Artykuł metodologiczny

Znormalizowany schemat postępowania w obrazowaniu wysokotreściowym i przetwarzaniu danych

35 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71863

⸱

21 sierpnia 2026

 ,  , 
1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół standaryzowanego obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging) oraz przetwarzania danych z komórek barwionych jodkiem propidyny (PI)/Hoechst 33342 w celu przeprowadzenia powtarzalnej analizy żywotności komórek z wykorzystaniem zautomatyzowanych schematów akwizycji i analizy obrazu.

Streszczenie

Aby rozwiązać problemy związane z niską powtarzalnością wynikającą z różnic operacyjnych w obrazowaniu badawczym oraz trudnościami w analizie dużej liczby próbek za pomocą konwencjonalnych metod, przedstawiamy protokół barwienia komórek HT22 za pomocą PI i Hoechst 33342, a następnie obrazowania i analizy danych z wykorzystaniem systemu obrazowania High-Content. Celem tego schematu postępowania jest ustalenie stabilnych parametrów ustawień obrazowania oraz rygorystycznych standardów kontroli jakości. Zaprezentowano ustawienia obrazowania instrumentu oraz przepływ pracy dla trzech różnych metod przetwarzania obrazów dostarczonych przez urządzenie: Multi-Wavelength Cell Scoring (Multi), Live-Dead (Live) oraz Custom Module Editor (CME). Metody przetwarzania obrazów zostały porównane i zwalidowane względem tradycyjnej metody, ImageJ, aby zapewnić ich skuteczność. Badanie to podsumowuje w końcowy sposób schemat wykorzystania systemu obrazowania High-Content do określania żywotności komórek przy użyciu metody podwójnego barwienia PI i Hoechst. Poprzez standaryzację całego procesu obrazowania i przetwarzania danych, badanie znacząco zwiększa powtarzalność i wiarygodność obrazowania w badaniach naukowych, zapewniając tym samym solidne wsparcie metodologiczne dla porównywania danych między laboratoriami i przyczyniając się do rozwoju badań naukowych.

Wprowadzenie

System obrazowania wysokiej treści (High-Content Imaging System) stanowi kluczowe narzędzie w nowoczesnych badaniach naukowych, umożliwiając szybkie obrazowanie oraz wieloparametrową ocenę komórek uszkodzonych i nieuszkodzonych1,2,3. Odgrywa on niezastąpioną rolę w różnych dyscyplinach. W naukach o życiu pomaga badaczom w eksploracji mikroskopijnego świata komórek i tkanek4,5. Na przykład precyzyjna detekcja znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek i struktur wewnątrzkomórkowych pozwala na wyraźną wizualizację drobnych struktur komórkowych oraz zmian dynamicznych6. W badaniach z zakresu neuronauki system ten może być wykorzystywany do obrazowania trójwymiarowego neuronów, co wspomaga analizę złożonych połączeń i mechanizmów transdukcji sygnałów w sieciach neuronalnych, dostarczając kluczowych wskazówek do zrozumienia funkcji mózgu oraz patogenezy chorób neurologicznych7,8,9.

Pomimo znaczących zalet technologii systemów obrazowania wysokotreściowego (High-Content Imaging System), proces obrazowania wciąż obarczony jest kilkoma problemami. Na etapie przygotowania próbek występuje wysoki stopień subiektywizmu. W przygotowaniu próbek biologicznych procesy takie jak manipulacja komórkami i barwienie nie posiadają odpowiednich standardów. W odniesieniu do parametrów obrazowania zauważalne są różnice w czasach ekspozycji oraz doborze płytek wielodołkowych pomiędzy laboratoriami i modelami mikroskopów wysokotreściowych. W fazie przetwarzania danych brakuje standaryzacji – od redukcji szumów i regulacji kontrastu obrazów surowych, po identyfikację parametrów i wyznaczanie cech docelowych. Problemy te prowadzą bezpośrednio do błędów systematycznych w wynikach obrazowania mikroskopowego, co wywołuje kryzys powtarzalności.

Protokół

W niniejszym protokole wykorzystano komercyjną linię komórkową (HT22, ATCC); badanie nie obejmowało udziału ludzi ani pierwotnych tkanek ludzkich. W badaniu nie wykorzystano zwierząt.

1. Standaryzacja przygotowania próbek

  1. Przygotowanie komórek HT22
    1. Gdy konfluencja komórek HT22 osiągnie 80%10,11, usunąć stare medium. Do odrywania komórek użyć 0,25% trypsyny, inkubując przez 1–2 min w temperaturze pokojowej.
    2. Aby zatrzymać proces odrywania, dodać podłoże DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) w objętości 3-krotnie większej niż objętość 0,25% trypsyny. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówki o pojemności 15 mL.
    3. Wirować przy 175 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsącz. Resuspender komórki w kompletnym DMEM, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
    4. Policzyć komórki za pomocą komory do liczenia komórek. Wysiać 5 000 komórek na studzienkę w 100 µL kompletnego medium do płytki 96-dołkowej12.
    5. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 24 h. Przeprowadzić operacje grupowania próbek, dawkowania i barwienia w płytce 96-dołkowej zgodnie z planem eksperymentalnym.
      ​UWAGA: Należy użyć płytki 96-dołkowej kompatybilnej z systemem obrazowania. Wybrać płytkę o odpowiedniej grubości i geometrii dna, zgodnie ze specyfikacją producenta. W przypadku zapotrzebowania na wyższą jakość obrazu zaleca się stosowanie płytek z dnem szklanym (grubość dna 130–170 µm)13,14,15,16.
  2. Procedura barwienia
    1. Upewnić się, że komórki tworzą pojedynczą, dobrze rozproszoną warstwę i nie przekraczają 70% konfluencji, aby zminimalizować nakładanie się komórek (Rycina 1B).
    2. Pogrupować próbki zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi i przystąpić do barwienia po zakończeniu traktowania. Przygotować robocze roztwory barwników o końcowym stężeniu 6,684 µg/mL dla PI oraz 10 µg/mL dla Hoechst 3334217,18.
    3. Usunąć stare medium z płytki 96-dołkowej i dwukrotnie przemyć każdą studzienkę 100 µL PBS. Dodać roboczy roztwór barwnika i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min w celu zabarwienia.
    4. Dwukrotnie przemyć każdą studzienkę 100 µL PBS, a następnie dodać DMEM.
      UWAGA: Różne plany eksperymentalne mogą wiązać się ze zmiennością parametrów nakładania próbek i barwienia.

2. Specyfikacje obrazowania i ustawienia parametrów

  1. Standardy parametrów obrazowania
    ​UWAGA: Niniejsze badanie przedstawia jedynie schemat obrazowania w szerokim polu (widefield) dla instrumentu po barwieniu PI i Hoechst 33342.
    1. Włącz instrument, a następnie uruchom komputer. Otwórz oprogramowanie analityczne dostarczone z urządzeniem.
    2. Włóż płytkę 96-dołkową do instrumentu. Wybierz pole widzenia z próbkami do obrazowania.
    3. W ustawieniach obiektywu i kamery (Objective and Camera settings) ustaw powiększenie (Magnification) na „20XPh1SPlanFluorELWDADM” (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), binowanie kamery (Camera binning) na „2” oraz tryb akwizycji (Acquisition Mode) na „Widefield”.
    4. W trybie płytki (plate mode) wybierz odpowiednie parametry dla płytki 96-dołkowej i dostosuj parametry płytki zgodnie z danymi o rozmiarze produktu.
    5. W opcjach lokalizacji (Site Option) zazwyczaj wybierz 9 pól na dołek dla gęstego obrazowania. W opcjach autofokusa (Autofocus options) zaznacz Enable laser-based focusing (Włącz ustawianie ostrości w oparciu o laser).
    6. Dostosuj parametry laserowego autofokusa w sekcji Autofocus na podstawie średniej grubości dna płytki zmierzonej w co najmniej trzech dołkach z próbkami. Odpowiednio dostosuj parametry Bottom thickness, Bottom thickness max variation, Adjacent well max variation, Intra-well max variation oraz Plate max variation.
    7. W sekcji Wavelengths ustaw liczbę długości fal (Number of wavelengths) na 3. Dla pierwszego oświetlenia (Illumination) wybierz DAPI. W sekcji Shading Correction wybierz „Auto Correction for FL” (Rycina 2B).
    8. Po znalezieniu obrazu ustaw początkowy czas ekspozycji (Exposure (ms)) na 20–30. Obserwuj przechwycone obrazy i na bieżąco dostosowuj ekspozycję, aby uzyskać umiarkowaną intensywność fluorescencji bez prześwietlenia, a głębokość bitową ustaw na 16 (Rycina 2A).
    9. Wybierz Laser z z-offset dla regulacji ostrości. Jeśli obraz nie jest ostry, zaznacz Use Z stack, kliknij Calculate Offset i wybierz odpowiednią odległość ogniskową. Zaznacz Digital Confocal (info) i ustaw parametry regulacji dla Increase Sharpness oraz Reduce Noise na 0,200.
      UWAGA: Jeśli ekspozycja lub przejrzystość obrazu nie jest satysfakcjonująca, dostosuj ekspozycję i ponownie oblicz parametry offsetu.
    10. Dla drugiego oświetlenia wybierz Cy3. Zastosuj te same ustawienia, co w krokach 2.1.7–2.1.9.
    11. Dla trzeciego oświetlenia wybierz TL 25. Zastosuj te same ustawienia, co w krokach 2.1.7–2.1.9.
      UWAGA: Ustaw korekcję cieniowania (Shading correction) w zależności od kanału; dla TL 25 należy wybrać Auto Correction for TL. W sekcji Wavelengths kanał TL musi być ustawiony do pozycjonowania komórek i obserwacji morfologicznej.
    12. W karcie Run nazwij płytkę zgodnie z konwencją nazewnictwa: nazwa płytki-typ komórek-ID eksperymentu-data-powiększenie obiektywu-typ obrazowania. Potwierdź parametry powiązane z kanałami obrazowania w sekcji Description.
    13. Kliknij Acquire Plate, aby rozpocząć obrazowanie. Po zakończeniu obrazowania wyłącz kolejno oprogramowanie, instrument i komputer.
      ​UWAGA: Następnie komputer może być uruchamiany wyłącznie w celu eksportu obrazów, przetwarzania danych i analizy wyników.
  2. Standardy i wymagania dotyczące operacji obrazowania
    1. Wyśrodkuj pole widzenia na dołku, aby uniknąć efektów brzegowych (Rycina 1A). Podczas konfiguracji parametrów obrazowania jako punkt odniesienia wykorzystaj kontrolę pozytywną o najwyższej intensywności fluorescencji. Dodatkowo podczas ustawiania ostrości wybierz pole widzenia z pojedynczą warstwą komórek, czyste i wolne od zanieczyszczeń.
    2. W przypadku kamery ściśle kontroluj wartości pikseli, aby pozostały poniżej 60000 (wartość maksymalna wynosi 65535), co zapobiegnie nasyceniu, które może spowodować trwałą utratę informacji. Jeśli pojawią się nasycone jasne punkty lub obszary, skróć czas ekspozycji. Jednocześnie nie ustawiaj czasu ekspozycji zbyt nisko, w przeciwnym razie szum będzie dominował w obrazie.
    3. W przypadku słabych sygnałów fluorescencyjnych priorytetowo traktuj niewielkie zwiększenie ekspozycji zamiast gwałtownego podnoszenia parametrów, aby uniknąć nieodwracalnych uszkodzeń spowodowanych fotoblaknięciem.
      UWAGA: W przypadku obrazowania w jasnym polu zasady te mogą być odpowiednio złagodzone, jednak głównym celem pozostaje integralność sygnału i ochrona próbki.
    4. Upewnij się, że kontury krawędzi próbki są wyraźnie rozróżnialne i że wewnętrzne struktury drobne (takie jak ziarnistości, włókna, organella) mają wyraźną teksturę, nie są rozmyte, a rozproszone światło tła jest równomiernie rozmieszczone, bez lokalnych jasnych punktów lub rozmytych aureoli. Ściśle unikaj przeostrzania i niedostatecznego ustawienia ostrości.
    5. Upewnij się, że istnieją grupy normalne, pozytywne, negatywne i eksperymentalne oraz że każda grupa terapeutyczna posiada co najmniej 3 równoległe dołki. Zaleca się rozmieszczenie dołków równoległych w pionie.

3. Przetwarzanie i analiza obrazu

UWAGA: Niniejszy dokument opisuje trzy metody przetwarzania obrazów dostępne w oprogramowaniu towarzyszącym instrumentowi, z których każda jest odpowiednia dla protokołu barwienia zastosowanego w niniejszym badaniu. Choć metody te opierają się na tej samej zasadzie rozpoznawania, różnią się one konkretnymi technikami przetwarzania oraz rodzajami uzyskanych wyników danych. Schemat przetwarzania obrazów przebiegał w następujący sposób: Otwórz plik → Załaduj oryginalny obraz z odpowiednią metodą przetwarzania → Ustaw odpowiednie parametry kanałów → Wygeneruj maskę → Ustaw typ danych pomiarowych w sekcji Measure → Uruchom analizę → Przejrzyj wyniki → Eksportuj dane.

  1. Otwórz oprogramowanie analityczne dostarczone z urządzeniem → Review Plate → Select Plate.
  2. W widoku Date wybierz Well arrangement i wybierz pole widzenia z grupy pozytywnej jako referencyjne.
  3. W sekcji Run Analysis wybierz odpowiedni program przetwarzania i ustaw parametry przetwarzania obrazu lub wyeksportuj obraz.
  4. Po ustawieniu i zapisaniu parametrów wybierz Run on all wells/ Run on selections/ Run on displayed site w zależności od obiektu ustawień parametrów.
  5. Po zakończeniu przetwarzania danych przez komputer, w zakładce Measurements, wybierz odpowiedni program przetwarzania danych w sekcji Analysis i wybierz różne wyniki pomiarów w sekcji Measurement, aby sprawdzić dane.
  6. Kliknij Open Log, aby rozpocząć eksport danych. W ustawieniach parametrów dla trzech metod przetwarzania obrazu określ następujące szczegóły:
    1. Pierwsza metoda przetwarzania obrazu: Multi-Wavelength Cell Scoring
      1. Wybierz program Multi-Wavelength Cell Scoring i skonfiguruj ustawienia. Ustaw Number of wavelengths. W sekcji Algorithm wybierz Standard.
      2. Ustaw parametry rozpoznawania dla wszystkich jąder na podstawie wyników barwienia PI. Domyślnym obrazem W1 Source jest kanał DAPI.
      3. Ustaw Approximate min width na 8–10 µm oraz Approximate max width na 30–35 µm, w zależności od wielkości poszczególnych obiektów do rozpoznania.
      4. Ustaw intensity above local background na 2 000–10 000 poziomów szarości. Użyj funkcji Preview, aby przetestować i dostosować ustawienia na podstawie wyników rozpoznawania.
      5. Ustaw parametry W2 na podstawie wyników barwienia Hoechst 33342. Nazwij ten kanał. Obrazem W2 Source jest Cy3.
      6. W sekcji Stained area wybierz obszar zabarwiony przez ten kanał jako Nucleus. W kolejnych ustawieniach postępuj zgodnie z krokami 3.6.1.3–3.6.1.4. W sekcji Configure Summary Log lub Configure Data Log (Cells) wybierz odpowiednią konfigurację parametrów (Parameter configuration) w zależności od pożądanych parametrów wyniku.
        UWAGA: Zazwyczaj Configure Summary Log służy do ustawienia wymaganych typów danych, natomiast Configure Data Log (Cells) jest używany, gdy wymagane jest specjalne znakowanie poszczególnych komórek.
      7. Wykonaj Test Run, aby zaobserwować proces rozpoznawania. Jeśli wyniki rozpoznawania są satysfakcjonujące, zapisz ustawienia.
    2. Druga metoda przetwarzania obrazu: Live-Dead
      1. Wybierz program Live-Dead i rozpocznij konfigurację ustawień. Sekwencyjnie ustaw Wavelength 1 Parameters oraz Wavelength 2 Parameters.
      2. W sekcji Wavelength 1 Parameters ustaw Wavelength 1 Source na DAPI. Domyślnym parametrem Algorithm jest „Standard”.
      3. Na podstawie warunków barwienia ustaw Stained cell type na All Cells oraz Stained area na Nucleus. Ustaw Approximate min width, Approximate max width oraz intensity above local background, stosując te same ustawienia co w metodzie Multi-Wavelength Cell Scoring.
      4. Zaznacz Split touching objects i użyj funkcji Preview do testów.
      5. W sekcji Wavelength 2 Parameters ustaw Wavelength 2 Source na Cy3.
      6. Na podstawie specyficznego barwienia ustaw Stained cell type na Dead oraz Stained area na Nucleus. Ustaw Approximate min width, Approximate max width oraz intensity above local background, stosując te same ustawienia co w metodzie Multi-Wavelength Cell Scoring.
      7. Kliknij Configure Summary Log i wybierz konfigurację parametrów (Parameter configuration) na podstawie wymaganych typów danych. Wykonaj Test Run, aby zaobserwować proces rozpoznawania. Jeśli wyniki rozpoznawania są satysfakcjonujące, zapisz ustawienia.
    3. Trzecia metoda przetwarzania obrazu: tryb programisty CME
      1. Wybierz program Custom Module (CME) i rozpocznij konfigurację ustawień. Skonfiguruj Image Names oraz kanały.
        UWAGA: Aby ułatwić późniejsze ustawianie parametrów, zazwyczaj należy ustawić je zgodnie z nazwami kanałów używanymi podczas obrazowania.
      2. W sekcji Find Objects otwórz Simple Threshold, aby ustawić rozpoznawanie dla całego zestawu.
      3. Ustaw Source zgodnie z Image Name. Na podstawie 16-bitowego zakresu wartości skali szarości wpisz 0 w Threshold Low oraz 65535 w Threshold High.
      4. Nazwij wynik przetwarzania w polu Result, zatwierdź i zaobserwuj sposób znakowania. W sekcji Find Objects otwórz Find Blobs, aby wygenerować wynik Mask.
      5. Ustaw Source zgodnie z Image Name, tak jak w Simple Threshold. Ustaw Approximate min width, Approximate max width oraz intensity above local background zgodnie z ustawieniami Multi-Wavelength Cell Scoring.
      6. Nazwij wynik przetwarzania w polu Result, zatwierdź i zaobserwuj wynik znakowania. Dla wyniku rozpoznawania Find Blobs użyj narzędzia Modify Objects do filtrowania, powiększania (grow), pomniejszania (shrink) i odwracania (invert).
      7. W sekcji Measure ustaw Modified. W Measurement Inputs wprowadź 1 dla Standard Area Value i zaznacz Create Object Overlay.
      8. W sekcji Objects to Measure wybierz źródło zaznaczonych obiektów w Mask of Objects oraz obraz źródłowy do pomiaru w Image to Measure. Wybierz odpowiednią nazwę pomiaru (Measurement Name) na podstawie wymaganych parametrów wyniku przetwarzania, zatwierdź i zaobserwuj wynik rozpoznawania parametrów.
      9. Po potwierdzeniu ustawień parametrów zapisz konfigurację.
    4. Metoda ogólna: ImageJ
      ​UWAGA: Przeanalizuj wyniki obrazowania metodą ImageJ dla obrazów fluorescencyjnych19, a następnie przeprowadź analizę porównawczą z trzema metodami tego urządzenia.
      1. Otwórz oprogramowanie ImageJ. Import obrazu: File → Open → wybierz oryginalny obraz w skali szarości do analizy.
      2. Konwertuj obraz na 8 bitów: Image → Type → 8-bit. Rozpoznawanie wartości skali szarości: Image → Adjust → Threshold → Default, Red → zaznacz Dark background → Set → OK.
        UWAGA: Jeśli rozpoznawanie obszaru czerwonego jest niesatysfakcjonujące, zastąp opcję Default jednym z 16 wbudowanych modeli rozpoznawania ImageJ lub dostosuj suwak w oknie dialogowym.
      3. Ustaw parametry: Analyze → Set Measurements. W wyskakującym oknie dialogowym zaznacz Area, Mean gray value, Integrated density, Limit to threshold, Display label, Redirect to None (domyślnie) oraz wprowadź 2 dla Decimal places (0-9). Kliknij OK.
      4. Analiza wyników rozpoznawania: Analyze → Measure. Zapisywanie wyników: w wyskakującym oknie wyników File → Save As i wybierz miejsce zapisu.
  7. Eksport obrazów
    1. Wybierz wysokiej jakości pole widzenia z pozytywnej studzienki jako standard referencyjny.
      UWAGA: Podstawowe wymagania dotyczące jakości to autentyczność, dokładna ostrość, odpowiednia ekspozycja (16-bit) i odpowiedni kontrast (im wyższy stosunek sygnału do szumu, tym lepiej). Wymagania dla wysokiej jakości obejmują wyraźne cechy, kontrast, praktyczność, intuicyjne zmiany morfologiczne oraz podkreślenie kluczowych punktów.
    2. W sekcji Run Analysis wybierz ExportPro w części Analysis i uruchom Run Setup for Analysis. W Select output options wybierz Individual channel, Color overlay, shrink image (opcjonalnie) oraz Scale bar (opcjonalnie) w zależności od wymagań dotyczących obrazu.
    3. Wybierz obrazy z kanałów fluorescencyjnych do eksportu dla każdego pola widzenia. W Individual Channel wybierz kolor dla każdego kanału, np. Blue dla kanału DAPI i Monochrome dla kanału TL.
    4. W Color overlay wybierz kolejno kanały odpowiadające BRIGHTFIELD, RED, BLUE i GREEN (wybierz długość fali koloru dla nakładki kolorystycznej). Ustaw Number na 100; zaobserwuj obraz podglądu i zaakceptuj wynik podglądu.
    5. W sekcji output wybierz folder, w którym będą przechowywane wyeksportowane obrazy w Export to folder. Rozpocznij uruchamianie.
      UWAGA: Obrazy z tej samej partii nie mogą być eksportowane oddzielnie; partia obrazów to zbiór obrazów z czterech próbek bazowych: kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej, podstawowej grupy kontrolnej i docelowej grupy eksperymentalnej, wszystkich uzyskanych w całkowicie spójnych warunkach eksperymentalnych.
  8. Porównanie metod przetwarzania obrazu
    1. Wybierz 9 pól widzenia i porównaj tradycyjne ręczne liczenie komórek żywych i martwych z metodami Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME i ImageJ w celu policzenia komórek żywych, martwych oraz stosunku komórek martwych do żywych. Użyj programu GraphPad Prism w wersji 10.1 do przeprowadzenia jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) wraz z testem wielokrotnych porównań Tukeya, aby przeanalizować różnice.
    2. Wybierz 81 pól widzenia i porównaj różnice w liczeniu komórek, ich powierzchni i intensywności pomiędzy metodami Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME i ImageJ. Użyj programu GraphPad Prism w wersji 10.1 do przeprowadzenia jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) wraz z testem wielokrotnych porównań Tukeya, aby przeanalizować różnice.
      UWAGA: Eksperymenty z hodowlą komórkową i barwieniem muszą być przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Utylizuj ciecze odpadowe, końcówki i inne odpady eksperymentalne zgodnie z regulaminem laboratorium. Zapewnij pełną ochronę przez cały czas trwania eksperymentu.

Wyniki

Wpływ standaryzowanego przygotowania na jakość obrazowania

Parametry płytki skonfigurowano w taki sposób, aby instrument mógł niezawodnie zlokalizować warstwę obrazu komórek. Próbki przygotowane jako pojedyncza warstwa komórek o umiarkowanej konfluencji ułatwiły ustawienie ostrości obrazu przy różnych powiększeniach obiektywu oraz poprawiły rozpoznawanie obrazów i analizę ilościową. Ustandaryzowane przygotowanie próbek i zoptymalizowane parametry płytki skutecznie zminimalizowały efekty brzegowe, nakładanie się komórek oraz inne czynniki wpływające na niską jakość obrazowania (Rycina 1).

Porównanie funkcji metod obliczania obrazów

Do rozróżnienia komórek żywych i martwych zastosowano metodę podwójnego barwienia PI/Hoechst 342. Metody Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead oraz CME skutecznie przetworzyły te obrazy, identyfikując obiekty na podstawie intensywności fluorescencji i rozmiaru obiektu, podczas gdy program ImageJ identyfikował obiekty na podstawie wartości skali szarości. Wyniki znakowania uzyskane za pomocą tych metod były w целом porównywalne (Rycina 3A–E).

Metoda wielodługościowego zliczania komórek wymagała barwienia jąder w celu identyfikacji wszystkich komórek (Rysunek 4A). Może ona przetwarzać do 7 kanałów obrazowania i obliczać parametry, w tym liczbę komórek, powierzchnię oraz gęstość optyczną.

Metoda Live-Dead okazała się bardziej elastyczna niż metoda Multi-Wavelength Cell Scoring. Oba kanały oferują moduły do barwienia jąder, barwienia cytoplazmy lub łączonego barwienia jądrowo-cytoplazmatycznego w celu identyfikacji wszystkich komórek, komórek żywych lub martwych. Funkcja Split touching objects oddziela nakładające się obiekty, co umożliwia obliczenie liczby komórek, ich powierzchni oraz gęstości optycznej. Ponieważ jednak metoda ta przetwarzała wyłącznie dane dwukanałowe, była ona szczególnie odpowiednia dla testów żywotności komórek podwójnie barwionych PI/Hoechst 342 (Rycina 4B).

Metoda CME opierała się na zdefiniowanej przez użytkownika logice przetwarzania obrazów. Liczba przetwarzanych kanałów odpowiadała liczbie pozyskanych kanałów. Wyniki rozpoznawania były dopracowywane przy użyciu funkcji takich jak Fill Holes, Invert Objects, Grow Objects, Shrink Objects, Logical Operations, Remove Border Objects, Keep Marked Objects, Grow Objects without Touching, Mark Object Centers, Watershed, Remove Marked Objects oraz Filter Mask w celu wyeliminowania zanieczyszczeń i innych źródeł zakłóceń. Metoda ta umożliwiła również obliczenie wielu parametrów obiektów do analizy wielowymiarowej.

Program ImageJ nie przetwarzał wielu kanałów jednocześnie. W przypadku serii obrazów z istotnymi różnicami w tle konieczne było ręczne przetwarzanie i dostosowywanie progów, co zwiększało subiektywizm i ograniczało powtarzalność.

Analiza różnic w wynikach przetwarzania

Analiza porównawcza metod przetwarzania obrazów nie wykazała istotnych różnic w całkowitej liczbie komórek, liczbie martwych komórek ani w stosunku martwych komórek do wszystkich komórek pomiędzy metodami Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME, ImageJ oraz tradycyjnym liczeniem ręcznym w 9 polach widzenia (Rysunek 5A–C, Plik uzupełniający 1).

Podobnie, nie zaobserwowano istotnej różnicy w stosunku powierzchni martwych komórek do całkowitej powierzchni komórek pomiędzy metodami Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME oraz ImageJ. Jednakże, na podstawie danych uzyskanych z 81 pól widzenia, stwierdzono istotną różnicę w stosunku średniej intensywności fluorescencji komórek martwych do intensywności wszystkich komórek pomiędzy metodami Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead oraz CME (Rycina 5D–F).

Na podstawie tych wyników opracowano ustandaryzowany schemat pracy dla systemu obrazowania wysokotreściowego (Rysunek 6).

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, komórki barwione DAPI i Cy3, światło przechodzące, analiza komórkowa.
Rysunek 1Niska jakość wyników obrazowania. (APole widzenia znajduje się blisko krawędzi studzienki, co powoduje widoczność cieni rzucanych przez krawędź studzienki (w tym przypadku komórki BV2).BStrzałki a i b wskazują na nakładanie się komórek w kanale DAPI i kanale TL, przy nadmiernej konfluencji komórek, a nawet obecności drugiej warstwy lub niektórych komórek pływających.C) Pole widzenia jest pozbawione komórek; parametry płytki są nieprawidłowe; ostrość nie jest ustawiona na warstwie komórek lub komórki nie zostały zabarwione, co skutkuje brakiem obrazu w tym polu widzenia. Pasek skali = 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Konfiguracja mikroskopii fluorescencyjnej, barwienie DAPI, ustawienia akwizycji obrazów, analiza obrazowania komórek.
Rysunek 2Ustawienia parametrów obrazowania. (A) Strzałka a wskazuje ikonę głębi bitowej. (BStrzałka b wskazuje położenie funkcji korekcji cieniowania (Shading Correction). Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, należy kliknąć tutaj.

Klasyfikacja komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; schemat; wielokolorowy zestaw danych; identyfikacja typu komórek.
Rycina 3Wyniki dla tego samego pola widzenia zidentyfikowane za pomocą kilku metod. (A) Wyniki maski Multi-Wavelength Cell Scoring: obszary szare i czerwone reprezentują wszystkie jądra komórkowe zidentyfikowane w kanale DAPI, przy czym obszar czerwony reprezentuje jądra martwych komórek zidentyfikowane w kanale Cy3. (B) Wyniki maski Live-Dead: zielone i czerwone obszary reprezentują wszystkie jądra komórkowe zidentyfikowane w kanale DAPI, przy czym obszar czerwony odpowiada jądrom martwych komórek zidentyfikowanym w kanale Cy3. (C) wynik maski CME: obszary żółte i niebieskie reprezentują wszystkie jądra komórkowe zidentyfikowane w kanale DAPI, przy czym obszar niebieski odpowiada jądrom martwych komórek zidentyfikowanym w kanale Cy3. (D) Wynik maskowania w ImageJ dla barwienia DAPI. (E) Wynik maskowania w programie ImageJ dla kanału Cy3. Pasek skali = 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układy do wielodługościowego scoringu komórek; parametry detekcji jąder w analizie obrazowej.
Rysunek 4Strony z częściowymi ustawieniami parametrów. (A) Lokalizacja wskazana przez a pokazuje, że pierwszy kanał funkcji Multi-Wavelength Cell Scoring może zaznaczyć jedynie jądro komórkowe; (B) b i c wskazują, że Live-Dead może przetwarzać tylko dwa kanały, co umożliwia podwójne barwienie PI/Hoechst 342 w celu rozróżnienia komórek martwych i żywych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe analizy żywotności komórek; całkowita liczba komórek, liczba komórek martwych oraz stosunek tych wartości; porównawcze wyniki graficzne.
Rycina 5Różnice w wynikach przetwarzania obrazów fluorescencyjnych. (A) Różnice we wszystkich liczbach komórek pomiędzy pięcioma metodami przetwarzania. (B) Różnice w liczbie martwych komórek pomiędzy pięcioma metodami przetwarzania. (C) Różnice w stosunku liczby martwych komórek do wszystkich komórek pomiędzy pięcioma metodami przetwarzania. (D) Różnice w stosunku martwych komórek do wszystkich komórek pomiędzy czterema metodami przetwarzania. (E) Różnice w stosunku powierzchni martwych komórek do całkowitej powierzchni komórek pomiędzy czterema metodami przetwarzania. (F) Różnice w stosunku średniej intensywności fluorescencji komórek martwych do intensywności fluorescencji wszystkich komórek w czterech metodach obróbki. Wszystkie słupki błędów na wykresach reprezentują odchylenia standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat procesu obrazowania wysokotreściowego: inokulacja, podawanie leku, barwienie fluorescencyjne, przetwarzanie obrazu.
Rysunek 6Standardowa procedura operacyjna. Schemat blokowy podsumowujący ustandaryzowaną procedurę przygotowania próbek, barwienia fluorescencyjnego, obrazowania wysokotreściowego, przetwarzania obrazów, eksportu obrazów oraz analizy danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Surowe dane dla analizy liczby komórek, pola powierzchni i intensywności fluorescencji przedstawione na Rysunku 5.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Stosując metodę podwójnego barwienia PI i Hoechst do oceny żywotności komórek, urządzenie do analizy wysokotreściowej (high-content) może szybko i w sposób wysokoprzepustowy obliczyć żywotność komórek w tej samej serii, wykorzystując wbudowane moduły algorytmiczne. Metoda ta posiada szereg zalet, m.in. małą objętość próbki, niski koszt, minimalne uszkodzenie komórek, słabe wybielanie fluorescencji, odporność na gaszenie oraz możliwość rejestrowania wielu obrazów. Dodatkowo czas obrazowania płytki 96-dołkowej wynosi zazwyczaj zaledwie 30–45 min20.

W protokole eksperymentalnym, aby zapewnić wysoką jakość obrazowania, należy skupić się na następujących krokach: Po pierwsze, należy zapewnić odpowiednią gęstość wysiewu na płytce, aby uniknąć zbyt wysokiej gęstości komórek, która mogłaby całkowicie wypełnić obraz, lub zbyt niskiej gęstości, co mogłoby doprowadzić do wypłukania komórek podczas barwienia i przemywania. Po drugie, należy dokładnie wypłukać barwnik, aby zapobiec wpływowi pozostałości barwnika na obrazowanie. W przypadku komórek o słabej adhezji należy delikatnie i powoli dodawać oraz usuwać ciecz przed i po barwieniu, unikając dodawania pionowego. Płyn należy dodawać po ściance, aby zapobiec utracie komórek w centrum pola widzenia, zwracając szczególną uwagę na odrywanie się martwych komórek podczas testów żywotności. W razie potrzeby należy rozważyć wirowanie płytki z próbkami, aby zmniejszyć błędy eksperymentalne. Po trzecie, należy dobrać odpowiedni czas ekspozycji. Zbyt długa ekspozycja zwiększy całkowity czas obrazowania i może doprowadzić do przeoczenia okna detekcji, co potencjalnie spowoduje prześwietlenie niektórych komórek lub błędne rozpoznanie tła. Zbyt krótka ekspozycja może skutkować niepełnymi informacjami na obrazie i utratą charakterystycznych szczegółów.

Jeśli podczas obrazowania nie można uzyskać wyraźnego obrazu, należy przeanalizować przyczynę, biorąc pod uwagę stan komórek, pozostałości barwnika, ustawienia parametrów oraz inne czynniki. W trakcie eksperymentu, jeśli na dnie studni nie ma komórek, w polu widzenia nie zostanie odnaleziony żaden obraz. Jeśli na dnie studni utworzą się dwie lub więcej nierównych warstw komórek, ostrość staje się trudna do ustawienia, co skutkuje rozmazanym obrazem. Nadmiar pozostałości barwnika może prowadzić do silnego tła, przez co obraz celu staje się mniej wyraźny. Duże obszary pozostałości barwnika mogą zasłaniać komórki w polu widzenia, natomiast małe cząstki pozostałości, o rozmiarach zbliżonych do komórek, mogą zakłócać późniejsze rozpoznawanie i segmentację obrazu. Jeśli wysokość płytki i wysokość studni nie zostaną ustawione zgodnie ze specyfikacją producenta dla płytki 96-dołkowej, w polu widzenia nie zostanie odnaleziony żaden obraz lub pozycja próbki może ulec przesunięciu, co grozi uszkodzeniem obiektywu.

Biorąc pod uwagę elastyczność i prostotę obsługi, a także dobre wyniki przetwarzania danych, optymalnym modułem przetwarzania obrazów dla metody podwójnego barwienia PI i Hoechst jest Live-Dead. Program ten został specjalnie zoptymalizowany pod kątem barwników PI i Hoechst i w porównaniu z innymi metodami oraz oprogramowaniem jest prosty w obsłudze, szybko oblicza wyniki i umożliwia łatwe ładowanie partii obrazów do bazy danych z jednolitymi ustawieniami parametrów. Wyniki są bardziej porównywalne niż te uzyskane przy użyciu obecnie powszechnie stosowanego oprogramowania ImageJ. W różnych trybach eksperymentalnych można stosować odpowiadające im metody autorskie lub ogólny tryb obliczeniowy Multi-Wavelength Cell Scoring; metody autorskie są wygodniejsze, natomiast ogólny tryb obliczeniowy nakłada mniej ograniczeń na metody barwienia. Różne protokoły barwienia wymagają różnych optymalnych modułów przetwarzania obrazów. Należy opracować metody obliczeniowe dostosowane do celów eksperymentalnych. Metoda ExportPro do eksportu obrazów jest prosta i łatwa do opanowania, umożliwiając podgląd obiektów referencyjnych. Jest przyjazna dla początkujących, posiada interfejs graficzny, który jasno wyjaśnia znaczenie parametrów i upraszcza pomiary, co przełamuje bariery w analizie z wykorzystaniem wielu programów i oszczędza czas potrzebny na naukę obsługi narzędzi.

W niniejszym badaniu zwalidowano jedynie podstawowy protokół barwienia. Jako punkt odniesienia, inne protokoły eksperymentalne, które znacząco różnią się od niniejszego, wciąż wymagają walidacji w odniesieniu do nowego standardu.

System obrazowania wysokiej zawartości (High-Content Imaging System) stanowi podstawową platformę technologiczną integrującą obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, synchroniczną detekcję wieloparametryczną, zautomatyzowaną analizę ilościową oraz przesiewy wysokoprzepustowe21,22,23. Przewiduje się, że zintegrowana konstrukcja możliwości obrazowania i obliczeniowego urządzenia umożliwi opracowanie i ustanowienie odpowiednich protokołów eksperymentalnych oraz modeli obliczeniowych dla większej liczby istniejących eksperymentów obrazowych7,24, co w efekcie poprawi spójność i porównywalność danych uzyskanych przez różnych operatorów, w różnym czasie oraz w różnych partiach.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy declare, że nie występuje konflikt interesów. Podczas tłumaczenia rękopisu wykorzystano Zhipu AI wyłącznie do tłumaczenia, a nie do generowania danych badawczych, wyników eksperymentalnych lub kluczowej treści akademickiej. Autorzy biorą pełną odpowiedzialność za treść rękopisu.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie udzielone przez Fundację Szkoły Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu. Autorzy dziękują za wsparcie z grantu MPRC2022034. Finansowanie to zostało wykorzystane do opracowania metody dynamicznego obrazowania 3D bakterii jelitowych w badaniu wpływu wywaru Erchen Decoction na leczenie myszy z prostą otyłością. Autorzy wyrażają wdzięczność za udostępnienie platformy badawczej przez Instytut Innowacji Medycyny i Farmacji Chińskiej Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu oraz Instytut Studiów Interdyscyplinarnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do wirowania 1,5 mLLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
Końcówki do pipety 1000 µLLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
Probówka do wirowania 15 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
Końcówki do pipety 2,5 µLQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
Końcówki do pipety 200 µLLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
Probówka do wirowania 50 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
96-dołkowa płytka do hodowli komórekCorning Incorporated3599
Regulowana pipeta jednokanałowa, 0,1–2,5 μLEppendorf SE3120000216
Regulowana pipeta jednokanałowa, 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
Regulowana pipeta jednokanałowa, 20–200 μLEppendorf SE3120000259
Regulowana pipeta jednokanałowa, 2–20 μLEppendorf SE3120000232
Szkło do hodowli komórekCorning Incorporated430167
Probówki kriogeniczneLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
Pożywka Eagle modyfikowana przez Dulbecco (DMEM)Life Technologies Limited11966-025W tej badaniu pełną pożywkę DMEM przygotowano, stosując 10% FBS, 1% roztworu penicyliny-streptomycyny oraz 89% DMEM.
Inkubator CO2 ESCO CelCultureEsco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
Płodowa surowica bydlęca (FBS, Superfine)Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.164210-50
Fluorescencyjne barwniki Hoechst 33342Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
Komórki HT22Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthImageJ jest jednym z programów do przetwarzania obrazów wykorzystanych w pracy.
Konfokalny system obrazowania wysokiej treści ImageXpress MicroMolecular Devices, LLCImageXpress Micro ConfocalW pracy nazwę instrumentu zastąpiono określeniem „System obrazowania wysokiej treści”.
Wirówka do zamrażania o niskiej prędkościHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów wysokiej treści MetaXpressMolecular Devices, LLCOprogramowanie to stanowi uzupełnienie konfokalnego systemu obrazowania wysokiej treści ImageXpress® Micro. W pracy sformułowanie „Oprogramowanie analityczne dostarczone z urządzeniem” odnosi się do tego programu.
Pionowa komora z laminarnym przepływem powietrza OptiMairEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
Roztwór penicyliny-streptomycynyProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.PB180120
Roztwór jodku propidyny (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
Roztwór trypsyny-EDTABasalMedia Technology Co.,Ltd.S310KJ

Bibliografia

  1. Dariolli R, Nir R, Mushlam T, Souza GR, Farmer SR, Batista ML. Optimized scaffold-free human 3D adipose tissue organoid culture for obesity and disease modeling. SLAS Discovery. 2025;31:100218.
  2. Menduti G, Boido M. Recent advances in high-content imaging and analysis in iPSC-based modelling of neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 2023;24(19).
  3. Park JC, Mook-Jung I. Toward brain organoid-based precision medicine in neurodegenerative diseases. Organoid. 2022;2.
  4. Geyer M, Schreyer D, Gaul LM, Pfeffer S, Pilarsky C, Queiroz K. A microfluidic-based PDAC organoid system reveals the impact of hypoxia in response to treatment. Cell Death Discovery. 2023;9:20.
  5. Huang CJ, Shieh PC, Yang JS, et al. Pterostilbene suppressed cell viability, induced apoptosis and autophagy of cisplatin-resistant gastric cancer cells. Anticancer Res. 2025;45(2):511-523.
  6. Wang G, Li Y, Sun T, et al. BMSC affinity peptide-functionalized β-tricalcium phosphate scaffolds promoting repair of osteonecrosis of the femoral head. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):204.
  7. Uzoechi SC, Collins BE, Badeaux CJ, et al. Effects of amyloid beta (aβ) oligomers on blood–brain barrier using a 3D microfluidic vasculature-on-a-chip model. Appl Sci. 2024;14(9). doi:10.3390/app14093917
  8. Pereira JD, DuBreuil DM, Devlin AC, et al. Human sensorimotor organoids derived from healthy and amyotrophic lateral sclerosis stem cells form neuromuscular junctions. Nat Commun. 2021;12(1):4744.
  9. Cromwell EF, Leung M, Hammer M, Thai A, Rajendra R, Sirenko O. Disease modeling with 3D cell-based assays using a novel flowchip system and high-content imaging. SLAS Technol. 2021;26(3):237-248.
  10. Tabęcka-Łonczyńska A, Skóra B, Szlachcikowska D, et al. Impact of Hericium erinaceus and Ganoderma lucidum metabolites on AhR activation in neuronal HT-22 cells. Pharmacol Rep. 2025;77(6):1557-1572.
  11. Tang J, Chen R, Wang L, et al. Melatonin attenuates thrombin-induced inflammation in BV2 cells and then protects HT22 cells from apoptosis. Inflammation. 2020;43(5):1959-1970.
  12. Zhang W, Sun H, Zhao W, Li J, Meng H. Suppression of JNK pathway protects neurons from oxidative injury via attenuating parthanatos in glutamate-treated HT22 neurons. Sci Rep. 2024;14(1):25793.
  13. Thoudam T, Chanda D, Lee JY, et al. Enhanced Ca2+-channeling complex formation at the ER-mitochondria interface underlies the pathogenesis of alcohol-associated liver disease. Nat Commun. 2023;14(1):1703.
  14. Huang Z, Zhang Q, Wang Y, et al. Inhibition of caspase-3-mediated GSDME-derived pyroptosis aids in noncancerous tissue protection of squamous cell carcinoma patients during cisplatin-based chemotherapy. Am J Cancer Res. 2020;10(12):4287-4307.
  15. Andreyev AY, Yang H, Doulias PT, et al. Metabolic bypass rescues aberrant S-nitrosylation-induced TCA cycle inhibition and synapse loss in Alzheimer’s disease human neurons. Adv Sci. 2024;11(12):2306469.
  16. Backström A, Kugel L, Gnann C, et al. A sample preparation protocol for high throughput immunofluorescence of suspension cells on an adherent surface. J Histochem Cytochem. 2020;68(7):473-489.
  17. Hongxing Tang et al. Protective effects of hinokitiol on neuronal ferroptosis by activating the Keap1/Nrf2/HO-1 pathway in traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2024;41(5-6):734-750.
  18. Teerawonganan P, Hasriadi, Dasuni Wasana PW, et al. Synthesis, cytotoxicity, and mechanistic evaluation of tetrahydrocurcumin-amino acid conjugates as LAT1-targeting anticancer agents in C6 glioma cells. Int J Mol Sci. 2024;25(20):11266.
  19. Shihan MH, Novo SG, Le Marchand SJ, Wang Y, Duncan MK. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 2021;25:100916.
  20. Gomez-Dopazo G, Nieves RJA, Rivera RLA, et al. Cellulose acetate microwell plates for high-throughput colorimetric assays. RSC Adv. 2024;14(22):15319-15327.
  21. DuBreuil DM, Chiang BM, Zhu K, et al. A high-content platform for physiological profiling and unbiased classification of individual neurons. Cell Rep Methods. 2021;1(1).
  22. Ronzetti M, Simeonov A. A comprehensive update on the application of high-throughput fluorescence imaging for novel drug discovery. Expert Opin Drug Discovery. 2025;20(6):785-797.
  23. Jiang X, Li M, Wang Y, et al. 1,2,4,5-tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity. Nat Commun. 2023;14(1):1401.
  24. Yu Y, Chen J, Zhang X, et al. Identification of anti-inflammatory compounds from zhongjing formulae by knowledge mining and high-content screening in a zebrafish model of inflammatory bowel diseases. Chin Med. 2021;16(1):42.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przebieg obrazowaniaywotno kom rekbarwienie PI i Hoechstkom rki HT22metody przetwarzania obraz wwielod ugofalowa ocena kom rektest Live Deadpor wnanie z ImageJ

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.