Zdefiniowana metoda oparta na hydrożelu do generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają morfogenezę sutka

Podsumowanie

Ten protokół opisuje określoną metodę opartą na hydrożelu do generowania ludzkich organoidów piersi, które odtwarzają kluczowe cechy morfogenezy sutka w kontrolowanym trójwymiarowym układzie kultury.

Streszczenie

Rozwój fizjologicznie istotnych ludzkich systemów modelowych, które odzwierciedlają architekturę tkanki i dynamikę stanu komórkowego, pozostaje głównym wyzwaniem w badaniach nad rozwojem piersi i wczesnymi zdarzeniami w karcynogenezie. Konwencjonalne dwuwymiarowej kultury i wiele trójwymiarowych systemów nie są w stanie uchwycić organizacji strukturalnej i mikrośrodowiskowych wskazówek, które definiują ludzką gruczoł piersiowy. Przedstawiamy tutaj metodę, która umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych organizmów ludzkiej piersi z pierwotnych komórek nabłonkowych osadzanych w zdefiniowanej matrycy hydrożelowej składającej się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowskiego. System ten wspiera przejście pojedynczych komórek przez kluczowe etapy morfogenezy sutka, w tym ekspansję przodków, układanie nabłonka i tworzenie struktur podobnych do końcowych jednostek pęcherzykowo-kanalikowych, a także pojawienie się mezenchymalnego przedziału, w okresie 21 dni kultury. Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania hydrożelu, wysiewu komórek oraz warunków kultury. Metoda ta jest zgodna z wysoko zawartościowym obrazowaniem i ilościową analizą liczby organizmów, rozkładu wielkości i złożoności architektonicznej. Ta platforma umożliwia badania mechanistyczne nad plastycznością nabłonkową i zaburzeniami środowiskowymi, zapewniając skalowalny i biologicznie istotny system do badania wczesnych zmian na poziomie tkanki związanych z ryzykiem raka piersi.

Wprowadzenie

Zrozumienie rozwoju ludzkiej gruczołowej tkanki piersiowej i wczesnych zdarzeń, które predysponują tkankę do złośliwej transformacji, wymaga systemów eksperymentalnych, które wiernie odtwarzają architekturę tkanki, hierarchię komórkową i sygnałowanie mikrośrodowiska. Chociaż dwuwymiarowe kultury nabłonkowe dostarczyły ważnych mechanizmów wskazówek, brakuje im kontekstu strukturalnego niezbędnego do modelowania organizacji nabłonkowej i morfogenezy¹. Istniejące trójwymiarowe systemy kulturowe, w tym te oparte na wyciągach błony podstawnej, poszerzyły dziedzinę, ale nadal są ograniczone przez zmienną kompozycję, niekompletną kontrolę nad składnikami macierzy pozakomórkowej i niekonsekwentne wsparcie dla wyższej struktury tkankowej¹. Ponadto wiele systemów organoidowych opartych na wyciągach błony podstawnej jest ograniczone przez niemożność konsekwentnego wsparcia dla pojawienia się organizacji przypominającej tkankę¹. W szczególności wiele systemów opiera się na egzogennych składnikach stromy, zamiast umożliwiać endogenny rozwój wspierających mikrośrodowisk, ograniczając w ten sposób ich zdolność do modelowania interakcji nabłonkowo-mezenchimalnych, które są centralne dla rozwoju tkanki i choroby. Ograniczenia te ograniczają możliwość powtarzalnego badania procesów rozwojowych, plastyczności nabłonkowej i wpływu zaburzeń środowiskowych lub molekularnych na organizację tkanki.

Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, opracowałeśmy zdefiniowany żel hydrokoloidowy trójwymiarowy model ludzkiej piersi, który umożliwia pierwotnym komórkom nabłonkowym generowanie zorganizowanych struktur w obrębie zdefiniowanej macierzy pozakomórkowej^2,3,4,5,8. Żel składa się z kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i kwasu hialuronowego, składników wybranych na podstawie ich uznanych ról w rozwoju gruczołu piersiowego i morfogenezie nabłonkowej. Te cząsteczki macierzy pozakomórkowej angażują odrębne receptory komórkowe, w tym integriny, receptory domeny dyskoidowej, CD44 i RHAMM, i są znane z regulacji polaryzacji nabłonkowej, morfogenezy rozgałęziającej, utrzymania komórek macierzystych, mechanotransdukcji i organizacji tkanki w gruczołach piersiowych^6,7. Poprzednie badania opisujące ten system żelowy wykazały, że włączenie tych składników macierzy pozakomórkowej znacznie poprawiło morfogenezę przewodowo-płatkową i dojrzewanie nabłonka w porównaniu z warunkami tylko z kolagenem lub opartymi na Matrigel^3,8. Ponadto fizyczne właściwości tej formuły żelu zostały wcześniej scharakteryzowane za pomocą mikroskopii sił atomowych, wykazując, że złożona żelowa macierz pozakomórkowa wykazywała niższą sztywność i zwiększone pęcznienie w stosunku do żeli tylko z kolagenem (moduł Younga: 256,7 ± 20,0 Pa przeciwko 559,2 ± 204,0 Pa odpowiednio), zgodnie z miększym i bardziej nawilżonym środowiskiem macierzy⁸.

Ważne jest, aby ten model wspierał pojawienie się przedziału przypominającego mezenchym, który powstaje wraz z strukturami nabłonkowymi, zapewniając endogenne wsparcie strukturalne i sygnałowe, które bardziej odzwierciedlają natywną organizację tkanki³. Fizjologiczna istotność tego systemu żelowego została oceniona poprzez bezpośrednie porównania z konwencjonalnymi kulturami organoidów opartymi na Matrigel za pomocą analiz morfologicznych i transkryptomowych. Wcześniejsze badania wykazały, że kultury żelowe wspierają bardziej zorganizowaną formowanie tkanki przewodowo-płatkowej i różnicowanie wieloliniowe niż kultury oparte na Matrigel, zachowując również odpowiedzialność hormonową⁸. Bardziej niedawno zintegrowane analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek porównujące organoidalne pochodzące z żelu, organoidalne rosnące w Matrigel i pierwotną ludzką tkankę piersiową wykazały, że organoidalne rosnące w żelu bardziej wiernie odtwarzają hierarchię nabłonkową, różnorodność komórkową i interakcje nabłonkowo-mezenchimalne obecne w natywnej ludzkiej tkanki piersiowej³. Natomiast organoidalne rosnące w Matrigel były wzbogacone o proliferacyjne hybrydowe stany bazalne i brakowało im populacji przypominających stromę, co jest zgodne z samozbieraniem nabłonka, a nie ukierunkowanym organogenezą.

Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalną i skalowalną metodę generowania organoidal z pierwotnej ludzkiej tkanki, z opcjonalnymi krokami wyczerpania fibroblastów i dysocjacji do pojedynczych komórek. Ponieważ ta platforma jest zgodna z obrazowaniem na żywo, obrazowaniem wysokozawartościowym, ilościową analizą morfometryczną, śledzeniem komórek i badaniami perturbacji genetycznych, może być zintegrowana z podejściami dółstrumieńowymi oceniającymi liczbę organoidal, rozmiar, architekturę i dynamikę wzrostu. Ta platforma zapewnia zatem biologicznie istotny system do badania rozwoju piersi ludzkich, plastyczności nabłonkowej, interakcji nabłonkowo-mikroś

Protokół

Podstawowe tkanki, które w przeciwnym razie zostałyby wyrzucone jako odpady medyczne po operacji, uzyskane zostały zgodnie z wszystkimi odpowiednimi prawami z wykorzystaniem protokołów zatwierdzonych przez komitety etyczne w Maine Medical Center i Tufts Medical Center. Wszystkie tkanki zostały anonimizowane przed transferem i nie można ich było przypisać do konkretnych pacjentów. Z tego powodu badania te uzyskały status zwolnienia od Komitetu ds. Wykorzystywania Ludzi jako Podmiotów Eksperymentów w Massachusetts Institute of Technology i na Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Wszyscy pacjenci wzięci udział w badaniach podpisali formularz zgody na udział w badaniu i na publikację wyników.

1. Przetwarzanie i przygotowanie tkanki

UWAGA: Przeprowadzaj wszystkie procedury z udziałem ludzkiej tkanki zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi biobezpieczeństwa i etycznymi. Odwołaj się do schematów przepływu przedstawionych na Rysunku 1A i 1B, aby uzyskać wizualny przegląd etapów protokołu i przepływu przygotowania organoidalnego przed rozpoczęciem procedury.

1. Przygotuj MEGM używając podstawowego medium komórek sutkowych sutka uzupełnionego o 52 µg/mL wyciągu z gruczołu przytarczyczy bydlęcym, 10 ng/mL ludzkiego czynnika wzrostu naskórka, 5 µg/mL insuliny, 500 ng/mL hydrokortyzonu, 1% (v/v) GlutaMAX i 1% (v/v) Antibiotic-Antimycotic (100X).
2. Przygotuj medium dysocjujące, dodając 1,5 mg/mL kolagenazy A (przechowywanej w −20°C) i 100 U/mL hialuronidazy (przechowywanej w 4°C) do medium wzrostu komórek sutkowych sutka (MEGM).
3. Otrzymaj ludzkie tkanki piersi uzyskane z profilaktycznych masektomie i redukcji piersi w ciągu 24 h po wycięciu, niefiksowane w buforowanym roztworze soli fosforanowej (PBS) i przechowywane w 4°C. Ważyć tkankę na wadze precyzyjnej, aby określić całkowitą wagę tkanki.
4. Umieścić tkankę w sterylnej szafce bezpieczeństwa biologicznego. Mechanicznie pokroić tkankę na fragmenty o wielkości 3–5 mm³ używając sterylnych skalpeli. Przenieść około 2–3 g pokrojonej tkanki do 15 mL stożkowego probówka. Dodać 10 mL medium dysocjującego do każdej probówki. 
5. Inkubować probówki w 37°C na orbitalnym rotatorze z prędkością 8 rpm przez 12–18 h w celu enzymatycznego strawienia tkanki. Uważać, że strawienie jest zakończone, gdy nie pozostają duże fragmenty tkanki i widoczna jest jednorodna zawiesina równomiernie rozdrobnionego materiału w całym medium.
6. Pozwólić fragmentom nabłonka osiąść przez grawitację przez 5 min. Upewnić się, że nie pozostają widoczne fragmenty zawieszone w medium i że obecny jest wyraźny osad. Ostrożnie osuszyć i wyrzucić nadstan, nie zakłócając osadzającego się pelletu.
   UWAGA: Nadstan zawiera komórki stromy i komponenty macierzy, i może być przepłukany i wykorzystany lub zachowany dla innych badań. 
7. Ponownie zawiesić pellet w 10 mL medium płukającego składającego się z 5% surowicy bydlęcej płodowej (FBS) w PBS. Wyśrodkuj przy 250 × g przez 5 min w wirówce wahadłowej w temperaturze pokojowej.
8. Powtórz krok płukania trzy razy więcej lub dopóki nadstan nie jest przezroczysty i wolny od widocznych zanieczyszczeń.
9. Ponownie zawiesić końcowy pellet w medium zamrażającym składającym się z 10% dimetylosulfonianu (DMSO) w MEGM o objętości 1 mL na gram początkowej masy tkanki.
   UWAGA: DMSO jest szkodliwe w kontakcie lub przez zadychanie. Obsługiwać używając odpowiedniego wyposażenia ochronnego dla osoby i pracować w osłonie chemicznej, jeżeli jest to wymagane przez wytyczne instytucjonalne.
10. Przenieść 1 mL zawiesiny do każdej kriowialki. Umieścić kriowialki w −80°C w pojemniku do zamrażania przed długotrwałym przechowywaniem w ciekłym azocie.
    UWAGA: Ten krok reprezentuje punkt przerwy. Przechowywać próbki w −80°C przed przeniesieniem do warunków długotrwałego przechowywania.

2. Odzyskiwanie i opcjonalna preparacja komórek

1. Roztapianie i początkowe odzyskiwanie
   1. Wyjąć zamrożoną tkankę z przechowywania w −80°C po przynajmniej 24 h zamrażania, lub z długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie. Natychmiast zanurzyć kriowialkę do góry koronką w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i szybko rozmrozić przez 1 min, aby zminimalizować śmierć komórek.
      UWAGA: Delikacie agitować kriowialkę podczas rozmrażania, aby zapewnić jednolite nagrzewanie.
   2. Gdy tkankę całkowicie rozmrożono, natychmiast przenieść zawartość kriowialki do 15 mL stożkowej probówki zawierającej 10 mL MEGM. Wyśrodkuj przy 250 × g przez 5 min.</

Wyniki

Skuteczna realizacja tego protokołu skutkuje tworzeniem trójwymiarowych struktur organoidalnych, które wykazują uporządkowaną morfologię nabłonkową i cechy architektoniczne specyficzne dla tkanki. Organoidy zaczynają tworzyć się w ciągu 3–7 dni po posadzeniu i nadal rozwijają się przez cały okres kultury. Wcześniejsza charakterystyka tego układu organoidalnego w żelu wykazała powtarzalne tworzenie się organoidów w wielu niezależnych pierwotnych ludzkich dawczyń³. W tym badaniu oceniono pierwotne k...

Dyskusja

Opisany protokół umożliwia powtarzalne generowanie trójwymiarowych ludzkich organoidów piersi w zdefiniowanym mikrośrodowisku hydrożelowym, które wspiera kluczowe cechy morfogenezy sutka³. Kilka kroków jest kluczowych dla sukcesu tej metody. Po pierwsze, przetwarzanie tkanki i enzymatyczne dysocjacja muszą być starannie kontrolowane, aby zachować żywotność nabłonka, jednocześnie minimalizując nadmierną trawienie, co może zmniejszyć wydajność komórek i zaburzyć późniejszą morfogenezę

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 mL conical tubes	VWR	89039-664	Sterile tubes for tissue processing and centrifugation
40 μm cell strainer	VWR	732-2757	Filtration device for single-cell suspension preparation
40 μm cell strainer for low volumes	Bel-Art	136800040	Filtration device for single-cell suspension preparation
Automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Device used to count cells and determine viability
Bovine pituitary extract	Thermo Scientific	13028014	Supplement for epithelial cell media
Cell counting slides	Bio-Rad	145-0011	Dual-chamber slides used for cell counting
Centrifuge	N/A	N/A	Benchtop centrifuge/s need to have at least 500 x g speed capability and accommodation of 15 mL and 1.5 mL tubes.
Collagen I	Millipore Sigma	08-115	Extracellular matrix protein used for hydrogel formation
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzyme used for tissue dissociation
Cryovials	Corning	976171	Sterile vials for cryogenic storage of samples
Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)	Corning	354104 354108 3603	Platforms for hydrogel deposition and organoid culture.
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	317275	Cryoprotectant used in freezing medium
Dispase II	Roche	4942078001	Enzyme used for secondary tissue dissociation
DNase I	Roche	10104159001	Enzyme used during cell dissociation.
Fetal bovine serum	Gibco	10437	Serum supplement used in wash and neutralization media
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006	Extracellular matrix protein component
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Supplement for epithelial cell media
Human epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	Supplement for epithelial cell media
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Supplement for epithelial cell media
Hyaluronic acid	Millipore Sigma	385908	Extracellular matrix component for hydrogel formulation
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzyme used for tissue dissociation
Incubator	Thermo Scientific	3598	Device used for tissue culture incubation
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Supplement for epithelial cell media
Laminin	Gibco	23017-015	Extracellular matrix protein component
Mammary epithelial basal medium	Thermo Scientific	M171500	Growth medium for epithelial cells
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubes used for small-volume reactions
Orbital rotator	Thermo Scientific	400110	Rotator used for tissue dispersion during enzymatic dissociation
P1000 pipette	Gilson	P1000	Device used to mix and transfer volumes up to 1,000 μL
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Antibiotic supplement for epithelial cell media
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012-027	Buffer solution used for washing and rinsing
Precision balance	Mettler Toledo	ML303E	Balance used for tissue weighing
Serological pipette	Nunc	170356N	Pipette used for harvesting non-adherent epithelial cells
Sodium hydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagent used for collagen neutralization
Sterile scalpels	Bard-Parker	372615	Tools used for mechanical tissue mincing
Trypan blue solution	Gibco	15250061	Dye used for cell viability assessment
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200056	Enzymatic reagent used for cell dissociation
Water bath (37 °C)	VWR	10LA	Device used for controlled thawing of samples