Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych organoidów ludzkiej piersi, które odtwarzają morfogenezę mleków

Summary

Protokół ten opisuje zdefiniowaną metodę opartą na hydrożelu do generowania organoidów piersi ludzkich, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy mleków mlecznych w kontrolowanym, trójwymiarowym systemie hodowli.

Abstract

Rozwój fizjologicznie istotnych ludzkich modeli modelowych, które odtwarzają architekturę tkanek i dynamikę stanu komórkowego, pozostaje poważnym wyzwaniem w badaniu rozwoju piersi i wczesnych zdarzeń w rakogenezie. Konwencjonalne kultury dwuwymiarowe i wiele trójwymiarowych systemów nie potrafią uchwycić struktury organizacyjnej i mikrośrodowiskowych sygnałów definiujących ludzki gruczoł mleczny. Tutaj opisujemy powtarzalną metodę generowania trójwymiarowych organoidów ludzkiej piersi z pierwotnych komórek nabłonkowych osadzonych w określonej matrycy hydrożelowej złożonej z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowego. System ten wspiera rozwój pojedynczych komórek przez kluczowe etapy morfogenezy mleków, w tym ekspansję progenitorów, wzorowanie nabłonka oraz tworzenie końcowych struktur lobularnych przewodów, a także pojawienie się przedziału przypominającego mezenchym, w ciągu 21-dniowego okresu hodowli. Oferujemy krok po kroku protokół dotyczący przygotowania hydrożelu, zasiewania komórek oraz warunków hodowli. Metoda ta jest kompatybilna z obrazowaniem o wysokiej zawartości oraz ilościową analizą liczby organoidów, rozkładu rozmiarów oraz złożoności architektonicznej. Ta platforma umożliwia mechanistyczne badania plastyczności nabłonka i zaburzeń środowiskowych, zapewniając skalowalny i biologicznie istotny system do badania wczesnych zmian na poziomie tkanek związanych z ryzykiem raka piersi.

Introduction

Zrozumienie rozwoju ludzkiego gruczołu mlecznego oraz wczesnych zdarzeń predysponujących tkanki do przemiany złośliwej wymaga eksperymentalnych systemów, które wiernie odtwarzają architekturę tkanek, hierarchię komórkową oraz sygnalizację mikrośrodowiskową. Chociaż dwuwymiarowe kultury nabłonkowe dostarczyły ważnych mechanistycznych wglądów, brakuje im kontekstu strukturalnego niezbędnego do modelowania organizacji nabłonka i morfogenezy¹. Istniejące systemy hodowli trójwymiarowej, w tym oparte na ekstraktach z błony podstawowej, posunęły pole naprzód, ale pozostają ograniczone przez zmienny skład, niepełną kontrolę nad składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej oraz niespójne wsparcie architektury tkanek wyższego rzędu¹. Ponadto wiele systemów organoidalnych opartych na ekstraktach z błony podstawnej jest ograniczonych przez swoją niezdolność do konsekwentnego wspierania powstawania struktury przypominającej tkanki¹. W szczególności wiele systemów opiera się na egzogennych komponentach stromalnych zamiast umożliwiać endogenny rozwój wspierających mikrośrodowisk, co ogranicza ich zdolność do modelowania interakcji nabłonk–mezenchymal, które są kluczowe dla rozwoju tkanek i chorób. Te ograniczenia ograniczają powtarzalne badanie procesów rozwojowych, plastyczności nabłonka oraz wpływu zaburzeń środowiskowych lub molekularnych na organizację tkanek.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy zdefiniowany, trójwymiarowy model organoidów piersi ludzkiej na bazie hydrożelu, który umożliwia komórkom nabłonkowym pierwotnym tworzenie zorganizowanych struktur w określonej macierzy zewnątrzkomórkowej 2,3,4,5,8. Hydrożel składa się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowego, składników wybranych na podstawie ich ustalonych ról w rozwoju gruczołów mlecznych i morfogenezie nabłonka. Te cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej angażują odrębne receptory komórkowe, w tym integriny, receptory domeny dyskoidyny, CD44 i RHAMM, i wiadomo, że regulują polaryzację nabłonka, morfogenezę rozgałęzień, utrzymanie komórek macierzystych, mechanotransdukcję oraz organizację tkanek w gruczole mleczkowym ^6,7. Poprzednie badania opisujące ten system hydrożelowy wykazały, że włączenie tych składników macierzy zewnątrzkomórkowej znacząco poprawiło morfogenezę i dojrzewanie nabłonka przewodowo-lobularnego w porównaniu z warunkami opartymi wyłącznie na kolagenie lub Matrigelu ^3,8. Ponadto właściwości fizyczne tej formuły hydrożelu zostały wcześniej scharakteryzowane mikroskopią sił atomowych, wykazując, że kompozytowy hydrogel z macierzy zewnątrzkomórkowej wykazuje niższą sztywność i zwiększoną obrzękliwość w porównaniu do żeli zawierających wyłącznie kolagen (moduł Younga: 256,7 ± 20,0 Pa w porównaniu odpowiednio do 559,2 ± 204,0 Pa), co odpowiada miększemu i bardziej nawodnionemu środowisku matrycy⁸.

Co istotne, model ten wspiera powstanie przedziału przypominającego mezenchym, który powstaje wzdłuż struktur nabłonkowych, zapewniając endogenne wsparcie strukturalne i sygnalizacyjne, które lepiej odzwierciedla natywną organizację tkanek³. Fizjologiczne znaczenie tego systemu hydrożelowego oceniono poprzez bezpośrednie porównania z konwencjonalnymi kulturami organoidów opartymi na Matrigelu, wykorzystując zarówno analizy morfologiczne, jak i transkryptomiczne. Wcześniejsze badania wykazały, że hodowle hydrożelowe wspierają bardziej zorganizowane tworzenie tkanek mięso-lobularnych oraz różnicowanie wieloliniowe niż hodowle oparte na Matrigelu, jednocześnie zachowując reakcję hormonalną⁸. Niedawno zintegrowane analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, porównujące organoidy pochodzące z hydrożelu, organoidy wyhodowane w Matrigelu oraz pierwotną tkankę ludzkiej piersi, wykazały, że organoidy hodowane w hydrożelu wierniej odtwarzają hierarchię nabłonka, różnorodność komórkową oraz interakcje nabłonkowo-mezenchymalne obecne w naturalnej tkance piersi człowieka³. Natomiast organoidy hodowane w Matrigelu były wzbogacone o proliferacyjne hybrydowe stany bazalne i nie posiadały populacji stromalnych, co jest zgodne z samoorganizacją nabłonkową, a nie organogenezą ukierunkowaną.

Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalną i skalowalną metodę generowania organoidów z pierwotnej tkanki ludzkiej, z opcjonalnymi krokami redukcji fibroblastów i dysocjacji do pojedynczych komórek. Ponieważ platforma ta jest kompatybilna z obrazowaniem na żywo, obrazowaniem o wysokiej zawartości, ilościową analizą morfometryczną, śledzeniem komórek oraz badaniami perturbacji genetycznych, może być integrowana z podejściami późniejszymi ocenami liczby, wielkości, architektury i dynamiki wzrostu organoidów. Ta platforma zapewnia zatem biologicznie istotny system do badania rozwoju ludzkiej piersi, plastyczności nabłonkowej, interakcji nabłonkowego z mikrośrodowiskiem oraz reakcji tkanek na zaburzenia rozwojowe, molekularne lub środowiskowe.

Schematyczny przegląd przepływu pracy, obejmujący przetwarzanie tkanek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, postęp rozwojowy oraz analizy dalsze, przedstawiono na Rysunku 1, natomiast reprezentatywne morfologie organoidów generowane za pomocą tej platformy pokazano na Rysunku 2.

Rysunek 1. Przegląd procesu generowania organoidów na bazie hydrożelu. (A) Schemat blokowy podsumowujący przepływ protokołu, obejmujący pobieranie tkanek, przetwarzanie tkanek, kriokonserwację, odzyskiwanie i opcjonalne przygotowanie komórek, przygotowanie hydrożelu, hodowlę organoidów, rozwój organoidów oraz dalsze zastosowania analityczne. (B) Schemat wizualny przedstawiający główne etapy protokołu generowania organoidów opartych na hydrożelu, w tym przetwarzanie i przygotowanie tkanek, regenerację i opcjonalne przygotowanie komórek oraz przygotowanie hydrożelu i zasiewanie organoidów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2. Reprezentatywne morfologie organoidów generowane w zdefiniowanym systemie hydrożelowym. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu organoidów pochodzących z różnych ludzkich tkanek hodowanych w zdefiniowanej matrycy hydrożelowej. Organoidy piersi powstałe w wyniku pojedynczych komórek nabłonkowych pochodzących z redukcyjnej mamoplastyki zostały zobrazowane w 21. dniu hodowli. Organoidy ksenotransplanttowe pochodzące od pacjenta, powstałe z fragmentów guza, zostały zobrazowane w 16. dniu hodowli. Organoidy gruczołów ślinowych powstałe z fragmentów nabłonka zostały sfotografowane w trzecim dniu hodowli. Organoidy nerkowe powstałe z fragmentów nabłonka zostały zobrazowane w 17. dniu hodowli. Paski skali = 50 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Protocol

Tkanki pierwotne, które w innym przypadku zostałyby wyrzucone jako odpady medyczne po operacji, zostały pozyskane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi przepisami, korzystając z protokołów zatwierdzonych przez instytucjonalne komisje rewizyjne w Maine Medical Center i Tufts Medical Center. Wszystkie tkanki zostały zanonimizowane przed transferem i nie udało się ich powiązać z konkretnymi pacjentami. Z tego powodu badania te uzyskały status zwolnienia od Komitetu ds. Wykorzystania Ludzi jako Eksperymentalnych Obiektów na Massachusetts Institute of Technology oraz na Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Wszyscy pacjenci biorący udział w tym badaniu podpisali formularz świadomej zgody, zgadzając się na udział w badaniu oraz na publikację wyników.

1. Przetwarzanie i przygotowanie tkanek

UWAGA: Wszystkie procedury dotyczące tkanek ludzkich wykonuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego i etycznymi. Przed rozpoczęciem procedury można zobaczyć schematy pracy pokazane na Rysunkach 1A i 1B, aby uzyskać wizualny przegląd kroków protokołu i procesu przygotowania organoidów przed rozpoczęciem procedury.

1. Przygotuj MEGM przy użyciu nabłonkowego podłoża bazalnego mleka, uzupełnionego o 52 μg/mL ekstraktu przysadki piersiowej bydła, 10 ng/mL ludzkiego czynnika wzrostu naskórka, 5 μg/mL insuliny, 500 ng/mL hydrokortyzonu, 1% (v/v) GlutaMAX oraz 1% (v/v) antymykotycznego (100X).
2. Przygotuj ośrodek dysocjacyjny, dodając 1,5 mg/mL kolagenazy A (przechowywanej w −20°C) oraz 100 U/mL hialuronidazy (przechowywanej w 4°C) do ośrodka wzrostu nabłonka mleczowego (MEGM).
3. Otrzymać ludzką tkankę piersi pozyskaną podczas profilaktycznych mastektomii i redukcyjnych mamoplastyki w ciągu 24 godzin po wycięciu, nieutrwaloną w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i utrzymywać ją w temperaturze 4°C. Ważyć tkankę na precyzyjnej wagie, aby określić całkowitą masę tkanek.
4. Umieść tkankę w sterylnej szafce na zabezpieczenia biologicznego. Mechanicznie rozdrobnić tkankę na fragmenty o rozmiarze 3–^{5 mm 3} za pomocą sterylnych skalpeli. Przenieś około 2–3 g posiekanej tkanki do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Dodaj 10 ml medium dysocjacyjnego do każdej rurki.
5. Inkubuj rurki w temperaturze 37°C na rotatorze oczodołowym z częstotliwością 8 obr./min przez 12–18 godzin, aby enzymatycznie trawić tkankę. Trawienie należy uznać za zakończone, gdy nie pozostaną duże fragmenty tkanki, a w całym medium widoczna jest jednorodna zawiesina równomiernie rozdrobnionego materiału.
6. Pozwól fragmentom nabłonka osiąść grawitacją przez 5 minut. Potwierdź, że w medium nie pozostały widoczne fragmenty i że obecny jest wyraźny pellet. Ostrożnie przelewaj i wyrzucaj supernatant, nie naruszając granulki.
   UWAGA: Supernatant zawiera komórki stromalne i składniki macierzy i może być prany, używany lub konserwowany do innych badań.
7. Ponownie zawiesij granulki w 10 mL medium do mycia zawierającym 5% surowicy płodowej bydła (FBS) w PBS. Wirówka w 250 × g przez 5 minut w wirówce z łyżką obrotową w temperaturze pokojowej.
8. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy lub aż nadmiar będzie przezroczysty i wolny od widocznych zanieczyszczeń.
9. Ostatni pellet ponownie zawiesić w medium zamrażającym zawierającym 10% dimetylosulfoklenku (DMSO) w MEGM w objętości 1 mL na gram początkowej masy tkanki.
   UWAGA: DMSO jest szkodliwe przy kontakcie lub wdychaniu. Należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i pracować w okapie chemicznym, jeśli wymagają tego wytyczne instytucjonalne.
10. Wystarczy: 1 mL zawieszenia w każdym kriovialu. Przed długotrwałym przechowywaniem w ciekłym azocie umieść krioviale w temperaturze −80°C w pojemniku mrożącym.
    UWAGA: Ten krok oznacza punkt przerwy. Przechowuj próbki w temperaturze −80°C przed przejściem do warunków długoterminowego przechowywania.

2. Regeneracja i opcjonalne przygotowanie komórek

1. Odmrożenie i początkowa regeneracja
   1. Usuń tkankę kriokonserwowaną z magazynu −80°C po zamrożeniu trwającym co najmniej 24 godziny lub z długotrwałego magazynowania ciekłego azotu. Natychmiast zanurz kriovial aż do kapsułki w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i szybko rozmrażaj przez 1 minutę, aby zminimalizować śmierć komórek.
      UWAGA: Delikatnie poruszaj kriovial podczas rozmrażania, aby zapewnić równomierne nagrzewanie.
   2. Po całkowitym rozmrożeniu natychmiast przenieś zawartość krioviala do stożkowej probówki o pojemności 15 mL zawierającej 10 ml MEGM. Wirówka na 250 × g przez 5 minut.
2. Opcjonalne wyczerpanie fibroblastów
   UWAGA: Redukcja fibroblastów przez wstępne pokrycie jest opcjonalnym krokiem wzbogacenia służącym do zmniejszenia szybko przylegających populacji stromalnych lub fibroblastów, gdy pożądana jest populacja początkowa o bardziej wzbogacone nabłonki. Ten etap nie jest wymagany do powstawania organoidów i może być dostosowany w zależności od celu eksperymentalnego.
   1. Ponownie zawiesić granulek w 10 mL MEGM.
   2. Przenieś ponownie zawieszoną tkankę do naczynia do hodowli komórek o średnicy 10 cm. Inkubuj w temperaturze 37°C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂ przez 90 minut, aby umożliwić przyłączenie fibroblastów.
      UWAGA: Nie ruszaj naczynia hodowlanego podczas inkubacji, aby zapewnić efektywne przyleganie fibroblastów.
   3. Pobierz supernatant zawierający nieprzylegające komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 mL, delikatnie przechylając naczynie hodowlujące pod kątem około 45°. Delikatnie opłucz talerz 5 mL PBS i połącz płukanie z zebranym supernatantem.
   4. Wiruj łączoną zawiesinę w dawce 250 × g przez 5 minut, aby odzyskać materiał wzbogacony w nabłonki.
      UWAGA: Komórki przylegające do płytki są wzbogacane o fibroblasty gruczołu mlecznego i mogą być propagowane oddzielnie poprzez dodanie podłoża składającego się z DMEM + 10% FBS oraz antybiotyków.
3. Opcjonalna dysocjacja do pojedynczych komórek
   1. Ponownie zawiesij pellet w 500 μL roztworu enzymu dysocjacyjnego (37°C) zawierającego 0,25% trypsyny. Alternatywne odczynniki dysocjacyjne mogą wymagać optymalizacji. Przenieś zawiesinę do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Tryturuj próbkę 20 razy za pomocą pipety P1000, aby sprzyjać dysocjacjacjom.
      UWAGA: Odczynniki enzymatyczne dysocjacyjne mogą być szkodliwe. Należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i unikać kontaktu ze skórą lub wzrokami.
   2. Inkubuj probówkę w temperaturze 37°C przez 3-5 minut. Próbkę rozłącz mechanicznie bezpośrednio po inkubacji, triturując 20 razy pipetą P1000.
   3. Dodaj 1 ml medium do płukania zawierającego surowicę, aby zneutralizować reakcję enzymatyczną. Wirówka na 500 × g przez 5 minut.
   4. Ponownie zawiesij pellet w roztworze 300 μL dyspazy (5 U/mL) i 30 μL roztworu DNazy (1 mg/mL). Inkubuj w temperaturze 37°C przez 3–5 minut.
   5. Mechanicznie rozłącz próbkę, pipetując 15–20 razy. Dodaj do zawiesiny medium do płukania zawierające surowicę 700 μL.
   6. Przefiltruj zawiesinę ogniwa przez sitko komórki o pojemności 40 μm do czystej rurki. Można użyć standardowego sito do komórek 40 μm lub sito z końcówką pipety Flowmi. Sita Flowmi mogą zmniejszyć utratę próbek przy pracy z ograniczoną liczbą komórek.
   7. Określ żywotną liczbę komórek za pomocą wykluczenia trypana niebieskiego. Wymieszaj 10 μL zawiesiny ogniwa z trypanowym niebieskim w stosunku 1:1 i załaduj 10 μL mieszanki do komory liczącej lub szkiełka liczącego. Określ żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
   8. Wiruj zawiesinę w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   9. Ponownie zawiesić pellet komórkowy w MEGM w pożądanym stężeniu do zasiewania hydrożelu.
      UWAGA: W eksperymentach z pojedynczym zasiewem typowe dane wejściowe wahają się od około 1 000 do 5 000 komórek na 200 μL hydrogelu, w zależności od celu eksperymentalnego i charakterystyki próbki dawcy. Niższe gęstości zasiewów są zazwyczaj wykorzystywane do obrazowania na żywo i badań morfogenezy, aby ułatwić śledzenie rozwoju poszczególnych organoidów, natomiast wyższe gęstości są powszechnie stosowane do końcowych analiz molekularnych, w tym do zbierania RNA i białek.

3. Przygotowanie hydrożelu i zasiewanie organoidów

1. Przygotowanie zapasów i obliczenia wolumenowe
   1. Przed użyciem umieść na lodzie roztwór lamininy (1,18 mg/mL), roztwór kwasu hialuronowego (1 mg/mL w wodzie sterylnej), roztwór fibronektyny (2 mg/mL w wodzie sterylnej) oraz PBS 1× przed użyciem. Przechowuj aliquoty lamininy i fibronektyny w temperaturze −80°C oraz roztwór kwasu hialuronowego w 4°C. Przed użyciem mroz składniki powoli na lodzie w temperaturze 0°C–4°C.
   2. Przygotuj 25× suplement macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby przygotować 1 mL, połącz 425 μL lamininy, 250 μL kwasu hialuronowego, 250 μL fibronektyny oraz 75 μL PBS w rurce utrzymywanej na lodzie. Delikatnie mieszać, odwracając rurkę 3–4 razy. Przechowuj roztwór w temperaturze 4°C do miesiąca.
   3. Określ pożądaną ostateczną objętość i skład hydrożelu przed przygotowaniem. Przygotuj co najmniej 20% nadwyżki objętości, aby zrekompensować utratę materiału podczas pipetowania i transferu.
      UWAGA: Formuła hydrożelu składa się z kolagenu I, 1× końcowego stężenia suplementów macierzy zewnątrzkomórkowej (z zapasu 25×) oraz 12,5% (v/v) 0,1 N wodorotlenku sodu w stosunku do objętości kolagenu I do neutralizacji pH i polimeryzacji.
      UWAGA: Końcowe stężenia hydrożelu to 1,7 mg/mL kolagenu I, 20 μg/mL lamininy, 20 μg/mL fibronektyny oraz 10 μg/mL kwasu hialuronowego.
   4. Oblicz wymaganą objętość kolagenu I (_{V kolagenu}) za pomocą następującego wzoru:
      
      Tutaj C_końcowa = 1,7 mg/mL, _{V całość} to pożądana końcowa objętość hydrożelu, a _{C to} stężenie roztworu kolagenowego zapasowego. Stosuj stężenia kolagenu w stężeniach od 2 do 12 mg/mL.
      UWAGA: Stężenie zapasów kolagenu może się różnić w zależności od partii. Wyższe stężenia zwiększają lepkość i należy je powoli pipetować.
   5. Oblicz objętość 0,1 N wodorotlenku sodu (V_NaOH) według następującego wzoru:
      V_NaOH = 0,125 x _{V kolagen}
      Przygotuj roztwór roboczy wodorotlenku sodu o zawartości 0,1 N, rozcieńczając 1 N wodorotlenku sodu w wodzie sterylnej.
   6. Oblicz objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej (V_ES) za pomocą następującego wzoru:
      
   7. Oblicz pozostałą objętość, którą należy wypełnić podłożem wzrostowym, stosując następujący wzór:
      _{V medium wzrostu} = V_całkowite - (_{V kolagen} + V_NaOH + V ES + V_{komórki/tkanka} V)
      UWAGA: Określ objętość komórek lub fragmentów tkanek dla każdego eksperymentu osobno. Stosuj typowy zakres 10–100 μL w dozwolonej objętości. Precyzyjne liczenie fragmentów nie jest wykonywane, ponieważ rozmiar i skład fragmentów znacznie różnią się między preparatami. Standaryzuj zasiew, oceniając wizualnie liczebność i rozmieszczenie fragmentów.
2. Przygotowanie Hydrogel Master Mix
   1. Umieść kolagen I, suplement macierzy zewnątrzkomórkowej, wodorotlenek sodu (0,1 N) i podłoże do wzrostu na lodzie w temperaturze 0°C–4°C. Utrzymuj wszystkie składniki w niskiej temperaturze, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.
   2. Dodaj obliczoną objętość kolagenu I do schłodzonej rurki mikrowirówki.
   3. Dodaj obliczoną objętość wcześniej schłodzonego medium wzrostu do roztworu kolagenowego.
   4. Dodaj obliczoną objętość 0,1 N wodorotlenku sodu, aby zneutralizować roztwór.
      UWAGA: Poprzednia optymalizacja wykazała, że te warunki dają odpowiednie pH żelu; dlatego rutynowe badania pH mieszaniny hydrożelowej nie są wymagane.
      UWAGA: Wszystkie kolejne kroki wykonuj szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji kolagenu.
   5. Mieszaj roztwór, mocno potrząsając rurką z częstotliwością około jednego potrząsania na sekundę przez co najmniej 6 potrząsania.
   6. Do mieszanki należy dodać obliczoną objętość suplementu macierzy zewnątrzkomórkowej.
   7. Dodaj obliczoną objętość pojedynczych komórek lub fragmentów tkanek za pomocą pipety P1000 lub końcówki pipety o szerokim przewiercie. Mieszaj od razu, potrząsając zgodnie z krokiem 3.2.5 i przejdź od razu do kolejnego kroku.
3. Osadzanie hydrożelu
   1. Pipetować mieszankę hydrożelu do naczyń hodowlanych o pożądanej objętości na odwiert. Stosuj 200 μL hydrożelu na odwiert dla szkiełek z 4 dołami, 100 μL na odwór dla szkiełek z komorą 8 i 20 μL na odwiert dla płyt 96-dołowych.
   2. Rozprowadzaj hydrogel w cienką poduszkę na powierzchni podczas używania szkiełek komorowych. Umieść końcówkę pipety na środkowej górnej krawędzi komory i przeciągnij końcówkę po powierzchni podczas dawkowania żelu, aby uzyskać równomierną podkładkę. W przypadku płyt z 96 dołkami ustaw końcówkę pipety w centrum dołka, utrzymując kontakt z powierzchnią, i rozprowadzaj żel centralnie, aby utrzymać strukturę kopuły. Unikaj pipetowania powietrza do żelu, ponieważ powoduje powstawanie pęcherzyków.
   3. Inkubuj naczynia hodowlane w temperaturze 37°C w nawilżonym inkubatorze z 5%_CO2 przez 60 minut, aby umożliwić pełną polimeryzację.
      UWAGA: Warunki polimeryzacji opisane tutaj zostały zoptymalizowane pod stosowane w tym badaniu formaty hodowlane. W zależności od geometrii naczynia hodowlanego, objętości hydrożelu oraz warunków inkubacji mogą być wymagane drobne korekty w czasie polimeryzacji.
4. Kultura i utrzymanie
   1. Dodaj do każdego dołku podgrzane MEGM. Dostosuj objętość do używanego formatu hodowli.
   2. Delikatnie odłącz hydrożel od powierzchni hodowli za pomocą końcówki pipety, aby żel mógł unosić się na powierzchni. Przesuń końcówkę pipety wokół obwodu żelu i delikatnie podnieś pod polimeryzowany hydrożel, aby uwolnić go od powierzchni.
   3. Wymień MEGM dwa razy w tygodniu na świeże, podgrzane medium. Utrzymuj hodowle w nawilżonym inkubatorze z zawartością 5% CO₂ przez około 3–4 tygodnie i zakończ hodowle przed całkowitym zapadnięciem się hydrożelu. Identyfikacja zapadłych hydrożeli można rozpoznać po wyglądzie gęstych, nieprzezroczystych, korkowatych struktur powstałych w wyniku rozległego wyrastania komórkowego w żelu (patrz przykłady reprezentatywne w Rysunku Uzupełniającym 1).

Results

Pomyślne wdrożenie tego protokołu skutkuje powstaniem trójwymiarowych struktur organoidalnych, które wykazują uporządkowaną morfologię nabłonka oraz specyficzne dla tkanek cechy architektoniczne. Organoidy zaczynają się formować w ciągu 3–7 dni po siewie i rozwijają się przez cały okres hodowli. Wcześniejsza charakterystyka tego hydrożelowego systemu organoidów wykazała powtarzalną formację organoidów u wielu niezależnych dawców ludzkich³. W tym badaniu oceniono pierwotne komórki nabłonkowe wyizolowane od 12 dawców mamoplastyki redukcyjnej bez choroby, a 11 z 12 próbek dawców z powodzeniem wygenerowało organoidy w opisanych warunkach hodowli. Wśród dawców mediana liczby struktur organoidalnych utworzonych na 100 zasianych komórek wynosiła 1,775 (95% CI: 0,45–4,10). Chociaż zaobserwowano znaczną zmienność między dawcami w efektywności formowania organoidów i dynamice wzrostu, złożone morfologie przewodowo-łopowe i acynary były powtarzalne u dawców.

Organoidy piersi pochodzące z pojedynczych komórek nabłonkowych wykazują progresywną morfogenezę, tworząc rozgałęziające struktury do 21. dnia hodowli (Rysunek 2). Struktury te charakteryzują się wydłużonymi wyrostkami i organizacją wielokomórkową. Organoidy wykazywały przewidywane powierzchnie w zakresie od 10 000 do 90 000 μm² do 18. dnia, z wartościami okręgowymi poniżej 0,3, obliczanymi jako 4π × (Area/Perimeter²)^3,9. Organoidy pochodzące z fragmentów tkanek zazwyczaj tworzyły struktury przekraczające 90 000 μm² do 18. dnia, podczas gdy organoidy pochodzące z fragmentów guza tworzyły gęstsze i bardziej nieregularne struktury o ograniczonej organizacji i zwiększonych promieniowych projekcjach, co odpowiadało zmienionym zachowaniom wzrostowym.

Organoidy pochodzące z fragmentów nabłonka gruczołów ślinowych i nerek również wykazują różne morfologie w tych samych warunkach hydrożelowych (Rysunek 2). Organoidy gruczołów ślinowych tworzą zwarte struktury na wczesnych etapach (dzień 3), natomiast organoidy nerkowe rozwijają wydłużone i asymetryczne morfologie już w 17. dniu. Obserwacje te zostały uwzględnione, aby pokazać szerszą elastyczność układu organoidów opartego na hydrożelu poza tkanką mleczną oraz zilustrować jego zdolność do wspierania powstawania organoidów z wielu źródeł nabłonkowych.

Immunobarwienie i analizy molekularne przeprowadzone^{wcześniej 3,5,8} wykazały obecność markerów linii linii nabłonkowej, w tym markerów świetlnych KRT8, KRT18, KRT19, E-kadheryny, GATA3, JAG1, Notch1 i MUC1, a także markerów podstawnych lub mioepithelowych KRT5, KRT14, Slug, SOX9 i TP63, co wskazuje na zachowanie heterogeniczności nabłonkowej w obrębie organoidów. Cechy strukturalne zgodne z końcową organizacją lobularną na wierzchołku zaobserwowano mikroskopią konfokalną i rekonstrukcją trójwymiarową i zostały zdefiniowane jako struktury zawierające wydłużone obszary przewodowe połączone z pąkami przypominającymi pąki przypominające pąki przypominające końcowe klocki lub pąki pęcherzykowe, przypominające organizację rodzimych ludzkich terminalnych jednostek lobularnych przewodów. Struktury te wykazywały również warstwową organizację nabłonka z wzorowaniem komórek luminalnych i podstawnych, zgodnym z wcześniej opublikowanymi analizami tej platformy³.

Obserwowano przedział podobny do mezenchymu w związku ze strukturami nabłonkowymi i pomiędzy nimi, charakteryzujący się migracyjnym zachowaniem i ekspresją markerów, w tym VIM, SNAI1, ZEB1, S100A, CD90 i FAPα. Wraz z analizami mikroskopii poklatkowej, obserwacje te wspierają powstanie wspierającego mikrośrodowiska w systemie hodowli³.

Co ważne, protokół ten ma na celu zapewnienie szeroko adaptowalnych ram metodologicznych, a nie ustanowienie jednego stałego punktu odniesienia biologicznego. Ilościowe wyniki, takie jak efektywność tworzenia organoidów, rozmiar, złożoność rozgałęzień i skład komórkowy, mogą się różnić w zależności od źródła dawcy, statusu menopauzy, materiału wyjściowego (np. fragmenty tkanki w porównaniu do pojedynczych komórek) oraz warunków eksperymentalnych.

Wyniki nieoptymalne obejmują obniżoną wydajność tworzenia organoidów (<1 organoid na 500 zasianych komórek), nadmiar zanieczyszczeń komórkowych, niepowodzenie polimeryzacji kolagenu lub nieutworzenie zorganizowanych struktur. Te skutki często wiążą się z niską żywotnością komórek, niepełną dysocjacją tkanek, nieprawidłowym składem hydrożelu lub nieprawidłową neutralizacją pH.

Ilościowa analiza rozwoju organoidów może być przeprowadzana za pomocą obrazowania na żywo oraz metod obrazowania o wysokiej zawartości do pomiaru liczby organoidów, rozkładu rozmiarów, zachowania rozgałęzień, złożoności strukturalnej oraz dynamiki komórek. Poprzednie badania wykorzystujące tę platformę przeprowadzały podłużne obrazowanie na żywo, śledzenie komórek, analizę morfometryczną oraz badania perturbacji genetycznych, aby ilościowo określić dynamikę wzrostu organoidów i zachowanie linii w czasie ^3,5. Obrazowanie wykonywano za pomocą mikroskopii konfokalnej, a analizę obrazów za pomocą oprogramowania NIS-Elements.

Rysunek uzupełniający 1. Reprezentatywny przykład zapadającego się hydrożelu podczas długotrwałej hodowli organoidów w dniu 18. Zapadłe hydrożele pojawiają się jako gęste, nieprzezroczyste, korkowate struktury wynikające z rozległego wyrastania komórek i kurczenia macierza. Te cechy morfologiczne były wykorzystywane jako kryterium zakończenia hodowli przed całkowitym zapadnięciem się hydrożelu. Pasek skali = 500 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Opisany tutaj protokół umożliwia powtarzalną generację trójwymiarowych organoidów ludzkiej piersi w określonym mikrośrodowisku hydrożelowym, które wspiera kluczowe cechy morfogenezy mleków³. Dla sukcesu tej metody jest kluczowych kilka kroków. Po pierwsze, przetwarzanie tkanek i dysocjacja enzymatyczna muszą być starannie kontrolowane, aby zachować żywotność nabłonka przy jednoczesnym minimalizowaniu nadmiernego trawienia, co może obniżyć wydajność komórek i utrudnić późniejszą morfogenezę¹⁰. W szczególności krótkotrwałe i sekwencyjne zabiegi enzymatyczne, połączone z delikatną dysocjacją mechaniczną, są niezbędne dla utrzymania funkcjonalnych populacji nabłonka. Po drugie, przygotowanie hydrożelu wymaga precyzyjnej kontroli stężenia kolagenu, pH i czasu¹¹. Neutralizacja kolagenu inicjuje polimeryzację; Dlatego wszystkie etapy po dodaniu wodorotlenku sodu muszą być wykonywane szybko i na lodzie, aby zapewnić stałe powstawanie żelu. Niepełna lub opóźniona polimeryzacja może skutkować źle zbudowanymi lub zapadłymi hydrożelami, które nie wspierają rozwoju organoidów. Na koniec, gęstość nasienia musi być empirycznie optymalizowana dla każdej próbki dawcy, ponieważ nadmierne obciążenie tkanką lub komórką może prowadzić do szybkiego kurczenia żelu i utraty integralności strukturalnej¹².

Kilka kwestii rozwiązywania problemów może poprawić powtarzalność. Słaba formacja organoidów może wynikać z niskiej żywotności komórek, nieoptymalnego składu hydrożelu lub nieprawidłowego traktowania żelu podczas depozycji¹³. Zapewnienie utrzymania zapasów kolagenu w temperaturze 4°C i uniknięcia przedwczesnej polimeryzacji jest kluczowe dla spójnej jakości żelu¹¹. Dodatkowo, skuteczne odłączenie hydrożeli od powierzchni hodowli po polimeryzacji jest wskaźnikiem prawidłowego powstawania żelu; Brak odłączenia zazwyczaj odzwierciedla niepełną polimeryzację lub nieodpowiednie warunki powierzchniowe¹⁴. Oczekiwana jest zmienność rozmiaru i morfologii organoidów w różnych próbkach dawców i odzwierciedla to heterogeniczność biologiczną, a nie awarię techniczną. Poprzednie badania z wykorzystaniem tej platformy wykazały powtarzalną formację organoidów u szerokiego grona niezależnych dawców pierwotnych ludzi, pomimo znacznej zmienności między dawcami w efektywności tworzenia organoidów i morfogenezie³.

Ta metoda ma kilka ograniczeń. Chociaż model wspiera pojawienie się przedziału przypominającego mezenchym obok struktur nabłonkowych, nie oddaje w pełni złożoności mikrośrodowiska stromalnego, immunologicznego i naczyniowego in vivo. Skład hydrogelu, choć jest określony, reprezentuje uproszczoną macierz zewnątrzkomórkową i może nie oddawać wszystkich sygnałów biomechanicznych lub biochemicznych obecnych w tkance rodzimej^15,16. Dodatkowo, zmienność między dawcami może wpływać na dynamikę wzrostu i morfologię organoidów, co wymaga empirycznej optymalizacji dla konkretnych zastosowań. Pomimo tych ograniczeń, zdolność tego systemu do wspierania samoorganizacji oraz endogennych interakcji epitelowo-mezenchymalnych stanowi znaczący postęp w porównaniu z wieloma istniejącymi modelami kulturowymi³.

W porównaniu z powszechnie stosowanymi systemami opartymi na ekstrakcji z błoną podstawową, to podejście zapewnia większą kontrolę nad składem macierzy zewnątrzkomórkowej i zmniejsza zmienność związaną z niezdefiniowanymi materiałami¹⁷. Wcześniejsze badania bezpośrednio porównujące tę platformę hydrożelową z systemami organoidowymi opartymi na Matrigelu wykazały istotne różnice w organizacji tkanek i składzie komórkowym ^3,8. Organoidy hodowane w hydrożelu bardziej przypominały rodzimą tkankę ludzkiej piersi zarówno na poziomie morfologicznym, jak i transkryptomicznym, zachowując wieloliniowe populacje nabłonkowe, w tym przedziały luminalne, bazalne, przodkowe i mezenchymalne, podczas gdy organoidy hodowane w Matrigelu były zdominowane przez proliferacyjne hybrydowe stany bazalne i nie posiadały populacji stromalnych. Ponadto, w przeciwieństwie do systemów współhodowli polegających na dodawaniu obcych komórek stromalnych, ten model umożliwia wewnętrzne powstanie wspierającej komory przypominającej mezenchym, umożliwiając badanie interakcji epitel-mikrośrodowisko w bardziej fizjologicznie istotnym i mniej sztucznie zaprojektowanym kontekście. Pojawiające się populacje przypominające mezenchymalne w hydrożelach były wcześniej weryfikowane za pomocą komplementarnego obrazowania na żywo, immunobarwienia oraz analiz transkryptomicznych pojedynczych komórek³. Badania te wykazały pojawienie się wysoce ruchomych komórek podobnych do stromalnych z ekspresją mezenchymalnych i epitelowo-mezenchymalnych markerów związanych z przejściami, w tym Vimentin, THY1/CD90, FAP, S100A4, ZEB1 i Snail, a także wzajemne interakcje sygnalizacyjne nabłonkowo-mezenchymalne, zidentyfikowane za pomocą analiz ligand–receptor. Te cechy sprawiają, że system jest szczególnie dobrze przystosowany do badań procesów zależnych od architektury tkanek i komunikacji komórka-komórka, w tym morfogenezy, plastyczności nabłonka oraz wczesnej remodelacji tkanek ^4,5.

Opisana platforma ma szerokie zastosowania w badaniach podstawowych i translacyjnych. Może być wykorzystywany do badania rozwoju ludzkiego piersi, modelowania wczesnych zdarzeń rozpoczynających chorobę oraz oceny wpływu zakłóceń molekularnych lub środowiskowych na organizację tkanek. Wcześniejsze badania z wykorzystaniem tej platformy wykazały, że funkcjonalna perturbacja regulatorów rozwojowych, takich jak DDR1 i RUNX1, zmienia różnicowanie linii, organizację nabłonka oraz morfogenezę przewodowo-lobularną w trójwymiarowej kulturze ^5,18. Zgodność z obrazowaniem ilościowym i analizą o wysokiej zawartości umożliwia systematyczne badania wyników fenotypowych, w tym zmian wielkości, struktury i złożoności organoidów. W związku z tym metoda ta zapewnia skalowalną i biologicznie istotną platformę do badania organizacji ludzkiej tkanki oraz jej zakłóceń w kontekstach związanych z chorobą.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stożkowe lampy o pojemności 15 mL	VWR	89039-664	Rurki sterylne do przetwarzania tkanek i wirowania
40 μ Sitnik komórek M	VWR	732-2757	Urządzenie filtracyjne do przygotowania zawiesiny jednokomórkowej
40 μ Sitnik komórek M dla niskich objętości	Bel-Art	136800040	Urządzenie filtracyjne do przygotowania zawiesiny jednokomórkowej
Automatyczny licznik komórek komórkowych	Bio-Rad	1450102	Urządzenie służące do liczenia komórek i określania żywotności
Ekstrakt przysadki bydlęcej	Thermo Scientific	13028014	Suplement dla ośrodka komórkowego nabłonka
Slajdy liczące komórki	Bio-Rad	145-0011	Szkiełka dwukomorowe używane do liczenia komórek
Wirówka	Nie ma	Nie ma	Wirówki stołowe muszą mieć co najmniej prędkość 500 x g oraz pojemność probówek 15 mL i 1,5 mL.
Kolagen I	Millipore Sigma	08-115	Białko macierzy zewnątrzkomórkowej wykorzystywane do tworzenia hydrożeli
Kolagenaza A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzym stosowany do dysocjacji tkanek
Krioviale	Corning	976171	Sterylne fiolki do kriogenicznego przechowywania próbek
Naczynia hodowlane (np. szkiełka komorowe, płyty wielorowne)	Corning	354104 354108 3603	Platformy do depozycji hydrożelu i hodowli organoidów.
Dimetylsulfoksyd	Millipore Sigma	317275	Krioprotekcjonant stosowany w medium zamrażającym
Dispase II	Roche	4942078001	Enzym stosowany do dysocjacji tkanek wtórnych
DNaza I	Roche	10104159001	Enzym używany podczas dysocjacji komórkowej.
Surowica bydła płodowa	Gibco	10437	Suplement serum stosowany w mediach do mycia i neutralizacji
Fibronektyna	Sigma-Aldrich	F2006	Składnik białka macierzy zewnątrzkomórkowej
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Suplement dla ośrodka komórkowego nabłonka
Ludzki czynnik wzrostu naskórka	Sigma-Aldrich	E9644	Suplement dla ośrodka komórkowego nabłonka
Hydrokortyzon	Sigma-Aldrich	H0888	Suplement dla ośrodka komórkowego nabłonka
Kwas hialuronowy	Millipore Sigma	385908	Składnik macierzy zewnątrzkomórkowej do formułowania hydrożelu
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H3506	Enzym stosowany do dysocjacji tkanek
Inkubator	Thermo Scientific	3598	Urządzenie używane do inkubacji w hodowli tkankowej
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278	Suplement dla ośrodka komórkowego nabłonka
Laminin	Gibco	23017-015	Składnik białka macierzy zewnątrzkomórkowej
Podstawowe ośrodek nabłonkowy mleka	Thermo Scientific	M171500	Ośrodek wzrostu komórek nabłonkowych
Rurki mikrowirówki (1,5 mL)	Thermo Scientific	3451	Rurki używane do reakcji o małej objętości
Rotator orbitalny	Thermo Scientific	400110	Rotator używany do dyspersji tkanek podczas dysocjacji enzymatycznej
Pipeta P1000	Gilson	P1000	Urządzenie używane do mieszania i przenoszenia objętości do 1 000 i mu; L
Penicylina-streptomycyna	Thermo Scientific	15140122	Suplement antybiotykowy dla ośrodka nabłonkowego
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym	Gibco	20012-027	Roztwór buforowy używany do mycia i płukania
Precyzyjna równowaga	Mettler Toledo	ML303E	Waga używana do ważenia tkanek
Pipeta serologiczna	Nunc	170356N	Pipeta używana do pobierania komórek nabłonka nieprzylegających do nabłonka
Wodorotlenek sodu (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagent stosowany do neutralizacji kolagenu
Sterylne skalpele	Bard-Parker	372615	Narzędzia używane do mechanicznego mielenia tkanek
Roztwór trypanowego niebieskiego	Gibco	15250061	Barwnik stosowany do oceny żywotności komórek
Trypsyna (0,25%)	Gibco	25200056	Enzymatyczny odczynnik stosowany do dysocjacji komórki
Kąpiel wodna (37 i stopnie; C)	VWR	10LA	Urządzenie używane do kontrolowanego rozmrażania próbek