Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Podsumowanie

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Streszczenie

Rozwój fizjologicznie istotnych ludzkich systemów modelowych, które odzwierciedlają architekturę tkanki i dynamikę stanu komórkowego, pozostaje głównym wyzwaniem w badaniach nad rozwojem piersi i wczesnymi zdarzeniami w karcynogenezie. Konwencjonalne dwuwymiarowej kultury i wiele trójwymiarowych systemów nie są w stanie uchwycić organizacji strukturalnej i mikrośrodowiskowych wskazówek, które definiują ludzką gruczoł piersiowy. Przedstawiamy tutaj metodę, która umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych organizmów ludzkiej piersi z pierwotnych komórek nabłonkowych osadzanych w zdefiniowanej matrycy hydrożelowej składającej się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowskiego. System ten wspiera przejście pojedynczych komórek przez kluczowe etapy morfogenezy sutka, w tym ekspansję przodków, układanie nabłonka i tworzenie struktur podobnych do końcowych jednostek pęcherzykowo-kanalikowych, a także pojawienie się mezenchymalnego przedziału, w okresie 21 dni kultury. Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania hydrożelu, wysiewu komórek oraz warunków kultury. Metoda ta jest zgodna z wysoko zawartościowym obrazowaniem i ilościową analizą liczby organizmów, rozkładu wielkości i złożoności architektonicznej. Ta platforma umożliwia badania mechanistyczne nad plastycznością nabłonkową i zaburzeniami środowiskowymi, zapewniając skalowalny i biologicznie istotny system do badania wczesnych zmian na poziomie tkanki związanych z ryzykiem raka piersi.

Wprowadzenie

Zrozumienie rozwoju ludzkiego gruczołu piersiowego oraz wczesnych zdarzeń predysponujących tkankę do transformacji nowotworowej wymaga systemów eksperymentalnych, które wiernie odtwarzają architekturę tkanki, hierarchię komórkową i sygnalizację mikrośrodowiskową. Choć dwuwymiarowe hodowle nabłonkowe dostarczyły istotnych informacji mechanistycznych, brakuje im kontekstu strukturalnego niezbędnego do modelowania organizacji i morfogenezy nabłonka¹. Istniejące systemy hodowli trójwymiarowych, w tym te oparte na ekstraktach błony podstawnej, przyczyniły się do rozwoju tej dziedziny, lecz pozostają ograniczone przez zmienny skład, niepełną kontrolę nad składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej oraz niespójne wsparcie dla wyższego rzędu architektury tkankowej¹. Ponadto wiele systemów organoidowych opartych na ekstraktach błony podstawnej jest ograniczonych przez brak zdolności do spójnego wspierania powstawania organizacji przypominającej tkankę¹. W szczególności wiele systemów opiera się na egzogennych komponentach zrębu, zamiast umożliwiać endogenny rozwój wspierających mikrośrodowisk, co ogranicza ich zdolność do modelowania oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych, które są kluczowe dla rozwoju tkanki i chorób. Ograniczenia te utrudniają powtarzalne badanie procesów rozwojowych, plastyczności nabłonka oraz wpływu zaburzeń środowiskowych lub molekularnych na organizację tkanki.

Aby wyeliminować te ograniczenia, opracowaliśmy zdefiniowany trójwymiarowy model organoidów piersi ludzkiej oparty na hydrożelu, który umożliwia pierwotnym komórkom nabłonkowym tworzenie zorganizowanych struktur wewnątrz zdefiniowanej macierzy pozakomórkowej^2,3,4,5,8. Hydrożel składa się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowego – składników wybranych na podstawie ich uznanej roli w rozwoju gruczołu piersiowego i morfogenezie nabłonka. Cząsteczki macierzy pozakomórkowej te wiążą się z odrębnymi receptorami komórkowymi, w tym z integrynami, receptorami domeny discoidyny, CD44 i RHAMM, a według znanych danych regulują polarność nabłonka, morfogenezę rozgałęzień, utrzymanie komórek macierzystych, mechanotransdukcję i organizację tkanki w gruczole piersiowym^6,7. Poprzednie badania opisujące ten system hydrożelowy wykazały, że włączenie tych składników macierzy pozakomórkowej znacznie poprawia morfogenezę przewodowo-płacikową i dojrzewanie nabłonka w porównaniu z warunkami opartymi wyłącznie na kolagenie lub Matrigelu^3,8. Ponadto właściwości fizyczne tej formulacji hydrożelu zostały wcześniej scharakteryzowane za pomocą mikroskopii sił atomowych, co wykazało, że kompozytowy hydrożel macierzy pozakomórkowej charakteryzował się niższą sztywnością i zwiększonym pęcznieniem w stosunku do żeli zawierających tylko kolagen (moduł Younga: 256,7 ± 20,0 Pa versus 559,2 ± 204,0 Pa), co jest zgodne z miększym i bardziej uwodnionym środowiskiem macierzy⁸.

Co istotne, model ten wspiera powstawanie przedziału przypominającego mezenchymę, który rozwija się obok struktur nabłonkowych, zapewniając endogenne wsparcie strukturalne i sygnałowe, które dokładniej odzwierciedla organizację tkanki natywnej³. Relewantność fizjologiczną tego systemu hydrożelowego oceniono poprzez bezpośrednie porównania z konwencjonalnymi kulturami organoidów opartymi na Matrigelu, wykorzystując analizy morfologiczne i transkryptomiczne. Wcześniejsze badania wykazały, że kultury w hydrożelu wspierały tworzenie bardziej zorganizowanej tkanki przewodzikowo-płacowej oraz różnicowanie wieloliniowe niż kultury oparte na Matrigelu, zachowując jednocześnie odpowiedź hormonalną⁸. Niedawno przeprowadzone zintegrowane analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, porównujące organoidy pochodzące z hydrożelu, organoidy hodowane w Matrigelu oraz pierwotną tkankę piersi człowieka, wykazały, że organoidy hodowane w hydrożelu wierniej odtwarzają hierarchię nabłonkową, różnorodność komórkową oraz interakcje nabłonkowo-mezenchymalne występujące w natywnej tkance piersi człowieka³. W przeciwieństwie do nich, organoidy hodowane w Matrigelu były wzbogacone o proliferujące hybrydowe stany podstawne i pozbawione populacji przypominających stromę, co jest zgodne z procesem samoorganizacji nabłonka, a nie ukierunkowanej organogenezy.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu przedstawia powtarzalną i skalowalną metodę generowania organoidów z pierwotnej tkanki ludzkiej, z opcjonalnymi etapami usuwania fibroblastów oraz dysocjacji do pojedynczych komórek. Ponieważ platforma ta jest kompatybilna z obrazowaniem na żywo, obrazowaniem wysokotreściowym (high-content imaging), ilościową analizą morfometryczną, śledzeniem komórek oraz badaniami nad perturbacjami genetycznymi, może być ona integrowana z późniejszymi podejściami oceniającymi liczbę, wielkość, architekturę i dynamikę wzrostu organoidów. Platforma ta stanowi zatem biologicznie istotny system do badania rozwoju ludzkiej piersi, plastyczności nabłonka, oddziaływań między nabłonkiem a mikrośrodowiskiem oraz odpowiedzi na poziomie tkankowym na perturbacje rozwojowe, molekularne lub środowiskowe.

Schematyczny przegląd procesu roboczego, obejmujący obróbkę tkanek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, progresję rozwojową oraz analizy końcowe, przedstawiono na Ryc. 1, natomiast reprezentatywne morfologie organoidów wytworzonych przy użyciu tej platformy pokazano na Ryc. 2.

Rycina 1. Przegląd schematu generowania organoidów w oparciu o hydrożel. (A) Schemat blokowy podsumowujący przebieg protokołu, obejmujący pobieranie tkanki, przetwarzanie tkanki, kriokonserwację, regenerację i opcjonalne przygotowanie komórek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, rozwój organoidów oraz późniejsze zastosowania analityczne. (B) Schemat wizualny przedstawiający główne etapy protokołu generowania organoidów w oparciu o hydrożel, w tym przetwarzanie i przygotowanie tkanki, regenerację i opcjonalne przygotowanie komórek oraz przygotowanie hydrożelu i wysiew organoidów. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Reprezentatywne morfologie organoidów wytworzonych w zdefiniowanym systemie hydrożelowym. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu organoidów pochodzących z różnych tkanek ludzkich hodowanych w zdefiniowanej macierzy hydrożelowej. Organoidy piersi wytworzone z pojedynczych komórek nabłonkowych pochodzących z redukcyjnej plastyki piersi obrazowano w 21. dniu hodowli. Organoidy typu ksenoprzeszczep pochodzenia pacjenta wytworzone z fragmentów guza obrazowano w 16. dniu hodowli. Organoidy gruczołu ślinowego wytworzone z fragmentów nabłonka obrazowano w 3. dniu hodowli. Organoidy nerek wytworzone z fragmentów nabłonka obrazowano w 17. dniu hodowli. Paski skali = 50 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Tkanki pierwotne, które w przeciwnym razie zostałyby zutylizowane jako odpady medyczne po zabiegu chirurgicznym, pozyskano zgodnie ze wszystkimi właściwymi przepisami, stosując protokoły zatwierdzone przez instytucjonalne rady przeglądowe (IRB) w Maine Medical Center oraz Tufts Medical Center. Wszystkie tkanki zostały zanonimizowane przed przekazaniem i nie można ich było powiązać z konkretnymi pacjentami. Z tego powodu badania te otrzymały status zwolnienia z nadzoru od Komitetu ds. Wykorzystania Ludzi jako Podmiotów Eksperymentalnych w Massachusetts Institute of Technology oraz w Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Wszyscy pacjenci włączeni do badania podpisali formularz świadomej zgody, zgadzając się na udział w badaniu oraz na publikację wyników.

1. Obróbka i przygotowanie tkanek

UWAGA: Wszystkie procedury z wykorzystaniem tkanek ludzkich należy przeprowadzać zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi biobezpieczeństwa i etyki. Przed rozpoczęciem procedury należy zapoznać się ze schematami przebiegu prac przedstawionymi na Ryc. 1A i 1B, aby uzyskać wizualny przegląd etapów protokołu i procesu przygotowania organoidów.

1. Przygotować MEGM, wykorzystując podstawową pożywkę dla nabłonka gruczołu piersiowego uzupełnioną o 52 µg/mL ekstraktu z przysadki bydlęcej, 10 ng/mL ludzki czynnik wzrostu naskórka, 5 µg/mL insulinę, 500 ng/mL hydrokortyzon, 1% (v/v) GlutaMAX oraz 1% (v/v) Antibiotic-Antimycotic (100X).
2. Przygotować pożywkę do dysocjacji, dodając 1,5 mg/mL kolagenazy A (przechowywanej w −20°C) oraz 100 U/mL hialuronidazy (przechowywanej w 4°C) do pożywki wzrostowej dla nabłonka gruczołu piersiowego (MEGM).
3. Otrzymać ludzką tkankę piersi pobraną podczas profilaktycznych mastektomii i redukcyjnych plastyk piersi w ciągu 24 h po wycięciu, nieutrwaloną, w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), utrzymywaną w temperaturze 4°C. Zważyć tkankę na wadze precyzyjnej, aby określić całkowitą masę tkanki.
4. Umieścić tkankę w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Mechanicznie rozdrobnić tkankę na fragmenty o wielkości 3–5 mm³ za pomocą sterylnych skalpeli. Przenieść około 2–3 g rozdrobnionej tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Do każdej probówki dodać 10 mL pożywki do dysocjacji.
5. Inkubować probówki w 37°C na rotatorze orbitalnym przy 8 rpm przez 12–18 h w celu enzymatycznego trawienia tkanki. Trawienie uznaje się za zakończone, gdy nie pozostaną żadne duże fragmenty tkanki, a w całej pożywce widoczna będzie jednorodna zawiesina równomiernie rozdrobnionego materiału.
6. Pozostawić fragmenty nabłonka do osiadania pod wpływem grawitacji przez 5 min. Potwierdzić, że w pożywce nie pozostają żadne widoczne zawieszone fragmenty i że obecny jest wyraźny osad. Ostrożnie odlać i usunąć nadsącz, nie naruszając osadu.
   UWAGA: Nadsącz zawiera komórki zrębu i komponenty macierzy; można go przemyć i wykorzystać lub zachować do innych badań.
7. Resuspendować osad w 10 mL pożywki do przemywania składającej się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS. Centryfugować przy 250 × g przez 5 min w wirówce z koszem wahadłowym w temperaturze pokojowej.
8. Powtórzyć etap przemywania trzy kolejne razy lub do momentu, aż nadsącz stanie się przejrzysty i wolny od widocznych zanieczyszczeń.
9. Resuspendować końcowy osad w pożywce do mrożenia składającej się z 10% dimetylosulfoksydu (DMSO) w MEGM, przy objętości 1 mL na gram początkowej masy tkanki.
   OSTRZEŻENIE: DMSO jest szkodliwy w przypadku kontaktu ze skórą lub inhalacji. Należy go używać z odpowiednimi środkami ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem chemicznym, jeśli wymagają tego wytyczne instytucjonalne.
10. Rozdzielić zawiesinę w ilościach 1 mL do każdej krioprobówki. Umieścić krioprobówki w temperaturze −80°C w pojemniku do mrożenia przed długoterminowym przechowywaniem w ciekłym azocie.
    UWAGA: Ten krok stanowi punkt przerwania procedury. Próbki należy przechowywać w −80°C przed przeniesieniem do warunków długoterminowego przechowywania.

2. Odzyskiwanie i opcjonalne przygotowanie komórek

1. Rozmrażanie i wstępna regeneracja
   1. Wyjąć kriokonserwowaną tkankę z przechowywania w temperaturze −80°C po zamrożeniu przez co najmniej 24 h lub z długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie. Natychmiast zanurzyć krioprobowkę do poziomu nakrętki w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i szybko rozmrozić przez 1 min, aby zminimalizować śmierć komórek.
      UWAGA: Podczas rozmrażania delikatnie agitować krioprobowkę, aby zapewnić równomierne ogrzewanie.
   2. Po całkowitym rozmrożeniu natychmiast przenieść zawartość krioprobowki do probówki stożkowej o objętości 15 mL zawierającej 10 mL MEGM. Wirować przy 250 × g przez 5 min.
2. Opcjonalne usuwanie fibroblastów
   UWAGA: Usuwanie fibroblastów poprzez pre-plating jest opcjonalnym etapem wzbogacania, stosowanym w celu zmniejszenia populacji szybko przylegających komórek zrębu lub fibroblastów, gdy pożądana jest populacja startowa bardziej wzbogacona w komórki nabłonkowe. Ten etap nie jest wymagany do tworzenia organoidów i może być dostosowany w zależności od celu eksperymentu.
   1. Resuspendować osad w 10 mL MEGM.
   2. Przenieść resuspendowaną tkankę do 10 cm naczynia do hodowli komórkowej. Inkubować w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂ przez 90 min, aby umożliwić przyleganie fibroblastów.
      UWAGA: Nie poruszać naczyniem hodowlanym podczas inkubacji, aby zapewnić efektywne przyleganie fibroblastów.
   3. Zebrać supernatant zawierający komórki nieprzylegające za pomocą pipety serologicznej 10 mL, delikatnie przechylając naczynie hodowlane pod kątem około 45°. Delikatnie przepłukać płytkę 5 mL PBS i połączyć płukankę z zebranym supernatorem.
   4. Wirować połączoną zawiesinę przy 250 × g przez 5 min, aby odzyskać materiał wzbogacony w komórki nabłonkowe.
      UWAGA: Komórki, które przylgnęły do płytki, są wzbogacone w fibroblasty gruczołu mlekowego i mogą być propagowane oddzielnie poprzez dodanie pożywki składającej się z DMEM + 10% FBS oraz antybiotyków.
3. Opcjonalna dysocjacja do pojedynczych komórek
   1. Resuspendować osad w 500 µL podgrzanego (37°C) roztworu enzymu dysocjującego składającego się z 0,25% trypsyny. Alternatywne odczynniki dysocjujące mogą wymagać optymalizacji. Przenieść zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi o objętości 1,5 mL. Triturację próbki wykonać 20 razy za pomocą pipety P1000, aby wspomóc dysocjację.
      OSTRZEŻENIE: Odczynniki do dysocjacji enzymatycznej mogą być szkodliwe. Należy posługiwać się odpowiednim sprzętem ochrony osobistej i unikać kontaktu ze skórą lub oczami.
   2. Inkubować probówkę w temperaturze 37°C przez 3-5 min. Natychmiast po inkubacji przeprowadzić mechaniczną dysocjację próbki poprzez triturację 20 razy za pomocą pipety P1000.
   3. Dodać 1 mL pożywki płuczącej zawierającej surowicę, aby zneutralizować reakcję enzymatyczną. Wirować przy 500 × g przez 5 min.
   4. Resuspendować osad w 300 µL roztworu dispazy (5 U/mL) i 30 µL roztworu DNazy (1 mg/mL). Inkubować w temperaturze 37°C przez 3–5 min.
   5. Przeprowadzić mechaniczną dysocjację próbki poprzez pipetowanie 15–20 razy. Dodać do zawiesiny 700 µL pożywki płuczącej zawierającej surowicę.
   6. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 40 µm do czystej probówki. Można zastosować standardowe sitko komórkowe 40 µm lub sitko Flowmi na końcówkę pipety. Sitka Flowmi mogą zmniejszyć stratę próbki podczas pracy z ograniczoną liczbą komórek.
   7. Wyznaczyć liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego. Zmieszać 10 µL zawiesiny komórkowej z błękitem trypanowym w stosunku 1:1 i nanieść 10 µL mieszaniny do komory do liczenia komórek lub na szkiełko do liczenia. Określić żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
   8. Wirować zawiesinę przy 500 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   9. Resuspendować osad komórkowy w MEGM do pożądanej koncentracji do siewu w hydrożelu.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów z siewem pojedynczych komórek, typowa liczba komórek wynosi od około 1 000–5 000 komórek na 200 µL hydrożelu, w zależności od celu eksperymentu i charakterystyki próbki od dawcy. Niższe gęstości siewu są zazwyczaj stosowane w badaniach obrazowania na żywo i morfogenezy, aby ułatwić śledzenie rozwoju poszczególnych organoidów, natomiast wyższe gęstości są powszechnie stosowane w końcowych analizach molekularnych, w tym do pozyskiwania RNA i białek.

3. Przygotowanie hydrożelu i wysiew organoidów

1. Przygotowanie roztworów stokowych i obliczenia objętości
   1. Przed użyciem umieścić na lodzie roztwór lamininy (1,18 mg/mL), roztwór kwasu hialuronowego (1 mg/mL w wodzie sterylnej), roztwór fibronektyny (2 mg/mL w wodzie sterylnej) oraz PBS 1×. Alikwoty lamininy i fibronektyny przechowywać w temperaturze −80°C, a roztwór kwasu hialuronowego w temperaturze 4°C. Zamrożone komponenty rozmrażać powoli na lodzie w temperaturze 0°C–4°C przed użyciem.
   2. Przygotować 25-krotny roztwór stokowy suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby przygotować 1 mL, połączyć w probówce utrzymywanej na lodzie 425 µL lamininy, 250 µL kwasu hialuronowego, 250 µL fibronektyny i 75 µL PBS. Pomieszać delikatnie, odwracając probówkę 3–4 razy. Roztwór przechowywać w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.
   3. Przed przygotowaniem określić pożądaną końcową objętość i skład hydrożelu. Przygotować co najmniej 20% nadmiaru objętości, aby uwzględnić straty materiału podczas pipetowania i przenoszenia.
      UWAGA: Formuła hydrożelu składa się z kolagenu I, końcowego stężenia 1× suplementów macierzy zewnątrzkomórkowej (z roztworu stokowego 25×) oraz 12,5% (v/v) 0,1 N wodorotlenku sodu w stosunku do objętości kolagenu I w celu neutralizacji pH i polimeryzacji.
      UWAGA: Końcowe stężenia w hydrożelu to 1,7 mg/mL kolagenu I, 20 µg/mL lamininy, 20 µg/mL fibronektyny i 10 µg/mL kwasu hialuronowego.
   4. Obliczyć wymaganą objętość kolagenu I (V_collagen) korzystając z następującego wzoru:
      
      Gdzie C_final = 1,7 mg/mL, V_total  to pożądana końcowa objętość hydrożelu, a C_stock to stężenie roztworu stokowego kolagenu. Stosować stężenia stokowe kolagenu w zakresie 2–12 mg/mL.
      UWAGA: Stężenie stokowe kolagenu może różnić się między partiami. Wyższe stężenia zwiększają lepkość, dlatego należy pipetować je powoli.
   5. Obliczyć objętość 0,1 N wodorotlenku sodu (V_NaOH) korzystając z następującego wzoru:
      V_NaOH = 0,125 x V_collagen
      Przygotować roboczy roztwór 0,1 N wodorotlenku sodu poprzez rozcieńczenie 1 N wodorotlenku sodu w wodzie sterylnej.
   6. Obliczyć objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej (V_ES) korzystając z następującego wzoru:
      
   7. Obliczyć pozostałą objętość do uzupełnienia pożywką wzrostową korzystając z następującego wzoru:
      V_{growth medium} = V_total - (V_collagen + V_NaOH + V_ES + V_cells/tissue)
      UWAGA: Objętość komórek lub fragmentów tkanki określać indywidualnie dla każdego eksperymentu. Stosować typowy zakres 10–100 µL w ramach dopuszczalnej objętości. Nie przeprowadza się precyzyjnego liczenia fragmentów, ponieważ ich rozmiar i skład znacząco różnią się między preparatami. Standaryzować wysiew poprzez wizualną ocenę liczby i rozkładu fragmentów.
2. Przygotowanie master mixu hydrożelu
   1. Umieścić kolagen I, suplement macierzy zewnątrzkomórkowej, wodorotlenek sodu (0,1 N) i pożywkę wzrostową na lodzie w temperaturze 0°C–4°C. Wszystkie komponenty utrzymywać w niskiej temperaturze, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.
   2. Dodać obliczoną objętość kolagenu I do schłodzonej probówki do mikrocentryfugi.
   3. Dodać obliczoną objętość uprzednio schłodzonej pożywki wzrostowej do roztworu kolagenu.
   4. Dodać obliczoną objętość 0,1 N wodorotlenku sodu w celu zneutralizowania roztworu.
      UWAGA: Wcześniejsza optymalizacja wykazała, że warunki te zapewniają odpowiednie pH żelu; w związku z tym rutynowe badanie pH mieszaniny hydrożelu nie jest wymagane.
      UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonywać szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.
   5. Wymieszać roztwór, energicznie potrząsając probówką z częstotliwością około jednego wstrząśnięcia na sekundę przez co najmniej 6 wstrząśnięć.
   6. Dodać obliczoną objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej do mieszaniny.
   7. Dodać obliczoną objętość pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki za pomocą pipety P1000 lub końcówki pipety o szerokim otworze. Wymieszać natychmiast poprzez potrząsanie zgodnie z opisem w kroku 3.2.5 i bezzwłocznie przejść do następnego etapu.
3. Osadzanie hydrożelu
   1. Nanieść pipetą mieszaninę hydrożelu do naczyń hodowlanych w pożądanej objętości na dołek. Stosować 200 µL hydrożelu na dołek dla szkiełek z komorami 4-dołkowymi, 100 µL na dołek dla szkiełek z komorami 8-dołkowymi i 20 µL na dołek dla płytek 96-dołkowych.
   2. W przypadku szkiełek z komorami rozprowadzić hydrożel w postaci cienkiej warstwy na powierzchni. Umieścić końcówkę pipety na środku górnej krawędzi dołka komory i przesuwać ją po powierzchni podczas dozowania żelu, aby utworzyć równomierną warstwę. Dla płytek 96-dołkowych umieścić końcówkę pipety w centrum dołka, utrzymując kontakt z powierzchnią, i dozować żel centralnie, aby zachować strukturę kopuły. Unikać wprowadzania powietrza do żelu, ponieważ spowoduje to powstanie pęcherzyków.
   3. Inkubować naczynia hodowlane w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂ przez 60 min, aby umożliwić całkowitą polimeryzację.
      UWAGA: Opisane tutaj warunki polimeryzacji zostały zoptymalizowane dla formatów hodowli użytych w tym badaniu. W zależności od geometrii naczynia hodowlanego, objętości hydrożelu i warunków inkubacji mogą być wymagane niewielkie korekty czasu polimeryzacji.
4. Hodowla i utrzymanie
   1. Dodać uprzednio ogrzane MEGM do każdego dołka. Dostosować objętość do zastosowanego formatu hodowli.
   2. Delikatnie oddzielić hydrożel od powierzchni hodowlanej za pomocą końcówki pipety, aby żel mógł pływać. Przesunąć końcówkę pipety wzdłuż obwodu żelu i delikatnie podnieść zpolymeryzowany hydrożel, aby uwolnić go z powierzchni.
   3. Wymieniać MEGM dwa razy w tygodniu na świeżą, ogrzaną pożywkę. Utrzymywać hodowle w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂ przez około 3–4 tygodnie i zakończyć hodowlę przed całkowitym zapadnięciem się hydrożelu. Zapadnięte hydrożele rozpoznaje się po pojawieniu się gęstych, nieprzezroczystych struktur przypominających zatyczki, będących wynikiem rozległego przerostu komórkowego wewnątrz żelu (patrz reprezentatywne przykłady na Rysunku uzupełniającym 1).

Wyniki

Skuteczna realizacja tego protokołu skutkuje tworzeniem trójwymiarowych struktur organoidalnych, które wykazują uporządkowaną morfologię nabłonkową i cechy architektoniczne specyficzne dla tkanki. Organoidy zaczynają tworzyć się w ciągu 3–7 dni po posadzeniu i nadal rozwijają się przez cały okres kultury. Wcześniejsza charakterystyka tego układu organoidalnego w żelu wykazała powtarzalne tworzenie się organoidów w wielu niezależnych pierwotnych ludzkich dawczyń³. W tym badaniu oceniono pierwotne k...

Dyskusja

Opisany protokół umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi w zdefiniowanym mikrośrodowisku hydrożelowym, które wspiera kluczowe cechy morfogenezy sutka³. Kilka kroków jest kluczowych dla sukcesu tej metody. Po pierwsze, przetwarzanie tkanki i enzymatyczne dysocjacja muszą być starannie kontrolowane, aby zachować żywotność nabłonka, jednocześnie minimalizując nadmierną trawienie, co może zmniejszyć wydajność komórek i zaburzyć późniejszą morfogenezę

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 mL conical tubes	VWR	89039-664	Sterile tubes for tissue processing and centrifugation
40 μm cell strainer	VWR	732-2757	Filtration device for single-cell suspension preparation
40 μm cell strainer for low volumes	Bel-Art	136800040	Filtration device for single-cell suspension preparation
Automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Device used to count cells and determine viability
Bovine pituitary extract	Thermo Scientific	13028014	Supplement for epithelial cell media
Cell counting slides	Bio-Rad	145-0011	Dual-chamber slides used for cell counting
Centrifuge	N/A	N/A	Benchtop centrifuge/s need to have at least 500 x g speed capability and accommodation of 15 mL and 1.5 mL tubes.
Collagen I	Millipore Sigma	08-115	Extracellular matrix protein used for hydrogel formation
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzyme used for tissue dissociation
Cryovials	Corning	976171	Sterile vials for cryogenic storage of samples
Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)	Corning	354104 354108 3603	Platforms for hydrogel deposition and organoid culture.
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	317275	Cryoprotectant used in freezing medium
Dispase II	Roche	4942078001	Enzyme used for secondary tissue dissociation
DNase I	Roche	10104159001	Enzyme used during cell dissociation.
Fetal bovine serum	Gibco	10437	Serum supplement used in wash and neutralization media
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006	Extracellular matrix protein component
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Supplement for epithelial cell media
Human epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	Supplement for epithelial cell media
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Supplement for epithelial cell media
Hyaluronic acid	Millipore Sigma	385908	Extracellular matrix component for hydrogel formulation
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzyme used for tissue dissociation
Incubator	Thermo Scientific	3598	Device used for tissue culture incubation
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Supplement for epithelial cell media
Laminin	Gibco	23017-015	Extracellular matrix protein component
Mammary epithelial basal medium	Thermo Scientific	M171500	Growth medium for epithelial cells
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubes used for small-volume reactions
Orbital rotator	Thermo Scientific	400110	Rotator used for tissue dispersion during enzymatic dissociation
P1000 pipette	Gilson	P1000	Device used to mix and transfer volumes up to 1,000 μL
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Antibiotic supplement for epithelial cell media
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012-027	Buffer solution used for washing and rinsing
Precision balance	Mettler Toledo	ML303E	Balance used for tissue weighing
Serological pipette	Nunc	170356N	Pipette used for harvesting non-adherent epithelial cells
Sodium hydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagent used for collagen neutralization
Sterile scalpels	Bard-Parker	372615	Tools used for mechanical tissue mincing
Trypan blue solution	Gibco	15250061	Dye used for cell viability assessment
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200056	Enzymatic reagent used for cell dissociation
Water bath (37 °C)	VWR	10LA	Device used for controlled thawing of samples