Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza ELISpot do oznaczania ilości antygenowo-specyficznych i całkowitych komórek wydzielających przeciwciała we krwi i szpiku kostnym immunizowanych makaków rezus

59 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71836

⸱

21 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

ELISpot dla limfocytów B jest zwalidowaną metodą ilościowego oznaczania liczebności i trwałości swoistych dla antygenu długożyjących komórek plazmatycznych wydzielających IgG, IgM i IgA, a także całkowitej liczby komórek wydzielających przeciwciała (ASC), zarówno we krwi (odzwierciedlającej krótkożyjące plazmablasty po immunizacji), jak i w bardziej trwałych ASC szpiku kostnego.

Streszczenie

Ocena nowych antygenów szczepionkowych i adiuwantów opiera się tradycyjnie na pomiarze mian przeciwciał, których rozwój po immunizacji wymaga czasu. Ilościowe oznaczenie komórek wydzielających przeciwciała (ASC) po immunizacji pierwotnej i przypominającej zapewnia wcześniejszy, informacyjny pod kątem mechanistycznym pomiar humoralnej odporności indukowanej szczepionką i może ułatwić optymalizację formulacji szczepionek oraz strategii immunizacji. W niniejszym opracowaniu opisano protokół enumeracji ASC z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) oraz komórek szpiku kostnego (BM) makaków rezus; makaki rezus stanowią istotny model przedkliniczny w badaniach nad szczepionką przeciwko HIV. Ten test immunospot z wiązaniem enzymatycznym (ELISpot) umożliwia ilościowe oznaczenie zarówno antygenowo swoistych, jak i całkowitych ASC dla IgG, IgM i IgA poprzez pomiar ich częstotliwości bezwzględnej i względnej. W krwi obwodowej test ten rejestruje szczytową odpowiedź plazmoblastów po immunizacji, natomiast w szpiku kostnym wykrywa akumulację antygenowo swoistych plazmocytów różnych izotypów, oceniając tym samym trwałość długożyjących ASC. Niniejszy protokół oferuje solidne i powtarzalne podejście do oceny kombinacji immunogenów i adiuwantów w przedklinicznych badaniach nad szczepionkami oraz dostarcza cennych danych wspierających przenoszenie obiecujących kandydatów na szczepionki do fazy rozwoju klinicznego.

Wprowadzenie

Komórki wydzielające przeciwciała (ASCs) są kluczowymi komponentami odporności adaptacyjnej i obejmują zarówno krótkożyjące plazmablasty, które powstają szybko po immunizacji, jak i długożyjące komórki plazmatyczne, odpowiedzialne za trwałą produkcję przeciwciał. Plazmablasty są przejściowo wykrywalne we krwi obwodowej i wtórnych narządach limfatycznych, osiągając szczytową częstość w określonych punktach czasowych po immunizacji, co różni się w zależności od preparatu szczepionki i gatunku gospodarza (zazwyczaj w dniach 4–5 u makaków rhesus i około 7. dnia u ludzi). Z kolei dojrzałe komórki plazmatyczne są długożyjące i bytują głównie w wtórnych tkankach limfatycznych oraz szpiku kostnym (BM). Skuteczna szczepionka powinna wywoływać silną odpowiedź immunologiczną zarówno humoralną, jak i komórkową. Pomiar odpowiedzi anamnestycznej, odzwierciedlony przez szybką ekspansję plazmablastów w mononuklearnych komórkach krwi obwodowej (PBMCs) po immunizacji przypominającej, dostarcza cennych informacji o sile odpowiedzi immunologicznej indukowanej szczepionką. Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie niezawodnej metody ilościowego oznaczania wczesnej odpowiedzi plazmablastów oraz odpowiedzi długożyjących komórek plazmatycznych po immunizacji swoistej dla Env u makaków rhesus.

W teście immunospot z użyciem enzymu (ELISpot), komórki ASC hoduje się w 96-dołkowych płytkach z dnem z membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) lub mieszanych estrów celulozy (MCE) pokrytych antygenem (Ag), co pozwala żywym komórkom na wydzielanie białek, które są wychwytywane bezpośrednio na powierzchni membrany. Wychwycone białka są następnie wykrywane za pomocą przeciwciał w konwencjonalnym formacie testu immunoenzymatycznego typu kanapkowego. W chromogennych testach ELISpot plamki powstają w wyniku konwersji substratu 3-amino-9-etylokarbazolu (AEC) przez peroksydazę chrzanową (HRP) w nierozpuszczalny, barwny osad, co umożliwia wizualizację i zliczanie poszczególnych komórek ASC. Metoda ELISpot oferuje kilka istotnych zalet, w tym możliwość wykrywania odpowiedzi swoistych względem antygenu ex vivo, wysoką czułość w ocenie funkcjonalnej pojedynczych komórek odpornościowych oraz ilościowe monitorowanie odpowiedzi immunologicznych limfocytów T i B zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych1,2,3.

W niniejszym opracowaniu opisano protokół B-komórkowego testu ELISpot służący do ilościowego oznaczania całkowitej oraz swoistej względem antygenu liczby komórek wydzielających przeciwciała (ASC) klasy IgG, IgM i IgA w PBMC i komórkach szpiku kostnego (BM) pozyskanych od makaków rezus. Protokół szczegółowo opisuje wszystkie krytyczne etapy, w tym pokrywanie płytek, blokowanie, wysiew komórek, rozwój testu, liczenie plamek oraz analizę danych, w celu scharakteryzowania kinetyki odpowiedzi plazmablastów i plazmocytów całkowitych oraz swoistych względem białka Env. Metoda ta stanowi powtarzalne podejście do oceny i porównywania immunogenności różnych formulacji antygenów i adiuwantów w przedklinicznych badaniach nad szczepionkami oraz wspiera optymalizację strategii szczepień przed ich późniejszym wdrożeniem klinicznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Makaki rezus wykorzystane w niniejszym protokole pochodziły z kolonii wolnych od określonych patogenów (SPF) z New Iberia Research Center i były utrzymywane w Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research w University of Texas MD Anderson Cancer Center. Opieka nad zwierzętami oraz wszystkie procedury eksperymentalne były zgodne z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee w University of Texas MD Anderson Cancer Center (protokół nr 2616RN00).

Niniejszy protokół stanowi optymalizację techniki opisanej w poprzednich przedklinicznych badaniach nad immunizacją4,5,6,7, opracowanej w celu wykrywania odpowiedzi ASC. Poniższy protokół opisuje procedurę ELISpot z wykorzystaniem świeżych preparatów komórek PBMCs oraz BM pobranych od makaków rezus biorących udział w eksperymentalnym protokole szczepionkowym przeciwko HIV.

UWAGA: Wszystkie procedury z sekcji 1–4 należy przeprowadzać w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, stosując techniki aseptyczne. W miarę możliwości należy używać pipet wielokanałowych.

1. Przygotowanie płytek ELISpot

  1. Powlekanie płytek ELISpot
    1. Płytki do oznaczania całkowitej immunoglobulin (Ig) 1 i 3 powlec 100 µL/well niekondensowanego przeciwciała koziego przeciwko IgG + IgM + IgA małpie w stężeniu 5 µg/mL w sterylnym DPBS. Inkubować płytki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 8 h, najlepiej przez noc (Rysunek 1A,C).
    2. Płytki specyficzne dla antygenu 2 i 4 powlec 100 µL/well lektyny Galanthus nivalis (GNL) w stężeniu 20 µg/mL w DPBS. Inkubować płytki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 8 h, najlepiej przez noc (Rysunek 1B,D).
    3. Powleczone płytki przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Przemywanie i blokowanie płytek do całkowitej immunoglobulin
    1. Usunąć roztwór do powlekania z płytek 1 i 3 poprzez szybkie odwrócenie każdej płytki nad pojemnikiem na odpady. Odwróconą płytkę energicznie uderzyć o papier chłonny, aby usunąć pozostały płyn.
    2. Przemyć każdą płytkę dwukrotnie 200 µL/well PBS zawierającego 0,05% Tween 20. Następnie przemyć płytki dwukrotnie 200 µL/well DPBS, aby usunąć pozostałości detergentu.
      UWAGA: Tween 20 jest cytotoksyczny. Należy go całkowicie usunąć przed wysianiem komórek.
    3. Do każdego dołka dodać 200 µL/well RPMI-10. Inkubować płytki przez 2 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem.
  3. Przemywanie i blokowanie płytek specyficznych dla antygenu
    1. Usunąć roztwór powlekający GNL z płytek 2 i 4 poprzez szybkie odwrócenie każdej płytki nad pojemnikiem na odpady. Odwrócone płytki energicznie uderzyć o papier chłonny, aby usunąć pozostały płyn.
    2. Przemyć każdą płytkę czterokrotnie 200 µL/well DPBS.
      UWAGA: W przypadku płytek powleczonych GNL nie należy używać PBS zawierającego Tween 20.
    3. Do każdego dołka dodać 200 µL/well RPMI-10. Inkubować płytki przez 2 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem.
    4. Odlać roztwór blokujący. Przemyć każdą płytkę czterokrotnie 200 µL/well DPBS.
    5. Dodać 100 µL/well antygenu CH505 SOSIP do końcowego stężenia 5 µg/mL. Inkubować płytki przez 2 h w temperaturze 37 °C.
    6. Odlać roztwór antygenu i przemyć każdą płytkę czterokrotnie sterylnym DPBS.
      UWAGA: Po ostatnim przemyciu pozostawić DPBS w dołkach, aby zapobiec wyschnięciu membrany MCE przed wysianiem komórek.

2. Przygotowanie próbek: Izolacja PBMC i mononuklearnych komórek szpiku kostnego

  1. Izolacja PBMC z krwi pełnej
    1. Wirować probówki z 10 mL krwi z EDTA przy 450 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej bez użycia hamulca.
    2. Usunąć osocze i dodać 4 mL DPBS bez Ca2+ i Mg2+. Delikatnie wymieszać za pomocą pipety serologicznej 10 mL.
    3. Ostrożnie nanieść rozcieńczoną krew na 4 mL Ficollu w probówce wirówkowej 15 mL. Wirować przy 800 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej, stosując powolne przyspieszanie i powolne hamowanie.
    4. Przenieść warstwę białkową (buffy coat) zawierającą mononuklearne komórki krwi obwodowej do nowej probówki 15 mL. Dodać 8–10 mL DPBS i wirować przy 450 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    5. Odlać nadosad i delikatnie resuspendować osad komórkowy.
    6. Do zawiesiny komórkowej dodać 2 mL buforu lizującego ACK (chlorek amonu i potasu). Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Nie przekraczać 5-minutowego czasu inkubacji, ponieważ przedłużona ekspozycja na bufor lizujący ACK obniża żywotność komórek.
    7. Zatrzymać lizę erytrocytów, dodając 10 mL DPBS zawierającego 2% FBS (płodowej surowicy bydlęcej). Wirować komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    8. Odlać nadosad i resuspendować komórki w RPMI-10.
    9. Policzyć PBMC za pomocą odpowiedniej metody liczenia komórek i upewnić się, że żywotność wynosi >90%, np. poprzez barwienie błękitem trypanu.
    10. Dostosować stężenie w jednej alikwocie do 5 × 106 komórek/mL dla testów ELISpot specyficznych dla antygenu. Dostosować stężenie w drugiej alikwocie do 1 × 106 komórek/mL dla testów ELISpot całkowitej immunoglobuliny.
  2. Izolacja mononuklearnych komórek szpiku kostnego
    1. Umieścić sitko komórkowe 70 µm w probówce wirówkowej 50 mL. Nawilżyć sitko 1 mL DPBS.
    2. Do 1 mL aspiratu szpiku kostnego dodać 4 mL DPBS. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety serologicznej.
    3. Przepuścić zawiesinę szpiku kostnego przez sitko komórkowe 70 µm. Przed wyrzuceniem sitka przepłukać je 2 mL DPBS.
    4. Nanieść przefiltrowaną zawiesinę na 4 mL Ficollu w probówce wirówkowej 15 mL. Wirować przy 800 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej, stosując powolne przyspieszanie i powolne hamowanie.
    5. Przenieść warstwę komórek mononuklearnych do nowej probówki 15 mL. Dodać 8–10 mL DPBS i wirować przy 450 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    6. Odlać nadosad i delikatnie resuspendować osad komórkowy.
    7. Do zawiesiny komórkowej dodać 2 mL buforu lizującego ACK. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Nie przekraczać zalecanego czasu lizy, aby zachować żywotność komórek.
    8. Zatrzymać lizę erytrocytów, dodając 10 mL DPBS zawierającego 2% FBS. Wirować komórki przy 300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    9. Odlać nadosad i resuspendować komórki w RPMI-10.
    10. Policzyć mononuklearne komórki szpiku kostnego za pomocą odpowiedniej metody liczenia komórek i upewnić się, że żywotność wynosi >90%, np. poprzez barwienie błękitem trypanu.
    11. Dostosować stężenie w jednej alikwocie do 5 × 106 komórek/mL dla testów ELISpot specyficznych dla antygenu. Dostosować stężenie w drugiej alikwocie do 1 × 106 komórek/mL dla testów ELISpot całkowitej immunoglobuliny.

3. Wysiewanie i inkubacja komórek

  1. Wysiewanie płytek do oznaczania całkowitej ilości immunoglobulin
    1. Usuń medium blokujące z płytek 1 i 3, szybko odwracając każdą płytkę nad pojemnikiem na odpady. Mocno uderz odwróconymi płytkami o papier chłonny, aby usunąć pozostałości medium.
    2. Dodaj 100 µL RPMI-10 do każdego dołka w pierwszym rzędzie oraz 133 µL RPMI-10 do każdego dołka w drugim i trzecim rzędzie. Próbki należy przygotować w duplikatach technicznych.
    3. Dodaj 100 µL zawiesiny PBMC (1 × 106 cells/mL) do pierwszego dołka każdej kolumny na płytce 1. Rozmieść próbki zgodnie z układem płytki [np. dołki A1–A6 dla makaka rezusa 1 (RM1) i A7–A12 dla makaka rezusa 2 (RM2)].
    4. Dodaj 100 µL zawiesiny komórek szpiku kostnego (1 × 106 cells/mL) do pierwszego dołka każdej kolumny na płytce 3. Rozmieść próbki zgodnie z układem płytki.
    5. Przygotuj trzykrotne rozcieńczenia seryjne, przenosząc 67 µL z jednego dołka do następnego i dokładnie mieszając po każdym transferze. Kontynuuj rozcieńczanie seryjne w wyznaczonych dołkach, a następnie odrzuć ostatnie 67 µL, aby zachować końcową objętość 133 µL na dołek.
    6. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO2.
      ​UWAGA: Unikaj przesuwania lub poruszania płytkami podczas inkubacji, aby zapobiec powstawaniu podwójnych plamek.
  2. Wysiewanie płytek do oznaczania swoistych antygenów
    1. Usuń DPBS z płytek 2 i 4, szybko odwracając każdą płytkę nad pojemnikiem na odpady. Mocno uderz odwróconymi płytkami o papier chłonny, aby usunąć pozostałości buforu.
    2. Dodaj 100 µL RPMI-10 do każdego dołka w pierwszym rzędzie oraz 133 µL RPMI-10 do każdego dołka w drugim i trzecim rzędzie.
    3. Dodaj 100 µL zawiesiny PBMC (5 × 106 cells/mL) do pierwszego dołka każdej kolumny na płytce 2. Dodaj próbki zgodnie z układem płytki.
    4. Dodaj 100 µL zawiesiny komórek szpiku kostnego (5 × 106 cells/mL) do pierwszego dołka każdej kolumny na płytce 4. Dodaj próbki zgodnie z układem płytki.
    5. Przygotuj trzykrotne rozcieńczenia seryjne, przenosząc 67 µL z jednego dołka do następnego i dokładnie mieszając po każdym transferze. Kontynuuj rozcieńczanie seryjne w wyznaczonych dołkach, a następnie odrzuć ostatnie 67 µL, aby zachować końcową objętość 133 µL na dołek.
    6. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO2.
      UWAGA: Unikaj zakłócania pracy inkubatora podczas inkubacji, ponieważ wibracje mogą powodować powstawanie podwójnych plamek lub artefaktów w kształcie ogona komety.

4. Obróbka płytek ELISpot

  1. Opracowanie płytek dla całkowitej zawartości immunoglobulin
    1. Wyjąć płytki z inkubatora po około 18 h inkubacji.
    2. Usunąć komórki i pożywkę hodowlaną poprzez szybkie odwrócenie każdej płytki nad pojemnikiem na odpady zawierającym 10% wybielacz. Odwrócone płytki mocno otrzepać o papier chłonny, aby usunąć pozostałą ciecz.
      UWAGA: Pozostałe etapy opracowania przeprowadzać w warunkach niejałowych.
    3. Przemyć każdą płytkę czterokrotnie, używając 200 µL/well DPBS zawierającego 0,05% Tween 20.
      UWAGA: Pozostawić końcowy bufor płuczący w dołkach, aby zapobiec wysychaniu membran.
    4. Alternatywnie, w przypadku opracowywania dużej liczby płytek, przemyć je za pomocą automatycznego myjki do mikropłytek.
    5. Przygotować roztwór przeciwciał detekcyjnych poprzez rozcieńczenie znakowanych biotyną przeciwciał anty-IgG i anty-IgM małpy w stosunku 1:1 000 oraz znakowanego biotyną przeciwciała anty-IgA małpy w stosunku 1:500 w DPBS zawierającym 0,05% Tween 20 i 1% FBS.
    6. Usunąć końcowy bufor płuczący, otrzepując płytki o papier chłonny. Dodać 100 µL/well rozcieńczonego przeciwciała anty-IgG do kolumn 1 i 2 oraz 7 i 8, przeciwciała anty-IgM do kolumn 3 i 4 oraz 9 i 10, a przeciwciała anty-IgA do kolumn 5 i 6 oraz 11 i 12.
      UWAGA: Opracowywać jedną płytkę na raz, aby zapobiec wysychaniu membran.
    7. Inkubować płytki przez 2 h w temperaturze pokojowej.
    8. Usunąć roztwór przeciwciał detekcyjnych i przemyć płytki czterokrotnie DPBS zawierającym 0,05% Tween 20.
    9. Przygotować koniugat enzymatyczny poprzez rozcieńczenie HRP-awidyny w stosunku 1:1 000 w DPBS zawierającym 0,05% Tween 20 i 1% FBS.
    10. Dodać 100 µL/well rozcieńczonej HRP-awidyny do każdego dołka. Inkubować płytki przez 2 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    11. Usunąć roztwór HRP-awidyny i przemyć płytki czterokrotnie DPBS zawierającym 0,05% Tween-20.
      ​UWAGA: Pozostawić końcowy bufor płuczący w dołkach aż do zakończenia rozwoju substratu.
  2. Opracowanie płytek swoistych dla antygenu
    UWAGA: Procedura jest analogiczna do tej stosowanej dla płytek dla całkowitej zawartości immunoglobulin. Należy jednak przeprowadzić wszystkie etapy płukania przy użyciu DPBS bez Tween 20, aby zachować powłokę GNL.
    1. Wyjąć płytki z inkubatora po około 18 h inkubacji.
    2. Usunąć komórki i pożywkę hodowlaną poprzez szybkie odwrócenie każdej płytki nad pojemnikiem na odpady zawierającym 10% wybielacz. Odwrócone płytki mocno otrzepać o papier chłonny, aby usunąć pozostałą ciecz.
      UWAGA: Pozostałe etapy opracowania przeprowadzać w warunkach niejałowych.
    3. Przemyć każdą płytkę czterokrotnie, używając 200 µL/well DPBS.
      UWAGA: Pozostawić końcowy bufor płuczący w dołkach, aby zapobiec wysychaniu membran.
    4. Przygotować roztwór przeciwciał detekcyjnych poprzez rozcieńczenie znakowanych biotyną przeciwciał anty-IgG i anty-IgM małpy w stosunku 1:1 000 oraz znakowanego biotyną przeciwciała anty-IgA małpy w stosunku 1:500 w DPBS zawierającym 1% FBS.
    5. Usunąć końcowy bufor płuczący, otrzepując płytki o papier chłonny. Dodać 100 µL/well rozcieńczonego przeciwciała anty-IgG do kolumn 1 i 2 oraz 7 i 8, przeciwciała anty-IgM do kolumn 3 i 4 oraz 9 i 10, a przeciwciała anty-IgA do kolumn 5 i 6 oraz 11 i 12.
      UWAGA: Opracowywać jedną płytkę na raz, aby zapobiec wysychaniu membran.
    6. Inkubować płytki przez 2 h w temperaturze pokojowej.
    7. Usunąć roztwór przeciwciał detekcyjnych i przemyć płytki czterokrotnie, używając 200 µL/well DPBS.
    8. Przygotować koniugat enzymatyczny poprzez rozcieńczenie HRP-awidyny w stosunku 1:1 000 w DPBS zawierającym 1% FBS.
    9. Dodać 100 µL/well rozcieńczonej HRP-awidyny do każdego dołka. Inkubować płytki przez 2 h w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    10. Usunąć roztwór HRP-awidyny i przemyć płytki czterokrotnie, używając 200 µL/well DPBS.
      UWAGA: Pozostawić końcowy bufor płuczący w dołkach aż do zakończenia rozwoju substratu.
  3. Automatyczne płukanie (opcjonalnie)
    1. Przygotować automatyczną myjkę do mikropłytek, napełniając ją DPBS zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wybrać zdefiniowany program płukania ELISpot i przeprowadzić wszystkie etapy płukania przy użyciu DPBS.
      UWAGA: Używać DPBS do wszystkich automatycznych płukań, aby wyeliminować konieczność wielokrotnego napełniania urządzenia różnymi buforami płuczącymi.
    3. Dla myjki do mikropłytek zastosować ustawienia wymienione w  tabeli 1.

5. Detekcja

  1. Przygotowanie roztworu substratu
    1. Przygotuj roboczy substrat AEC bezpośrednio przed użyciem, dodając jedną kroplę roztworu chromogenu do każdego 1 mL roztworu substratu. Wymieszaj dokładnie za pomocą wortexa.
      UWAGA: Przygotuj około 40 mL roboczego substratu dla czterech płytek 96-dołkowych.
  2. Wywoływanie płytek ELISpot w temperaturze pokojowej
    1. Przetwarzaj jedną płytkę na raz. Odlej końcowy bufor piorący i natychmiast dodaj 100 µL/well roboczego substratu AEC.
    2. Monitoruj wizualnie wywoływanie plamek, aż pojawią się wyraźne czerwone plamki, zazwyczaj w ciągu 2–4 min.
      OSTRZEŻENIE: Nie doprowadzaj do prześwietlenia płytek, ponieważ nadmierne wywoływanie zwiększa tło i pogarsza rozdzielczość plamek.
    3. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dokładnie płucząc płytkę pod bieżącą wodą z kranu.
    4. Przepłucz płytkę od czterech do pięciu razy wodą z kranu. Usuń nadmiar wody za pomocą chłonnych ręczników papierowych.
    5. Zdejmij odpływ z dna płytki i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu przez około 24 h przed zliczeniem plamek.
      UWAGA: Zatrzymaj reakcję natychmiast po pojawieniu się plamek w dołkach zawierających najwyższe stężenia komórek, aby uniknąć prześwietlenia.
    6. Powtórz kroki 5.2.1–5.2.5 dla każdej z pozostałych płytek.

6. Kwantyfikacja plamek

  1. Pozyskiwanie obrazów ELISpot
    1. Przeskanuj każdą płytkę za pomocą czytnika ELISpot wyposażonego w oprogramowanie do akwizycji obrazów.
    2. Wybierz odpowiedni szablon płytki, zdefiniuj analizowane studzienki i wykonaj akwizycję obrazów zgodnie z instrukcjami oprogramowania.
    3. Zapisz surowe dane i wyeksportuj obrazy płytek w formacie TIFF do celów archiwalnych.
  2. Zliczanie komórek wydzielających przeciwciała
    1. Przejrzyj zautomatyzowane wyniki zliczania plamek dla każdej studzienki.
    2. Zweryfikuj ręcznie każdą studzienkę, aby zidentyfikować błędnie połączone lub rozdzielone plamki. W razie potrzeby zaznaczaj poszczególne plamki ręcznie, aby uzyskać dokładne wyniki.
      UWAGA: Zaleca się weryfikację ręczną, ponieważ duże plamki mogą zostać policzone wielokrotnie przez oprogramowanie do zautomatyzowanej analizy.
    3. Zapisz liczbę plamek wraz z odpowiadającymi im czynnikami rozcieńczenia w arkuszu kalkulacyjnym, jak opisano w Tabeli 2.
    4. Przeanalizuj studzienki powtórzone osobno dla IgG, IgM i IgA przed obliczeniem średniej liczby plamek dla każdego rozcieńczenia.
    5. Oblicz liczbę komórek wydzielających przeciwciała na milion wprowadzonych komórek, mnożąc średnią liczbę plamek przez odpowiedni czynnik rozcieńczenia.
      UWAGA: Stosuj czynniki rozcieńczenia 15×, 45× i 135× dla testów całkowitej zawartości immunoglobulin oraz 3×, 9× i 27× dla testów specyficznych dla antygenu.
    6. Wszystkie obliczenia wykonaj w programie do arkuszy kalkulacyjnych, a wykresy wygeneruj przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym teście ELISpot dla limfocytów B, komórki wydzielające przeciwciała (ASCs) wykrywano przy użyciu CH505 SOSIP, rozpuszczalnego trimeru glikoproteiny otoczki (Env) HIV-1, jako antygenu powlekającego w badaniu nad szczepionką mającej na celu wywołanie szeroko neutralizujących przeciwciał (bnAbs) przeciwko HIV-1. Rycina 1 przedstawia układ płytki ELISpot zastosowany do ilościowego oznaczenia całkowitej oraz swoistej dla antygenu liczby ASCs na osobnych płytkach. Układ ten identyfikuj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

ELISpot dla limfocytów B to czuła metoda wykrywania całkowitej immunoglobulin oraz odpowiedzi komórek wydzielających przeciwciała (ASC) specyficznych dla antygenu w komórkach krwi, osocza i szpiku kostnego8,9,10,11. Kilka etapów jest krytycznych dla zapewnienia powtarzalności protokołu. Po pierwsze, membrany powinny zostać precyzyjnie pokryte optymalnym stężeniem przeciwciała wychwytującego. Bl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować zwierzętom oraz personelowi opiekuńczemu w Keeling Center for Comparative Medicine and Research za sprawowaną opiekę, a także wielu byłym członkom zespołu i współpracownikom za sukcesywne ulepszanie procedury. Finansowanie tego projektu szczepionki przeciw HIV u NHP zapewniły granty NIH 5R01AI183472 dla MBZ oraz R24OD010947 dla FJV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor lizujący ACKQuality Biological118-156-101500 ml
Sito µmFisher22363548Sterylne sito do komórek, pasujące do probówek stożkowych 50 mL
Substrat roboczy AECBD Biosciences551951Odczynniki na 10 płytek
Analiza: ExcelMicrosoft officeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel dla Microsoft 365
Analiza: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Przeciwciało anty-Rhesus IgA biotynilowaneNHPRRAB-3086851liofilizowane
Przeciwciało anty-małpie IgG biotynilowaneRocklandP/N 617-106-012liofilizowane
Przeciwciało anty-małpie IgM biotynilowaneRocklandP/N 617-106-007liofilizowane
Medium blokująceOdczynniki przygotowane w laboratoriumformułowane wewnętrznieRPMI-10
Bufor do rozcieńczania przeciwciał wtórnych i HRPOdczynniki przygotowane w laboratoriumformułowane wewnętrznie1X DPBS z 1% FBS
Wirówka Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, Rok produkcji: 2013, rotor TX-750 i 75003608 (koszyk okrągły)
Bufor do powlekaniaOdczynniki przygotowane w laboratoriumformułowane wewnętrznie1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
Płytki ELISpotMillipore SigmaMSHAN4B50opakowanie 50 płytek
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL niekonjugowanyVector LaboratoriesL-1240-5liofilizowane
Peroksydaza chrzanowa (HRP) - AwidynaVector LaboratoriesA-20045 mg/ml gotowy do użycia
Czytnik Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpotMabtech ABP/N: 2000Zautomatyzowany system obrazowania i analizy dla testów ELISpot i Fluorospot
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122100X
Myjka do płytekBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRSMyjka do mikropłytek 405 TS
RPMI-10Odczynniki przygotowane w laboratoriumformułowane wewnętrznieRPMI-1640 + 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween 20Sigma Life sciencesP7949500 ml
Niekonjugowane poliklonalne przeciwciała kozie anty-małpie IgG+IgA+IgM IgG/IgM/IgALS-BioC347340liofilizowane
Bufor do mycia (płytki specyficzne dla antygenu)Odczynniki przygotowane w laboratoriumformułowane wewnętrznie(wyłącznie DPBS 1X)
Bufor do mycia (płytki Ig całkowite)Odczynniki przygotowane w laboratoriumformułowane wewnętrznie(DPBS 1X + 0,05% Tween 20)

Bibliografia

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
  3. Sahay B, Aranyos AM, McAvoy A, Yamamoto JK. Utilization of Feline ELISpot to Evaluate the Immunogenicity of a T Cell-Based FIV MAP Vaccine. Methods Mol Biol. 2018;1808:197-219.
  4. Silveira EL, et al. Vaccine-induced plasmablast responses in rhesus macaques: Phenotypic characterization and a source for generating antigen-specific monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2015;416:69-83.
  5. Arunachalam PS, et al. A comparative immunological assessment of multiple clinical-stage adjuvants for the R21 malaria vaccine in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2024;16(758):eadn6605.
  6. Kasturi SP, et al. 3M-052, a synthetic TLR-7/8 agonist, induces durable HIV-1 envelope-specific plasma cells and humoral immunity in nonhuman primates. Sci Immunol. 2020;5(48):eabb1025.
  7. Kasturi SP, et al. Adjuvanting a Simian Immunodeficiency Virus Vaccine with Toll-Like Receptor Ligands Encapsulated in Nanoparticles Induces Persistent Antibody Responses and Enhanced Protection in TRIM5alpha Restrictive Macaques. J Virol. 2017;91(4):e01844-16.
  8. Shah HB, Koelsch KA. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods Mol Biol. 2015;1312:419-426.
  9. Czerkinsky CC, et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):109-121.
  10. Saletti G, et al. Enzyme-linked immunospot assays for direct ex vivo measurement of vaccine-induced human humoral immune responses in blood. Nat Protoc. 2013;8(6):1073-1087.
  11. Walsh PN, et al. Optimization and qualification of a memory B-cell ELISpot for the detection of vaccine-induced memory responses in HIV vaccine trials. J Immunol Methods. 2013;394(1-2):84-93.
  12. Brunner C, et al. Cell-based ELISpot protocol to detect and quantify antigen-specific antibody-secreting cells in murine whole-organ single-cell suspensions. STAR Protoc. 2025;6(3):103797.
  13. Rouers A, Tay MZ, Ng LFP, Renia L. B-cell ELISpot assay to analyze human memory B cell and plasmablast responses specific to SARS-CoV-2 receptor-binding domain. STAR Protoc. 2023;4(1):102130.
  14. Tian C, et al. Use of ELISpot assay to study HBs-specific B cell responses in vaccinated and HBV-infected humans. Emerg Microbes Infect. 2018;7(1):16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krew obwodowaimmunogenność szczepionkiodpowiedź plazmablastycznakomórki plazmatycznestrategia immunizacjiprzedkliniczne badania nad szczepionkami

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.