Model oparty na cytrynianie amonu żelaza z nadmiarem żelaza i odczytami związanymi z ferroptozą w mioblastach C2C12

Podsumowanie

Przedstawiamy tu szybką metodę przeładowania żelazem opartą na cytrynianie żelazistym amonu w komórkach C2C12, która powoduje ładowanie żelaza, zmiany molekularne związane z ferroptozą i wczesną utratę żywotności wrażliwą na ferrostatynę.

Streszczenie

Ferroptoza to zależna od żelaza forma regulowanej śmierci komórkowej związana ze starzeniem i chorobami zwyrodnieniowymi. Wcześniej odkryliśmy, że starzejące się komórki macierzyste mięśni akumulują żelazo wewnątrzkomórkowe i ulegają śmierci ferropototycznej po aktywacji. Tutaj opisujemy prosty model in vitro, który wykorzystuje cytrynian amonu żelazowego do wygenerowania przeładowania żelaza w myszych mioblastach C2C12. Leczenie cytrynianem amonu żelazowego zwiększyło obciążenie żelazem wewnątrzkomórkowym, co pokazuje podwyższone transkrypty łańcucha ciężkiego i lekkiego ferrityna, zwiększona białko ferrityna i zwiększony sygnał z barwnika żelaza labilnego w żywych komórkach. Ekspozycja na cytrynian amonu żelazowego (FAC) spowodowała również zmiany molekularne związane z ferropotozą, w tym zwiększoną ekspresję Slc40a1 i Hmox1 oraz zmniejszenie białka glutation peroksydazy 4. Spadek glutation peroksydazy 4 związany z FAC został częściowo odwrócony przez deferoksaminę. Po 12 godzinach cytotoksyczny cytrynian amonu żelazowego zmniejszył żywotność komórek, a efekt ten został odblokowany przez ferrostatynę-1, co jest zgodne z czułym na ferropotozę składnikiem śmierci komórkowej. W późniejszych punktach czasowych zwiększona zmienność i zmniejszona dynamikę pomiaru ograniczają interpretację pomiarów żywotności. Tym samym protokół ten zapewnia szybki i skalowalny model przeładowania żelaza za pośrednictwem cytrynianu amonu żelazowego, który może być wykorzystany do badania odpowiedzi związanych z ferropotozą i testowania interwencji modyfikujących żelazo lub ferroptozę w komórkach mięśniowych.

Wprowadzenie

Ferroptoza to forma regulowanej śmierci komórkowej (RCD), molekularnie odrębna od innych form RCD. Po raz pierwszy została odkryta za pomocą erastyny, śmiercionośnej małej cząsteczki selektywnej dla RAS (rak szczurów), której stwierdzono, że powoduje śmierć komórek nieapoptotyczną¹. W swojej zasadniczej pracy Dixon i wsp. jako pierwsi opisali jej mechanizm jako zależny od żelaza, a tym samym ukuto termin ferroptoza, co oznacza “upadek (śmierć) przez żelazo¹.” Molekularnie, ferroptoza objawia się nadmiernym nagromadzeniem żelaza, zwiększoną peroksydacja lipidów i akumulacją reaktywnych form tlenu, prowadzącą do śmierci komórek². Jest ona unikalnie rozróżnialna od stresu oksydacyjnego i innych form RCD przez swoją niezależność od aktywacji kaspaz, charakterystycznego znaku apoptozy oraz brak fosforylowanej kinazy oddziałującej z receptorem 3 (RIPK3) i pseudokinazy podobnej do domeny kinazy linii mieszanych (MLKL), które są obserwowane tylko w nekroptozie³. Ponadto, ferroptozę można również złagodzić za pomocą przeciwutleniaczy lipidowych ferrostatyny-1 i lipokstatyny-1 oraz chelatora żelaza deferoksaminy⁴. Chociaż ferroptoza jest podobna do innych typów RCD pod względem ostatecznego wyniku, jakim jest śmierć komórek, jej przedstawienie sprawia, że jest ona mechanicznie odrębna od innych form RCD.

Badania nad ferroptozą zyskały na sile w ciągu ostatnich dziesięcioleci, głównie dzięki ciągłym wysiłkom w tym zakresie w celu zidentyfikowania nowych cech charakterystycznych i opracowania nowych narzędzi do badania jej podstawowych mechanizmów i udziału w chorobach człowieka⁵. Ostatnie dowody sugerują, że przeładowanie żelazem i ferroptoza są niedocenianymi czynnikami przyczyniającymi się do słabości związanej z wiekiem i sarkopenii^6,7,8. Niedawno wykazaliśmy, że starzejące się komórki macierzyste mięśni (MuSCs) są unikalnie podatne na ferroptotyczną śmierć wynikającą z przewlekłego zapalenia tłumiącego przeciwutleniający program genetyczny poprzez silnik epigenetyczny⁹. Stwierdziliśmy, że starzejące się komórki MuSCs akumulują nieprawidłowy poziom wewnątrzkomórkowego żelaza, około 30 razy wyższy niż u ich dorosłych odpowiedników. Chociaż ferroptoza została powiązana z chorobami wielu narządów i tkanek – przede wszystkim z tymi związanymi ze starzeniem – jej fizjologiczna rola pozostaje niejasna i wymaga dalszych badań.

Podczas gdy nasze poprzednie badania wykazały, że starzejące się komórki MuSCs są wrażliwe na śmierć ferroptotyczną po aktywacji, szczególny wkład obciążenia żelazem w ten fenotyp pozostaje do wyjaśnienia. Tutaj, ustanawiamy prosty model przeładowania żelazem w mioblastach C2C12 traktowanych cytrynianem amonowo-żelazany (FAC) i pytamy, czy nadmiar żelaza jest wystarczający do wygenerowania zmian molekularnych związanych z ferroptozą i czułą na ferrostatynę utratą żywotności. Komórki C2C12 zapewniają niedrogą, skalowalną i łatwo dostępną mysią progenitory mięśni¹⁰. Przewidujemy, że to podejście zapewni praktyczną platformę do badania reakcji na stres wywołane żelazem w komórkach mięśniowych i do testowania interwencji modyfikujących fenotypy związane z ferroptozą.

Protokół

1. Przygotowanie komórek C2C12

1. Roztapianie komórek
   UWAGA: Wszystkie kroki hodowania komórek należy wykonywać w czystej kabinie biosafety.
   1. Przygotuj stężone 9 mL ciepłego pełnego pożywki (modyfikowane przez Dulbecco pożywka Eagle z wysoką zawartością glukozy i pirogronianu + 10% płodowego surowicy wołowej + 1% pen/strep).
   2. Roztapiaj jedną probówkę zamrożonych komórek C2C12 (~1 milion) dodając 800 μL rozgrzanej pełnej pożywki do probówki z głównego zasobu pożywki. Przez wykonywanie powolnego pipetowania w górę i w dół.
   3. Gdy pożywka dodana do probówki rozmrożonej stanie się zimna, usuń ją i dodaj do stężonego pożywki. Wymień na taką samą objętość ciepłej pożywki z probówki. Kontynuuj pipetowanie w górę i w dół oraz wymień pożywkę aż do momentu, gdy zamrożone komórki zostaną zawieszone.
   4. Pipetuj zawartość probówki do stężonej pożywki. Wywróć, aby wymieszać, następnie dodaj zawartość do 10 cm naczynia do hodowli komórek. Inkubację prowadź w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
   5. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że przyczepiły się. Przyczepione komórki będą wyglądały na wydłużone, podczas gdy komórki unoszące się są okrągłe i poruszają się, gdy płytka się porusza.
      UWAGA: Zakładając, że zasadowe komórki są zdrowe, większość z nich powinna być przyczepiona.
   6. Zasądź pożywkę, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia. Zastąp 10 mL ciepłej pełnej pożywki i włóż z powrotem do inkubatora. Pozostaw inkubację na noc lub do momentu, gdy płytka osiągnie 80% konfluencji.
2. Siew komórek C2C12 do leczenia żelazem
   1. Gdy osiągnięta zostanie pożądana konfluencja, zasądź pożywkę komórkową. Dodaj 2 mL PBS kroplą do płytki, upewniając się, że cała powierzchnia jest pokryta; zasądź.
   2. Dodaj 2 mL 0,25% trypsyny do komórek. Inkubację prowadź w temperaturze 37 °C przez 5-10 min lub do momentu, gdy komórki się odrywają. Gdy się oderwą, komórki będą wyglądały na okrągłe pod mikroskopem, a trypsyna i zawiesina komórek będą mętne i zagęszczone.
   3. Neutralizuj trypsynę, dodając 8 mL ciepłej pełnej DMEM. Użyj pipety serologicznej, aby dokładnie wymieszać roztwór i przepłukać płytkę. Przenieś zawiesinę komórek do stężonego pożywki.
   4. Delikatnie odwróć probówkę 3-5 razy. Usuń odpowiednią objętość i zlicz komórki za pomocą preferowanej metody (licznik komórek, hemotocytometr itp.).
   5. Przygotuj zawiesinę komórek w wystarczającej ilości, aby zasiewać pożądaną liczbę komórek w dołach/płytkach dla n = 3 dla każdego warunku: płytka 10 cm (do western blot): 100 000 komórek/płytka, płytka 6-dołowa (do qPCR): 50 000 komórek/dół, płytka 96-dołowa (do testu żelaza labilnego i barwienia luminescencyjnego): 1000 komórek/dół. Pozostaw komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C na noc.
3. Zastosowanie leczenia żelazem do zasiewianych komórek
   1. W dniu leczenia dodaj cytrat amonowo-żelazowy (FAC; wzór = C₆H₁₁FeNO₇³; masa molowa = 265 g/mol) do pełnej DMEM w następujących stężeniach w czystych warunkach: Ciężkie: 180 μM (0,0477 mg/mL), Cytotoksyczne: 1800 μM (0,477 mg/mL).
      UWAGA: Rozważ dodanie kontroli, w tym, ale nie ograniczając się do pojazdu, ciężkie + 150 μM deferoksaminy (chelator żelaza), pojazd + 150 μM deferoksaminy i/lub pojazd + RSL3 (induktor ferroptozy; kontrola dodatnia. Dodatkowo warto zauważyć, że DMEM może zawierać niewielką ilość azotan(III) żelaza nonahydratu, źródła żelaza trójwartościowego, w warunkach wyjściowych. Czytelnik ma interpretować zalecane powyżej stężenia FAC jako dodatkowe do każdego istniejącego żelaza trójwartościowego już obecnego w pożywce kultury.
   2. Odwróć, aby wymieszać, aż FAC rozpuści się w pełnej pożywce.
      UWAGA: Ponieważ FAC jest rozpuszczalny w wodzie, nie potrzeba DMSO ani dodatkowego rozpuszczalnika. Dodanie FAC może zmienić pH roztworu, więc jeśli zauważysz drastyczne zmiany koloru pożywki, zaleca się zmierzenie pH, aby zapewnić żywotność komórek po dodaniu traktowanej pożywki do kultury.
   3. Zasądź pożywkę z komórek. Dodaj taką samą objętość pożywki uzupełnionej żelazem do warunków leczenia, a nieuzupełnioną pełną pożywkę do dołów/płytek kontrolnych. Inkubację prowadź w temperaturze 37 °C przez pożądany czas leczenia przed przejściem do wybranego testu: Test żelaza labilnego: 2 godz. leczenia FAC, qPCR i western blot:

Wyniki

Na podstawie wcześniejszych prac naszych i innych, założyliśmy, że zwiększenie poziomu żelaza pozakomórkowego wygeneruje przeładowanie komórek mięśniowych myszy żelazem wewnątrzkomórkowym i pozwoli nam monitorować związane z ferroptozą zmiany następcze. Dlatego opracowaliśmy przepływ pracy C2C12 opisany w Rysunek 1, w którym komórki były narażone na określone stężenia cytrynianu amonowo-żelaznego przez 2–24 h, w zależności od dalszego testu.

Pierwszym krokiem do walidacji naszego modelu było potwierdzenie, że FAC może wchodzić do komórek. Korzystając z zweryfikowanych zestawów starterów opisanych w Tabeli 3, przeprowadziliśmy qPCR zarówno dla ciężkiego, jak i lekkiego łańcucha ferotyn i stwierdziliśmy, że zwiększenie wpływu żelaza koreluje z podwyższonymi poziomiami mRNA ferotyn (Rysunek 2A,B). Na poziomie białka, podobny wzrost poziomu ferotyn był widoczny przy zwiększeniu stężenia FAC, choć nie wydawał się to być zależne od dawki (Rysunek 2C). Podobnie, barwienie żywych komórek C2C12 potraktowanych FAC wykazało, że te potraktowanych cytotoksyczną dawką żelaza – jak również komórki potraktowywane ciężką dawką i ferotyn stabilną w tym samym czasie jako dodatnia kontrola – wizualnie i ilościowo wykazywały zwiększone magazynowanie żelaza w porównaniu z nietraktowanymi komórkami i tymi narażonymi na chelator żelaza deferoksaminę (DFO; Rysunek 2D). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te sugerują, że żelazo wprowadzone do pożywki komórkowej za pomocą FAC faktycznie wchodzi do komórek.

Mając na względzie, że FAC zwiększyło wewnątrzkomórkowe obciążenie żelazem, następnie próbowaliśmy określić, czy przeładowanie żelazem było towarzyszone zmianami molekularnymi i funkcjonalnymi związanymi z ferroptozą. FAC zwiększyło ekspresję Slc40a1 (ferryportyna) (Rysunek 3A) i podniosło Hmox1 (Rysunek 3B). FAC również zmniejszyło białko GPX4, a ta redukcja została częściowo odwrócona przez deferoksaminę (Rysunek 3C). Leczenie RSL3 wywołało podobne zmniejszenie GPX4, umieszczając reakcje na FAC w szerszym kontekście molekularnym związanym z ferroptozą. Funkcjonalnie, cytotoksyczna dawka FAC zmniejszyła wiarygodność opartą na luminescencji po 12 h, a ta wczesna utrata wiarygodności została odbudowana przez ferrostatynę-1 (Rysunek 3D). Natomiast po 24 h separacja pomiędzy warunkami staje się mniej wyraźna i bardziej zmienna (Rysunek 3E). Choć próbki potraktowywane ferrostatyną-1 pozostają podwyższone w porównaniu do cytotoksycznego FAC samodzielnie, ogólny zakres dynamiczny testu jest zmniejszony w tym późniejszym punkcie. Łącznie, te dane pokazują, że leczenie FAC wywołuje przeładowanie żelazem, zmiany molekularne związane z ferroptozą i zależną od czasu redukcję wiarygodności czułą na ferrostatynę w komórkach C2C12.

Rysunek 1: Graficzny abstrakt modelu przeładowania żelazem. W tym modelu, komórki C2C12 są wysiewane i pozostawione do inkubacji na noc przed traktowaniem różnymi fizjologicznie znaczącymi dawkami pożywki kulturowej z dodatkiem żelaza i bezpośrednią analizą molekularną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zwiększone magazynowanie labilnego żelaza i synteza ferotyn po dodaniu cytrynianu amonowo-żelaznego. Poziomy mRNA (A) ciężkiego łańcucha ferotyn i (B) lekkiego łańcucha ferotyn wzrastają wraz z dodaniem cytrynianu amonowo-żelaznego do układu. (C) Poziomy białka FTH1 wzrastają wraz z dodaniem żelaza w postaci żelazo(III) do układu. (D) Poziomy labilnego żelaza wzrastają w komórkach C2C12 potraktowanych żelazo(III) przed i jednocześnie z barwieniem far-red labilnym żelazem, w porównaniu z kontrolą z pożywką + deferoksaminą. Warunek współleczenia oznacza jednoczesne leczenie pożywką kulturową + 180 μM FAC + barwieniem labilnym żelazem. Paski błędów to  +/- SD. Skróty: FTH1 = ciężki łańcuch ferotyn; FTL1 = lekki łańcuch ferotyn; DFO = deferoksamina.

Dyskusja

Celem tej pracy było ustawienie praktycznego modelu przeciążenia żelazem in vitro w mysich przodkach mięśniowych i zdefiniowanie warunków, w których można niezawodnie wykryć reakcje związane z ferroptozą. Korzystając z tego procesu, wykazano, że leczenie cytrynianem amonu żelaza prowadzi do znacznej akumulacji żelaza wewnątrzkomórkowego, któremu towarzyszy zwiększona ekspresja ferrytyny i podwyższony sygnał żelaza wolno wiązanego. Nadmiar żelaza wiąże się ponadto ze zmianami molekularnymi zgodnymi ze stresem związanym z ferroptozą, w tym zwiększoną ekspresją Slc40a1 i Hmox1 oraz zmniejszoną białkiem GPX4. Funkcjonalnie, cytotoksyczne narażenie na FAC indukuje zmniejszenie żywotności komórek, które jest ratowanie przez ferrostatynę-1 we wczesnych punktach czasowych, co sugeruje obecność składnika wrażliwego na ferroptozę, przyczyniającego się do obserwowanej śmierci komórkowej.

Dawka żelaza i czas trwania leczenia są kluczowymi parametrami, które bezpośrednio wpływają na interpretowalność tego systemu. W naszych rękach, wcześniejsze punkty czasowe (około 12 h) zapewniają najwyraźniejsze oddzielenie między warunkami, pozwalając na ratowanie cytotoksyczności indukowanej FAC przez ferrostatynę-1 w sposób powtarzalny. W późniejszych punktach czasowych (np. 24 h) ogólna żywotność maleje, a zmienność wzrasta między warunkami, co zmniejsza zakres dynamiczny testu. Jest to zgodne z kumulacyjną utratą komórek i adaptacją przetrwałych populacji, takich jak zwiększona zdolność antyoksydacyjną lub zmieniona charakterystyka obsługi żelaza.

Administracja żelaza trójwartościowego (Fe³⁺) zamiast dwuwartościowego (Fe²⁺), a także stężenie podanego żelaza i czas trwania leczenia, są również kluczowymi aspektami protokołu. Użycie żelaza trójwartościowego jest niezbędne, ponieważ żelazo trójwartościowe jest łatwo pobierane przez transferrynę, główny transporter odpowiedzialny za import żelaza trójwartościowego¹¹. Chociaż żelazo dwuwartościowe może być pobierane przez inne transportery (szczególnie dwuwartościowy transporter metali DMT1), w tym kontekście żelazo trójwartościowe zdawało się być inkorporowana bardziej efektywnie niż żelazo dwuwartościowe¹². Stężenia FAC wybrane do tego protokołu zostały dobrane ze względu na ich fizjologiczne znaczenie i zastosowanie w podobnych wcześniejszych modelach^13,14. Czas trwania leczenia żelazem, który wyniósł 24 h, był również oparty na podobnych modelach naszych i innych badaczy. Jednakże w niektórych kontekstach (a mianowicie barwienie żelaza wolno wiązanego i testy luminescencji komórkowej) 24 godziny okazały się zbyt długim czasem leczenia. W tych przypadkach, 24-godzinny okres leczenia spowodował tak znaczącą śmierć komórek, że nie można było wyciągnąć żadnych wniosków z powodu zniszczenia materiału komórkowego. Na przykład, RSL3 jest tak potężnym środkiem peroksydacji lipidów, że 12-godzinny okres leczenia był wystarczający, aby indukować peroksydacje lipidów, zapewniając równocześnie, że efekty przeciążenia żelazem były widoczne (Rysunek 3C-E). Dodatkowo, w przypadku barwienia żelaza wolno wiązanego, komórki były leczone FAC tylko przez 2 h przed barwieniem (po próbie barwienia po 2, 4 i 24 godzinowych traktowaniach żelazem) aby uchwycić początkową reakcję na przeciążenie żelazem, zanim mogła nastąpić nadmierna destrukcja komórek (Rysunek 2D). Ogólnie rzecz biorąc, wydaje się, że zmiany na poziomie genów i białek były najlepiej mierzone po 12-24 h leczenia żelazem, prawdopodobnie dlatego, że te zmiany wymagają więcej czasu, aby komórki je zainicjowały, podczas gdy barwienie było najlepiej przeprowadzane po krótszym okresie leczenia.

Inni opracowali podobne modele. Jedna grupa stworzyła model C2C12 traktowany żelazem trójwartościowym, aby badać rolę osi p53-Slc7a11 w ferroptozie. Znaleźli, że leczenie żelazem trójwartościowym przez 48 h zwiększyło peroksydacje lipidów i zmniejszyło poziomy Slc7a11, co wskazuje na ferroptozę¹³. Inny podobny model – tym razem używający komórek C2C12 traktowanych siarczanem żelaza dwuwartościowego w celu badania związku między ścieżką ubikwitynoligazy Akt-FoxO3-E3 a ferroptozą – zawierał leczenie żelazem przez 4 h¹⁴. Wspólnym elementem między nimi jest to, że zaangażują leczenie żelazem komórek C2C12, które zostały zróżnicowane w miotki, zamiast pozostawać w stanie bardziej przypominającym komórki macierzyste. To sprawia, że nasz system jest szczególnie istotny dla wcześniej zaobserwowanego nagromadzenia żelaza w MuSCs.

Mimo że jest to prosty sposób na badanie wpły

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Store at -20 °C. Thaw on ice.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	Is a neurotoxin. Handle only when wearing appropriate PPE (lab coat, gloves, eye protection).
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	Polymerizing agent for acrylamide gel casting as a 10% weight/volume solution in sterile water. Powder is room temperature stable, but solution should be stored long-term at -20 °C and short-term at 4 °C.
Anti-GAPDH, mouse antibody, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Use at a 1:2000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at 37 kDa.
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Follow manufacturer's instructions for use. Be advised that standards must be kept at 4 °C after first use.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Use at a 1:1000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at 42 kDa.
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Black, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	Use in preparation of Laemmli buffer.
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Store at 4 °C.
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772	Store in the vapor phase of liquid nitrogen.
cDNA Supermix QScript 500 reactions	Avantor/VWR	101414-108	Store at -20 °C. Thaw on ice.
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Since larger, use for extraction of cells from 10 cm and larger dishes.
Cell scrapers, 10 inch handle, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Since they have a small head, they are best suited for removing cells from multi-well plates.
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Use in a fume hood only, and dispose of waste in a separate container.
COMPLETE EDTA-free protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	Dissolve 1 tablet in 500 µL of sterile water to create a 100× solution.
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	Model version CBS 170-120 V. Use for cell culture.
Deferoxamine mesylate, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFO is an iron chelator, so adding it to cells decreases iron content. Dissolve in water for a stock concentration of 1 M.
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Use in labile iron staining and reconstitution.
DMEM, high glucose, pyruvate, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Add to 5% BSA in wash buffer at a ratio of 1:5000.
DyLight 800 4× PEG conjugate Goat anti-Mouse IgG (H&L) Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Add to 5% BSA in wash buffer at a ratio of 1:5000.
Easypet 3 1-channel pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Prepare stock solution by adding 50 µL DMSO to a room temperatureerature aliquot. Light sensitive. Stock concentration: 1 mM
Ferric Ammonium Citrate, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Sequesters lipid peroxidation byproducts, inhibiting ferroptosis in vitro. Dissolve in DMSO for a stock concentration of 10 mM.
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, bottle, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Use to supplement DMEM for C2C12 cell culture. Added at 10% by volume.
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, colorless, 500 pcs.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Rabbit mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	Use at a 1:1000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at ~20 kDa.
Glycerol, ultrapure	Thermo Fisher Scientific	15514011	Use in 6x Laemmli buffer prep.
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL), 300 μL	Thermo Fisher Scientific	AM9515	Use to visualize pellet during RNA purification.
Image-iT Lipid Peroxidation Kit	Thermo Fisher Scientific	C10445	Ready to use. Light sensitive. Stock concentration: 10 mM
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A	Use to quantify western blot band intensity and corrected total cell fluorescence from microscopy images.
Inverted Light Microscope	Zeiss	415510-1100-000	Use in cell culture applications.
Isopropanol, 99.5%, 1 L bottle	Thermo Fisher Scientific	327270010
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate, 10 /cs	Thermo Fisher Scientific	N8010560	Use in qPCR.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4311971