Generowanie neuronów GABAergicznych z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych za pomocą indukcji doksycykliny ASCL1/DLX2 ekspresji w AAVS1

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę wytwarzania neuronów GABAergicznych z ludzkich komórek pluripotencjalnych indukowanych poprzez integrację transgenów indukowanych doksycykliną do AAVS1. bezpiecznego lokusu. Stabilne, jednorodne ekspresja transgenów zapewnia efektywne podejście do bezpośredniego różnicowania się w neurony GABAergiczne, ograniczając jednocześnie wyciszenie transgenów, co jest częstym problemem w przypadku podejść lentiwirusowych.

Streszczenie

Ludzkie komórki macierzyste wielopotencjalne indukowane (hiPSCs) oferują bezprecedensową możliwość modelowania ludzkich chorób neurologicznych in vitro. Niezawodne generowanie określonych populacji neuronów, takich jak neurony kwasu gamma-aminomasłowego (GABAergiczne), jest niezbędne do tych badań. Ten protokół szczegółowo opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSCs na neurony GABAergiczne przy użyciu systemu indukowanego doksycykliną. Podejście opiera się na stabilnej integracji transgenów kodujących czynniki transkrypcyjne ASCL1 i DLX2 w lokusu miejsca integracji adeno-skojarzonego wirusa safe-harbor 1 (AAVS1) poprzez knock-in za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Ta ukierunkowana integracja unika wyciszenia transgenów często obserwowanego przy losowej integracji lentiwirusowej. Protokół obejmuje utrzymanie hiPSCs, proces nukleofekcji w celu integracji transgenów, selekcję puromycinem w celu wzbogacenia pomyślnie inżynieryzowanych komórek oraz krok po kroku procedurę różnicowania. Po indukcji doksycykliną, inżynieryzowane hiPSCs szybko opuszczają cykl komórkowy, nabierają morfologii neuronów i wyrażają markery linii GABAergicznej w ciągu 21 dni. Kluczowe kroki obejmują neuroindukcję i następującą po niej dojrzałość za pomocą specyficznych czynników wzrostu, a także potencjalne podejścia do poprawy adhezyjności komórkowej podczas dojrzewania. Ta standaryzowana metoda daje wzbogacone populacje indukowanych neuronów wyrażających markery linii GABAergicznej, zapewniając cenne narzędzie do badań nad neurologią i modelowaniu komórkowego.

Wprowadzenie

Komórki ludzkie pluripotencjalne indukowane (hiPSC) zapewniają unikalną platformę do modelowania ludzkich chorób neurologicznych in vitro oraz do badania złożonych mechanizmów molekularnych, które napędzają rozwój i zwyrodnienie¹. Technologia ta umożliwia generowanie specyficznych dla pacjenta modeli komórkowych w celu zbadania szerokiego zakresu warunków, od wczesnych zaburzeń neurorozwojowych w zespołach rzęskowych² po subtelne zmiany epigenomiczne obserwowane w sporadycznym chorobie Alzheimera³. W związku z tym, kierowana dyferencjacja hiPSC stała się filarem nowoczesnej molekularnej neurobiologii.

Aby skutecznie uchwycić subtelności ludzkich procesów neurologicznych, konieczne jest generowanie wysoce specyficznych i czystych podtypów neuronów. Na przykład, zdefiniowane populacje neuronów są wymagane, aby wyjaśnić specyficzne role transkrypcyjne białek jak MECP2 w ludzkich neuronach⁴ lub aby ocenić ukierunkowane podatności obwodowych neuronów czuciowych na infekcje wirusowe, takie jak SARS-CoV-2⁵. Co więcej, konstruowanie złożonych, fizjologicznie istotnych mikrośrodowisk, jak włączenie funkcjonalnych mikrogleju do 3D organizmów mózgowych, opiera się zasadniczo na solidnym, przewidywalnym wytwarzaniu odrębnych linii neuronowych i glejowych⁶. Wśród tych podtypów, neurony GABAergiczne są szczególnie interesujące ze względu na ich kluczową rolę hamującą w ośrodkowym układzie nerwowym i ich zaangażowanie w różne zaburzenia neurologiczne i psychiatryczne⁷. Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie niezawodnego, wydajnego i powtarzalnego protokołu kierowane dyferencjacji hiPSC w indukowane neurony wyrażające markery linii GABAergicznej. Tradycyjne protokoły kierowane dyferencjacji dla neuronów GABAergicznych, które opierają się na zewnętrznych cząsteczkach sygnałowych, mogą być czasochłonne, bardzo zmienne i prowadzić do heterogenicznych populacji komórek⁸.

Aby pokonać te ograniczenia, kierownictwo przez czynniki transkrypcyjne stało się potężną alternatywą⁹. Ten protokół wykorzystuje system ekspresji indukowany doksycykliną do sterowania ekspresją proneuronalnych czynników transkrypcyjnych ASCL1 i DLX2¹⁰. Poprzez kierowanie tych transgenów do miejsca integracji wirusa adeno-skojarzonego 1 (AAVS1), lokusu safe-harbor za pomocą CRISPR/Cas9, ta metoda omija wspólny problem wyciszenia transgenu związanego z losową integracją lentiwirusową¹⁰. Konstrukt donora zawiera fluorescujący reporter, taki jak mCherry, aby monitorować komórki pozytywne na transgen po selekcji. Ta strategia ma na celu wsparcie bardziej jednorodnej ekspresji transgenów niż losowe podejście integracyjne, chociaż stabilność ekspresji i powtarzalność dyferencjacji powinny zostać zweryfikowane dla każdej inżynierowanej linii. Ta standaryzowana metoda generuje wzbogacone populacje indukowanych neuronów wyrażających markery linii GABAergicznej w około 21 dni, czyli krótszy czas w porównaniu z tradycyjnymi podejściami opartymi na małych cząsteczkach^8,10. Ten protokół jest wysoce odpowiedni dla badaczy, którzy wymagają skalowalnych, spójnych populacji neuronów do zastosowań dółstrumienia, takich jak mikroskopia wysokozawartościowa, transkryptyka pojedynczych komórek lub funkcjonalne badania fizjologiczne.

Protokół

UWAGA: kultury ludzkich hiPSC należy trzymać jak potencjalnie niebezpieczny materiał biologiczny zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Przeprowadzaj wszystkie procedury kultury ludzkich hiPSC w certyfikowanym szafie biologicznej klasy II z zachowaniem sterylnej techniki. Wszystkie odpady zawierające ludzkie komórki, medium eksponowane na ludzkie komórki oraz materiał plazmidowy CRISPR/Cas9 należy dezaktywować zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego przed wyrzuceniem. Doksycyklinę, puromycin, DMSO i inne reagenty chemiczne należy obchodzić się z rękawiczkami i odpowiednią ochroną oczu i skóry, a odpady należy wyrzucać zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów chemicznych. Ekstrakt z błony podstawnej (BME) należy przechowywać stosując sterylną technikę i przechowywać na lodzie przed użyciem, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji. Przechowywanie w ciekłym azocie i obsługa kriowiorów powinna być wykonywana z odpowiednimi rękawicami kriogenicznymi, ochroną twarzy i ostrożnością, aby uniknąć poparzeń mrozem lub eksplozji fiolki podczas odmrażania.

UWAGA: Przed edycją za pomocą CRISPR/Cas9 i różnicowaniem neuronów, kultury hiPSC powinny spełniać wcześniej określone kryteria kontroli jakości. Komórki muszą być potwierdzone jako negatywne na mykoplazmę, wyświetlać normalny kariotyp lub akceptowalny profil integralności genomowej oraz utrzymywać mocną ekspresję markerów pluripotencji, w tym OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 i/lub SSEA4. Kultury powinny wykazywać typową zwartą morfologię kolonii hiPSC, z wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy, zdefiniowanymi granicami kolonii i minimalną samoistną różnicowaniem. Powinny być używane tylko aktywnie rozmnażające się kultury w zalecanym zakresie przelewów i nie powinny przekraczać maksymalnej liczby przelewów określonej w laboratorium, zwykle poniżej przelew 40, chyba że zostanie to inaczej zweryfikowane. Kultury wykazujące nieprawidłową morfologię, nadmierną samoistną różnicowanie, słaby wzrost, potwierdzone zakażenie lub dowody na niestabilność genomową powinny być wyłączone z eksperymentów edycji i różnicowania. Wszystkie materiały potrzebne do tego protokołu, w tym receptury na media, są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie reagentów i płytek kulturalnych

1. Przygotuj medium do zamrażania łącząc 40 mL zamiennika surowicy knock-out (KOSR) i 10 mL dimetylosulfonianu (DMSO) w 50 mL stożkowym probówce.
2. Wyrównaj medium do zamrażania pipetowaniem w górę i w dół 10 razy. Przechowuj roztwór w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
3. Rozcieńczyć ekstrakt z błony podstawnej (BME) w media Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) do końcowej koncentracji 80 μg/mL.
   UWAGA: Przed rozcieńczeniem, zweryfikuj koncentrację otrzymanego roztworu BME za pomocą numeru partii na stronie internetowej dostawcy.
4. Dodaj 1 mL rozcieńczonego BME na dołek do płytki 6-dołkowej. Natychmiast umieść BME w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
5. Przechyl płytkę, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na całej powierzchni dołków. Upewnij się, że nie ma niepokrytych obszarów.
6. Inkubować płytkę przez co najmniej 30 min w temperaturze 37 °C przed użyciem.
   UWAGA: Nie ma maksymalnego czasu inkubacji. Jeśli inkubacja trwa dłużej niż 1 dzień, upewnij się, że DMEM/F-12 nie odparowują się. Roztwór BME użyty do jednego dołka można ponownie użyć tylko raz do powłoki drugiego dołka. Manipulowanie BME w temperaturze pokojowej powinno być krótkie z powodu jego szybkiego polimeryzacji.

2. Utrzymanie i przelewanie hiPSC

UWAGA: W tym protokole, medium do utrzymania hiPSC odnosi się do mTeSR plus. mTeSR plus jest zalecanym medium do rutynowego utrzymania, przelewania, odzyskiwania po nukleofekcji i selekcji puromycinu.

1. Przelew hiPSC wykonuj około co 4-6 dni, gdy komórki osiągną 60% konfluencji.
2. Wyssaj medium kulturowe z dołków za pomocą pipety aspirującej.
3. Dodaj 1 mL ReLeSR do dołka i inkubować przez 30 s w temperaturze pokojowej.
4. Wyssaj środek dysocjujący i inkubować płytkę przez 8 min w temperaturze 37 °C.
5. Delikatnie dodaj 1 mL medium do utrzymania hiPSC za pomocą pipety 5 mL. Zebraj zawiesinę komórkową w probówce 50 mL.
6. Wymieszaj 10 μL zawiesiny komórkowej z 10 μL niebieskiego trypanu w probówce mikrowirówkowej. Włóż 10 μL mieszanki na ślizg komórkowy, aby określić koncentrację żywych komórek.
7. Wyssaj powłokę BME z wcześniej przygotowanego dołka. Dodaj 2 mL medium do utrzymania hiPSC uzupełnione o inhibitor kinazy związanych z Rho (ROCK) (Y-27632; 10 μM końcowa).
8. Zasiej 100 000 hiPSC do dołka

Wyniki

Pomyślne zastosowanie niniejszego protokołu prowadzi do uzyskania wzbogaconej populacji indukowanych neuronów o cechach molekularnych neuronów GABAergicznych. Strategia opiera się na ukierunkowanej insercji kasety ASCL1-P2A-DLX2 indukowanej doksycykliną do locus AAVS1 (Rysunek 1A). Po selekcji zmodyfikowanych hiPSC stosuje się indukcję doksycykliną w celu stymulacji różnicowania w kierunku neuronów GABAergicznych, zgodnie z harmonogramem przedstawionym na

Dyskusja

Udane generowanie neuronów GABAergicznych w znacznym stopniu opiera się na kilku krytycznych krokach w obrębie tego protokołu. Utrzymanie wysokiej jakości, niediferencjowanych hiPSCs jest kluczowe; spontaniczna dyferencjacja przed nukleofekcją drastycznie zmniejsza efektywność integracji i czystość neuronów na dalszych etapach⁸. Ponadto, precyzyjne określenie krzywej eliminacji puromycyny jest istotne, aby zapewnić całkowitą eliminację niezintegrowanych komórek bez nadmiernego stresu dla właściwie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4D-Nucleofector™ Core Unit	Lonza	AAF-1002B	Do elektroporacji/nukleofekccji hiPSC.
6-well culture plates	Sarstedt	83.3920300	Plate wymagające kultury tkankowej do utrzymania i różnicowania hiPSC.
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78005	Rekombinowana ludzka białko dla dojrzewania neuronów; przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta i używaj w końcowej koncentracji 10 ng/mL.
Cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	C10283	Używany do liczenia komórek.
Centrifuge	VWR	76468-134	Do osiadania komórek.
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i lub równoważny	Inkubator do kultury komórek utrzymujący 37 °C, wilgotne powietrze i 5% CO2.
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific	5000-0020	Sterylne naczynia kriogeniczne do zamrażania hiPSC; mogą być użyte odpowiednie zewnętrznie gwintowane 1,8–2,0 mL naczynia kriogeniczne.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	Bio-Techne	BME001-05	Standardowa macierz powłoki BME używana w protokole. Zweryfikuj stężenie magazynowe dla danej partii z certyfikatu analitycznego Bio-Techne i rozcieńcz w DMEM/F-12 do stężenia roboczego 80 µg/mL.
DMEM/F-12	Wisent	319-090-CL	Podstawowe medium używane do rozcieńczania BME.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma-Aldrich	D2650	Kryoprotektor używany w przygotowaniu medium zamrażającego.
Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassette	Custom plasmid	Addgene accession pending	Niestandardowy plazmid AAVS1 zawierający indukowany doksycykliną ASCL1-P2A-DLX2 kasecie i elementy selekcji/reportera. Podaj mapę plazmidu i pełną sekwencję jako plik dodatkowy lub na żądanie.
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Używany do indukcji ekspresji ASCL1-P2A-DLX2. Przygotuj sterylny skoncentrowany roztwór, porcje, chronić przed światłem, przechowywać zamrożony i używać w końcowej koncentracji 1 µg/mL.
Ethanol (70%)	Commercial Alcohols / Greenfield Global	P016EAAN	Do sterylizacji wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego; używaj zatwierdzonego przez instytucję 70% alkoholu lub równoważnego.
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve R4	Mikroskop używany do fazokontrastowego i fluorescencyjnego obrazu ekspresji reportera i morfologii neuronów.
GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78058	Rekombinowana ludzka białko dla dojrzewania neuronów; przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta i używaj w końcowej koncentracji 10 ng/mL.
hiPSC line PGP1	EditCo Bio	PGP1 human iPSC line	Dostępna komercyjnie ludzka linia hiPSC z otwartą zgodą używaną w tym protokole; zarejestruj numer przejścia i status QC przed edycją i różnicowaniem.
Image-analysis software	ImageJ/Fiji	Open-source; version used should be reported	Do kwantyfikacji fluorescencji i przetwarzania reprezentatywnych obrazów.
KnockOut™ Serum Replacement (KOSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028	Używany w przygotowaniu medium zamrażającego.
Laminin-521	STEMCELL Technologies	200-0117	Tylko opcjonalny reagent do rozwiązywania problemów. Nie jest częścią standardowego protokołu powłoki; może być użyty jako alternatywa lub podwójna warstwa powłokowa, jeśli trwa odczepianie neuronów.
Liquid nitrogen dewar	Thermo Fisher Scientific	Locator 6 Plus lub równoważny	Długotrwała przechowywanie zamrożonych hiPSC w fazie pary lub ciekłym azocie zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa kriogenicznego.
Mr. Frosty™ Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Do kontrolowanego zamrażania komórek w -80 °C.
mTeSR™ Plus	STEMCELL Technologies	100-0276	Medium bez karmy dla hiPSC.
Neuro-induction medium	STEMCELL Technologies	08582	Komercyjne medium neuro-indukcyjne używane do wczesnej indukcji neuronów.
Neuro-maturation base medium (BrainPhys™ Neuronal Medium)	STEMCELL Technologies	05790	Podstawowe medium dla dojrzewania neuronów; uzupełnić z BDNF, GDNF, NT-3, doksycykliną i PluriSln-1 jak opisano w protokole.
NT-3 (Neurotrophic Factor 3)	STEMCELL Technologies	78074	Rekombinowana ludzka białko dla dojrzewania neuronów; przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta i używaj w końcowej koncentracji 10 ng/mL.
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit	Lonza	V4XP-3024	Zestaw zawierający roztwór P3 i kubeczki do nukleofekcji hiPSC.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Opcjonalny antybiotyk do zmniejszenia ryzyka skażenia bakteryjnego.
Plasmocin™ prophylactic	InvivoGen	ant-mpp	Opcjonalny antybiotyk do zapobiegania skażeniu mykoplazmą.
PluriSIn-1	STEMCELL Technologies	72822	Inhibitor przeżycia komórek pluripotentnych do eliminacji niezróżnicowanych hiPSC; przygotuj skoncentrowany roztwór zgodnie z instrukcjami producenta i u