Artykuł metodologiczny

Zasady technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR)

20.4K wyświetleń

DOI:

10.3791/718

29 maja 2008

W tym artykule

Podsumowanie

Wprowadzenie technologii rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR) oraz systemu Cre/lox doprowadziło do licznych osiągnięć w biologii molekularnej i okazało się cennym narzędziem do oceny funkcji genów u zwierząt transgenicznych. W niniejszym wywiadzie omówiono mechanizm rekombinacji specyficznej dla miejsca za pomocą rekombinazy cyklizacyjnej (Cre) oraz sposób, w jaki zastosowanie tego enzymu doprowadziło do opracowania mutagenezy warunkowej, która wykazuje znaczące zalety w porównaniu z tradycyjnymi strategiami nokautu.

Streszczenie

Technologia rekombinaz specyficznych dla miejsca (SSR) umożliwia manipulację strukturą genów w celu zbadania ich funkcji i stała się nieodzownym narzędziem biologii molekularnej. Rekombinazy specyficzne dla miejsca są białkami, które wiążą się z określonymi sekwencjami docelowymi DNA. System Cre/lox został po raz pierwszy opisany w bakteriofagach w latach 80. XX wieku. Rekombinaza Cre jest topoizomerazą typu I, która katalizuje rekombinację specyficzną dla miejsca w DNA pomiędzy dwiema sekwencjami loxP (locus of X-over P1). System Cre/lox nie wymaga żadnych kofaktorów. Sekwencje loxP zawierają odrębne miejsca wiązania dla rekombinaz Cre, które otaczają kierunkową sekwencję rdzeniową, w której zachodzi rekombinacja i reorganizacja. Gdy komórki zawierają sekwencje loxP i wykazują ekspresję rekombinazy Cre, dochodzi do zdarzenia rekombinacyjnego. Dwuniciowy DNA jest przecinany w obu miejscach loxP przez rekombinazę Cre, reorganizowany, a następnie ligowany („nożyczki i klej”). Produkty zdarzenia rekombinacyjnego zależą od względnej orientacji asymetrycznych sekwencji.

Technologia SSR jest często wykorzystywana jako narzędzie do badania funkcji genów. W tej metodzie geny docelowe są flankowane sekwencjami loxP, będącymi miejscami rozpoznawanymi przez rekombinazę Cre (tzw. geny „floxed”). Następnie zwierzęta te krzyżuje się z osobnikami wykazującymi ekspresję rekombinazy Cre pod kontrolą promotora specyficznego dla danej tkanki. W tkankach, w których zachodzi ekspresja rekombinazy Cre, enzym ten wiąże się z sekwencjami docelowymi i wycina floxowany gen. Kontrolowana delecja genu umożliwia badanie jego funkcji w konkretnych tkankach oraz w określonych punktach czasowych. Analiza funkcji genów z wykorzystaniem technologii SSR — czyli mutogeneza warunkowa — wykazuje znaczące zalety w porównaniu z tradycyjnymi nokautami, w których delecja genu jest często letalna.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

System Cre Loxwarunkowa mutagenezadelecja genupromotor specyficzny tkankowomiejsca LoxPtechnologia rekombinazin ynieria genomurekombinacja DNAbiologia molekularna

Powiązane artykuły