Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Podsumowanie

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Streszczenie

Rozwój fizjologicznie istotnych ludzkich systemów modelowych, które odzwierciedlają architekturę tkanki i dynamikę stanu komórkowego, pozostaje głównym wyzwaniem w badaniach nad rozwojem piersi i wczesnymi zdarzeniami w karcynogenezie. Konwencjonalne dwuwymiarowej kultury i wiele trójwymiarowych systemów nie są w stanie uchwycić organizacji strukturalnej i mikrośrodowiskowych wskazówek, które definiują ludzką gruczoł piersiowy. Przedstawiamy tutaj metodę, która umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych organizmów ludzkiej piersi z pierwotnych komórek nabłonkowych osadzanych w zdefiniowanej matrycy hydrożelowej składającej się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowskiego. System ten wspiera przejście pojedynczych komórek przez kluczowe etapy morfogenezy sutka, w tym ekspansję przodków, układanie nabłonka i tworzenie struktur podobnych do końcowych jednostek pęcherzykowo-kanalikowych, a także pojawienie się mezenchymalnego przedziału, w okresie 21 dni kultury. Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania hydrożelu, wysiewu komórek oraz warunków kultury. Metoda ta jest zgodna z wysoko zawartościowym obrazowaniem i ilościową analizą liczby organizmów, rozkładu wielkości i złożoności architektonicznej. Ta platforma umożliwia badania mechanistyczne nad plastycznością nabłonkową i zaburzeniami środowiskowymi, zapewniając skalowalny i biologicznie istotny system do badania wczesnych zmian na poziomie tkanki związanych z ryzykiem raka piersi.

Wprowadzenie

Zrozumienie rozwoju ludzkiego gruczołu mlekowego oraz wczesnych zdarzeń predysponujących tkankę do transformacji złośliwej wymaga systemów eksperymentalnych, które wiernie odwzorowują architekturę tkanki, hierarchię komórkową i sygnalizację mikrośrodowiskową. Chociaż dwuwymiarowe hodowle nabłonkowe dostarczyły ważnych informacji na temat mechanizmów, brakuje im kontekstu strukturalnego niezbędnego do modelowania organizacji i morfogenezy nabłonka¹. Istniejące trójwymiarowe systemy hodowli, w tym te oparte na ekstraktach z błony podstawnej, przyczyniły się do rozwoju tej dziedziny, lecz nadal są ograniczone przez zmienny skład, niepełną kontrolę nad składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej oraz niespójne wsparcie dla wyższego rzędu architektury tkankowej¹. Ponadto wiele systemów organoidowych opartych na ekstraktach z błony podstawnej jest ograniczone przez brak możliwości stałego wspierania wyłaniania się organizacji przypominającej tkankę¹. W szczególności wiele systemów opiera się na egzogennych komponentach zrębu, zamiast umożliwiać endogenny rozwój wspomagających mikrośrodowisk, co ogranicza ich zdolność do modelowania oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych, które są kluczowe dla rozwoju tkanek i chorób. Ograniczenia te utrudniają powtarzalne badanie procesów rozwojowych, plastyczności nabłonka oraz wpływu zaburzeń środowiskowych lub molekularnych na organizację tkanki.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy zdefiniowany trójwymiarowy model organoidów ludzkiej piersi oparty na hydrożelu, który umożliwia pierwotnym komórkom nabłonkowym tworzenie zorganizowanych struktur w obrębie zdefiniowanej macierzy pozakomórkowej^2,3,4,5,8. Hydrożel składa się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowego – komponentów wybranych na podstawie ich udokumentowanej roli w rozwoju gruczołu piersiowego oraz morfogenezie nabłonka. Cząsteczki macierzy pozakomórkowej oddziałują z odrębnymi receptorami komórkowymi, w tym z integrynami, receptorami domeny discoidin, CD44 oraz RHAMM, i wiadomo, że regulują one polaryzację nabłonka, morfogenezę rozgałęzioną, utrzymanie komórek macierzystych, mechanotransdukcję oraz organizację tkanki w gruczole piersiowym^6,7. Wcześniejsze badania opisujące ten system hydrożelowy wykazały, że włączenie tych komponentów macierzy pozakomórkowej znacznie poprawiło morfogenezę przewodowo-płacikową oraz dojrzewanie nabłonka w porównaniu z warunkami opartymi wyłącznie na kolagenie lub Matrigelu^3,8. Ponadto właściwości fizyczne tej formulacji hydrożelu zostały wcześniej scharakteryzowane za pomocą mikroskopii sił atomowych, wykazując, że kompozytowy hydrożel macierzy pozakomórkowej charakteryzował się niższą sztywnością i zwiększonym pęcznieniem w stosunku do żeli zawierających tylko kolagen (moduł Younga: 256.7 ± 20.0 Pa versus 559.2 ± 204.0 Pa, odpowiednio), co jest zgodne z miękkim i bardziej nawodnionym środowiskiem macierzy⁸.

Co istotne, model ten wspiera powstawanie przedziału przypominającego mezenchymę, który wyłania się obok struktur nabłonkowych, zapewniając endogenne wsparcie strukturalne i sygnalizacyjne, które dokładniej odzwierciedla organizację tkanki natywnej³. Relewantność fizjologiczna tego systemu hydrożelowego została oceniona poprzez bezpośrednie porównania z konwencjonalnymi kulturami organoidów opartymi na Matrigelu, z wykorzystaniem analiz morfologicznych i transkryptomicznych. Wcześniejsze badania wykazały, że kultury hydrożelowe wspierały bardziej zorganizowane tworzenie tkanki przewodowo-płaczkowej oraz różnicowanie wieloliniowe niż kultury oparte na Matrigelu, zachowując jednocześnie odpowiedź na hormony⁸. Niedawno przeprowadzone zintegrowane analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, porównujące organoidy pochodzące z hydrożelu, organoidy hodowane na Matrigelu oraz pierwotną tkankę piersi człowieka, wykazały, że organoidy hodowane w hydrożelu bardziej wiernie odtwarzają hierarchię nabłonkową, różnorodność komórkową oraz oddziaływania nabłonkowo-mezenchymalne występujące w natywnej tkance piersi człowieka³. W przeciwieństwie do nich, organoidy hodowane na Matrigelu były wzbogacone o proliferacyjne hybrydowe stany podstawne i pozbawione populacji przypominających stromę, co jest spójne z samoorganizacją nabłonka, a nie z ukierunkowaną organogenezą.

Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalną i skalowalną metodę generowania organoidów z pierwotnej tkanki ludzkiej, z opcjonalnymi etapami usuwania fibroblastów oraz dysocjacji do pojedynczych komórek. Ponieważ platforma ta jest kompatybilna z obrazowaniem na żywo, obrazowaniem wysokoprzepustowym (high-content imaging), ilościową analizą morfometryczną, śledzeniem komórek oraz badaniami nad zaburzeniami genetycznymi, może zostać zintegrowana z późniejszymi podejściami oceniającymi liczbę, wielkość, architekturę i dynamikę wzrostu organoidów. Platforma ta stanowi zatem biologicznie istotny system do badania rozwoju ludzkiej piersi, plastyczności nabłonka, oddziaływań między nabłonkiem a mikrośrodowiskiem oraz reakcji na poziomie tkankowym na zaburzenia rozwojowe, molekularne lub środowiskowe.

Schematyczny przegląd przebiegu prac, obejmujący przetwarzanie tkanek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, postępy rozwojowe oraz analizy końcowe, przedstawiono na Rysunku 1, natomiast reprezentatywne morfologie organoidów wytworzonych przy użyciu tej platformy pokazano na Rysunku 2.

Rycina 1. Przegląd schematu generowania organoidów w oparciu o hydrożel. (A) Schemat blokowy podsumowujący przebieg protokołu, obejmujący pobranie tkanki, przetwarzanie tkanki, krio konserwację, regenerację i opcjonalne przygotowanie komórek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, rozwój organoidów oraz późniejsze zastosowania analityczne. (B) Schemat wizualny przedstawiający główne etapy protokołu generowania organoidów w oparciu o hydrożel, w tym przetwarzanie i przygotowanie tkanki, regenerację i opcjonalne przygotowanie komórek oraz przygotowanie hydrożelu i wysiew organoidów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Reprezentatywne morfologie organoidów wytworzonych w zdefiniowanym systemie hydrożelowym. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu organoidów pochodzących z różnych tkanek ludzkich hodowanych w zdefiniowanej macierzy hydrożelowej. Organoidy piersi wytworzone z pojedynczych komórek nabłonkowych pochodzących z redukcyjnej plastyki piersi zostały zobrazowane w 21. dniu hodowli. Organoidy ksenoprzeszczepów pochodzenia pacjenta wytworzone z fragmentów guza zostały zobrazowane w 16. dniu hodowli. Organoidy ślinianki wytworzone z fragmentów nabłonka zostały zobrazowane w 3. dniu hodowli. Organoidy nerek wytworzone z fragmentów nabłonka zostały zobrazowane w 17. dniu hodowli. Paski skali = 50 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Tkanki pierwotne, które w przeciwnym razie zostałyby utylizowane jako odpady medyczne po operacjach, pozyskano zgodnie ze wszystkimi obowiązującymi przepisami, stosując protokoły zatwierdzone przez komisje bioetyczne (institutional review boards) w Maine Medical Center oraz Tufts Medical Center. Wszystkie tkanki zostały zanonimizowane przed przekazaniem, co uniemożliwiło powiązanie ich z konkretnymi pacjentami. Z tego powodu badanie to otrzymało status zwolnienia z nadzoru od Komitetu ds. Wykorzystania Ludzi jako Obiektów Doświadczalnych (Committee on the Use of Humans as Experimental Subjects) w Massachusetts Institute of Technology oraz w Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Wszyscy pacjenci objęci badaniem podpisali formularz świadomej zgody, wyrażając zgodę na udział w badaniu oraz na publikację jego wyników.

1. Obróbka i przygotowanie tkanek

UWAGA: Wszystkie procedury z wykorzystaniem tkanek ludzkich należy przeprowadzać zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi biobezpieczeństwa i etyki. Przed rozpoczęciem procedury należy zapoznać się ze schematami przepływu pracy przedstawionymi na Rysunku 1A i 1B, aby uzyskać wizualny przegląd kroków protokołu i procesu przygotowania organoidów.

1. Przygotować MEGM, używając podstawowej pożywki dla nabłonka gruczołu mlekowego uzupełnionej o 52 µg/mL ekstraktu z przysadki bydlęcej, 10 ng/mL ludzkiego czynnika wzrostu naskórka, 5 µg/mL insuliny, 500 ng/mL hydrokortyzonu, 1% (v/v) GlutaMAX oraz 1% (v/v) Antibiotic-Antimycotic (100X).
2. Przygotować pożywkę do dysocjacji, dodając 1,5 mg/mL kolagenazy A (przechowywanej w −20°C) oraz 100 U/mL hialuronidazy (przechowywanej w 4°C) do pożywki wzrostowej dla nabłonka gruczołu mlekowego (MEGM).
3. Otrzymać ludzką tkankę piersi pozyskaną z profilaktycznych mastektomii i plastyk redukcyjnych w ciągu 24 h od wycięcia, niefiksowaną, w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i utrzymywaną w temperaturze 4°C. Zważyć tkankę na wadze precyzyjnej, aby określić całkowitą masę tkanki.
4. Umieścić tkankę w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Mechanicznie rozdrobnić tkankę na fragmenty o rozmiarze 3–5 mm³ za pomocą sterylnych skalpeli. Przenieść około 2–3 g rozdrobnionej tkanki do stożkowatej probówki o pojemności 15 mL. Do każdej probówki dodać 10 mL pożywki do dysocjacji.
5. Inkubować probówki w temperaturze 37°C na rotatorze orbitalnym przy prędkości 8 rpm przez 12–18 h w celu enzymatycznego strawienia tkanki. Uznać trawienie za zakończone, gdy nie pozostaną duże fragmenty tkanki, a w całej pożywce widoczna będzie jednorodna zawiesina równomiernie rozdrobnionego materiału.
6. Pozostawić fragmenty nabłonka do osadzenia się pod wpływem grawitacji przez 5 min. Potwierdzić, że w pożywce nie pozostały widoczne fragmenty w zawiesinie i że obecny jest wyraźny osad. Ostrożnie zdekantować i usunąć nadsącz, nie naruszając osadu.
   UWAGA: Nadsącz zawiera komórki zrębu i komponenty macierzy; może zostać przemyty i wykorzystany lub zachowany do innych badań.
7. Resuspendować osad w 10 mL pożywki płuczącej składającej się z 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS. Wirować przy 250 × g przez 5 min w wirówce z koszykiem wahadłowym w temperaturze pokojowej.
8. Powtórzyć etap płukania jeszcze trzy razy lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny i wolny od widocznych zanieczyszczeń.
9. Resuspendować końcowy osad w pożywce do mrożenia składającej się z 10% dimetylosulfoksydu (DMSO) w MEGM w objętości 1 mL na gram początkowej masy tkanki.
   OSTROŻNIE: DMSO jest szkodliwy w przypadku kontaktu ze skórą lub inhalacji. Należy posługiwać się odpowiednimi środkami ochrony osobistej i pracować pod wyciągiem chemicznym, jeśli wymagają tego wytyczne instytucjonalne.
10. Rozdzielić zawiesinę po 1 mL do każdej krioprobówki. Umieścić krioprobówki w temperaturze −80°C w pojemniku do mrożenia przed długoterminowym przechowywaniem w ciekłym azocie.
    UWAGA: Ten etap stanowi punkt przerwania procedury. Próbki należy przechowywać w −80°C przed przeniesieniem do warunków długoterminowego przechowywania.

2. Odzyskiwanie i opcjonalne przygotowanie komórek

1. Odmrażanie i wstępna regeneracja
   1. Wyjąć kriokonserwowaną tkankę z przechowywania w −80°C po zamrożeniu przez co najmniej 24 h lub z długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie. Natychmiast zanurzyć krioprobówkę aż do zakrętki w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i szybko rozmrozić przez 1 min, aby zminimalizować śmierć komórek.
      UWAGA: Podczas rozmrażania delikatnie potrząsać krioprobówką, aby zapewnić równomierne ogrzewanie.
   2. Po całkowitym rozmrożeniu natychmiast przenieść zawartość krioprobówki do probówki stożkowej 15 mL zawierającej 10 mL MEGM. Wirować przy 250 × g przez 5 min.
2. Opcjonalne usuwanie fibroblastów
   UWAGA: Usuwanie fibroblastów metodą pre-platingu jest opcjonalnym etapem wzbogacania, stosowanym w celu redukcji szybko przylegających populacji stromy lub fibroblastów, gdy pożądana jest populacja startowa o większej zawartości komórek nabłonkowych. Krok ten nie jest wymagany do formowania organoidów i może być dostosowany w zależności od celu eksperymentu.
   1. Resuspendować osad w 10 mL MEGM.
   2. Przenieść resuspendowaną tkankę do 10 cm szalki hodowlanej. Inkubować w 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂ przez 90 min, aby umożliwić przyleganie fibroblastów.
      UWAGA: Nie poruszać szalką hodowlaną podczas inkubacji, aby zapewnić efektywną adhezję fibroblastów.
   3. Zebrać nadosad zawierający nieprzylegające komórki za pomocą pipety serologicznej 10 mL, delikatnie przechylając szalkę hodowlaną pod kątem około 45°. Delikatnie wypłukać szalkę 5 mL PBS i połączyć płukaninę z zebranym nadosadem.
   4. Wirować połączoną zawiesinę przy 250 × g przez 5 min, aby odzyskać materiał wzbogacony w komórki nabłonkowe.
      UWAGA: Komórki, które przylgnęły do szalki, są wzbogacone w fibroblasty gruczołu mlekowego i mogą być namnażane oddzielnie poprzez dodanie medium składającego się z DMEM + 10% FBS i antybiotyków.
3. Opcjonalna dysocjacja do pojedynczych komórek
   1. Resuspendować osad w 500 µL uprzednio ogrzanego (37°C) roztworu enzymu dysocjującego składającego się z 0,25% trypsyny. Alternatywne odczynniki dysocjujące mogą wymagać optymalizacji. Przenieść zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL. Triturować próbkę 20 razy za pomocą pipety P1000, aby wspomóc dysocjację.
      OSTROŻNIE: Odczynniki do dysocjacji enzymatycznej mogą być szkodliwe. Należy z nich korzystać, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej i unikając kontaktu ze skórą lub oczami.
   2. Inkubować probówkę w 37°C przez 3–5 min. Natychmiast po inkubacji przeprowadzić dysocjację mechaniczną próbki poprzez triturowanie 20 razy za pomocą pipety P1000.
   3. Dodać 1 mL medium płuczącego zawierającego surowicę, aby zneutralizować reakcję enzymatyczną. Wirować przy 500 × g przez 5 min.
   4. Resuspendować osad w 300 µL roztworu dyspazy (5 U/mL) i 30 µL roztworu DNazy (1 mg/mL). Inkubować w 37°C przez 3–5 min.
   5. Przeprowadzić dysocjację mechaniczną próbki poprzez pipetowanie 15–20 razy. Dodać do zawiesiny 700 µL medium płuczącego zawierającego surowicę.
   6. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 40 µm do czystej probówki. Można użyć standardowego sitka komórkowego 40 µm lub sitka w końcówce pipety Flowmi. Sitka Flowmi mogą ograniczyć utratę próbki przy pracy z ograniczoną liczbą komórek.
   7. Określić liczbę żywych komórek metodą wykluczania trypan blue. Wymieszać 10 µL zawiesiny komórkowej z trypan blue w stosunku 1:1 i nanieść 10 µL mieszaniny do komory licznikowej lub na szkiełko do liczenia. Określić żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
   8. Wirować zawiesinę przy 500 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
   9. Resuspendować osad komórkowy w MEGM do pożądanej koncentracji do siewu w hydrożelu.
      UWAGA: W eksperymentach z siewem pojedynczych komórek typowa liczba komórek wynosi od około 1 000 do 5 000 komórek na 200 µL hydrożelu, w zależności od celu eksperymentu i charakterystyki próbki dawcy. Niższe gęstości siewu są zazwyczaj stosowane w badaniach obrazowania na żywo i morfogenezy, aby ułatwić śledzenie rozwoju poszczególnych organoidów, natomiast wyższe gęstości są powszechnie stosowane w końcowych analizach molekularnych, w tym do pozyskiwania RNA i białek.

3. Przygotowanie hydrożelu i wysiew organoidów

1. Przygotowanie roztworów zapasów i obliczenia objętości
   1. Przed użyciem umieścić na lodzie roztwór lamininy (1,18 mg/mL), roztwór kwasu hialuronowego (1 mg/mL w sterylnej wodzie), roztwór fibronektyny (2 mg/mL w sterylnej wodzie) oraz PBS 1×. Alikwoty lamininy i fibronektyny przechowywać w temperaturze −80°C, a roztwór kwasu hialuronowego w temperaturze 4°C. Zamrożone komponenty rozmrażać powoli na lodzie w temperaturze 0°C–4°C przed użyciem.
   2. Przygotować 25-krotny roztwór zapasowy suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby przygotować 1 mL, połączyć w probówce utrzymywanej na lodzie 425 µL lamininy, 250 µL kwasu hialuronowego, 250 µL fibronektyny i 75 µL PBS. Wymieszać delikatnie, odwracając probówkę 3–4 razy. Przechowywać roztwór w temperaturze 4°C przez maksymalnie 1 miesiąc.
   3. Przed przygotowaniem określić pożądaną końcową objętość i skład hydrożelu. Przygotować co najmniej 20% nadmiaru objętości, aby uwzględnić straty materiału podczas pipetowania i przenoszenia.
      UWAGA: Formuła hydrożelu składa się z kolagenu I, końcowego 1-krotnego stężenia suplementów macierzy zewnątrzkomórkowej (z zapasu 25×) oraz 12,5% (v/v) 0,1 N wodorotlenku sodu w stosunku do objętości kolagenu I w celu neutralizacji pH i polimeryzacji.
      UWAGA: Końcowe stężenia w hydrożelu to: 1,7 mg/mL kolagenu I, 20 µg/mL lamininy, 20 µg/mL fibronektyny i 10 µg/mL kwasu hialuronowego.
   4. Obliczyć wymaganą objętość kolagenu I (V_collagen) korzystając z następującego wzoru:
      
      Gdzie C_final = 1,7 mg/mL, V_total  to pożądana końcowa objętość hydrożelu, a C_stock to stężenie roztworu zapasowego kolagenu. Stosować stężenia zapasowe kolagenu w zakresie 2–12 mg/mL.
      UWAGA: Stężenie zapasowe kolagenu może różnić się między partiami. Wyższe stężenia zwiększają lepkość i wymagają powolnego pipetowania.
   5. Obliczyć objętość 0,1 N wodorotlenku sodu (V_NaOH) korzystając z następującego wzoru:
      V_NaOH = 0,125 x V_collagen
      Przygotować roboczy roztwór 0,1 N wodorotlenku sodu poprzez rozcieńczenie 1 N wodorotlenku sodu w sterylnej wodzie.
   6. Obliczyć objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej (V_ES) korzystając z następującego wzoru:
      
   7. Obliczyć pozostałą objętość do uzupełnienia pożywką wzrostową korzystając z następującego wzoru:
      V_{growth medium} = V_total - (V_collagen + V_NaOH + V_ES + V_cells/tissue)
      UWAGA: Objętość komórek lub fragmentów tkanki określać indywidualnie dla każdego eksperymentu. Stosować typowy zakres 10–100 µL w ramach dopuszczalnej objętości. Nie wykonuje się precyzyjnego liczenia fragmentów, ponieważ ich wielkość i skład znacząco różnią się między preparatami. Standaryzować wysiew poprzez wizualną ocenę liczby i rozmieszczenia fragmentów.
2. Przygotowanie głównej mieszaniny (Master Mix) hydrożelu
   1. Umieścić kolagen I, suplement macierzy zewnątrzkomórkowej, wodorotlenek sodu (0,1 N) i pożywkę wzrostową na lodzie w temperaturze 0°C–4°C. Wszystkie komponenty utrzymywać w niskiej temperaturze, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.
   2. Dodać obliczoną objętość kolagenu I do schłodzonej probówki do mikrocentryfugi.
   3. Dodać obliczoną objętość uprzednio schłodzonej pożywki wzrostowej do roztworu kolagenu.
   4. Dodać obliczoną objętość 0,1 N wodorotlenku sodu w celu zneutralizowania roztworu.
      UWAGA: Poprzednia optymalizacja wykazała, że warunki te zapewniają odpowiednie pH żelu; w związku z czym rutynowe badanie pH mieszaniny hydrożelu nie jest wymagane.
      UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonywać szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.
   5. Wymieszać roztwór, energicznie potrząsając probówką z częstotliwością około jednego wstrząśnięcia na sekundę przez co najmniej 6 wstrząśnięć.
   6. Dodać obliczoną objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej do mieszaniny.
   7. Dodać obliczoną objętość pojedynczych komórek lub fragmentów tkanki, używając pipety P1000 lub końcówki do pipety o szerokim wylocie. Wymieszać natychmiast poprzez potrząsanie, zgodnie z opisem w kroku 3.2.5, i niezwłocznie przejść do następnego etapu.
3. Nakładanie hydrożelu
   1. Nanieść mieszaninę hydrożelu do naczyń hodowlanych w pożądanej objętości na dołek. Stosować 200 µL hydrożelu na dołek dla szkiełek z komorami 4-dołkowymi, 100 µL na dołek dla szkiełek 8-dołkowych i 20 µL na dołek dla płytek 96-dołkowych.
   2. W przypadku szkiełek z komorami rozprowadzić hydrożel w postaci cienkiej warstwy na całej powierzchni. Umieścić końcówkę pipety na środkowej górnej krawędzi dołka komory i przesuwać ją po powierzchni podczas dozowania żelu, aby stworzyć równomierną warstwę. Dla płytek 96-dołkowych umieścić końcówkę pipety w centrum dołka, utrzymując kontakt z powierzchnią, i dozować żel centralnie, aby zachować strukturę kopuły. Unikać wprowadzania powietrza do żelu, ponieważ spowoduje to powstanie pęcherzyków.
   3. Inkubować naczynia hodowlane w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO₂ przez 60 min, aby umożliwić pełną polimeryzację.
      UWAGA: Opisane tutaj warunki polimeryzacji zostały zoptymalizowane dla formatów hodowli użytych w niniejszym badaniu. W zależności od geometrii naczynia hodowlanego, objętości hydrożelu i warunków inkubacji mogą być wymagane niewielkie korekty czasu polimeryzacji.
4. Hodowla i utrzymanie
   1. Dodać uprzednio ogrzaną pożywkę MEGM do każdego dołka. Dostosować objętość do zastosowanego formatu hodowli.
   2. Delikatnie oddzielić hydrożel od powierzchni hodowlanej za pomocą końcówki pipety, aby żel mógł unosić się w pożywce. Przesunąć końcówkę pipety wokół obwodu żelu i delikatnie podnieść polimeryzowany hydrożel, aby uwolnić go z powierzchni.
   3. Wymieniać MEGM dwa razy w tygodniu na świeżą, uprzednio ogrzaną pożywkę. Utrzymywać hodowle w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂ przez około 3–4 tygodnie i zakończyć hodowlę przed całkowitym zapadnięciem się hydrożelu. Zapadnięte hydrożele rozpoznawać po pojawieniu się gęstych, nieprzezroczystych struktur przypominających korki, wynikających z rozległego wzrostu komórkowego wewnątrz żelu (patrz reprezentatywne przykłady na Ryc. uzupełniającej 1).

Wyniki

Skuteczna realizacja tego protokołu skutkuje tworzeniem trójwymiarowych struktur organoidalnych, które wykazują uporządkowaną morfologię nabłonkową i cechy architektoniczne specyficzne dla tkanki. Organoidy zaczynają tworzyć się w ciągu 3–7 dni po posadzeniu i nadal rozwijają się przez cały okres kultury. Wcześniejsza charakterystyka tego układu organoidalnego w żelu wykazała powtarzalne tworzenie się organoidów w wielu niezależnych pierwotnych ludzkich dawczyń³. W tym badaniu oceniono pierwotne k...

Dyskusja

Opisany protokół umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi w zdefiniowanym mikrośrodowisku hydrożelowym, które wspiera kluczowe cechy morfogenezy sutka³. Kilka kroków jest kluczowych dla sukcesu tej metody. Po pierwsze, przetwarzanie tkanki i enzymatyczne dysocjacja muszą być starannie kontrolowane, aby zachować żywotność nabłonka, jednocześnie minimalizując nadmierną trawienie, co może zmniejszyć wydajność komórek i zaburzyć późniejszą morfogenezę

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 mL conical tubes	VWR	89039-664	Sterile tubes for tissue processing and centrifugation
40 μm cell strainer	VWR	732-2757	Filtration device for single-cell suspension preparation
40 μm cell strainer for low volumes	Bel-Art	136800040	Filtration device for single-cell suspension preparation
Automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Device used to count cells and determine viability
Bovine pituitary extract	Thermo Scientific	13028014	Supplement for epithelial cell media
Cell counting slides	Bio-Rad	145-0011	Dual-chamber slides used for cell counting
Centrifuge	N/A	N/A	Benchtop centrifuge/s need to have at least 500 x g speed capability and accommodation of 15 mL and 1.5 mL tubes.
Collagen I	Millipore Sigma	08-115	Extracellular matrix protein used for hydrogel formation
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzyme used for tissue dissociation
Cryovials	Corning	976171	Sterile vials for cryogenic storage of samples
Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)	Corning	354104 354108 3603	Platforms for hydrogel deposition and organoid culture.
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	317275	Cryoprotectant used in freezing medium
Dispase II	Roche	4942078001	Enzyme used for secondary tissue dissociation
DNase I	Roche	10104159001	Enzyme used during cell dissociation.
Fetal bovine serum	Gibco	10437	Serum supplement used in wash and neutralization media
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006	Extracellular matrix protein component
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Supplement for epithelial cell media
Human epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	Supplement for epithelial cell media
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Supplement for epithelial cell media
Hyaluronic acid	Millipore Sigma	385908	Extracellular matrix component for hydrogel formulation
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzyme used for tissue dissociation
Incubator	Thermo Scientific	3598	Device used for tissue culture incubation
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Supplement for epithelial cell media
Laminin	Gibco	23017-015	Extracellular matrix protein component
Mammary epithelial basal medium	Thermo Scientific	M171500	Growth medium for epithelial cells
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubes used for small-volume reactions
Orbital rotator	Thermo Scientific	400110	Rotator used for tissue dispersion during enzymatic dissociation
P1000 pipette	Gilson	P1000	Device used to mix and transfer volumes up to 1,000 μL
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Antibiotic supplement for epithelial cell media
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012-027	Buffer solution used for washing and rinsing
Precision balance	Mettler Toledo	ML303E	Balance used for tissue weighing
Serological pipette	Nunc	170356N	Pipette used for harvesting non-adherent epithelial cells
Sodium hydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagent used for collagen neutralization
Sterile scalpels	Bard-Parker	372615	Tools used for mechanical tissue mincing
Trypan blue solution	Gibco	15250061	Dye used for cell viability assessment
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200056	Enzymatic reagent used for cell dissociation
Water bath (37 °C)	VWR	10LA	Device used for controlled thawing of samples