Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i charakterystyka rozpuszczalnych plastrów z mikroigłami obciążonymi 3BDO w celu stymulacji odrostu włosów u myszy C57BL/6

74 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71814

⸱

25 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Stomatology, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie, charakterystykę oraz zastosowanie rozpuszczalnych plastrów z mikroigłami obciążonymi 3BDO do transdermalnego dostarczania leków w modelu odrastania włosów u myszy.

Streszczenie

Tradycyjne metody leczenia łysienia androgenowego (AGA) mają swoje ograniczenia, co motywuje do poszukiwania alternatywnych podejść do dostarczania leków. Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie, charakterystykę i zastosowanie rozpuszczalnych plastrów z mikroigieł (MN) wykonanych z kwasu hialuronowego/chitozanu (HA/CS) obciążonych 3BDO w modelu odrastania włosów u myszy C57BL/6. Metoda ta wykorzystuje dwuetapowy proces formowania w formie z polidimetylosiloksanu (PDMS), aby skoncentrować 3BDO w końcówkach igieł, tworząc jednocześnie wolną od leku warstwę podkładową z HA/CS. Plaster jest charakteryzowany za pomocą obrazowania skaningowym mikroskopem elektronowym (SEM), testów mechanicznych, testów penetracji skóry i rozpuszczalności, testów uwalniania in vitro, testów przeciwbakteryjnych, testów cytotoksyczności oraz oceny odrastania włosów in vivo. Po wprowadzeniu końcówki MN rozpuszczają się, uwalniając 3BDO lokalnie. Ocena in vivo wykazała, że w grupie z MN obciążonymi 3BDO odrastanie włosów było bardziej jednorodne niż w badanym grupie z iniekcjami podskórnymi oraz grupie kontrolnej. Protokół ten wspiera również ocenę morfologii plastra, wydajności penetracji oraz lokalnej biozgodności. Metoda ta zapewnia przedklinowy schemat postępowania w celu oceny dostarczania 3BDO za pomocą mikroigieł w zastosowaniach związanych z odrastaniem włosów.

Wprowadzenie

Łysienie androgenowe (AGA) jest jednym z najczęstszych klinicznych zaburzeń prowadzących do utraty włosów, charakteryzującym się przede wszystkim postępującym przerzedzeniem i wypadaniem włosów na skórze głowy. Jego dożywotnia zapadalność pozostaje stale wysoka wśród mężczyzn, co czyni je istotnym problemem zdrowotnym wymagającym pilnego rozwiązania1,2. Obecnie kliniczne metody leczenia AGA dzielą się głównie na interwencje farmakologiczne oraz przeszczepy chirurgiczne, z których obie mają istotne wady. Leki pierwszego rzutu, takie jak finasteryd i minoksydyl, wykazują określone działanie terapeutyczne, ale wiążą się z konkretnymi reakcjami niepożądanymi, takimi jak dysfunkcje seksualne, świąd skóry głowy oraz suchość skóry głowy1,3. Chociaż przeszzczep włosów może doprowadzić do lokalnej regeneracji owłosienia, jest on ograniczony przez wysokie koszty leczenia, niewystarczającą ilość włosów w obszarach dawców oraz zmienny odsetek przeżywalności przeszczepów, co utrudnia jego szerokie upowszechnienie w praktyce klinicznej1. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, istnieje zapotrzebowanie na nowe strategie terapeutyczne łączące skuteczność, bezpieczeństwo i zgodność pacjenta z leczeniem.

3BDO jest małocząsteczkowym aktywatorem mTOR konkurującym z rapamycyną4. Był on szeroko stosowany jako inhibitor autofagii w różnych układach5,6,7. Na przykład długotrwałe leczenie 3BDO mogło poprawić funkcje pamięci poprzez zmniejszenie liczby autofagosomów8. Ponadto narastające dowody sugerują, że 3BDO może działać niezależnie jako aktywator mTOR. Przykładowo, 3BDO hamował śmierć komórek śródbłonka i rozwój miażdżycy u myszy, niezależnie od aktywności mTOR9. Jednakże jego potencjalna rola we wzroście mieszków włosowych nie została opisana. Co istotne, w naszych wstępnych badaniach stwierdzono, że 3BDO promuje odrastanie włosów. Niemniej jednak tradycyjne metody miejscowego podawania leków mają wyraźne ograniczenia. Warstwa rogowa naskórka ogranicza efektywność przenikania przez skórę, co utrudnia dostarczenie leków do docelowego miejsca w mieszku włosowym w skórze właściwej. Chociaż żele transdermalne mogą wydłużyć czas retencji leku, mogą one pozostawiać niepożądane osady. Skuteczność kliniczna obu wspomnianych strategii leczenia pozostaje nieoptymalna10,11.

Mikroigły (MNs) stanowią nowatorską, bezbolesną technologię dostarczania leków, której główną zaletą jest zdolność do łatwego przenikania przez warstwę rogą oraz precyzyjnego dostarczania substancji leczniczych do mikrośrodowiska okołomieszkowego na granicy naskórka i skóry właściwej. Ponadto MNs charakteryzują się wygodą użytkowania, minimalną inwazyjnością i przystępnym kosztem12,13,14. Aby rozwiązać problem ograniczonej przenikalności skórnej miejscowego podawania 3BDO, opracowano plaster z mikroigieł wykorzystujący kwas hialuronowy (HA) jako matrycę i chitosan (CS) jako komponent funkcjonalny. Wprowadzenie CS ma na celu zapewnienie składnika o potencjale przeciwbakteryjnym. Co więcej, zastosowanie HA na skórze myszy z łysicą może znacząco stymulować rozwój mieszków włosowych15. Niniejszy protokół opisuje zatem wytwarzanie i charakterystykę rozpuszczalnego systemu mikroigieł obciążonych 3BDO oraz jego zastosowanie w modelu odrastania włosów u wygolonych myszy C57BL/6. Model ten jest użyteczny do oceny odpowiedzi w zakresie odrastania włosów po depilacji, jednak sam w sobie nie potwierdza skuteczności klinicznej w przypadku AGA.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyki badań na zwierzętach Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences (W202112030345). Wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

1. Wytwarzanie plastrów 3BDO@MN

  1. Przygotowanie formulacji CS/HA
    1. Odważyć 1 g proszku CS (stopień deacetylacji ≥ 95%) i dodać go do 20 mL wody destylowanej, a następnie mieszać w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min.
    2. Dodać 0,4 mL 2% (v/v) roztworu kwasu octowego (masa cząsteczkowa 60,05) i kontynuować mieszanie przez 2 h.
      OSTROŻNIE: Stężony kwas octowy jest substancją żrącą. Rozcieńczanie i obchodzenie się z odczynnikiem należy przeprowadzać w wyciągu, stosując jednorazowe rękawice i gogle ochronne, aby zapobiec kontaktowi ze skórą i błonami śluzowymi.
    3. Dodać 2 g proszku HA, a następnie odwirować zmieszaną formulację przy 1 207 × g (około 3 000 obr./min) przez 5 min, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
      ​UWAGA: Formulacja CS/HA powinna być przygotowana na świeżo; można ją przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez 24 h.
  2. Przygotowanie formulacji CS/HA obciążonej 3BDO
    1. Dodać uprzednio rozpuszczony roztwór 3BDO (2 mg/mL) w dimetylosulfotlenku (DMSO).
      OSTROŻNIE: DMSO przenika przez skórę. Podczas pracy należy stosować rękawice, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu ze skórą, a następnie dodać roztwór do formulacji CS/HA. Wymieszać, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
    2. Odwiruwać zmieszaną formulację przy 1 207 × g przez 5 min, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.
      ​UWAGA: Jeśli po wirowaniu nadal obecne są pęcherzyki, pozostawić formulację na 5 min, a następnie odwirować ponownie.
  3. Wytwarzanie plastrów 3BDO@MN
    1. Użyć formy do MN z polidimetylosiloksanu (PDMS), zawierającej macierz 20 × 20 stożkowych grotów o wysokości 600 µm, średnicy podstawy 250 µm i rozstawie 550 µm.
    2. Potraktować powierzchnię formy PDMS oczyszczaczem plazmowym, aby uczynić ją całkowicie hydrofilową.
    3. Dodać 1 mL formulacji 3BDO@CS/HA do formy PDMS MN. Umieścić formę w komorze próżniowej i zastosować próżnię przez 10 min, aby ułatwić infiltrację lepkej formulacji do mikrownęk.
    4. Odwirować formę przy 134 × g przez 5 min w RT, aby zapewnić wypełnienie wszystkich wnęk przez formulację. Za pomocą sterylnej metalowej skrobaczki ostrożnie usunąć nadmiar formulacji z powierzchni formy, pozostawiając idealnie płaską powierzchnię.
    5. Nanieść na powierzchnię formy mieszaninę matrycy CS/HA bez 3BDO. Odwirować przy 134 × g przez 5 min w RT, aby utworzyć jednorodną warstwę podkładu.
    6. Umieścić formę w suszarce w temperaturze 36 °C i wilgotności 37% i suszyć przez noc (około 12–16 h).
    7. Oderwać całkowicie wysuszony plaster MN z formy po jej ochłodzeniu do RT.
      UWAGA: Wytworzone plastry 3BDO@MN należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

2. Charakterystyka plastrów 3BDO@MN

  1. Zamocuj przygotowany plaster 3BDO@MN na stubie, używając dwustronnej przewodzącej taśmy węglowej.
    1. Nanieś na zamontowaną próbkę cienką warstwę złota (lub platyny) metodą naparowania w celu zwiększenia przewodnictwa elektrycznego.
    2. Umieść stub z preparatem w komorze próżniowej skaningowego mikroskopu elektronowego z emiterem polowym (FE-SEM).
    3. Dostosuj napięcie przyspieszające oraz odległość roboczą, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości. Zaobserwuj ogólną morfologię macierzy oraz szczegółową topografię powierzchni poszczególnych MN.
    4. Wykonaj reprezentatywne mikrografie SEM. Zmierz długość MN oraz średnicę wierzchołka.
  2. Badanie wytrzymałości mechanicznej
    1. Umieść płasko plaster MN na stole pomiarowym analizatora tekstury. Upewnij się, że podłoże jest całkowicie płaskie, a końcówki igieł skierowane są bezpośrednio w górę.
    2. Mocno przymocuj płaską cylindryczną sondę (o średnicy 25 mm) do ogniwa pomiarowego urządzenia.
    3. Obniż sondę pionowo, aż znajdzie się tuż nad końcówkami MN. Unikaj jakiegokolwiek kontaktu fizycznego między sondą a końcówkami przed rozpoczęciem testu.
    4. Ustaw w oprogramowaniu specyficzne parametry testu: prędkość nacisku ustaw na 0,05 mm/s, a docelny dystans przemieszczenia na 0,7 mm.
  3. Test rozpuszczania
    1. Rozłóż skórę grzbietową szczura na stole sekcyjnym i osusz powierzchnię skóry za pomocą ręcznika papierowego. Dopilnuj, aby skóra była płasko rozłożona i pozbawiona zmarszczek.
    2. Należy umieścić suche plastry MN końcami igieł skierowanymi do dołu na powierzchni skóry, a następnie przyłożyć jednostajny nacisk pionowy, aby zapewnić wprowadzenie MN do skóry.
    3. Zdejmij plastry ze skóry w określonych odstępach czasu (5, 10, 30 i 60 s) i susz przez 5 min.
    4. Obserwować morfologię pozostałości za pomocą SEM w tych samych warunkach obrazowania.
  4. In vitro testy uwalniania leku
    1. Dodać 500 µL buforu fosforanowego (PBS) do każdej studzienki płytki 6-dołkowej. Umieścić nanocząsteczki (MNs) obciążone 3BDO w każdej studzience w taki sposób, aby stykały się z PBS.
    2. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej. W każdym punkcie czasowym pobrać 500 µL buforu PBS do ilościowego oznaczenia stężenia 3BDO.
    3. Należy niezwłocznie uzupełnić każdy dołek o 500 µL świeżego PBS w celu utrzymania warunków odpływu (sink conditions).
    4. Oblicz skumulowany procent uwolnienia 3BDO na podstawie całkowitej zawartości leku początkowo znajdującej się w MNs.
  5. Testy przeciwbakteryjne
    1. Wyjmij zapasy komórek bakteryjnych (*E. coli* i Staphylococcus aureus) z przechowywania w temperaturze -80 °C, i dodać 10 µL każdej hodowli bakterii do 5 ml pożywki LB.
    2. Inkubować zaszczepioną pożywkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C oraz 250 obr./min przez około 16 h (przez noc).
    3. Dostosować kulturę bakteryjną w podłożu LB do początkowej gęstości optycznej (OD)620 wynoszącej 0,01.
    4. Rozcieńczyć roztwór zapasowy CS sterylną wodą w celu przygotowania roztworów CS o sześciu stężeniach (1, 5, 10, 50, 100 i 500 mg/ml), wykonując trzy powtórzenia dla każdego stężenia.
    5. Podziel próbki na trzy grupy: grupę ślepą, grupę kontrolną oraz grupę CS. Do grupy ślepej dodaj 200 µL podłoża LB. W przypadku grupy kontrolnej należy dodać 180 µL roztworu bakteryjnego i 20 µL sterylnej wody. W przypadku grupy CS dodać 180 µL roztworu bakteryjnego i 20 µL odpowiedniego stężenia roztworu CS.
    6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 h.
    7. Zmierzyć i zapisać wartość OD620 z każdej studni płytki 96-dołkowej za pomocą czytnika płytek absorbancyjnych w 0 h i 20 h.
  6. Oceny cytotoksyczności
    1. Nasiono 100 µL zawiesiny komórek naskórka lub skóry właściwej do płytki 96-dołkowej (2 × 103 komórek na dołek).
    2. Dodaj 10 µL odpowiednich preparatów do wyznaczonych studzienek w celu utworzenia czterech grup: grupy kontrolnej (pożywka hodowlana), grupy 3BDO (stężenie końcowe wynoszące 1 µM), grupę z ekstraktem MN oraz grupę 3BDO+ekstrakt MN, z 3 powtórzeniami dla każdej grupy.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2₂ przez 24 h.
    4. Dodaj 10 µL roztworu roboczego zestawu do liczenia komórek Cell Counting Kit-8 (CCK-8) do każdej studzienki.
      UWAGA: Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza w dołkach, ponieważ mogą one wpływać na odczyty absorbancji.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2₂ przez 2 h.
    6. Zmierz absorbancję przy 450 nm dla wszystkich dołków za pomocą spektrofotometru do mikropłytek.
    7. Przeanalizuj dane i oblicz przeżywalność komórek.

3. Eksperymenty na zwierzętach

  1. Przygotowanie i traktowanie zwierząt doświadczalnych
    1. Zanurzyć w znieczuleniu 7-tygodniowe samce myszy C57BL/6 przy użyciu izofluranu, zapewniając termoregulację podczas znieczulenia.
      OSTRZEŻENIE: Izofluran jest lotnym środkiem znieczulającym. Pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, aby uniknąć nadmiernego wdychania.
    2. Nanieść smar oftalmiczny na oczy myszy, aby chronić je przed wysychaniem.
    3. Ogolić włosy na grzbietach myszy za pomocą golarki elektrycznej, przygotowując obszar o wymiarach około 2 × 2 cm2.
    4. Nanieść krem do depilacji, odczekać 5–10 s, a następnie go usunąć. Przetrzeć skórę gazikiem z solą fizjologiczną, aby usunąć pozostałości kremu do depilacji i włosy.
    5. Przyciąć plastry MN i odłożyć je na bok.
    6. Losowo podzielić ogolone myszy na pięć grup (n = 5 na grupę) i traktować w następujący sposób:
      1. Grupa kontrolna nietraktowana: wyłącznie ogolenie włosów bez żadnej terapii.
      2. Grupa z pustymi plastrami MN: traktować ogoloną skórę plastrami MN bez 3BDO zgodnie z tym samym harmonogramem, co grupa 3BDO@MN.
      3. Grupa z plastrami 3BDO@MN: traktować ogoloną skórę plastrami 3BDO@MN w dniach 1, 3, 5, 7, 9, 11 i 13.
      4. Grupa z podskórnymi iniekcjami PBS: codziennie podawać podskórnie roztwór PBS w ogolony obszar grzbietu myszy.
      5. Grupa z podskórnymi iniekcjami 3BDO: codziennie podawać podskórnie roztwór 3BDO w ogolony obszar grzbietu myszy.
    7. Przyłożyć plastry 3BDO@MN do ogolonej skóry i wywrzeć jednolity nacisk pionowy, aby zapewnić wprowadzenie MN w głąb skóry. Zabezpieczyć plastry 3BDO@MN elastycznym bandażem i użyć klamry prostej do jego przymocowania.
      ​UWAGA: Różne harmonogramy dawkowania wybrano zgodnie z odrębnymi charakterystykami dostarczania każdej z metod: plaster 3BDO@MN zapewnia miejscowe uwalnianie przedłużone, podczas gdy iniekcja podskórna dostarcza 3BDO w formie dawki bolusa.
    8. Obserwować myszy przez cały czas trwania eksperymentu, aby upewnić się, że w pełni wybudziły się z narkozy.
  2. Zbiór próbek i ocena wzrostu włosa
    1. Wykonuj codziennie zdjęcia skóry grzbietowej myszy, aby rejestrować wzrost włosa.
    2. Ocenić odrastanie włosów, mierząc średnicę trzasteka, stopień pokrycia włosem oraz gęstość włosów w 15. dniu. Ilościowo określić procent pokrycia włosem w obszarze traktowanym przy użyciu oprogramowania ImageJ.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia sposób wytwarzania i charakterystyki plastra 3BDO@MN. Rysunek 1 przedstawia schemat procesu wytwarzania plastra 3BDO@MN. 3BDO zmieszano z formulacją CS/HA, a następnie mieszaninę matrycy naniesiono do formy PDMS MN i odwirowano, aby wypełnić końcówki igieł. Mieszaninę matrycy CS/HA bez 3BDO naniesiono na powierzchnię formy i odwirowano w celu wypełnienia warstwy nośnej. Po całkowitym wyschnięciu plastry odklejono, otrzymując plastry 3BDO@MN. Morfologię MN scharakteryzowano za pomocą SEM, co przedstawiono na Rysunku 2A.

Stożkowe MN-y zostały uformowane jednorodnie w macierzy 20 × 20 na plastrze o wymiarach 15 × 15 mm, przy czym każda igła miała szerokość podstawy 250 µm i wysokość 600 µm. Końcówki MN wytrzymały siłę 1,2 N, co jest wystarczające do penetracji skóry, o czym świadczą wyraźne otwory po wkłuciu widoczne w barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E) (Ryc. 2B,C). Do przetestowania aplikacji plastrów 3BDO@MN wykorzystano skórę grzbietową myszy. Plastry dociśnięto do skóry myszy w celu pomiaru czasu rozpuszczania; końcówki MN rozpuściły się całkowicie w czasie poniżej 60 s (Ryc. 2D). W badaniu in vitro profil uwalniania 3BDO z MN wykazał, że uwolnione zostało około 90% leku (Ryc. 2E). Ekstrakt z MN nie wykazał cytotoksyczności wobec komórek naskórka i skóry właściwej, podczas gdy 1 µM 3BDO znacząco stymulowało wzrost komórek (Ryc. 2F). Formuła zawierająca chitosan wykazała zależną od stężenia aktywność przeciwbakteryjną wobec E. coli oraz S. aureus, z bardziej wyraźnym efektem przy stężeniach przekraczających 10 mg/mL (Ryc. 2G,H). Wyniki te potwierdzają zasadność stosowania chitosanu jako funkcjonalnego składnika formuły MN, choć do potwierdzenia działania przeciwbakteryjnego w warunkach aplikacji konieczne byłoby dalsze testowanie gotowych plastrów.

Wyniki eksperymentów na zwierzętach wykazały, że w grupie 3BDO@MN wystąpiła znacząca pigmentacja skóry w 5. dniu. Do 15. dnia grupa, która otrzymała iniekcje 3BDO, wykazała około 45% pokrycia włosem, w porównaniu do około 39% w grupie kontrolnej, podczas gdy grupa 3BDO@MN osiągnęła około 90% pokrycia (Rysunek 3). Odrost włosów w grupie 3BDO@MN był bardziej jednolity i gęsty, co wskazuje na lepszą penetrację i retencję leku niż w przypadku bezpośredniej iniekcji.

Wspólnie wyniki te wskazują, że dostarczanie 3BDO za pomocą MN promowało odrost włosów w modelu myszy C57BL/6 z depilacją użytym w niniejszym badaniu. Wymagane są dalsze badania, aby ustalić, czy podejście to jest skuteczne w modelach specyficznych dla choroby łysienia androgenowego oraz w klinicznie istotnych warunkach dawkowania.

Schemat procesu biodruku 3D: powłoka 3BDOQCS/HA, wirowanie, suszenie próżniowe, matryca CS/HA.
Rycina 1. Schematyczna ilustracja procesu wytwarzania 3BDO@MNs. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy macierzy mikroigieł i wykresy żywotności komórek; badanie właściwości przeciwbakteryjnych mleczanu chitosanu.
Rysunek 2. Wytwarzanie i charakterystyka systemu 3BDO@MN. (A) Obraz SEM przedstawiający morfologię 3BDO@MNs. Pasek skali = 500 µm. (B) Krzywa siła-przemieszczenie 3BDO@MNs. (C) Przekrój skóry myszy barwiony H&E po wprowadzeniu 3BDO@MNs i usunięciu podstawy, potwierdzający skuteczną penetrację tkanki. Pasek skali = 100 µm. (D) Obrazy SEM przedstawiające rozpuszczanie MNs w czasie 5 s, 10 s, 30 s i 60 s po wprowadzeniu w skórę. (E) Kumulatywny profil uwalniania 3BDO z MNs in vitro. (F) Żywotność komórek naskórka i komórek skóry właściwej traktowanych 3BDO, ekstraktem z MN oraz ekstraktem z MN zawierającym 3BDO po 24 h. (G,H) Absorbancja przy 620 nm zawiesin (G) Staphylococcus aureus oraz (H) Escherichia coli hodowanych w pożywce zawierającej chitosan w różnych stężeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3), a istotność statystyczną analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA (**p < 0.01). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment dotyczący wzrostu włosów z użyciem plastrów z mikroiłkami (MN); wyniki pigmentacji i pokrycia włosami u myszy.
Rycina 3. Efekty odrastania włosów 3BDO@MNs in vivo. (A) Schematyczna ilustracja eksperymentów na zwierzętach. (B) Reprezentatywne obrazy skóry grzbietu myszy w dniu 0 (golenie), dniu 5, dniu 10 i dniu 15 po zastosowaniu leczenia. (C) Analiza ilościowa punktacji pigmentacji (jednostki umowne) w (B). (D) Analiza ilościowa powierzchni pokrycia włosami (%) w obszarze leczonym w (B). (E) Względna krotność zmiany powierzchni pokrycia włosami w obszarze leczonym w porównaniu z grupą kontrolną. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 5), a istotność statystyczną analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (**p < 0.01). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Obecnie leczenie kliniczne AGA dzieli się głównie na interwencje farmakologiczne oraz przeszczepy chirurgiczne. W niniejszym badaniu MNy obciążone 3BDO stymulowały odrastanie włosów w modelu myszy C57BL/6. Jednakże konwencjonalne metody dostarczania leków mają pewne ograniczenia, takie jak nierównomierny rozkład leku. Kluczowym protokołem w tym badaniu jest dwuetapowa metoda wytwarzania MNów obciążonych 3BDO. HA i CS stanowią główne składniki MNów. Aby zapewnić jakość MNów, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka krytycznych etapów.

Po pierwsze, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w roztworze polimeru, zastosowano schłodzoną wcześniej formę w celu spowolnienia odparowywania rozpuszczalnika podczas wirowania. Po drugie, warunki suszenia bezpośrednio wpływają na kruchość końcówek oraz integralność warstwy podkładowej. Suszenie przez 16 h w temperaturze 36 °C przy kontrolowanej wilgotności pomogło zapewnić wystarczającą wytrzymałość mechaniczną końcówek przy jednoczesnym zachowaniu elastyczności warstwy podkładowej i uniknięciu przesuszenia. Po trzecie, prędkość 134 × g przez 5 min skutecznie koncentruje 3BDO w obszarze końcówek, jednak wyższe prędkości lub dłuższy czas mogą spowodować wytrącanie się leku u podstawy formy, co obniża wydajność dostarczania. W badaniu in vivo jako model odrastania włosów wykorzystano myszy C57BL/6. Mieszki włosowe myszy C57BL/6 wykazują widoczny, wysoce zsynchronizowany cykl wzrostu włosa, co zapewnia wygodę eksperymentalną i czyni je jednym z najczęstszych modeli badania chorób skóry16. W wieku około 7 tygodni mieszki włosowe myszy C57BL/6 naturalnie wchodzą w fazę telogenu. Po sztucznej depilacji myszy mieszki włosowe natychmiast ponownie wchodzą w fazę anagenu17. Badanie in vivo wykazało, że w tym modelu system MN promował bardziej jednorodne odrastanie włosów niż wstrzyknięcie podskórne.

System 3BDO@MN może stanowić obiecującą strategię przedkliniczną w leczeniu utraty włosów, integrując małocząsteczkowy związek regenerujący włosy z małoinwazyjną platformą do dostarczania przezskórnego. Doniesiono, że długo działające formulacje z mikroiłkami umożliwiają kontrolowane lub przedłużone uwalnianie leku, zmniejszają częstotliwość podawania oraz poprawiają przestrzeganie zaleceń przez pacjentów, rozwiązując tym samym niektóre ograniczenia związane z konwencjonalnymi metodami leczenia miejscowego lub systemowego18,19. Ponadto ostatnie strategie regeneracji włosów wspomagane mikroiłkami, w tym dostarczanie komórek macierzystych, dodatkowo potwierdzają szeroką aplikowalność platform mikroiłkowych w tej dziedzinie20. Niemniej jednak przed wdrożeniem klinicznym nadal wymagane są dalsze badania w celu oceny długoterminowego bezpieczeństwa biologicznego, profili farmakokinetycznych/farmakodynamicznych, optymalizacji dawkowania, stabilności przechowywania oraz skalowalności procesu produkcji.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez National Natural Science Foundation of China (82273554), Medical and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province (nr 202304030716), National College Students Innovation and Entrepreneurship Training Program of China (nr 202410439001) oraz Tai’an Science and Technology Innovation Development Project (nr 2023NS232).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3BDOYuanye Bio-Technology Co., Shanghai, China890405-51-3Przygotowanie formulacji CS/HA z obciążeniem 3BDO
płytka 6-dołkowaCorning Incorporated, USAREF 3516testy przeciwbakteryjne i testy uwalniania leku in vitro
75% etanolShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.1202050004Dezynfekcja
płytka 96-dołkowaCorning Incorporated, USAREF3599ocena cytotoksyczności komórkowej i testy przeciwbakteryjne
myszy C57BL/6Charles River Laboratories7 tygodnidoświadczenia na zwierzętach
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)Dojindo, JapanCK04ocena cytotoksyczności
WirówkaThermo Fisher Scientific75007204Wirowanie formulacji
Chitozan (CS) Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd9012-76-4Przygotowanie formulacji CS/HA
Krem do depilacjiVeet3059944023307Depilacja
Dimetylosulfoksyd (DMSO)Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd67-68-5Przygotowanie formulacji CS/HA z obciążeniem 3BDO
Waga elektronicznaRadwagAS 220.R2Ważenie proszków
Escherichia coli (E. coli)ATCC/test przeciwbakteryjny
Kwas hialuronowy (HA) w proszkuBloomage Biotechnology Co. China9067-32-7Przygotowanie formulacji CS/HA
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of Health/Analiza statystyczna
Inkubator z wytrząsarkąThermo Scientific  50163013inkubacja bakterii
Waporyzator izofluranuGene&IAMSznieczulenie zwierząt
Pożywka LBSigma Life ScienceL3022test przeciwbakteryjny
Mieszadło magnetyczneHangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.SP-16Mieszanie formulacji
Spektrofotometr z mikrodołkami Multiskan SkyHighThermo Fisher Scientific/pomiar OD
SuszarkaShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,LtdDHG-9260ASuszenie mikroigieł
Parafilm MAmcor PM-996Uszczelnianie mikroigieł
Bufor fosforanowy (PBS)BiosharpBL302Atest uwalniania leku in vitro
Staphylococcus aureus (S. aureus)ATCC/test przeciwbakteryjny
Uniwersalny analizator tekstury TAShanghai Tengba Instrument Technology Co., Ltd/Badanie wytrzymałości mechanicznej
Komora próżniowaShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,LtdDZF-6050Suszenie próżniowe

Bibliografia

  1. Zhou C, Li X, Wang C, Zhang J. Alopecia areata: an update on etiopathogenesis, diagnosis, and management. Clin Rev Allergy Immunol. 2021;61(3):403-23.
  2. Rudnicka L. Hair loss is a symptom of many complex medical and psychological problems. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2023;37(8):1460-1.
  3. Alessandrini A, Bruni F, Piraccini BM, Starace M. Common causes of hair loss: clinical manifestations, trichoscopy and therapy. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2021;35(3):629-40.
  4. Zhao X et al. Long noncoding RNA CA7-4 promotes autophagy and apoptosis via sponging MIR877-3P and MIR5680 in high glucose-induced vascular endothelial cells. Autophagy. 2020;16(1):70-85.
  5. Wang L et al. An effective pharmacological hydrogel induces optic nerve repair and improves visual function. Sci China Life Sci. 2024;67(3):529-42.
  6. Wei Y et al. Midline-1 regulates effector T cell motility in experimental autoimmune encephalomyelitis via mTOR/microtubule pathway. Theranostics. 2024;14(3):1168-80.
  7. Gao Y et al. Rheb1 promotes tumor progression through mTORC1 in MLL-AF9-initiated murine acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 2016;9:36.
  8. Wei L et al. A butyrolactone derivative 3BDO alleviates memory deficits and reduces amyloid-beta deposition in an AbetaPP/PS1 transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 2012;30(3):531-43.
  9. Meng N et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein E1 regulates protein disulphide isomerase translation in oxidized low-density lipoprotein-activated endothelial cells. Acta Physiol (Oxf). 2015;213(3):664-75.
  10. Clavel C et al. Sox2 in the dermal papilla niche controls hair growth by fine-tuning BMP signaling in differentiating hair shaft progenitors. Dev Cell. 2012;23(5):981-94.
  11. Yang CC, Cotsarelis G. Review of hair follicle dermal cells. J Dermatol Sci. 2010;57(1):2-11.
  12. Jin Y et al. Multifunctional microneedle patches loaded with engineered nitric oxide-releasing nanocarriers for targeted and synergistic chronic wound therapy. Adv Mater. 2025;37(5):e2413108.
  13. Wu H et al. Ultrasonic hollow microneedle array (USHM) for androgenetic alopecia treatment through modulating the expression of hair-growth-associated genes. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(14):21419-30.
  14. Cao Y et al. Dissolvable microneedle-based wound dressing transdermally and continuously delivers anti-inflammatory and pro-angiogenic exosomes for diabetic wound treatment. Bioact Mater. 2024;42:32-51.
  15. Liu J et al. Medium-molecular weight hyaluronic acid orchestrates hair follicle regeneration via CD44/AKT-driven endogenous ROS activation of beta-catenin. Int J Biol Macromol. 2026;360:151752. doi:10.1016/j.ijbiomac.2026.151752.
  16. Nareswari A et al. Development and validation of a C57BL/6 mouse model of androgenetic alopecia through testosterone propionate induction. Trends Sci. 2026;23(8):12711.
  17. Liu M, He G, Wang F, Wang Y. In vivo non-invasive observation of dynamic changes in hair shaft, melanin, and collagen during the C57BL/6 follicle cycle. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.09.15.676351.
  18. Vora LK et al. Long-acting microneedle formulations. Adv Drug Deliv Rev. 2023;201:115055.
  19. Xiang H et al. Dissolving microneedles for alopecia treatment. Colloids Surf B Biointerfaces. 2023;229:113475.
  20. Xiao T et al. Microneedle assisted delivery of epidermal and dermal stem cells to promote hair growth. J Mater Sci. 2024;59(19):8427-40.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bioengineering3BDOWnt cateninAndrogenetic alopeciaHair regenerationMicroneedleTransdermal delivery

Powiązane artykuły