Przeciwbadzieniowy test uzupełniania Split-Luciferazy do czasowo rozdzielonych pomiarów eliminacji Tau w mikrogleju

Podsumowanie

Opisujemy wrażliwą, czasowo rozdzielczościową ilościową platformę do pomiaru klirensu pozakomórkowego tau w ludzkich wywołanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC) pochodzących z mikroglii, z wykorzystaniem systemu luminescencji opartego na płytkach mikrotytrajowych. Takie podejście umożliwia wrażliwe wykrywanie kinetyki degradacji tau w formacie mikrodołków, pozwalając na dużo wyższą efektywność badania przetwarzania tau w różnych warunkach eksperymentalnych.

Streszczenie

Jako komórki odpornościowe mózgu, mikroglej to centralne regulatory homeostazy mózgu i kluczowe mediatory chorób neurodegeneracyjnych. Te komórki ciągle monitorują środowisko neuronowe i odgrywają krytyczną rolę w rozpoznawaniu, internalizacji i degradacji substratów pozakomórkowych, w tym nieprawidłowo sfałdowanych i zagregowanych białek, takich jak patologiczne tau. Pomimo rosnących dowodów implikujących mikroglej w usuwaniu tau, istniejące podejścia do pomiaru przyjmowania i degradacji tau nie mają rozdzielczości czasowej i wrażliwości potrzebnej, aby w pełni uchwycić te dynamiczne procesy. Tutaj, opracowałyśmy świetlny test do ilościowego monitorowania usuwania tau w mikrogleju pochodzącym z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ta platforma wykorzystuje system dopełniacza oparty na podzielonej lucyferazie, aby umożliwić wysoce wrażliwe, czasowe wykrywanie tau w żywych komórkach, pozwalając na precyzyjne śledzenie jego wewnątrzkomórkowego przetwarzania. Ten test jest skalowalny i przystosowywalny dla wielu typów komórek, zapewniając wszechstronne narzędzie do badania szlaków endolizosomalnych i mechanizmów komórkowych rządzących obsługą tau w chorobach neurodegeneracyjnych, w tym chorobie Alzheimera.

Wprowadzenie

Tauopatii, w tym choroba Alzheimera (AD), charakteryzują się agregacją i rozprzestrzenianiem się białka tau związanego z mikrotubulami w obrębie obwodów neuronalnych^1,2. Glia są coraz bardziej doceniane jako regulatorzy dynamiki choroby tau, w tym pobierania, degradacji i rozprzestrzeniania się^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Zrozumienie, w jaki sposób glia przyczynia się do tauopatii, jest pilnym problemem do rozwiązania kluczowych dynamiki choroby, w tym neuroinflamacji i rozprzestrzeniania się tau. Wśród populacji glejocytów, mikrogleja – komórki fagocytarne zamieszkujące mózg – są unikalnie pozycjonowane, aby pośredniczyć w usuwaniu tau.

Mimo pilnej potrzeby wyjaśnienia mechanizmów obsługi tau w mikroglei, dziedzina ta nadal ogranicza się w zakresie rozdzielczości i przepustowości dostępnych testów. Kluczowe pytania dotyczące wewnętrznego pobierania tau, transportu wewnątrzkomórkowego i usuwania komórkowego pozostają nierozwiązane. Każdy z tych etapów reprezentuje odrębny mechanizmiczny proces: pobieranie odnosi się do wewnętrznego pobierania tau pozakomórkowego w błonie komórkowej; transport obejmuje sortowanie i transport pobranego tau przez endosomalne, lizosomalne i inne komponenty wewnątrzkomórkowe; a degradacja oznacza proteolityczny rozkład tau, głównie przez ścieżki lizosomalne i proteasomowe. Chociaż te kroki są sekwencyjne dla przetwarzania tau pozakomórkowego, ponieważ pobrane tau musi przejść przez komponenty wewnątrzkomórkowe przed osiągnięciem mechanizmów degradacyjnych, są one niezależnie regulowane, a dana eksperymentalna perturbacja może wpływać na jeden krok bez zmiany pozostałych. Na przykład zmniejszenie wewnętrznego sygnału tau może oznaczać upośledzone pobieranie, niewłaściwe kierowane z dala od komponentów degradacyjnych lub zwiększoną degradację. Rozwiązanie tych procesów wymaga nowych platform testowych, które mogą wykrywać obecność białka i mogą być połączone z istniejącymi środkami w celu określenia losu białka w czasie.

Obecne metody rozwiązywania wewnętrznego pobierania i degradacji tau opierają się na immunocytochemii, cytometrii przepływowej, western blottingu i podejściach do fluorescencyjnego oznaczania w celu ilościowego określenia pobierania, lokalizacji subkomórkowej i przetwarzania wewnątrzkomórkowego gatunków tau^{13,14,15,16,17,18}. Jednak każde z tych podejść cierpi na fundamentalne ograniczenia, gdy jest stosowane do badania dynamiki usuwania białka. Immunocytochemia i western blotting nie mają wystarczającej czułości do wykrycia gatunków tau o niskiej obfitości i są pracochłonne. Cytometria przepływowa i testy oparte na fluorescencji nie wiernie raportują usuwanie białka, ponieważ fluorofory mogą utrzymywać się po zdegradowaniu skonjugowanego białka¹⁹, rozdzielając sygnał fluorescencyjny od rzeczywistego losu białka interesującego nas. Razem, te ograniczenia pozostawiają krytyczną lukę, bez żadnej istniejącej metody, która jednocześnie zapewnia czułość, rozdzielczość czasową i skalowalność wymaganą do ilościowego śledzenia dynamiki usuwania tau. Dlatego główną przeszkodą w postępie w zrozumieniu dynamiki obsługi tau w mikroglei był brak ilościowych, czasowo rozdzielonych, wysoko-przepustowościowych testów do pomiaru usuwania tau w żywych komórkach.

Aby załatać lukę w braku ilościowej platformy do monitorowania dynamiki tau w żywych komórkach, opracowaliśmy wrażliwy test oparty na luminescencji, który może być używany do wykrywania dynamiki białka tau wewnątrzkomórkowego. To podejście wykorzystuje system dopełniający oparty na podzielonym luciferase, w którym mała tag-peptydowa (High Affinity Binary Technology lub HiBiT) jest scalana z tau, umożliwiając pomiary kinetyczne w żywych komórkach. Po interakcji z komplementarnym partnerem wiązania (Large Binary Technology lub LgBiT), oznaczone białko odtwarza aktywny enzym luciferase, generując ilościowy bioluminescencyjny sygnał^20,21,22. Ten luminescencyjny sygnał zapewnia bezpośrednie, wrażliwe odczytywanie obfitości białka, umożliwiając dynamiczne śledzenie zmian w poziomach wewnątrzkomórkowych w czasie. W rezultacie luminescencja może być używana jako solidny reporter obecności lub braku białka, jak w przypadku degradacji wewnątrzkomórkowej. Razem, ta platforma umożliwia precyzyjne, czasowo rozdzielone pomiary obsługi tau i oferuje powszechnie stosowalną strategię do badania obrotu białka.

Protokół

Wszystkie eksperymenty komórkowe przeprowadzono w odpowiednim laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, zatwierdzonym przez Służby Ochrony Środowiska i Zdrowia Uniwersytetu Massachusetts Amherst.

1. Ekspresja, oczyszczanie i usuwanie endotoksyny białka Tau-SLP

1. Dołącz peptyd split-lucyferazy lub tag SLP (VSGWRLFKKIS) do konstruktu Tau, aby stworzyć oznakowane konstrukty (Tau-SLP) przy użyciu standardowych metod klonowania, takich jak montaż Gibson²³.
   UWAGA: Uzupełnienie tagu peptydu split-lucyferazy generuje mocny sygnał, jeśli jest umieszczony na końcu C-terminalnym, N-terminalnym lub w domen wewnętrznych 2N4R Tau²⁴.
2. Wyprodukuj i oczyść Tau-SLP przy użyciu wcześniej opisanych metod^25,26 i upewnij się o czystości za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu.
3. Do użycia z komórkami mikrogleju, postępuj zgodnie z opublikowanymi protokołami, aby usunąć endotoksyny bakteryjne po oczyszczeniu Tau-SLP, aby ograniczyć niepożądane reaktywności²⁷.
4. Określ stężenie białka Tau-SLP za pomocą standardowego testu kwasu bicinchoninowego (BCA) lub testu Bradford^28,29.
5. Jeśli to pożądane, agreguj Tau-SLP zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami²⁴.
6. Waliduj funkcjonalne luminescencje Tau-SLP, generując krzywą standardową przy użyciu komercyjnie dostępnego substratu lucyferazy i reagentu dopełnienia, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).

2. Hodowla mikroglii pochodzącej z iPSC (iTF-Mikroglia)

1. Hoduj komórki mikrogleju w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C w odpowiednim pożywce hodowlanej.
2. Zróżnicuj linię komórek pluripotentnych (iPSC) zawierającą sześć indukowanych przez doksycyklinę czynników transkrypcyjnych, aby wytworzyć komórki przypominające mikroglej (indukowany transkrypcyjny czynnik mikroglej-podobny lub iTF-Mikroglej) przy użyciu zweryfikowanego protokołu³⁰ (patrz Tabela Materiałów).
   UWAGA: Ten test nie jest ograniczony do iTF-Mikroglii i może być stosowany z dowolną linią komórek adhezji. Optymalizacja czasów klaransu może być wymagana podczas pracy z innymi liniami komórek.

3. Test klaransu Tau

1. Na 24-dołkową płytkę, umieść komórki w gęstości 1 x 10⁵ komórek na dołku, w trzech powtórzeniach na warunek, z pożywką hodowlanym (250 μL) i inkubację przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ (Rysunek 1A).
2. Usuń pożywkę hodowlanym, przepłucz komórki raz z PBS (250 μL) i zamień na 250 μL pożywki hodowlanym.
3. Aby czasowo zmierzyć klarans Tau-SLP, wystaw komórki na Tau-SLP w sposób przesunięty, aby wszystkie dołki zostały zebrane jednocześnie, różniąc się tylko czasem klaransu. Na przykład, dla grup klaransu 0 h, 2 h i 4 h, dodaj 100 nM pożywki zawierającej Tau-SLP najpierw do grupy 4 h, następnie 1 h później do grupy 2 h i wreszcie 1 h później do grupy 0 h (patrz Rysunek 1B dla zaleceń dotyczących czasu). Po zakończeniu ostatniego okresu internalizacji wszystkie dołki przeszły ten sam okres ekspozycji na Tau-SLP, ale różnią się tylko czasem klaransu (Rysunek 1B).
4. Umieść dołki nieotrzymujące żadnego leczenia Tau-SLP na potrzeby subtrahowania tła (Rysunek 1C).
5. Pod koniec okresu internalizacji usuń pożywkę zawierającą Tau-SLP. Przepłucz komórki trzy razy z PBS, aby usunąć pozakomórkowe Tau-SLP i zamień na pożywkę hodowlanym bez Tau-SLP.
6. Inkubaj komórki przez określony czas klaransu (Rysunek 1A). Grupa 0 h klaransu, zebrana natychmiast po okresie internalizacji, reprezentuje całkowitą ilość zinternalizowanego Tau-SLP na początku fazy klaransu.
7. Po wszystkich punktach czasowych klaransu usuń pożywkę z dołków i przepłucz 250μL PBS.
8. Tresc każdy dołek przez 5 min w 37 °C z 250 μL Trypsyny-EDTA 0,25%. Ten krok usuwa tau związane z powierzchnią, aby upewnić się, że luminescencja odzwierciedla zinternalizowanego Tau-SLP. Neutralizuj każdy dołek z 250 μL inhibitorem trypsyny (5 mg/mL).
9. Zbierz każdy dołek do odpowiednio oznaczonej mikroprobówki 1,5 mL i osadź przez wirowanie (500 x g, 5 min).
10. Przygotuj odpowiednią ilość buforu lizacyjnego zawierającego substrat lucyferazy i komponenty dopełnienia (patrz Tabela Materiałów; 50 μL x liczba dołków + 10%).
11. Usuń każdy nadstan z pipetą aspirowajac

Wyniki

Dzięki zastosowaniu tego czułego testu opartego na luminescencji, możliwe było monitorowanie w czasie ilości wewnątrzkomórkowego Tau-SLP po zsynchronizowanym okresie poboru w mikrogleju pochodzącym z ludzkich iPSC. Po wypłukaniu Tau-SLP luminescencja stopniowo spadała, co było zgodne z wewnątrzkomórkowym oczyszczaniem Tau-SLP. Platforma ta była wystarczająco czuła, aby wykryć różnice w sposobie przetwarzania monomerów i form włóknistych Tau-SLP przez mikroglej. Monomeryczny Tau-SLP został całkowicie usunięty z iTF-Microglia w ciągu 60 min, podczas gdy włóknisty Tau-SLP utrzymywał się powyżej 240 min (Rycina 2A). Dodatkowo przeprowadzono test z mutantem tau (np. N279K) w celu oceny kinetyki oczyszczania i stwierdzono, że TauN279K-SLP wykazuje znacząco zredukowaną kinetykę oczyszczania jedynie w krótkich punktach czasowych (15 min) (Rycina 2B). Wyniki te sugerują, że obserwowana degradacja może być widoczna jedynie dzięki wysokiej czułości tego testu. W celu potwierdzenia udziału lizosomów przeprowadzono eksperyment degradacji Tau-SLP z wykorzystaniem małej cząsteczki L-leucylo-L-leucyny metylowego estru (LLOMe). LLOMe jest substratem katepsyny C, który zwiększa przepuszczalność błon lizosomalnych, zaburzając aktywność lizosomów³¹. Po zastosowaniu LLOMe zaobserwowano znacząco zwiększone poziomy stanu stacjonarnego Tau-SLP w t=0 (Rycina 3A) oraz znacząco zredukowaną szybkość degradacji (Rycina 3B) z 4-krotnym wzrostem pozostałego Tau-SLP po 60-minutowym czasie oczyszczania. Na koniec przeprowadzono test oczyszczania Tau-SLP w neuronach pochodzących z iPSC, aby potwierdzić kompatybilność testu z różnymi typami komórek. Stwierdzono, że neurony pochodzące z iPSC wykazują zredukowaną kinetykę oczyszczania zarówno dla form monomerów (Rycina 4A), jak i włókien (Rycina 4B) Tau-SLP. Co najważniejsze, poziomy włókien Tau-SLP pozostają stabilne na poziomie ~100% przez 240 min oczyszczania, podczas gdy w tym samym przedziale czasowym poziomy włókien Tau-SLP w iTF-Microglia spadły poniżej 50%. Wyniki te wykazują, że nasza platforma komplementacji oparta na rozszczepionej lucyferazie oferuje solidne i wiarygodne wykrywanie wewnątrzkomórkowego oczyszczania endolizosomalnego Tau-SLP oraz prezentuje wysoce adaptacyjny projekt testu, który mógłby zostać zastosowany do wielu innych białek lub typów komórek.

Rycina 1: Reprezentatywny schemat eksperymentalny testu usuwania Tau-SLP.(A) Reprezentatywny obraz w polu jasnym iTF-Mikroglii wykorzystanych w tym teście (pasek skali = 100µm) (B) Ludzkie mikrogleje (iTF-Mikroglia) są eksponowane na rekombinowany 2N4R-SLP w sposób kaskadowy, co umożliwia precyzyjną detekcję opartą na luminescencji. Po 1-godzinnej inkubacji tau pozakomórkowe jest usuwane poprzez wymianę medium, a komórki są płukane PBS. Komórki są utrzymywane w medium podstawowym podczas odpowiedniego okresu usuwania (0 h, 2 h, 4 h) przed zbiorami. W punkcie końcowym komórki są lizowane, a następnie mierzona jest luminescencja. (C) Proponowany układ płytki do pomiaru usuwania Tau-SLP w celu porównania degradacji monomerowej i włóknistej. (D) Białko Tau-SLP jest internalizowane do wnętrza komórek i kierowane do degradacji lizosomalnej. Dodanie LgBiT zapewnia ilościowy odczyt ilości Tau-SLP pozostałego w komórce poprzez komplementację i generowanie luminescencji. Kilknięcie tutaj pozwala wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: iTF-Microglia usuwają pozakomórkowe Tau-SLP. (A) iTF-Microglia poddano działaniu monomerystycznego Tau-SLP (100nM) lub włóknistego Tau-SLP (50nM); próbki znormalizowano do odpowiedniego początkowego pobrania (t = 0; 100%) oraz do komórek, które nie były poddane działaniu Tau-SLP (0%) (średnia ± SD; n = 9 z trzech niezależnych różnicowań). (B) iTF-Microglia inkubowano z monomerystycznym Tau-SLP lub TauN279K-SLP (100nM), a próbki znormalizowano do odpowiedniego początkowego pobrania (t = 0; 100%) oraz komórek, które nie były poddane działaniu Tau-SLP (0%) (średnia ± SD; n ≥ 7 z trzech niezależnych różnicowań; ∗ p < 0.05 w nieparzystym teście t Welcha). Dane przedrukowane z Shultz et al., 2025²⁴, i użyte na podstawie licencji Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Hamowanie lizosomalne upośledza usuwanie Tau-SLP. (A) Leczenie 1mM inhibitorem lizosomalnym L-leucylo-L-leucynianem metylu (LLOMe) przez 24 h zwiększyło początkowe pobieranie Tau-SLP (t = 0) w komórkach neuroglioma H4 (średnia ± SD; n = 9 niezależnych kultur; ∗ p < 0.05 przy użyciu nieparzystego testu t Welcha). (B) Leczenie LLOMe (1mM) przez 24 h zwiększyło % znormalizowanych RLU Tau-SLP po 60 min czasu usuwania (t = 60min) w porównaniu do grupy kontrolnej (DMSO). Sygnał luminescencyjny został znormalizowany do odpowiednich poziomów początkowego pobierania (100%) oraz komórek, które nie były eksponowane na Tau-SLP (0%) (średnia ± SD; n = 9 niezależnych kultur; ∗∗∗∗ p < 0.0001, ∗ p < 0.05 przy użyciu nieparzystego testu t Welcha). Dane powtórzone z Shultz et al., 2025²⁴, użyte na podstawie licencji Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: iTF-Microglia i iNeurony wykazują różnice w usuwaniu Tau-SLP.(A) iTF-Microglia lub iNeurony inkubowano z monomericznym Tau-SLP (100nM), próbki znormalizowano do odpowiedniego początkowego pobrania (t=0; 100%) oraz komórek nieeksponowanych na Tau-SLP (0%) (średnia±SD; n ≥ 6 z dwóch-trzech niezależnych różnicowań; ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗∗ p < 0.0001 przy użyciu dwuczynnikowej analizy wariancji ANOVA; czas: F(1, 28) = 7.489, p = 0.0107; typ komórek: F(1, 28) = 46.61, p < 0.0001; interakcja: F(1, 28) = 3.229, p = 0.0831; test wielokrotnych porównań Sidaka, wartości p zaznaczone na rysunku, wartości dla t=0 przedstawiono dla odniesienia, lecz wykluczono je z analizy statystycznej). (B) iTF-Microglia lub iNeurony inkubowano z włóknistym Tau-SLP (50nM), próbki znormalizowano do odpowiedniego początkowego pobrania (t=0; 100%) oraz komórek nieeksponowanych na Tau-SLP (0%) (średnia±SD; n ≥ 6 z dwóch do trzech niezależnych różnicowań; ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗∗ p < 0.0001 przy użyciu dwuczynnikowej analizy wariancji ANOVA; czas: F(1, 26) = 0.3888, p = 0.5384; typ komórek: F(1, 26) = 43.09, p < 0.0001; interakcja: F(1, 26) = 1.209, p = 0.2816; test wielokrotnych porównań Sidaka, wartości p zaznaczone na rysunku, wartości dla t=0 przedstawiono dla odniesienia, lecz wykluczono je z analizy statystycznej). Dane przedrukowane z Shultz et al., 2025²⁴, wykorzystane na licencji Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

To narzędzie zapewnia skalowalną i ilościową platformę do mierzenia zewnątrzkomórkowego usuwania Tau-SLP przez mikrogleję z wysoką czułością i rozdzielczością czasową. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod opartych na obrazowaniu, które często wymagają pracochłonnej obróbki próbek i są ograniczone pod względem przepływu i próbkowania czasowego, ten system oparty na luminescencji umożliwia bezpośrednie, ilościowe określenie poziomu tau na poziomie populacji w formacie płytki mikrotypanowej. Otrzymany wynik zapewnia ilościowe pomiaru usuwania Tau-SLP po ekspozycji na zewnątrzkomórkowe tau. Ponieważ pomiary mogą być uzyskiwane wielokrotnie w wielu punktach czasowych i przy dłuższych okresach inkubacji, test umożliwia wysokoszybkową, kinetycznie rozdzielczną analizę dynamiki pobierania i usuwania tau. Ponadto zmiany w luminescencji w czasie są zgodne ze zmianami w wewnątrzkomórkowym stężeniu Tau-SLP, ale nie rozróżniają między przemieszczaniem, degradacją czy sekrecją bez uzupełniających podejść. Chociaż znacznik Tau-SLP nie wpłynął istotnie na pobieranie tau czy agregację w naszym towarzyszącym badaniu²⁴, egzogenne znaczniki mogą wpływać na zachowanie innych białek. Dlatego wyniki testu powinny być uzupełniane za pomocą ortogonalnych podejść i porównywane z preparatami tau bez znaczników, gdzie to możliwe. Dodatkową ograniczeniem jest to, że ten test wykorzystuje rekombinowane gatunki Tau-SLP, a nie endogenne tau czy pochodzące od pacjentów patologiczne agregaty tau. Podczas gdy rekombinowane 2N4R tau zapewnia powtarzalny eksperymentalny substrat, nie w pełni odwzorowuje endogenną heterogeniczność (tj. modyfikacje potranslacyjne) gatunków tau izolowanych z mózgów ludzkich pacjentów. Istnieje wiele protokołów dotyczących in vitro fosforylacji rekombinowanego białka tau i mogą one być łatwo włączone do tego przepływu pracy. Ta platforma może również być dostosowana do badania endogennego tau; wymagałoby to zastosowania inżynierii genetycznej do włączenia sekwencji znacznika SLP w locus tau (MAPT).

Ważne jest, aby interpretacja redukcji sygnału jako degradacji była uzależniona od skutecznego usunięcia tau zewnątrzkomórkowego i związanego z powierzchnią, na przykład poprzez trypsynizację lub równoważne kroki ściągania. Możliwe są fałszywie ujemne wyniki, jeśli skuteczne usunięcie nie zostanie osiągnięte. Również pozorna utrata sygnału, która zostałaby interpretowana jako fałszywie dodatnia degradacja tau, jest możliwa. Mogłoby to wynikać z oderwania komórek czy ich śmierci, sekrecji Tau-SLP czy proteolitycznego rozszczepienia, które oddziela SLP od tau bez degradacji białka. Odpowiednio, spadki w luminescencji powinny być interpretowane jako redukcje wewnątrzkomórkowego stężenia Tau-SLP, a nie jako bezpośrednie pomiary degradacji lizosomowe. Aby bardziej jednoznacznie przypisać zmiany sygnału do degradacji lizosomowe, zalecane są ortogonalne strategie walidacji. Mogą one obejmować farmakologiczne zakłócenie funkcji lizosomowe, takie jak leczenie bafilomycyną A1 lub LLOMe (Rysunek 3), a także eksperymentalne projekty pulse–chase, aby rozdzielić dynamikę pobierania i degradacji.

Giętkość tego testu sprawia, że jest on dobrze przystosowany do badania mechanizmów rządzących pobieraniem tau, przemieszczaniem wewnątrzkomórkowym i degradacją, a także do przesiewowych testów farmakologicznych czy genetycznych modyfikatorów usuwania tau w ludzkich systemach komórkowych. Chociaż przedstawiono tutaj w mikrogleji pochodzącej z iPSC, platforma jest łatwo przystosowana do innych typów komórek (Rysunek 4), umożliwiając szerokie zastosowanie w modelach biologii tau i chorób neurodegeneracyjnych, w tym chorobie Alzheimera i innych pierwotnych i wtórze tauopatiach. Ponieważ ten test opiera się na zewnątrzkomórkowym ekspozycji Tau-SLP i wykrywaniu opartym na luminescencji, powinien być łatwo przystosowany do astrocytów, oligodendrocytów czy powszechnie stosowanych linii komórkowych, choć może być konieczna optymalizacja warunków pobierania. W sumie, to podejście zapewnia potężne narzędzie do rozdzielania ścieżek komórkowych zaangażowanych w proteostazę i rozwijania mechanistycznego rozumienia procesów chorób neurodegeneracyjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Accutase	Thermo Scientific	A1110501
Stożkowe sterylne polipropylenowe probówki do wirówki	Fisher Scientific	12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Scientific	11330057
Doksycyklina	Clontech	631311
DPBS	Thermo Scientific	14-190-250
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061
Oprogramowanie graficzne	GraphPad Prism (lub podobne)	n/a
Human GM-CSF	Thermo Scientific	300-03
KnockOut DMEM	Thermo Scientific	10829018
Luminescent Plate Reader	SpectraMax i3x (lub podobne) - Molecular Devices	n/a
Probówki do mikrowirówki	Fisher Scientific	02-682-002
Płytka mikroskoliczna, 96 dołków, PS, półpowierzchniowa, biała	Greiner	675075
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System	Promega	N3030
Poly-L-Lysine hydrobromide	Fisher Scientific	ICN15017750
Recombinant Human IL-34	Thermo Scientific	200-34
Recombinant Human M-CSF	Thermo Scientific	300-25
Recombinant Human TGF-β1	Thermo Scientific	100-21C
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012927
Białko Tau-HiBiT	In house	n/a	Białko Tau z tagiem peptydowym VSGWRLFKKIS
Inhibitor trypsyny	Sigma Aldrich	T9128
Trypsyna-EDTA	Thermo Scientific	5-200-072
Y-27632 dihydrochloride	Bio-techne	1254