator trzigazowy | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 51026402 | |
| królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko VEGF | BioLegend, USA | B199116 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.