Skuteczny protokół hodowania i mikroiniekcji do modyfikacji genetycznej muchy stajniowej, Stomoxys calcitrans

Summary

Ten protokół opisuje niezawodną metodę mikroiniekcji embrionalnej do integracji obcego materiału genetycznego z genomem muchy, fluorescujący system przesiewowy do monitorowania rozwoju embrionalnego po iniekcji oraz podłoże do wychowu larw składające się z agaru z żółtkiem jaja wzbogaconego węglem aktywowanym, zaszczepione Escherichia coli, które wspiera rozwój od jaja do osobnika dorosłego.

Abstract

Muchy domowe są pasożytami żywiącymi się krwią bydła, zwierząt towarzyszących i ludzi, i występują na wszystkich kontynentach z wyjątkiem Antarktydy. Bolesne ukąszenia dorosłych samców i samic powodują zachowania związane ze stresem u zwierząt gospodarskich, prowadząc do utraty masy ciała i znacznych strat ekonomicznych dla producentów. Zarówno samce, jak i samice much domowych są obligatoryjnymi żywicielami krwi, co stanowi wyzwanie dla sterylnej techniki owadów i innych strategii zarządzania szkodnikami, które wymagają masowego uwolnienia samców. Obecne strategie zarządzania szkodnikami much domowych często nie pozwalają na odpowiednie kontrolowanie populacji much. Chociaż opracowano liczne metody manipulacji genetycznej wprowadzającej egzogenne materiały genetyczne lub indukujące wyłączenie genów dla komarów, Drosophila i innych modelowych grup owadów, metody genetycznej transformacji much domowych są nadal ograniczone. Ten protokół opisuje niezawodne i ulepszone podejście do wprowadzania obcego materiału genetycznego do much domowych przy użyciu hiperaktywnej warianty transpozytazy piggyBac i nowego stałego podłoża do hodowli larw, które wspiera odzyskiwanie larw, wylęganie, karmienie i fluorescencyjne przesiewanie po mikroiniekcji embrionalnej.

Introduction

Mucha stajniowa (Stomoxys calcitrans L., 1758) to ekonomicznie istotne szkodniki i wektory chorób zwierząt hodowlanianych^1,2,3i mają rozmieszczenie kosmopolityczne na całym świecie. Strategie zintegrowanego zarządzania szkodnikami (IPM) często nie udało się odpowiednio kontrolować populacji much stajniowych^2,3, co skutkuje roczną stratą szacowaną na ponad 2 miliardy dolarów w Stanach Zjednoczonych³. Ponadto, oporność na środki owadobójcze została udokumentowana w populacjach much stajniowych w Europie^4,5 i została również zgłoszona w Stanach Zjednoczonych⁶. W konsekwencji, podejścia do kontroli genetycznej, takie jak sterylna technika owadów (SIT) i systemy gene drive, stanowią pożądane uzupełnienie tradycyjnych programów IPM.

Poprzednie wysiłki na rzecz opracowania metod kontroli genetycznej u much stajniowych, w tym generowanie genetycznych szczepów płciowych dla SIT, opierały się na hodowli selektywnej i translokacji indukowanej promieniowaniem^7,8. Te podejścia są intensywne pod względem pracy i ograniczone do modyfikacji nietransgennych. Następnie, O'Brochta et al.⁹ wykazali, że zastosowanie systemu transpoazy Hermes było w stanie zintegrować transgeny do S. calcitrans; jednak, protokół przyniósł niską efektywność transformacji, z około 0,11% wstrzykniętych zarodków produkujących transgeniczne potomstwo, i wytwarzał słabe wyrażenie markera wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) pod kontrolą egzogennego promotora⁹.

Inne podejścia do manipulacji genetycznej, w tym systemy CRISPR-Cas, nie zostały jeszcze szeroko zastosowane u much stajniowych, częściowo z powodu trudności w przeniknięciu odpornego chorionu zarodków much stajniowych. Twardy zewnętrzny chorion jest porównywalny z chorionem innych much muscid^10,11. Próby wstrzyknięcia przez chorion za pomocą igł kwarcowych lub usunięcia chorionu za pomocą dwustronnej taśmy klejącej nie powiodły się, co wymagało zastosowania leczenia roztworem utleniającym (3% hipochloryt sodu, NaOCl), co obniża współczynnik wylęgu jaj.

Muchy stajniowe mogą być utrzymywane długoterminowo w warunkach laboratoryjnych, a niedojrzałe stadia są zwykle hodowane w fermentowanych podłożach celulozowych, takich jak wiórki drewniane, otręby pszeniczne lub słoma uzupełnione źródłami azotu, w tym suplementami z białka cielęcego lub płatkami rybnymi¹². Jednak te podłoża mają kilka wad, gdy są używane do wychowywania zarodków wstrzykiwanych mikro. Ich nieprzezroczystość i wysokie autofluorescencja utrudniają identyfikację larw GFP-dodatnich po wylęgu i zakopywaniu się w podłożu. Ponadto, choć pewien obecność bakterii jest wymagana dla przeżycia larw¹³, fermentowane media wprowadzają nieprzewidywalne społeczności bakterii i grzybów, które mogą uszkodzić lub zjeść zarodki przed wylęgiem. Te ograniczenia uniemożliwiły odzyskanie transformowanych larw przy użyciu wcześniej opisanych metod wstrzykiwania i wychowu⁹, co podkreśla potrzebę bardziej niezawodnego protokołu wstrzykiwania, który również umożliwia fluorescijne przesiewanie przez cały okres rozwoju.

Przedstawiony tutaj jest powtarzalny protokół mikroiniekcji, który uwzględnia ulepszenia w selekcji transpoazy, metodologii wstrzykiwania oraz mediów do przesiewania i hodowli. Te modyfikacje ułatwiają rozwój genetycznie zmodyfikowanych much stajniowych do zastosowań, w tym genetyczne szczepy płciowe dla SIT, gene drive i nokautów genów pośredniczych przez CRISPR-Cas. Kluczowe ulepszenia obejmują zastosowanie hiperaktywnej transpoazy piggyBac¹⁴ pod kontrolą promotora białka skurczowego muchy stajniowej (hsp)83, suszenie zarodków, aby zminimalizować utratę ooplazmy po wstrzyknięciu oraz eliminację taśmy klejącej i oleju halokarbonowego podczas wstrzykiwania zarodków.

Odzyskanie wstrzykniętych zarodków został jeszcze bardziej ulepszony poprzez zastąpienie podstawowego podłoża hodowlanego płaskimi, barwionymi płytkami agar z pożywką odżywczą zaszczepionymi warstwą Escherichia coli. Ta formuła agaru zapewnia dwie główne zalety. Po pierwsze, dostarcza przewidywalnego monogenicznego źródła pokarmu bakterii dla rozwoju larw. Po drugie, zapewnia kontrastowe, nisko autofluorescencyjne tło, które ułatwia obserwację morfologii, rozwoju i ekspresji GFP w larw pierwszego pokolenia (G0). Muchy domowe i stajniowe normalnie rozwijają się i przepoczwarczają na agarowych płytkach z żółtka jaja zaszczepionych E. coli^13,15. Opisana tutaj formuła zawiera aktywowany proszek węglowy jako niereaktywny, bezpieczny dla żyw

Protocol

Wszystkie eksperymenty i operacje przeprowadzono za aprobatą Instytucjonalnego Komitetu Biobezpieczeństwa Texas A&M (protokół IBC2019-081). Reagenty, chemikalia i narzędzia użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla much dla celów produkcji jaj

1. Przygotowywanie klatki dla dorosłych much
   1. Ustaw termostat komory inkubatora na 28°C i wymieszaj 3 kg chlorku sodu z ~5 L wody z kranu w 10 litrowym naczyniu, rozpuszczając ~50% soli.
   2. Umieść to odkryte naczynie z solanką na dnie komory inkubatora, aby utrzymać wilgotność około 80% RH. Utrzymuj 16:8 cykl dzień-noc w komorze lub pomieszczeniu.
   3. Wyłóż dno klatki dla owadów (stalowe/aluminiowe klatki 30 x 30 x 30 cm z siatką) dwoma warstwami ręczników papierowych i umieść 45 mL jednorazowego pojemnika na przyprawy wypełnionego granulowanym cukrem stołowym na szczycie warstwy ręczników (Rysunek 1A).
      UWAGA: Ręczniki pomagają absorbować muchy, a cukier zapewnia źródło pokarmu przed karmieniem krwią.
   4. Napraw 250 mL becherka Griffina około 100 mL wodą o temperaturze pokojowej z kranu i włóż kwadrat z czarnej bawełny o boku 20 cm x 20 cm do wody aż do zwilżenia. Wyreguluj czarny materiał tak, aby jego krawędzie wystawały 1-2 cm poza brzeg becherka (Rysunek 1B).
      UWAGA: Ten wilgotny ścielnik zapewnia zarówno wodę w stanie ciekłym, jak i powierzchnię do składania jaj dla dorosłych much. Śmierć może nastąpić szybko, jeśli dorosłe nie mają dostępu do źródła wilgoci.
   5. Przenieś 500-1500 larw muchy rzeźniczej do małej miski lub becherka i umieść je w klatce dla owadów. Umieść klatkę dla dorosłych w wilgotnej komorze hodowlanej (krok 1.1.1) i codziennie monitoruj wyklucie. Po wykluciu się dorosłych zacznij codzienne karmienie cytowaną krwią bydlęcą (sekcja 1.2.).
2. Karmienie dorosłych much
   1. Przygotuj cytowaną krew bydlęcą, dodając końcową koncentrację 10,9 mM cytrynianu trisodowego dihydratu do świeżo pobranej krwi bydlęcej.
   2. Krótko zawieś ~12,8 gramów soli cytrynowej w minimalnej objętości wody dejonizowanej i dodaj do 4 litrów krwi zebranej w lokalnym rzeźni.
      UWAGA: Pojemniki na krew powinny mieć śruby z nakrętkami (np. sześcienne, szeroko gardłowe, butelki 4L grip) i być dokładnie wyczyszczone ciepłą wodą z mydłem przed użyciem. W rzeźni unikaj zbierania pierwszych ~1 litra krwi od zabijanej zwierzęcia, aby zminimalizować zanieczyszczenie włosami, potem, brudem i innymi środkami krzepnących.
   3. Zamrożoną krew bydlęcą podziel na 200 mL porcje i rozmrażaj według potrzeby, przechowując rozmrożone porcje w lodówce w temperaturze 4°C przez maksymalnie tydzień.
   4. Podaj ~40 mL krwi o temperaturze pokojowej na 600 much dla każdej klatki dla dorosłych.
   5. Krów można podawać w pojemniku na przyprawy lub becherku, a do naczynia należy włożyć złożoną nieterylizowaną bawełnianą gąbkę, aby wyssała krew. Agituj gąbkę, aż bawełna będzie całkowicie nasączona i włóż ją do klatki.
      UWAGA: Krew należy wymieniać codziennie, zaczynając 24 godziny po wykluciu.
3. Zbieranie jaj
   1. Gdy zauważysz jaja na czarnej bawełnianej tkaninie, wyjmij ścielnik z becherka i przemyj jaja do osobnego płytkiego plastikowego pojemnika o pojemności ~700 mL za pomocą butelki do mycia (Rysunek 2A). Składanie jaj zwykle następuje, gdy muchy mają 7-10 dni.
      UWAGA: Sprawdź również kubeczki z krwią na jaja i zbieraj wszelkie rozproszone jaja, które mogą zostać złożone tam.
   2. Zbierz jaja na papierze filtrowym za pomocą filtracji próżniowej. Wykonuje się to poprzez umieszczenie czarnego papieru filtrującego w lejku Büchnera, zastosowanie próżni, a następnie przelanie jaj z kroku 1.3.1. nad ustawienia.
   3. Następnie przenieś jaja do miarki lub 1,7 mL mikrocentryfugującego probówka za pomocą butelki do mycia i odnotuj objętość zebranych jaj (Rysunek 2B).
      UWAGA: Unikaj długotrwałego zanurzania jaj w wodzie, ponieważ śmiertelność zaczyna wzrastać ~10 minut po zanurzeniu.
4. Przygotowanie masowej gleby larw
   1. Zbierz materiały na masową glebę larw (Rysunek 3A), zgodnie z opisem w Tabeli 1.
   2. W 1000 mL becherku dodaj suplement białkowy dla cieląt i całą wodę z kranu. Pozostaw do nawilżenia na noc w temperaturze pokojowej.

Results

Używając tego protokołu, 431 stabilnych zarodków muchy rzeźnej zostało pozbawionych osłonek i zainjekcjonowano piggyBac-Hsp83 plasmidem donorowym i pomocniczym plasmidem Hsp83 w końcowej koncentracji 500 ng/µL. Z 431 zainjekcjonowanych zarodków, 18 larw pozytywnych na ZsGreen (4,2%) i 8 larw negatywnych na ZsGreen (1,9%) wykluło się 48-76 godzin po iniekcji, kiedy były badane na czarnych płytkach agarowych z węglem (Tabela 3). Ogólnie, 26 z 431 zainjekcjonowanych zarodków wykluło się (6,0%), a 16 z 26 wyklutych larw przeżyło do dorosłości (61,5%).

Gatunek	Typ iniekcji	Konstrukt	# zainjekcjonowano	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) Larwy	ZsGreen(-) Larwy	ZsGreen(+) Dorosłe	ZsGreen(-) Dorosłe	# Dorosłych wytwarzających ZsGreen(+) potomstwo
Stomoxys calcitrans	Wstawianie transpoazy	Hsp83:hy-pBac (pomocniczy, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donor, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Wstawianie transpoazy	Hsp83:hy-pBac (pomocniczy, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donor, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tabela 3: Statystyki iniekcji. Wskaźniki przeżywalności, transformacji i odzyskiwania po mikroiniekcji zarodków.

Z 18 larw G0 pozytywnych na ZsGreen, 12 przeżyło do stadium poczwarki (66,7%) i 10 oskrzydliło się jako dorosłe. Sześć dorosłych okazów pozytywnych na ZsGreen (1,4% zainjekcjonowanych zarodków, 60% płodnych przeżywających larw G0) wyprodukowało potomstwo pozytywne na ZsGreen. To potomstwo (Rysunek 9A–E) zostało skrzyżowane i utrzymało fluorescencje przez sześć pokoleń w momencie pisania.

Wśród ośmiu larw negatywnych na ZsGreen, sześć przeżyło do dorosłości (75%). Żaden z niefluorescencyjnych dorosłych nie wyprodukował fluorescencyjnego potomstwa.

Rysunek 9: Fluorescencyjne badanie much transgenicznych. (A) Porównanie larw F1 wyrażających ZsGreen i larw WT. (B) Fluorescencja widoczna przez kutikulę poczwarki, umożliwiająca badanie transgeniczne na etapie poczwarki. (C,D) Porównanie trzech larw i poczwarek wyrażających ZsGreen (z lewej) z trzema larwami i poczwarkami WT (z prawej) pod światłem białym (C) i fluorescencyjnym (D). (E) Dorosła transgeniczna mucha F1 wyrażająca ZsGreen (z lewej) w porównaniu z dorosłą muchą WT (z prawej). Słupki skali = 1 mm (A), 2 mm (B,E) i 3 mm (C,D). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Transformacja genetyczna gatunków owadów niebędących modelami pozostaje główną przeszkodą w rozwoju i ewaluacji strategii kontroli genetycznej dla szkodników i wektorów stawonogów.

W przypadku muchy gniady, opisany tu protokół zmniejsza czas, zasoby, wysiłek i zmienność związaną z wstrzyknięciem i wychowem much G0 po mikroiniekcji zarodków. Ponadto, użycie czarnych płytek agarowych do przesiewania umożliwia bezpośrednią obserwację rozwoju przez cały cykl życia, ułatwiając identyfikację i korekcję problemów, które pojawiają się podczas wstrzykiwania, regeneracji i wychowu larw. Przy użyciu konstrukcji plazmidowych ocenianych w niniejszym badaniu, protokół wygenerował transgeniczne linie much gniady z mniejszą liczbą zastrzykiwanych zarodków niż wcześniej opisane metody⁹. Chociaż poza zakresem tego artykułu, potwierdzenie i zlokalizowanie miejsc wstawienia transgenu można przeprowadzić za pomocą uznanych podejść, takich jak odwrotna PCR i splinkerette PCR.

Skuteczny protokół wstrzykiwania ułatwia również przyszłe badania w dziedzinie genomiki funkcjonalnej, w tym charakteryzację promotorów za pomocą reporterów fluorescencyjnych; kompetencję wektora poprzez analizy odwrotnej genetyki genów związanych z przenoszeniem patogenów; charakteryzację nukleaz, w tym ocenę CRISPR-Cas9 i innych programowalnych nukleaz w muchach gniady; badania nad odpornością na owadobójcze środki chemiczne poprzez modyfikację kandydujących alleli odporności; i badania podstawowej biologii, w tym genów zaangażowanych w pobieranie krwi, kopulacji i rozwoju. Nasz protokół eliminuje również potrzebę zanurzania zarodków w oleju i używania komór wilgotności z utlenianie dla regeneracji zarodków po wstrzyknięciu, jak to jest udokumentowane w poprzedniej literaturze na temat transformacji piggyBac Musca domestica i Lucilia cuprina^16,17.

Kilka parametrów jest kluczowych dla pomyślnej transgenozy. Wysuszanie zarodków i czas wstrzykiwania są szczególnie ważne, ponieważ DNA plazmidowe musi zostać wprowadzone przed komórkowym zorganizowaniem, aby zapewnić włączenie do komórek prekursorowych linii germinalnej. Jednakże, dokładny czas formowania się syncytium w zarodkach muchy gniady pozostaje nieznany. Dodatkowo, tempo rozwoju zarodków jest wpłynięte przez temperaturę, a harmonogram rozwoju zarodków muchy gniady w różnych warunkach środowiskowych nie został w pełni scharakteryzowany. Przyszłe badania nad szybkością rozwoju i embriogenezą laboratorium much gniady mogą dostarczyć wglądu w optymalizację protokołów mikroiniekcji i transformacji, a tym samym dalsze zwiększenie efektywności i powtarzalności protokołu. Jednakże, do momentu osiągnięcia tego, określenie optymalnego okna wstrzykiwania pozostaje ograniczeniem metodologicznym, które może wpłynąć na efektywność transformacji. Kiedy współczynnik przeżywalności jest niski, rozwiązywanie problemów można przeprowadzić poprzez porównanie wskaźników wylęgu i przeżywalności dorosłych much między nieleczonymi zarodkami, zarodkami pozbawionymi skorupy, zarodkami wstrzykniętymi sterylnym w filtrze PBS oraz zarodkami WT wychowanymi na płytkach agarowych. Poprzednia literatura opisująca transformację Musca domestica wykazała 14 zdarzeń integracji z 1668 wstrzyknięć (0,84% wstrzykniętych)¹⁶, a transformacja owada owcy Lucilia cuprina ustanowiła 3 linie transgeniczne z około 900 wstrzyknięć zarodków (0,33% wstrzykniętych)¹⁷, sugerując, że protokół transformacji muchy gniady opisany w tym protokole (6 zdarzeń integracji w 431 wstrzyknięciach, 1,4% wstrzykniętych) oferuje poprawę efektywności wstrzykiwań w porównaniu z innymi gatunkami muchówek z literatury.

Konstytutywny promotor hsp83 muchy gniady zapewniał trwałe wyrażenie ZsGreen na całym etapie rozwoju i wsparł wyrażenie hiperaktywnej transpozytazy piggyBac podczas wczesnej embriogenezy, poprawiając widoczność fluorescującego markera i efektywność transformacji w porównaniu z wcześniej opisanym protokołem transformacji muchy gniady⁹. Plasmida pomocnicza użyta w tym badaniu została wygenerowana przez subklonowanie 3,1 kb DNA genomowego bezpośrednio na początku kodonu startowego hsp83 do minimalnego wektora plazmidowego bezpośrednio przed sekwencją kodującą hiperaktywnej transpozytazy piggyBac. Stosunek pomocniczego plazmidu do plazmidu transportującego został empirycznie ustalony na 1:1 w masie i był stosowany przez całe badanie. Chociaż nie oceniono dodatkowych stosunków plazmidów, alternatywne proporcje mogą również okazać się skuteczne.

Opisane tu poprawki mogą być stosowane do protokołów transgenozy innych stawonogów. Ponadto, agarowy system przesiewania i wychowu jest obecnie stosowany do wstrzykiwania i przesiewania zarodków muchy żołnierz (Hermetia illucens). Protokół może być szczególnie przydatny dla wysiłków transgenozy w innych muscidy, w tym Musca domestica i Haematobia irritans, ze względu na podobną ekologię larw i rozwój w rozkładających się wrzosach włóknistych. Użycie płytek agarowych zaszczepionych Escherichia coli może zapew

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	Komora susząca
Bacto Agar	Difco	281230	Agar do czarnych płytek agarowych
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	Czarne bawełniane tkaniny do miseczek do zbierania jaj i uszczelki tkaninowej do wylęgarni larw
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	Suszarka do komory suszącej
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Środek masowy dla larw
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	Mikroskop iniekcyjny
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Źródło składników odżywczych dla czarnych płytek agarowych
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Bakteria używana na czarnych płytkach agarowych
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	Zasilacz ciśnieniowy do mikroiniekcji
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	Przenoszenie zarodków
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	Kapilary do wyciągania igieł
Forceps	Fine Science tools	11251-20	Obsługa próbek
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Utrzymywanie zarodków podczas usuwania chrząstki
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	Roztwór wybielający do usuwania chrząstki
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Kontener środka masowego dla larw
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	Zbieranie zarodków
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	Bułka LB do hodowania E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Mikroskop do przemieszczania i układania zarodków
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Używane do ładowania mieszanki iniekcyjnej do igieł
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Mikromanipulator do iniekcji
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Używane do filtrowania mieszanki iniekcyjnej
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	Bufor do iniekcji
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Pigment dla czarnych płytek agarowych
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Urządzenie do wyciągania igieł z kapilar
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	Bufor do iniekcji
Petri plates	VWR	391-0609	Petri na czarne płytki agarowe
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Barwnik do iniekcji
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Zatyczka komory suszącej
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	Środek masowy dla larw
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Szklane pokrywy do mikroiniekcji
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	Lampa fluorescencyjna i filtry do przesiewania larw
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	Rozprowadzanie bakterii na płytkach
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	Płukanie zarodków podczas usuwania chrząstki
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Usuwanie chrząstki z zarodków
Wash bottle	Safetyware	Z423335	Płukanie zarodków z powierzchni