Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Interpretacja wariantów klinicznych za pomocą programu Integrative Genomics Viewer (IGV) dla patologów molekularnych

103 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71808

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2University of Michigan, Department of Pathology, 3Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), 4University of Chicago, Department of Pathology, 5University of Colorado, Department of Pathology, 6University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 7Broad Institute of MIT and Harvard, 8University of California San Diego, Department of Medicine, 9Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Oprogramowanie Integrative Genomics Viewer (IGV) oferuje rozbudowany, intuicyjny wgląd w dane podstawowe służące do wykrywania wariantów klinicznych. Przedstawiamy tutaj pięć przykładów, które demonstrują, jak szybko odróżnić rzeczywiste zdarzenia patogenne od artefaktów, co w efekcie zwiększa pewność diagnostyczną specjalistów zajmujących się weryfikacją wyników badań sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

Integrative Genomics Viewer (IGV) to kluczowe narzędzie w genomice klinicznej, umożliwiające wizualizację i interpretację złożonych danych z sekwencjonowania. Połączenie wiedzy klinicznej z wizualną oceną wyników sekwencjonowania jest głównym sposobem, w jaki patolodzy molekularni i inni specjaliści oceniają i kończą analizę przypadków. Pomocne mogą być różnorodne narzędzia programistyczne, jednak ich relacja do danych podstawowych musi być rozumiana i stosowana systematycznie. Niniejsze opracowanie zawiera niezbędne informacje podstawowe na temat typów plików danych sekwencjonowania nowej generacji (NGS) (np. FASTQ, BAM, VCF) wraz z omówieniem ich formatu i przeznaczenia. Następnie opisujemy funkcje programu IGV, które pozwalają wydobyć niuanse z tych plików. Wykorzystujemy serię wyselekcjonowanych przypadków praktycznych opartych na scenariuszach klinicznych, dzięki którym czytelnik będzie mógł pracować z klinicznymi danymi sekwencjonowania NGS przy użyciu oprogramowania IGV w celu przeanalizowania różnych typów istotnych klinicznie wariantów w odniesieniu do ludzkiego genomu referencyjnego. Scenariusze kliniczne zostały opracowane tak, aby opisać przykłady pewnych trudności w interpretacji danych genomicznych oraz wykazać, w jaki sposób wykorzystanie IGV w ramach rutynowego schematu pracy może dostarczyć dodatkowych informacji interpretacyjnych dla wariantów, wykraczających poza standardowe wyniki wywołania wariantów przez algorytmy oprogramowania bioinformatycznego. Wizualna inspekcja wariantów genomicznych przy użyciu narzędzi w IGV może ujawnić subtelne wskazówki kontekstowe (np. częstość występowania wariantu allelicznego, błąd nici, kontekst specyficzny dla tkanki), które mogą wpłynąć na interpretację wariantów genomicznych. Chociaż niniejsze opracowanie koncentruje się na wykorzystaniu IGV do wykrywania i interpretacji wariantów somatycznych, przedstawione zastosowania można przenieść na grunt analizy linii zarodkowej, w tym do analizy wariantów złożonych i wykrywania mozaicyzmu.

Wprowadzenie

Opieka onkologiczna została w ostatnich latach przekształcona dzięki zastosowaniu technologii sekwencjonowania następnej generacji (NGS) w celu doprecyzowania diagnozy, rokowania oraz wyboru terapii1. Badania NGS stały się standardem opieki w wielu typach nowotworów w zakresie 1) ustalania diagnozy nowotworu zdefiniowanego molekularnie, 2) wykorzystania wyników biomarkerów niezależnych od typu nowotworu (tumor-agnostic) do podejmowania decyzji terapeutycznych oraz 3) określania stratyfikacji ryzyka dla konkretnych typów nowotworów2,3. Dokładne i terminowe wyniki badań NGS oraz innych testów biomarkerowych stały się krytycznym elementem opieki nad pacjentem i planowania leczenia w onkologii.

Badania NGS są zazwyczaj przeprowadzane w dużych laboratoriach referencyjnych lub w laboratoriach szpitalnych i akademickich, gdy instytucje te dysponują wystarczającą wiedzą i zasobami do opracowania i prowadzenia takich testów. Organizacja Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) została powołana jako sieć współpracy skoncentrowana na dzieleniu się wiedzą akademicką i kosztami odczynników4. Istotnym elementem działań konsorcjum GOAL były sesje szkoleniowe dotyczące kluczowych aspektów analizy i raportowania badań klinicznych. Zostały one opracowane jako praktyczne sesje instruktażowe i obejmują interaktywny warsztat z zakresu korzystania z programu integrative genomics viewer (IGV), mający na celu zaprezentowanie jego podstawowych i zaawansowanych funkcji w medycynie genomowej.

IGV to narzędzie do wizualizacji danych zaprojektowane w celu umożliwienia użytkownikom łatwego przeglądu danych NGS oraz innych dużych zbiorów danych, biorąc pod uwagę, że większość danych NGS jest ogromna i trudna do opanowania bez graficznego interfejsu użytkownika5. IGV nie został pierwotnie zaprojektowany do klinicznej analizy wariantów. Jednak ze względu na łatwość obsługi dla wszystkich specjalistów z zakresu biologii molekularnej, niezależnie od ich doświadczenia w bioinformatyce, został on szeroko przyjęty przez wiele laboratoriów jako element złożonego procesu przeglądu danych6. Niniejsze opracowanie zostało przygotowane jako mechanizm rozpowszechniania tych informacji w szerszym środowisku specjalistów laboratoriów genomicznych.

Kliniczna potrzeba stosowania IGV jako elementu przepływu pracy klinicznej obejmuje wykrywanie błędów sekwencjonowania, radzenie sobie ze złożonością procesu identyfikacji wariantów genomowych (variant calling) oraz innymi nawracającymi zmianami, w których dodatkowa wizualizacja może pomóc w odpowiedniej interpretacji danych7. Użycie IGV wymaga standardowych plików bioinformatycznych pochodzących z badania NGS8. Podstawowe funkcje oprogramowania IGV umożliwiają wizualizację danych sekwencjonowania i wymagają skonfigurowania zestawu preferencji oraz opcji dla klinicznej interpretacji wariantów (Supplementary File 1).

Przebieg sekwencjonowania krótkich odczytów charakteryzuje się stosowaniem standardów plików FASTQ, binary alignment map (BAM) oraz variant call format (VCF). NGS osiąga wysoką przepustowość dzięki równoległemu generowaniu milionów krótkich odczytów. Choć strategia ta znacznie przyspiesza produkcję danych, każdy odczyt stanowi jedynie fragment oryginalnego DNA lub RNA. Jest on przytwierdzony do określonej pozycji na płytce przepływowej NGS za pomocą sekwencji adaptera. Informacje o sekwencji i jakości zasad pochodzące z przetwarzania optycznego są zapisywane w plikach FASTQ. Te surowe odczyty to sekwencje nukleotydowe wraz z przypisanymi do każdej zasady ocenami jakości. Dlatego wczesnym etapem przetwarzania surowych odczytów jest dopasowanie każdego odczytu do genomu referencyjnego8. Ponieważ każdemu odczytowi przypisywana jest konkretna lokalizacja w genomie referencyjnym o najwyższym prawdopodobieństwie dopasowania, odczyty odpowiadające tej samej lokalizacji "gromadzą się" w każdym locus, a takie dane są przechowywane w pliku BAM zgodnie ze specyfikacjami sequence alignment mapping (SAM) (dostępnymi pod adresem https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; ostatnia weryfikacja: 30.09.2025) (Rysunek 1A). Informacje te można analizować wizualnie za pomocą przeglądarki genomu, takiej jak IGV. Jak pokazano na Rysunku 1B, porównywanie odczytów między sobą lub z samą sekwencją referencyjną może wskazywać na różnice lub rozbieżności pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi. Podsumowania tylko tych pozycji "wariantowych" w całym genomie są kompilowane w pliku VCF, który może być zatem znacznie mniejszy niż plik BAM, a wciąż zawierać większość przydatnych informacji niezbędnych do analizy wariantów. Z tego powodu plik VCF jest zazwyczaj końcowym wynikiem potoków analizy wariantów (variant-calling pipelines) (Rysunek 1C). Zatem podczas gdy pliki FASTQ zawierają surowe dane o odczytach i ich jakości, plik BAM daje wgląd w to, z jaką pewnością odczyty te mapują się do genomu, a plik VCF reprezentuje różnice między sekwencją referencyjną a sekwencją próbki, dostarczając znacznie łatwiejszą do analizy ilość danych pod kątem potencjalnego raportowania.

Sześć opisów przypadków klinicznych w niniejszym badaniu ilustruje typowe scenariusze analityczne związane z wykrywaniem wariantów somatycznych w laboratoriach molekularnych, a także problemy utrudniające prawidłowe zrozumienie i interpretację podstawowych danych. Ogólnie rzecz biorąc, opisy te wybrano w celu przedstawienia coraz bardziej złożonych scenariuszy interpretacyjnych oraz wykazania, w jaki sposób wykorzystanie zaawansowanych funkcji programu IGV pozwala na lepszy opis kompleksowych cech genomowych. Choć badanie to koncentruje się na interpretacji wariantów somatycznych, funkcje te można zastosować podczas korzystania z IGV w wizualizacji i interpretacji zmian linii zarodkowej6. Należy zauważyć, że terminy użyte w tym artykule opierają się na chemii sekwencjonowania przez syntezę oraz, w stosownych przypadkach, na innych analogicznych terminach/pojęciach dla innych platform.

Każdy opis przypadku klinicznego rozpoczyna się od bardzo zwięzłego kontekstu klinicznego, po którym następują instrukcje dotyczące sposobu badania wariantu lub wariantów oraz rozstrzygnięcia kwestii: który z obecnych wariantów (jeśli taki występuje) jest rzeczywisty, a który (jeśli taki występuje) jest artefaktem. Kontekst kliniczny wraz ze szczegółami danych z sekwencjonowania jest istotny dla udzielenia odpowiedzi na to pytanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przedstawione tutaj dane stanowią mieszaninę symulowanych oraz rzeczywistych danych NGS od pacjentów. Wszystkie dane pacjentów zostały jednak zanonimizowane poprzez usunięcie etykiet oraz ekstrakcję odczytów z pojedynczych loci. Niniejszy protokół jest zgodny z obowiązującymi wytycznymi komisji etyki badań nad ludźmi w instytucjach wszystkich autorów.

1. Pobieranie najnowszej wersji programu Integrative Genomics Viewer (IGV)

UWAGA: IGV to bezpłatny, do pobrania program do wizualizacji różnych genomów, w tym genomu ludzkiego (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV jest okresowo aktualizowane w celu uwzględnienia nowych wersji transkryptów, cech i ścieżek, a najnowsza wersja zazwyczaj znajduje się na górze listy.

  1. Pobierz na pulpit plik dostępny pod powyższym adresem URL (uniform resource locator) o nazwie „IGV for Windows, Java Included”; w zależności od instytucji może być wymagane posiadanie uprawnień administratora.
  2. Wybierz wersję genomu ludzkiego (genome build), która ma zostać przywołana w raportach (np. hg19 lub hg38), a która jest hostowana wewnątrz programu IGV.
    UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano wersję IGV 2.19.7. W ramach tego protokołu pobrano wersję na system Windows z dołączonym programem Java. Program IGV uruchomiono z domyślną alokacją pamięci wynoszącą 8Gb RAM. Ustawienia zalecane w zakładce preferencji IGV oraz w innych sekcjach programu opisano w Supplementary File 1.

2. Zrozumienie winiet klinicznych i pobieranie niezbędnych plików

  1. Przejdź do repozytorium GitHub: Wszystkie pliki są dostępne do pobrania w repozytorium GitHub pod adresem https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
    UWAGA: W repozytorium GitHub znajduje się plik sesji dla każdego przykładu; załadowanie tego pliku sesji eliminuje konieczność osobnego ładowania plików i przechodzenia do odpowiedniego locus, ponieważ plik sesji realizuje te kroki automatycznie.
  2. Załaduj plik sesji za pomocą menu plik. Kliknij File > Open Session i wybierz odpowiedni plik sesji.

3. Konfiguracja ścieżki pokrycia

UWAGA: W programie IGV główne okno zawiera "ścieżkę pokrycia" (coverage track). W określonych kontekstach nawet niewielka frakcja odczytów zawierających specyficzne warianty nowotworowe może mieć znaczenie kliniczne. Z tego powodu kluczowe jest osiągnięcie bardzo wysokiej głębokości odczytów w analizowanych fragmentach genomu. Jeśli tylko 2% odczytów zawiera dany wariant, do przekonującego zidentyfikowania go może być wymagana głębokość odczytu rzędu setek lub tysięcy – stąd określenie "głębokie sekwencjonowanie" (deep sequencing).

  1. Upewnij się, że ścieżka pokrycia jest widoczna: W menu górnym kliknij View > Preferences, a następnie wybierz zakładkę Alignments. Na górze zakładki znajduje się pole o nazwie 'Show coverage track'. Upewnij się, że jest ono zaznaczone.
  2. Ustaw klinicznie istotny próg dla wariantu o niskiej częstotliwości: Przejdź do zakładki Alignments , zgodnie z opisem w kroku 3.1, i przewiń w dół, aż pojawi się pole o nazwie Coverage allele-fraction. Wpisz w polu wartość 0,01 i kliknij Save (po kliknięciu Save okno preferencji powinno zostać zamknięte).

4. Konfiguracja odczytów z miękkim przycinaniem (soft-clipped reads)

UWAGA: To ustawienie jest nieocenione przy wykrywaniu większych wariantów strukturalnych, takich jak rearanżacje genów, zmiany liczby kopii lub połączone zdarzenia insercji i delecji. Zaawansowane winiety — na przykład te skupiające się na amplifikacjach i delecjach EGFR — demonstrują, w jaki sposób odczyty z tzw. miękkim przycinaniem (soft-clipped reads) mogą potwierdzić obecność wariantów strukturalnych, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte przez standardowe metody wywoływania wariantów.

  1. Włącz soft-clips: Z menu górnego wybierz View > Preferences, a następnie przejdź do karty Alignments. Przewiń w dół do pola Show soft-clipped bases i upewnij się, że jest ono zaznaczone (Supplementary File 1), aby wyświetlić odczyty częściowo dopasowane — takie, których krawędzie nie mapują się dokładnie do sekwencji referencyjnej i są "odcięte" (clipped).

5. Przypadki kliniczne

  1. Studium przypadku nr 1: Odróżnienie prawdziwego wariantu patogennego KRAS (homolog onkogenu wirusa sarkomy szczura Kirsten) od artefaktu sekwencjonowania.
    UWAGA: Przypadek A dotyczy 65-letniego mężczyzny z nowo zdiagnozowanym gruczolakorakiem płuc, w którym ocena histologiczna wykazała około 80% komórek nowotworowych. Profilowanie NGS zidentyfikowało wariant KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C), który jest znaną mutacją sterującą (driver mutation) w niedrobnokomórkowym raku płuca (NSCLC). Powstały wariant missense KRAS c.34G>T (p.G12C) występuje w około 13% gruczolakoraków płuc i kwalifikuje pacjenta do terapii celowanych9. Przypadek B dotyczy 54-letniej kobiety z rozpoznanym sarkomą (szacowane 50% guza i 50% tkanki prawidłowej). W tej próbce zidentyfikowano identyczny wariant KRAS c.34G>T (p.G12C). Jednakże, ponieważ KRAS c.34G>T (p.G12C) jest rzadko raportowany w sarkomach, jego obecność budzi podejrzenie możliwego artefaktu sekwencjonowania. 
    1. Procedura w IGV (plik sesji KRAS.xml)             
      1. Ładowanie danych: Wybierz Hg19 z rozwijanego menu genomu i załaduj plik BAM, kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam, a następnie przejdź do regionu chr12:25,398,281–25,403,833, aby skupić się na regionie genu KRAS. Pamiętaj, że plik indeksu (ta sama nazwa co plik BAM, ale z rozszerzeniem .bai) musi znajdować się w tym samym katalogu co plik BAM.  
      2. Badanie pokrycia i VAF: Przejrzyj kodon 12 w eksonie 2 (NM_004985.5) i kliknij pozycję wariantu na ścieżce pokrycia (coverage track), aby wyświetlić głębokość odczytów w tej pozycji. Zauważ substytucję G→T (zdarzenie transwersji) z VAF wynoszącym 35%–40%, co jest wysoce spójne z heterozygotyczną, klonalną mutacją sterującą (Rysunek 2A), szczególnie w kontekście około 80% cellularity guza.   
      3. Analiza błędu nici (StrandBias): Zastosuj kodowanie kolorystyczne według nici (patrz Plik uzupełniający 1, krok 4), aby ujawnić rozkład nici forward (czerwona) do reverse (niebieska) bliski 50:50 w próbce z płuc.  
      4. Powtórz kroki 5.1.1.1–5.1.1.3 dla przypadku B, próbki z sarkomy: Załaduj plik BAM, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, i zauważ VAF <1% oraz niemal wyłączne wsparcie przez nić forward, co wskazuje na artefakt PCR/wyrównania (Rysunek 2B).
  2. Studium przypadku nr 2: Rozstrzygnięcie błędnej klasyfikacji wariantu wielonukleotydowego (MNV).
    UWAGA: 50-letnia kobieta z przerzutowym czerniakiem przechodzi profilowanie guza w oparciu o NGS. Analiza identyfikuje potencjalną mutację BRAF (protoonkogen B-Raf, kinaza serynowo-treoninowa) c.1798_1799delinsAA. Podczas gdy BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) jest częstszy w różnych guzach litych, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) jest stosunkowo specyficzny dla czerniaka, ponieważ światło UV może indukować przejścia C > T w obrębie dipirymidyn10. Zgodnie z zasadami HGVS dwa warianty jednonukleotydowe (SNV) w układzie cis powinny być nazywane jako pojedynczy MNV. W wielu przypadkach potok bioinformatyczny może błędnie zidentyfikować ten złożony wariant jako dwa sąsiadujące SNV in cis: BRAF c.1798G>A oraz BRAF c.1799T>A. Ze względu na kwestie techniczne (związane z programem do wykrywania wariantów) i biologiczne (rozróżnienie cis vs trans), istnieje obawa, że mutacja może zostać błędnie zaraportowana w momencie podpisania wyniku, chyba że dane zostaną zwizualizowane podczas przeglądu klinicznego.      
    1. Procedura w IGV (plik sesji BRAF.xml)           
      1. Ładowanie danych: Wybierz Hg38 z rozwijanego menu genomu i załaduj plik BAM, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, a następnie przejdź do chr7:140,453,136–140,753,336. Pamiętaj, że plik indeksu (ta sama nazwa co plik BAM, ale z rozszerzeniem .bai) musi znajdować się w tym samym katalogu co plik BAM.
      2. Przybliżenie kodonu 600 BRAF: Zauważ zmianę dinukleotydową GT→AA na podstawie sąsiednich pozycji ścieżki pokrycia, które są zielone i niebieskie zamiast szarych, co jest spójne z p.V600K. 
      3. Wyszukiwanie dwóch indywidualnych SNV w celu ustalenia, czy są w układzie cis czy trans: Zauważ, że oba SNV są przypisane do tych samych odczytów i znajdują się w układzie cis.  
      4. Badanie nici i pokrycia: Zastosuj kodowanie kolorystyczne odczytów, aby wykazać w przybliżeniu równomierne wsparcie nici forward/reverse (patrz Plik uzupełniający 1, krok 4) oraz VAF przekraczający 50%, co jest spójne z klonalnym driverem. Próg ścieżki pokrycia wynoszący 0,01 (patrz Plik uzupełniający 1, krok 3 w celu konfiguracji) zapewnia, że częściowe subklony (jeśli występują) pozostaną widoczne (Rysunek 2C).  
      5. Analiza kontekstu i nomenklatury MNV: Dwie zmiany nukleotydowe sąsiadują ze sobą. Zgodnie z konsensusem ekspertów, SNV w odległości do 50 bp, które mapują się na ten sam odczyt sekwencji, należy określać jako pojedynczy wariant "złożony" lub "delins"11. 
  3. Studium przypadku nr 3: Badanie insercji w eksonie 9 KIT (protoonkogen KIT, receptorowa kinaza tyrozynowa) w guzie stromalnym przewodu pokarmowego (GIST)
    UWAGA: 58-letni pacjent z guzem stromalnym przewodu pokarmowego przechodzi resekcję, a następnie zlecono badanie NGS. Wyniki wskazują na możliwy wariant w KIT. Mutacje KIT są częstym driverem w GIST, występując w około 75% przypadków i są podatne na terapię celowaną. Po aktywujących mutacjach w eksonie 11, aktywujące mutacje w eksonie 9 KIT są najczęstszymi zidentyfikowanymi driverami, choć GIST z mutacją w eksonie 9 i GIST z mutacją w eksonie 11 różnią się pod względem wrażliwości na inhibitory kinazy tyrozynowej12. 
    1. Procedura w IGV (plik sesji KIT.xml)
      1. Ładowanie danych: Wybierz genom Hg19 i załaduj plik BAM, KITdupmod2.bam, upewniając się, że plik indeksu (ta sama nazwa co BAM, ale z rozszerzeniem .bai) znajduje się w tym samym katalogu. Przejdź do chr4:55,592,144-55,592,257, co odpowiada części eksonu 9 genu KIT.
      2. Kondensacja widoku: Kliknij prawym przyciskiem myszy na ścieżce wyrównania i wybierz Squished , aby skondensować widok (Rysunek 3A).
      3. Lokalizacja insercji: Zidentyfikuj marker insercji w kształcie grotu strzałki, znajdujący się bezpośrednio nad ścieżką pokrycia, pomiędzy pozycjami 55,592,178 a 55,592,179, co wskazuje na krótką insercję (Rysunek 3B,C).
      4. Interakcja z insercją: Kliknij grot strzałki, aby rozszerzyć widok, a następnie kliknij jeden z odczytów z zasadami wypełniającymi lukę, aby wyświetlić szczegóły w oknie pop-up. Porównaj wstawioną sekwencję z sekwencją referencyjną, aby ustalić, czy jest to duplikacja (Rysunek 3D,E).
      5. Analiza pokrycia: Kliknij na ścieżce pokrycia bezpośrednio obok grotu strzałki insercji, aby wyświetlić liczbę wspierających odczytów, którą można porównać z całkowitą liczbą odczytów w celu określenia przybliżonej częstotliwości wariantu allelicznego (VAF), w tym przypadku ~28%.
      6. Sprawdzenie błędu nici: Posortuj odczyty według nici i przejrzyj bazy soft-clipped (patrz Plik uzupełniający 1, sekcja 3), aby wykazać region zainteresowania sąsiadujący z insercją w odczytach reverse (Rysunek 3F).
  4. Studium przypadku nr 4: Badanie delecji w eksonie 19 EGFR (receptor naskórkowego czynnika wzrostu) w niedrobnokomórkowym raku płuca (NSCLC).
    UWAGA: 70-letnia kobieta z nowo zdiagnozowanym NSCLC przechodzi chirurgiczną resekcję guza. Zlecono badanie NGS z fragmentu tkanki o wystarczającej czystości nowotworowej; wyniki wskazują na możliwy wariant w EGFR. Wiele mutacji EGFR jest podatnych na inhibitory kinazy tyrozynowej, a ten wariant może mieć wpływ na terapię i rokowanie pacjentki13.
    1. Procedura w IGV (plik sesji EGFR.xml)
      1. Ładowanie danych: Wybierz genom Hg19, załaduj plik BAM EGFRE746_A750delmod.bam i upewnij się, że plik indeksu (ta sama nazwa co BAM, ale z rozszerzeniem .bai) znajduje się w tym samym katalogu, a następnie przejdź do chr7:55,242,420-55,242,513, co odpowiada części eksonu 19 genu EGFR.
      2. Badanie delecji za pomocą ścieżki pokrycia: Przejrzyj ścieżkę pokrycia, aby zidentyfikować mały region o niższym pokryciu, który nie znajduje się na końcach odczytów (Rysunek 4A,B). Analiza ścieżki pokrycia wykazuje niższe pokrycie nad niewielką częścią eksonu 19.
      3. Badanie delecji za pomocą odczytów: Rozszerz widok wyrównania, aby wyświetlić odczyty z luką w wyrównaniu, reprezentowaną jako czarna linia wewnątrz odczytu (Rysunek 4C,D).
      4. Analiza kontekstu genomicznego: Zbadaj sekwencję nukleotydową referencji zaangażowaną w delecję oraz w jej bezpośrednim sąsiedztwie. Oceń zgłoszoną delecję w kontekście pozycji w sekwencji referencyjnej, ponieważ delecje w regionach homopolimerowych lub repetytywnych mogą reprezentować artefakt sekwencjonowania, szczególnie gdy występują przy niskiej częstotliwości wariantu allelicznego. Szczegółowy opis procedury znajduje się w części Viewing a small deletion w Pliku uzupełniającym 2.
  5. Studium przypadku nr 5: Badanie zmian w EGFR u pacjentki z glejakiem.
    UWAGA: 77-letnia kobieta z glejakiem o dzikim typie IDH przechodzi badanie sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS). Jej wyniki wskazują na potencjalny wzrost liczby kopii EGFR oraz potencjalną rearanżację EGFRvIII (delecja eksonów 2–7). Zarówno amplifikacja EGFR, jak i zmiany EGFRvIII mają znaczenie prognostyczne i terapeutyczne w glejaku. Dodatkowo te dwie zmiany często współwystępują, co oznacza, że obecność jednej może potwierdzać ważność drugiej, gdy jest ona wykrywana na niskim poziomie.
    1. Procedura w IGV (plik sesji copynumber.xml):
      1. Ładowanie danych: Wybierz genom Hg38, załaduj plik segmentów proband.seg oraz próbki porównawcze c1.seg-c9.seg, przeciągając i upuszczając je do okna IGV. Przejdź do Chr7.
        UWAGA: Pliki segmentacji wygenerowane za pomocą CNVKit są udostępnione do pobrania. Pełna procedura użycia CNVKit do generowania kwantyfikacji liczby kopii wykracza poza zakres niniejszego badania. Jednakże, w skrócie, użyto programu CNVKit w wersji 0.9.9 (dostępnego do pobrania z https://github.com/etal/cnvkit) z gotową zbiorczą referencją składającą się z prawidłowych, euploidnych próbek. Dane wejściowe obejmują plik BED zawierający 9 144 lokalizacji sond szkieletowych CNV, rozproszonych w całym genomie. Ważnym aspektem jest to, że szczegóły wejść i parametrów potoku liczby kopii są mniej istotne niż fakt, że próbki są przetwarzane przy użyciu konfiguracji identycznej dla wszystkich próbek w jednym przebiegu. Ułatwia to rozpoznanie błędu systematycznego.
      2. Ocena mapy ciepła (heatmap): Porównaj względną intensywność kolorów między próbką badaną (zlokalizuj wiersz mapy ciepła odpowiadający tej próbce, oznaczony jako proband) a innymi próbkami (c1-9), aby odróżnić prawdziwe zmiany liczby kopii od artefaktów.
        UWAGA: Pionowe porównanie wizualne locus we wszystkich próbkach jest sposobem na identyfikację anomalii (różnice jakościowe oparte na różnicach kolorów między wierszami, a nie różnice ilościowe) w danym locus w każdej próbce względem tła. Szczegółowe kroki znajdują się na Rysunku 5 oraz w sekcji Viewing copy number changes w Pliku uzupełniającym 2.
  6. Studium przypadku nr 6: Badanie EGFRvIII u pacjentki z glejakiem.
    UWAGA: Ta sama pacjentka wykazuje również dowody rearanżacji EGFRvIII (delecja eksonów 2–7). Zarówno amplifikacja EGFR, jak i zmiany EGFRvIII mają znaczenie prognostyczne i terapeutyczne w glejaku. Dodatkowo te dwie zmiany często współwystępują, co oznacza, że obecność jednej może potwierdzać ważność drugiej, gdy jest ona wykrywana na niskim poziomie.
    1. Procedura w IGV (plik sesji egfr_vIII.xml):
      1. Ładowanie danych: Wybierz genom Hg19, załaduj plik BAM pacjentki proband.bam i upewnij się, że plik indeksu (ta sama nazwa co BAM, ale z rozszerzeniem .bai) znajduje się w tym samym katalogu, a następnie przejdź do genu EGFR.
      2. Wizualizacja punktów przełamania (breakpoints) EGFRvIII: Dostosuj widok, aby indywidualnie zbadać kandydujące punkty przełamania (powyżej eksonu 2 i poniżej eksonu 7 dla EGFRvIII), a następnie wykonaj „sort-by-base”  (lub użyj skrótu Ctrl-s w systemie Windows/Linux lub Cmd-s w systemie Mac) w punktach przełamania, aby zwizualizować spiętrzenia (pileups) odczytów soft-clipped.
      3. Wyrównanie odczytów BLAT: Kliknij prawym przyciskiem myszy na sekwencji soft-clipped i wybierz BLAT sequence (IGV używa ustawień domyślnych z UCSC, patrz https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html w celu sprawdzenia domyślnych parametrów BLAT). Kliknij pierwszy wiersz i zaobserwuj ścieżkę Blat, która pojawi się na dole sekcji ścieżek IGV.
        UWAGA: Nawet pojedynczy odczyt wyrównujący się do złącza ekson 1/intron 1 oraz do złącza intron 6/ekson 7 może być wystarczającym dowodem na EGFRvIII, o ile wykluczy się kontaminację krzyżową z innej próbki jako przyczynę obecności tego odczytu. Szczegółowe kroki znajdują się na Rysunku 6 oraz w sekcji Viewing structural rearrangement w Pliku uzupełniającym 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Należy zauważyć, że niniejsze badanie koncentruje się na opisaniu niuansów przeglądu wariantów w programie IGV na potrzeby raportowania klinicznego. Ostateczne raportowanie kliniczne powinno być uzależnione od zwalidowanego procesu, kryteriów jakości oraz polityki raportowania każdego poszczególnego laboratorium. Pełna dyskusja na ten ważny temat wykracza poza zakres niniejszego badania; jednakże zalecane standardy i wytyczne zostały opracowane przez American College of Medical Genetics and Genomics oraz Association for ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dokładna weryfikacja wariantów na potrzeby raportowania klinicznego zależy od złożonych algorytmów bioinformatycznych oraz włączenia wizualnej oceny złożonych wariantów z wykorzystaniem IGV5,6. Niniejsze badanie zostało zaprojektowane w celu opracowania zwięzłego zbioru rekomendowanych ustawień do wizualizacji prostych i złożonych zmian genomowych w programie IGV (Plik uzupełniający 1). Badanie to koncentruje się na powszechnych zmianach somatycz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie stwierdzono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni wszystkim twórcom oprogramowania IGV, a także NIH za grant finansujący obecnie rozwój IGV: U24CA258406. Na realizację niniejszego badania nie pozyskano funduszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BLATBLAT Search Genomehttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatSamodzielna strona internetowa BLAT. API BLAT jest dostępne w programie IGV, nie jest wymagana dodatkowa instalacja
CNVKitGitHubhttps://github.com/etal/cnvkitPubliczne repozytorium GitHub z bezpłatnym programem CNVKit do pobrania. Instrukcje pobierania i uruchamiania CNVKit są dostępne również tutaj.
Plik segmentowy porównawczy nr 1 dla winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.segPliki liczby kopii
Plik segmentowy porównawczy nr 2 dla winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.segPliki liczby kopii
Plik segmentowy porównawczy nr 3 dla winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.segPliki liczby kopii
Plik segmentowy porównawczy nr 4 dla winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.segPliki liczby kopii
Plik segmentowy porównawczy nr 5 dla winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.segPliki liczby kopii
Plik segmentowy porównawczy nr 6 dla winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.segPliki liczby kopii
Plik segmentowy porównawczy nr 7 dla winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.segPliki liczby kopii
Plik segmentowy porównawczy nr 8 dla winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.segPliki liczby kopii
Plik segmentowy porównawczy dla winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.segPliki liczby kopii
Sekwencja genomu ludzkiegoSekwencja genomu ludzkiegohttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gzPlik fasta do pobrania, zawierający wersję genomu ludzkiego Hg38.  Jest on dostępny w programie IGV, nie jest wymagane dodatkowe pobieranie
Sekwencja genomu ludzkiegoSekwencja genomu ludzkiegohttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gzPlik fasta do pobrania, zawierający wersję genomu ludzkiego Hg19. Jest on dostępny w programie IGV, nie jest wymagane dodatkowe pobieranie
Pakiet oprogramowania IGVOprogramowanie IGVhttps://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exeOprogramowanie IGV wersja 2.19.7 z Java (JDK 21), bezpłatne do pobrania. Tutaj znajduje się link dla systemu Windows, jednak dostępne są również linki dla systemów Linux i Mac.
Plik segmentowy dla przypadku z winiety nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.segPliki liczby kopii
Repozytorium GitHub z tutorialemGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/mainPubliczne repozytorium GitHub ze wszystkimi plikami niezbędnymi do odtworzenia sześciu winiet
Winieta nr 1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xmlPliki sesji
Winieta nr 1 Przypadek A indeks baiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam.bai		Pliki dopasowań
Winieta nr 1 Przypadek A plik dopasowań bamGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam		Pliki dopasowań
Winieta nr 1 Przypadek B indeks baiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam.bai		Pliki dopasowań
Winieta nr 1 Przypadek B plik dopasowań bamGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam		Pliki dopasowań
Winieta nr 2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xmlPliki sesji
Winieta nr 2  indeks baiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai		Pliki dopasowań
Winieta nr 2  plik dopasowań bamGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam		Pliki dopasowań
Winieta nr 3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xmlPliki sesji
Winieta nr 3 plik indeksu baiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.baiPliki dopasowań
Winieta nr 3 plik dopasowań bamGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bamPliki dopasowań
Winieta nr 4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xmlPliki sesji
Winieta nr 4 plik dopasowańGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bamPliki dopasowań
Winieta nr 4 indeks baiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.baiPliki dopasowań
Winieta nr 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xmlPliki sesji
Winieta nr 6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xmlPliki sesji
Winieta nr 6 indeks baiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.baiPliki dopasowań
Winieta nr 6 plik dopasowań bamGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bamPliki dopasowań

Bibliografia

  1. Tjota MY, Segal JP, Wang P. Clinical utility and benefits of comprehensive genomic profiling in cancer. J Appl Lab Med. 2024;9(1):76-91.
  2. Freedman AN, et al. Use of next-generation sequencing tests to guide cancer treatment: results from a nationally representative survey of oncologists in the United States. JCO Precis Oncol. 2018;2:PO.18.00169.
  3. Ghoreyshi N, et al. Next-generation sequencing in cancer diagnosis and treatment: clinical applications and future directions. Discov Oncol. 2025;16:578.
  4. Aisner DL, et al. The Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL): A vision for a genomics future for academic pathology. Acad Pathol. 2023;10(3):100090.
  5. Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Wenger AM, Zehir A, Mesirov JP. Variant review with the Integrative Genomics Viewer (IGV). Cancer Res. 2017;77(21):e31-e34.
  6. Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 2013;14(2):178-192.
  7. Richards S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424.
  8. Larson NB, Oberg AL, Adjei AA, Wang L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 2023;18(2):143-157.
  9. Jänne PA, et al. Adagrasib in non-small-cell lung cancer harboring a KRAS G12C mutation. N Engl J Med. 2022;387(2):120-131.
  10. Vandenberg BN, et al. Contributions of replicative and translesion DNA polymerases to mutagenic bypass of canonical and atypical UV photoproducts. Nat Commun. 2023;14(1):2576.
  11. Dunn T, Narayanasamy S. vcfdist: accurately benchmarking phased small variant calls in human genomes. Nat Commun. 2023;14(1):8149.
  12. Trent JC. Toward personalized, targeted therapy of gastrointestinal stromal tumor. Gastrointest Cancer Res. 2008;2(5):256-257.
  13. Xu CW, et al. Molecular characteristics and clinical outcomes of EGFR Exon 19 C-helix deletion in non-small cell lung cancer and response to EGFR TKIs. Transl Oncol. 2020;13(9):100791.
  14. Guille A, et al. A benchmarking study of individual somatic variant callers and voting-based ensembles for whole-exome sequencing. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae697.
  15. Cooke DP, Wedge DC, Lunter G. A unified haplotype-based method for accurate and comprehensive variant calling. Nat Biotechnol. 2021;39(7):885-892.
  16. Ezzati S, Salib S, Balasubramaniam M, Aboud O. Epidermal Growth Factor Receptor inhibitors in glioblastoma: current status and future possibilities. Int J Mol Sci. 2024;25(4):2316.
  17. Vivanco I, et al. Differential sensitivity of glioma- versus lung cancer-specific EGFR mutations to EGFR kinase inhibitors. Cancer Discov. 2012;2(5):458-471.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie nast pnej generacjiwizualizacja danych sekwencjonowaniawykrywanie wariant w genomowychanaliza wariant w somatycznychformat plik w VCFformat plik w BAMcz sto wyst powania allelu wariantu

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.