Skuteczny protokół hodowania i mikroiniekcji do modyfikacji genetycznej muchy stajniowej, Stomoxys calcitrans

Podsumowanie

Ten protokół opisuje niezawodną metodę mikroiniekcji embrionalnej do integracji obcego materiału genetycznego z genomem muchy, fluorescujący system przesiewowy do monitorowania rozwoju embrionalnego po iniekcji oraz podłoże do wychowu larw składające się z agaru z żółtkiem jaja wzbogaconego węglem aktywowanym, zaszczepione Escherichia coli, które wspiera rozwój od jaja do osobnika dorosłego.

Streszczenie

Muchy domowe są pasożytami żywiącymi się krwią bydła, zwierząt towarzyszących i ludzi, i występują na wszystkich kontynentach z wyjątkiem Antarktydy. Bolesne ukąszenia dorosłych samców i samic powodują zachowania związane ze stresem u zwierząt gospodarskich, prowadząc do utraty masy ciała i znacznych strat ekonomicznych dla producentów. Zarówno samce, jak i samice much domowych są obligatoryjnymi żywicielami krwi, co stanowi wyzwanie dla sterylnej techniki owadów i innych strategii zarządzania szkodnikami, które wymagają masowego uwolnienia samców. Obecne strategie zarządzania szkodnikami much domowych często nie pozwalają na odpowiednie kontrolowanie populacji much. Chociaż opracowano liczne metody manipulacji genetycznej wprowadzającej egzogenne materiały genetyczne lub indukujące wyłączenie genów dla komarów, Drosophila i innych modelowych grup owadów, metody genetycznej transformacji much domowych są nadal ograniczone. Ten protokół opisuje niezawodne i ulepszone podejście do wprowadzania obcego materiału genetycznego do much domowych przy użyciu hiperaktywnej warianty transpozytazy piggyBac i nowego stałego podłoża do hodowli larw, które wspiera odzyskiwanie larw, wylęganie, karmienie i fluorescencyjne przesiewanie po mikroiniekcji embrionalnej.

Wprowadzenie

Mucha stajniowa (Stomoxys calcitrans L., 1758) to ekonomicznie istotne szkodniki i wektory chorób zwierząt hodowlanianych^1,2,3i mają rozmieszczenie kosmopolityczne na całym świecie. Strategie zintegrowanego zarządzania szkodnikami (IPM) często nie udało się odpowiednio kontrolować populacji much stajniowych^2,3, co skutkuje roczną stratą szacowaną na ponad 2 miliardy dolarów w Stanach Zjednoczonych³. Ponadto, oporność na środki owadobójcze została udokumentowana w populacjach much stajniowych w Europie^4,5 i została również zgłoszona w Stanach Zjednoczonych⁶. W konsekwencji, podejścia do kontroli genetycznej, takie jak sterylna technika owadów (SIT) i systemy gene drive, stanowią pożądane uzupełnienie tradycyjnych programów IPM.

Poprzednie wysiłki na rzecz opracowania metod kontroli genetycznej u much stajniowych, w tym generowanie genetycznych szczepów płciowych dla SIT, opierały się na hodowli selektywnej i translokacji indukowanej promieniowaniem^7,8. Te podejścia są intensywne pod względem pracy i ograniczone do modyfikacji nietransgennych. Następnie, O'Brochta et al.⁹ wykazali, że zastosowanie systemu transpoazy Hermes było w stanie zintegrować transgeny do S. calcitrans; jednak, protokół przyniósł niską efektywność transformacji, z około 0,11% wstrzykniętych zarodków produkujących transgeniczne potomstwo, i wytwarzał słabe wyrażenie markera wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) pod kontrolą egzogennego promotora⁹.

Inne podejścia do manipulacji genetycznej, w tym systemy CRISPR-Cas, nie zostały jeszcze szeroko zastosowane u much stajniowych, częściowo z powodu trudności w przeniknięciu odpornego chorionu zarodków much stajniowych. Twardy zewnętrzny chorion jest porównywalny z chorionem innych much muscid^10,11. Próby wstrzyknięcia przez chorion za pomocą igł kwarcowych lub usunięcia chorionu za pomocą dwustronnej taśmy klejącej nie powiodły się, co wymagało zastosowania leczenia roztworem utleniającym (3% hipochloryt sodu, NaOCl), co obniża współczynnik wylęgu jaj.

Muchy stajniowe mogą być utrzymywane długoterminowo w warunkach laboratoryjnych, a niedojrzałe stadia są zwykle hodowane w fermentowanych podłożach celulozowych, takich jak wiórki drewniane, otręby pszeniczne lub słoma uzupełnione źródłami azotu, w tym suplementami z białka cielęcego lub płatkami rybnymi¹². Jednak te podłoża mają kilka wad, gdy są używane do wychowywania zarodków wstrzykiwanych mikro. Ich nieprzezroczystość i wysokie autofluorescencja utrudniają identyfikację larw GFP-dodatnich po wylęgu i zakopywaniu się w podłożu. Ponadto, choć pewien obecność bakterii jest wymagana dla przeżycia larw¹³, fermentowane media wprowadzają nieprzewidywalne społeczności bakterii i grzybów, które mogą uszkodzić lub zjeść zarodki przed wylęgiem. Te ograniczenia uniemożliwiły odzyskanie transformowanych larw przy użyciu wcześniej opisanych metod wstrzykiwania i wychowu⁹, co podkreśla potrzebę bardziej niezawodnego protokołu wstrzykiwania, który również umożliwia fluorescijne przesiewanie przez cały okres rozwoju.

Przedstawiony tutaj jest powtarzalny protokół mikroiniekcji, który uwzględnia ulepszenia w selekcji transpoazy, metodologii wstrzykiwania oraz mediów do przesiewania i hodowli. Te modyfikacje ułatwiają rozwój genetycznie zmodyfikowanych much stajniowych do zastosowań, w tym genetyczne szczepy płciowe dla SIT, gene drive i nokautów genów pośredniczych przez CRISPR-Cas. Kluczowe ulepszenia obejmują zastosowanie hiperaktywnej transpoazy piggyBac¹⁴ pod kontrolą promotora białka skurczowego muchy stajniowej (hsp)83, suszenie zarodków, aby zminimalizować utratę ooplazmy po wstrzyknięciu oraz eliminację taśmy klejącej i oleju halokarbonowego podczas wstrzykiwania zarodków.

Odzyskanie wstrzykniętych zarodków został jeszcze bardziej ulepszony poprzez zastąpienie podstawowego podłoża hodowlanego płaskimi, barwionymi płytkami agar z pożywką odżywczą zaszczepionymi warstwą Escherichia coli. Ta formuła agaru zapewnia dwie główne zalety. Po pierwsze, dostarcza przewidywalnego monogenicznego źródła pokarmu bakterii dla rozwoju larw. Po drugie, zapewnia kontrastowe, nisko autofluorescencyjne tło, które ułatwia obserwację morfologii, rozwoju i ekspresji GFP w larw pierwszego pokolenia (G0). Muchy domowe i stajniowe normalnie rozwijają się i przepoczwarczają na agarowych płytkach z żółtka jaja zaszczepionych E. coli^13,15. Opisana tutaj formuła zawiera aktywowany proszek węglowy jako niereaktywny, bezpieczny dla żyw

Protokół

Wszystkie eksperymenty i operacje zostały przeprowadzone za zgodą Institutional Biosafety Committee uniwersytetu Texas A&M (protokół IBC2019-081). Odczynniki, chemikalia i narzędzia użyte w niniejszym protokole są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Hodowla much w celu produkcji jaj

1. Przygotowanie klatek dla osobników dorosłych
   1. Ustaw termostat komory inkubatora na 28°C i wymieszaj 3 kg chlorku sodu z ok. 5 L wody z kranu w naczyniu o pojemności 10 L, rozpuszczając ok. 50% soli.
   2. Umieść to odkryte naczynie z solanką na dnie komory inkubatora, aby utrzymać wilgotność na poziomie około 80% RH. W komorze lub pomieszczeniu zachowaj cykl dnia i nocy 16:8.
   3. Wyłóż dno klatek dla owadów (stalowe/aluminiowe klatki o wymiarach 30 x 30 x 30 cm z siatką) dwiema warstwami ręczników papierowych i połóż na nich jednorazowy pojemniczek do przypraw o pojemności 45 mL wypełniony granulowanym cukrem spożywczym (Rysunek 1A).
      UWAGA: Ręczniki papierowe pomagają absorbować odchody much, a cukier stanowi źródło pokarmu przed karmieniem krwią.
   4. Napełnij zlewkę Griffina o pojemności 250 mL około 100 mL wody z kranu w temperaturze pokojowej i zanurz w niej kwadrat czarnej bawełnianej tkaniny o wymiarach 20 cm x 20 cm (wycięty z gładkiej czarnej poszewki na poduszkę lub prześcieradła), aż tkanina zostanie zwilżona. Ułóż czarną tkaninę tak, aby jej krawędzie wystawały 1-2 cm poza brzeg zlewki (Rysunek 1B).
      UWAGA: Ta wilgotna tkanina zapewnia zarówno wodę w formie płynnej, jak i powierzchnię do składania jaj dla dorosłych much. Śmierć osobników dorosłych może nastąpić szybko, jeśli nie będą miały dostępu do źródła wilgoci.
   5. Przenieś 500-1500 poczwarek muchy stajennej do małego naczynia lub zlewki i umieść je w klatce dla owadów. Umieść klatkę dla dorosłych w wilgotnej komorze hodowlanej (krok 1.1.1) i codziennie monitoruj proces wykluwania. Po pojawieniu się osobników dorosłych rozpocznij codzienne karmienie cytrynianową krwią bydlęcą (sekcja 1.2.).
2. Karmienie dorosłych much
   1. Przygotuj cytrynianową krew bydlęcą, dodając do świeżo pobranej krwi bydlęcej cytrynian trisodu dwuwodny do stężenia końcowego 10,9 mM.
   2. Krótko mówiąc, zawieś ok. 12,8 grama soli cytrynianu w minimalnej objętości wody dejonizowanej i dodaj do 4 litrów krwi pobranej w lokalnej rzeźni.
      UWAGA: Pojemniki na krew powinny mieć zakrętki (np. kwadratowe butelki z szerokim wlotem o pojemności 4 L) i zostać dokładnie oczyszczone ciepłą wodą z mydłem przed użyciem. W rzeźni unikaj pobierania pierwszych ok. 1 litra krwi bydlęcej z ubojnego zwierzęcia, aby zminimalizować zanieczyszczenie włosami, potem, brudem i innymi substancjami koagulującymi.
   3. Zamroź cytrynianową krew bydlęcą w alikwotach po 200 mL i rozmrażaj w razie potrzeby, przechowując rozmrożone alikwoty w lodówce w temperaturze 4°C do tygodnia.
   4. Zapewnij ok. 40 mL krwi w temperaturze pokojowej na 600 much w każdej klatce dla dorosłych.
   5. Krew można podawać w pojemniku do przypraw lub zlewce, a do naczynia należy włożyć złożoną, niesterylną gazę bawełnianą, która będzie służyć jako knot do pobierania krwi. Agituj knot, aż bawełna zostanie całkowicie nasycona, i włóż go do klatki.
      UWAGA: Krew należy wymieniać codziennie, zaczynając od 24 godzin po wykluciu.
3. Zbieranie jaj
   1. Po zaobserwowaniu jaj na czarnej bawełnianej tkaninie, wyjmij tkaninę ze zlewki i wypłucz jaja do oddzielnego, płytkiego plastikowego pojemnika o pojemności ok. 700 mL za pomocą butelki zmywaka (Rysunek 2A). Składanie jaj zazwyczaj następuje, gdy muchy mają od 7 do 10 dni.
      UWAGA: Sprawdzaj również pojemniki z krwią pod kątem obecności jaj i zbieraj wszystkie przypadkowe jaja, które mogły zostać tam złożone.
   2. Zbierz jaja na papierze filtracyjnym poprzez filtrację próżniową. Odbywa się to poprzez umieszczenie czarnego papieru filtracyjnego w lejku Büchnera, przyłożenie próżni, a następnie wylanie jaj z kroku 1.3.1. na tak przygotowany zestaw.
   3. Następnie przenieś jaja do cylindra miarowego lub miarkowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL za pomocą butelki zmywaka i zapisz objętość zebranych jaj (Rysunek 2B).
      UWAGA: Unikaj długotrwałego zanurzania jaj w wodzie, ponieważ śmiertelność zaczyna wzrastać ok. 10 minut po zanurzeniu.
4. Przygotowanie masowej pożywki larwalnej
   1. Zbierz materiały do masowej pożywki larwalnej (Rysunek 3A), zgodnie z opisem w Tabeli 1.
   2. Do zlewki o pojemności 1000 mL dodaj suplement białkowy cielęcy i całą wodę z kranu. Pozostaw do rehydratacji przez noc w temperaturze pokojowej.
   3. Dodaj otręby pszenne i wermikulit do oddzielnego, większego pojemnika do mieszania.
   4. Po nocnej rehydratacji dokładnie wymieszaj rehydratyzowany suplement cielęcy, aby rozbić grudki, a następnie wlej mieszaninę do pojemnika z otrębami pszennymi i wermikulitem. Mieszaj dokładnie do uzyskania jednorodności i całkowitego pokrycia otrębów pszennych zawiesiną z suplementu cielęcego.
   5. Przenieś masową pożywkę do polipropylenowego pojemnika do przechowywania żywności w warstwie o grubości ok. 8 cm, pokrywającej całe dno pojemnika (Rysunek 3B).
   6. Dodaj ok. 1000 embrionów (około 0,2 mL jaj na 2,2 L masowej pożywki), zbierając embriony poprzez filtrację próżniową na okrągłym papierze filtracyjnym o średnicy 90 mm, a następnie kładąc papier filtracyjny z jajami stroną do dołu w centrum pojemnika z pożywką (Rysunek 3B, C).
   7. Przykryj papier filtracyjny warstwą ok. 1 cm pożywki, aby utrzymać wilgoć (Rysunek 3C), i przykryj pojemnik dużym prostokątem czarnej bawełnianej tkaniny, tak aby 5 cm tkaniny zwisało poza krawędź pojemnika.
   8. Wytnij duży otwór (o średnicy ok. 12 cm) w pokrywie pojemnika na żywność, aby umożliwić wymianę gazową, i zatrzaśnij pokrywę na pojemniku z pożywką, zakleszczając czarną bawełnianą tkaninę między pojemnikiem a pokrywą (Rysunek 3D).
      UWAGA: Służy to jako uszczelka, zapobiegając uwięźnięciu larw 1^st stadium w kroplach kondensatu w szczelinie między pokrywą a pojemnikiem.
   9. Umieść gotowy pojemnik z pożywką w komorze hodowlanej dla osobników dorosłych aż do przepoczwarczenia i monitoruj rozwój larwalny (Rysunek 4) (przepoczwarczenie następuje w ok. 10 dni, w zależności od temperatury pożywki i zagęszczenia larw).
      UWAGA: Tkanina przykrywająca powinna być na tyle gęsta, aby zapobiec przechodzeniu larw 1. stadium, ale na tyle przepuszczalna, aby zapobiec tworzeniu się kondensatu na wewnętrznych ściankach pojemników z pożywką, co mogłoby uwięzić i utopić larwy.
5. Separacja poczwarek
   1. Zdejmij tkaninę przykrywającą z pojemników z poczwarkami i zbierz poczwarki za pomocą łyżki lub czerpaka.
      UWAGA: Poczwarki muchy stajennej wyglądają jak nieruchome, czerwono-brązowe cylindry o długości 4-7 mm, w przeciwieństwie do ruchliwych, żółto-białych larw. Poczwarki zazwyczaj gromadzą się na zewnętrznym obwodzie ścianek pojemnika lub w wilgotnych, podwyższonych miejscach w pojemniku z pożywką, gdy muchy rozpoczynają metamorfozę z larw w poczwarki, a następnie w osobniki dorosłe.
   2. Ułóż 500-1500 poczwarek warstwą o grubości ok. 1 cm na naczyniu i umieść w nowej czystej klatce, zgodnie z opisem w sekcji 1.1, aby wyhodować następne pokolenie.

Rysunek 1: Materiały do hodowli dorosłych much. (A) Klatka do hodowli dorosłych much z widocznym kubkiem z sacharozą (S) i kubkiem do składania jaj (O). (B) Kubek do składania jaj przygotowany z nasyconą wodą czarną tkaniną bawełnianą, wystającą nieco poza krawędź zlewki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zbieranie jaj. (A) Zbieranie jaj z tkaniny do składania jaj przy użyciu butelki płuczki. (B) Odzyskiwanie jaj poprzez filtrację próżniową na wysokokontrastowy papier filtracyjny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Materiały do przygotowania podłoża dla larw w ilościach masowych
Odczynnik	Masa (g)
Woda	900
Otoki pszenicy	230
Suplement dla cieląt	100
Wermikulit (A4 gruby)	70
Materiały do roztworów do usuwania chorionu
Roztwór	Skład
Kąpiel utleniająca	3% podchloryn sodu w wodzie dejonizowanej
Kąpiel płucząca	0,02% roztwór Triton X-100 w wodzie dejonizowanej
Płukanie	Woda dejonizowana
Materiały do czarnych płytek agarowych do przesiewania i hodowli
Odczynnik	Masa (g)
Woda	500
Żółtka jaj w proszku	18
Węgiel aktywny	4
Chlorek sodu	1

Tabela 1: Odczynniki do przygotowania zbiorczych pożywek dla larw, roztworów do dechorionacji oraz czarnych szalek z agarem. Odczynniki wykorzystane do przygotowania zbiorczych pożywek dla larw do utrzymania kolonii, a także skład roztworów służących do osłabiania i usuwania chorionu z embrionów muchy stajennej oraz materiały niezbędne do przygotowania 500 mL czarnego podłoża agarowego do przesiewania i hodowli.

Rysunek 3: Przygotowanie masowej pożywki dla larw. (A) Materiały użyte do przygotowania masowej pożywki dla larw: suplement białka cielęcego (CM), otręby pszenne (WB), wermikulit (VM), pojemnik do przechowywania (SC), pokrywka (L) oraz uszczelka z tkaniny (FG). (B) Dokładne wymieszanie składników pożywki. (C) Umieszczenie papieru filtracyjnego z jajami (EP) stroną z jajami do dołu na powierzchni pożywki i przykrycie dodatkową porcją pożywki w celu zapobiegania wysychaniu. (D) Montaż bawełnianej uszczelki między pojemnikiem a pokrywką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Rozwój larwalny w pożywce masowej. Przezroczyste pojemniki umożliwiają monitorowanie rozwoju larw i stanu pożywki. Larwy (L) są widoczne na ściankach pojemnika, pokrywie oraz w pożywce. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie do iniekcji: usuwanie otoczki chorionowej i wysuszanie

1. Umieścić zwilżoną czarną bawełnianą tkaninę w zlewce, zgodnie z opisem w kroku 1.1.4., a następnie przenieść ją do klatki z dorosłymi osobnikami na 25 min w celu zebrania jaj. Spłukać jaja na sito ze stali nierdzewnej o oczkach 106 µm za pomocą butelki z myjką.
   UWAGA: 25-minutowy okres zbierania zazwyczaj pozwala uzyskać około 400 jaj.
2. Pozostawić embriony niezakłócone na sicie przez dodatkowe 30 min.
3. Podczas starzenia się embrionów przygotować po 150 mL roztworów utleniającego, piorącego i płuczącego, opisanych w sekcji „Materials for De-chorionation Solutions" w Tabeli 1 (Rysunek 5). Należy użyć objętości wystarczającej do przykrycia embrionów warstwą roztworu o grubości około 1 cm.
4. Zanurzyć sito z embrionami w kąpieli utleniającej na 2 min i delikatnie mieszać embriony za pomocą pipety Pasteura (Rysunek 6A).
   UWAGA: Powtarzające się aspirowanie i dozowanie roztworu w celu wytworzenia wirowego ruchu cieczy pomaga skoncentrować embriony w centrum sita i zapobiega przywieraniu świeżo zdechorionowanych embrionów do ścianek sita.
5. Wyjąć sito z kąpieli utleniającej i odlać nadmiar roztworu. Przenieść sito do roztworu piorącego i mieszać poprzez aspirację i dozowanie przez 2 min.
6. Przenieść sito z embrionami do roztworu płuczącego i mieszać zgodnie z opisem w kroku 2.4. przez 2 min. Wyjąć sito z roztworu płuczącego i odlać nadmiar wody.
7. Położyć sterylną szklaną lamellkę na sicie i, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, przenieść embriony (Rysunek 6B) z sita na krawędź lamellki za pomocą cienkiego nylonowego pędzelka. Ułożyć embriony blisko siebie, tak aby się nie dotykały, szerokim biegunem tylnym skierowanym w stronę krawędzi lamellki. Unikać zginania, zniekształcania lub rozrywania embrionów podczas przenoszenia.
8. Przygotować komorę suszącą, zasypując dno kolby o pojemności 1 L 100 mL osuszacza z siarczanu wapnia i zamykając kolbę korkiem gumowym.
   UWAGA: Po 24 h równoważenia komora susząca zazwyczaj osiąga wilgotność względną <5% w temperaturze 23 °C.
9. Usunąć nadmiar wody z lamellki i położyć lamellkę z zdechorionowanymi embrionami na osuszaczu. Ponownie zamknąć kolbę korkiem gumowym i suszyć embriony przez 8 min.
10. Wyjąć lamellkę z komory suszącej i umieścić ją na stoliku mikroskopu pod obiektywem 20× w celu przeprowadzenia mikroiniekcji.

Rycina 5: Roztwory do dechorionacji. Od lewej do prawej: sito ze stali nierdzewnej, roztwór utleniający, roztwór do mycia oraz roztwór do płukania stosowane do dechorionacji embrionów. Podchloryn sodu jest przechowywany jako 6% roztwór stokowy chroniony przed światłem, a Triton X-100 jako 10× roztwór stokowy i rozcieńczany do stężenia końcowego 0.02% przed użyciem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Dechorionizacja zarodków. (A) Delikatne odsysanie i dozowanie roztworu generuje wir, który koncentruje zarodki w centrum sita i zmniejsza ich przyleganie do ścianek sita. (B) Zdechorionizowany zarodek wychodzący z półprzezroczystego chorionu po płukaniu. Biegun przedni (węższy koniec) zazwyczaj wysuwa się przed biegun tylny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Mikroiniekcja

1. Wytwórz kwarcowe igły do mikroiniekcji z kapilar szklanych o długości 100 mm (śr. wewn. 0.7 mm, śr. zewn. 1.0 mm), stosując parametry wymienione w Tabeli 2. Przechowuj igły w miejscu wolnym od kurzu do momentu użycia.
   UWAGA: Można również stosować igły borokrzemowe o podobnej geometrii.
2. Przygotuj bufor do iniekcji (0.1% w/v czerwieni fenolowej w solance fosforanowej (PBS), pH 7.4) i wysterylizuj go poprzez filtr strzykawkowy 0.22 µm.
3. Przygotuj 20 µL mieszaniny do iniekcji, łącząc po 10 µg plazmidu pomocniczego piggyBac oraz plazmidu donora, który zawiera ładunek genetyczny pomiędzy lewą a prawą odwróconą powtórką końcową piggyBac, z 4 µL buforu do iniekcji. Rozcieńcz do końcowego stężenia 500 ng/µL za pomocą wody wolnej od nukleaz.
   UWAGA: Plazmid pomocniczy obejmuje 3.1 kb sekwencję promotora hsp83 powyżej kodonu startowego hsp83 oraz kodującą sekwencję hiperaktywnej transpozazy piggyBac.
4. Przenieś mieszaninę do iniekcji do niskopojemnego filtra strzykawkowego PTFE 0.20 µm i umieść filtr w otworze probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 mL (Rysunek 7A). Wirowuj przy ≥11,000 x g przez 10 minut lub do momentu, aż cała mieszanina do iniekcji przejdzie przez filtr. Niewykorzystaną mieszaninę do iniekcji przechowuj w temperaturze -20 °C.
5. Napełnij od tyłu kwarcową igłę do mikroiniekcji około 2 µL mieszaniny do iniekcji, używając końcówki mikropipety do nakładania żelu (Rysunek 7B). Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas napełniania.
   UWAGA: Ustaw igłę do mikroiniekcji równolegle do długiej osi zarodka i zachowaj zerowe przesunięcie kątowe w poziomie i pionie, aby zminimalizować rozdarcia i ścinanie.
6. Delikatnie uderzaj końcówką igły o krawędź szkiełka przedmiotowego, aż mieszanina do iniekcji zacznie wypływać z końcówki igły (Rysunek 7C).
   UWAGA: Odłamuj końcówkę igły stopniowo, aby uzyskać najmniejszy i najostrzejszy otwór, który wciąż umożliwia przepływ mieszaniny do iniekcji.
7. Wykonaj iniekcję zarodka przez biegun tylny bezpośrednio po osuszeniu, stosując ciśnienie iniekcyjne około 700 hPa i ciśnienie wsteczne 300 hPa.
8. Delikatnie przebij zarodek i wstrzyknij mieszaninę do iniekcji w ilości odpowiadającej około jednej dziesiątej objętości zarodka (Rysunek 7D–F).
   UWAGA: Zminimalizuj penetrację igły, aby ograniczyć zaburzenie błony witelinowej i zapobiec utracie ooplazmy podczas wycofywania igły.
9. Bezpośrednio po iniekcji przenieś szkiełko nakrywkowe do szalki Petriego wyłożonej sterylnym, wilgotnym czarnym papierem filtracyjnym 90 mm i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 48 h.
   UWAGA: Wykonaj wszystkie iniekcje w ciągu 2 h od złożenia jaj, aby objąć zarodki przed stadium syncytialnym.
10. Sprawdzaj zarodki pod kątem wyklucia co 12–16 h. Przenieś nowo wyklute larwy oraz szkiełko nakrywkowe na zaszczepioną i warunkowaną płytkę agarową przygotowaną zgodnie z opisem w sekcji 4.

Parametr	Ciepło	Filtr	Vel	Usuń	Pociągnij
Wartość	825	5	60	150	175

Tabela 2: Parametry wyciągania igieł. Parametry zastosowane do wytworzenia kwarcowych igieł do mikroiniekcji.

Rysunek 7: Mikoiniekcja zarodka. (A) Filtracja mieszaniny do iniekcji przy użyciu filtra strzykawkowego umieszczonego w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL. (B) Napełnianie igły do mikoiniekcji przefiltrowaną mieszaniną do iniekcji za pomocą końcówki do pipety do nakładania żelu. (C) Geometria końcówki kwarcowej igły do mikoiniekcji. (D) Ustawienie igły względem bieguna tylnego zarodka. (E) Przebicie powierzchni zarodka przy jednoczesnym minimalnym zakłóceniu błony witelinowej. (F) Iniekcja objętości stanowiącej około jednej dziesiątej objętości zarodka, a następnie wycofanie igły. Zwiększona przejrzystość wskazuje na wyparcie ooplazmy przez mieszaninę do iniekcji. Pasek skali = 400 µm (D–F) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie płytki z próbkami traktowanymi

1. Skład pożywki agarowej
   1. Przygotować pożywkę opisaną w sekcji „Materials for Black Agar Screening and Rearing Plates” w Tabeli 1 i wysterylizować w autoklawie przez 15 min w temperaturze 121 °C. Odlać agar w temperaturze 40 °C lub przechowywać go w temperaturze pokojowej przed ponownym podgrzaniem i rozlaniem do szalek Petri o średnicy 90 mm.
      UWAGA: Przed rozlaniem energicznie zamieszać pożywkę w celu resuspensji cząstek stałych.
2. Inokulacja szalek
   1. Rozcieńczyć 24-godzinną kulturę Escherichia coli szczepu K12 do OD600 = 0.200 w bulionie Luria-Bertani i nanieść 200 µL na schłodzoną, zestaloną płytkę agarową. Równomiernie rozprowadzić kulturę za pomocą sterylnych szklanych kulek lub rozpylacza szklanego i odstawić płytkę do wchłonięcia nadmiaru wilgoci (Rysunek 8A, B).
      UWAGA: Szalek agarowych należy użyć w ciągu 1 miesiąca od rozlania lub je zutylizować, aby zapewnić niezawodny wzrost bakterii i larw.
3. Kondycjonowanie szalek
   1. Złożyć kawałki czarnego papieru filtracyjnego o wymiarach 6 × 6 cm, tworząc 6-10 pofałdowań, a następnie wysterylizować metodą wypalania lub w autoklawie. Aseptycznie umieścić jeden sterylny pofałdowany papier filtracyjny na zaszczepionej szalce Petri i nawilżyć go kilkoma kroplami sterylnej wody (Rysunek 8C).
   2. Wysterylizować powierzchniowo niepoddane zabiegom, nieiniekcyjne larwy pierwszego stadium typu dzikiego (WT) i przenieść 10 larw na nawilżony papier filtracyjny.
      UWAGA: Embriony WT należy sterylizować poprzez zanurzenie w 10% roztworze wybielacza (0.6% NaOCl) przez 1 min, a następnie płukać w sterylnej wodzie dejonizowanej przez 2 min.
   3. Umieścić okrągły papier filtracyjny o średnicy 90 mm między pokrywką a dnem szalki Petri, aby pełnił funkcję uszczelki.
   4. Pozostawić larwy WT do kondycjonowania szalek przez 24 h przed dodaniem iniekcyjnych embrionów na szkiełkach nakrywkowych (Rysunek 8C). Usunąć larwy WT po wykluciu się pierwszych iniekcyjnych embrionów.

Rycina 8: Przygotowanie szalek z agarem oraz rekonwalescencja po iniekcji. (A) Inokulacja szalek z agarem kulturą Escherichia coli o OD600 = 0.2 przy użyciu sterylnych szklanych kulek. (B) Wchłanianie nadmiaru wilgoci z powierzchni przed przeniesieniem embrionów. (C) Umieszczenie 90 mm uszczelki z papieru filtracyjnego między pokrywką a spodnią częścią szalki Petriego. (D) Przesiewanie larw pod kątem markerów fluorescencyjnych na warunkowanych szalkach z agarem. Iniektowane embriony są odzyskiwane na nasyconym dejonizowaną wodą 90 mm papierze filtracyjnym umieszczonym w pokrywce odwróconej szalki Petriego i inkubowane przez 48 h przed przeniesieniem na szalki do przesiewania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Zastosowano niniejszy protokół, aby zdechorionować 431 embrionów muchy stabilnej i wstrzyknąć im plazmid donorowy piggyBac-Hsp83 oraz plazmid pomocniczy Hsp83 w stężeniu końcowym 500 ng/µL. Z 431 wstrzykniętych embrionów, w czasie 48-76 h po iniekcji, podczas przesiewania na czarnych płytkach agarowych z węglem, wykluło się 18 larw ZsGreen-dodatnich (4,2%) i 8 larw ZsGreen-ujemnych (1,9%) (Tabela 3). Łącznie wykluło się 26 z 431 wstrzykniętych embrionów (6,0%), a 16 z 26 wyklutych larw przeżyło do stadium dorosłego (61,5%).

Gatunek	Rodzaj iniekcji	Konstrukt	Liczba iniekcji	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) poczwarki	ZsGreen(-) poczwarki	ZsGreen(+)  osobniki dorosłe	ZsGreen(-) osobniki dorosłe	Liczba dorosłych dających potomstwo ZsGreen(+)
Stomoxys calcitrans	Insercja transposazy	Hsp83:hy-pBac (pomocniczy, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donor, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Insercja transposazy	Hsp83:hy-pBac (pomocniczy, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donor, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tabela 3: Statystyki iniekcji. Wskaźniki przeżywalności, transformacji i odzysku po mikroiniekcji zarodków.

Z 18 larw G0 wykazujących pozytywny wynik dla ZsGreen, 12 przeżyło do stadium poczwarki (66,7%), a 10 z nich przeszło przeobrażenie w osobniki dorosłe. Sześć dorosłych osobników ZsGreen-dodatnich (1,4% wstrzykniętych embrionów, 60% płodnych osobników G0, które przeżyły) dało potomstwo ZsGreen-dodatnie. Potomstwo to (Rysunek 9A–E) poddano krzyżowaniu wsobny i utrzymywało ono fluorescencję przez sześć pokoleń w momencie sporządzania tekstu.

Spośród ośmiu larw niewykazujących fluorescencji ZsGreen, sześć przeżyło do stadium dorosłego (75%). Żadne z niefluorescencyjnych osobników dorosłych nie dało fluorescencyjnego potomstwa.

Rycina 9: Przesiew fluorescencyjny much transgenicznych. (A) Porównanie larw F1 wykazujących ekspresję ZsGreen z larwami WT. (B) Fluorescencja widoczna przez kutykulę poczwarki, umożliwiająca przesiew transgeniczny na etapie poczwarki. (C,D) Porównanie trzech larw i poczwarek wykazujących ekspresję ZsGreen (lewo) z trzema larwami i poczwarkami WT (prawo) w oświetleniu światłem białym (C) oraz fluorescencyjnym (D). (E) Imago transgenicznej muchy F1 wykazującej ekspresję ZsGreen (lewo) w porównaniu z imago muchy WT (prawo). Paski skali = 1 mm (A), 2 mm (B,E) oraz 3 mm (C,D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Transformacja genetyczna gatunków owadów niebędących modelami pozostaje główną przeszkodą w rozwoju i ewaluacji strategii kontroli genetycznej dla szkodników i wektorów stawonogów.

W przypadku muchy gniady, opisany tu protokół zmniejsza czas, zasoby, wysiłek i zmienność związaną z wstrzyknięciem i wychowem much G0 po mikroiniekcji zarodków. Ponadto, użycie czarnych płytek agarowych do przesiewania umożliwia bezpośrednią obserwację rozwoju przez cały cykl życia, ułatwiając identyfikację i korekcję problemów, które pojawiają się podczas wstrzykiwania, regeneracji i wychowu larw. Przy użyciu konstrukcji plazmidowych ocenianych w niniejszym badaniu, protokół wygenerował transgeniczne linie much gniady z mniejszą liczbą zastrzykiwanych zarodków niż wcześniej opisane metody⁹. Chociaż poza zakresem tego artykułu, potwierdzenie i zlokalizowanie miejsc wstawienia transgenu można przeprowadzić za pomocą uznanych podejść, takich jak odwrotna PCR i splinkerette PCR.

Skuteczny protokół wstrzykiwania ułatwia również przyszłe badania w dziedzinie genomiki funkcjonalnej, w tym charakteryzację promotorów za pomocą reporterów fluorescencyjnych; kompetencję wektora poprzez analizy odwrotnej genetyki genów związanych z przenoszeniem patogenów; charakteryzację nukleaz, w tym ocenę CRISPR-Cas9 i innych programowalnych nukleaz w muchach gniady; badania nad odpornością na owadobójcze środki chemiczne poprzez modyfikację kandydujących alleli odporności; i badania podstawowej biologii, w tym genów zaangażowanych w pobieranie krwi, kopulacji i rozwoju. Nasz protokół eliminuje również potrzebę zanurzania zarodków w oleju i używania komór wilgotności z utlenianie dla regeneracji zarodków po wstrzyknięciu, jak to jest udokumentowane w poprzedniej literaturze na temat transformacji piggyBac Musca domestica i Lucilia cuprina^16,17.

Kilka parametrów jest kluczowych dla pomyślnej transgenozy. Wysuszanie zarodków i czas wstrzykiwania są szczególnie ważne, ponieważ DNA plazmidowe musi zostać wprowadzone przed komórkowym zorganizowaniem, aby zapewnić włączenie do komórek prekursorowych linii germinalnej. Jednakże, dokładny czas formowania się syncytium w zarodkach muchy gniady pozostaje nieznany. Dodatkowo, tempo rozwoju zarodków jest wpłynięte przez temperaturę, a harmonogram rozwoju zarodków muchy gniady w różnych warunkach środowiskowych nie został w pełni scharakteryzowany. Przyszłe badania nad szybkością rozwoju i embriogenezą laboratorium much gniady mogą dostarczyć wglądu w optymalizację protokołów mikroiniekcji i transformacji, a tym samym dalsze zwiększenie efektywności i powtarzalności protokołu. Jednakże, do momentu osiągnięcia tego, określenie optymalnego okna wstrzykiwania pozostaje ograniczeniem metodologicznym, które może wpłynąć na efektywność transformacji. Kiedy współczynnik przeżywalności jest niski, rozwiązywanie problemów można przeprowadzić poprzez porównanie wskaźników wylęgu i przeżywalności dorosłych much między nieleczonymi zarodkami, zarodkami pozbawionymi skorupy, zarodkami wstrzykniętymi sterylnym w filtrze PBS oraz zarodkami WT wychowanymi na płytkach agarowych. Poprzednia literatura opisująca transformację Musca domestica wykazała 14 zdarzeń integracji z 1668 wstrzyknięć (0,84% wstrzykniętych)¹⁶, a transformacja owada owcy Lucilia cuprina ustanowiła 3 linie transgeniczne z około 900 wstrzyknięć zarodków (0,33% wstrzykniętych)¹⁷, sugerując, że protokół transformacji muchy gniady opisany w tym protokole (6 zdarzeń integracji w 431 wstrzyknięciach, 1,4% wstrzykniętych) oferuje poprawę efektywności wstrzykiwań w porównaniu z innymi gatunkami muchówek z literatury.

Konstytutywny promotor hsp83 muchy gniady zapewniał trwałe wyrażenie ZsGreen na całym etapie rozwoju i wsparł wyrażenie hiperaktywnej transpozytazy piggyBac podczas wczesnej embriogenezy, poprawiając widoczność fluorescującego markera i efektywność transformacji w porównaniu z wcześniej opisanym protokołem transformacji muchy gniady⁹. Plasmida pomocnicza użyta w tym badaniu została wygenerowana przez subklonowanie 3,1 kb DNA genomowego bezpośrednio na początku kodonu startowego hsp83 do minimalnego wektora plazmidowego bezpośrednio przed sekwencją kodującą hiperaktywnej transpozytazy piggyBac. Stosunek pomocniczego plazmidu do plazmidu transportującego został empirycznie ustalony na 1:1 w masie i był stosowany przez całe badanie. Chociaż nie oceniono dodatkowych stosunków plazmidów, alternatywne proporcje mogą również okazać się skuteczne.

Opisane tu poprawki mogą być stosowane do protokołów transgenozy innych stawonogów. Ponadto, agarowy system przesiewania i wychowu jest obecnie stosowany do wstrzykiwania i przesiewania zarodków muchy żołnierz (Hermetia illucens). Protokół może być szczególnie przydatny dla wysiłków transgenozy w innych muscidy, w tym Musca domestica i Haematobia irritans, ze względu na podobną ekologię larw i rozwój w rozkładających się wrzosach włóknistych. Użycie płytek agarowych zaszczepionych Escherichia coli może zapew

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	Komora susząca
Bacto Agar	Difco	281230	Agar do czarnych płytek agarowych
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	Czarne bawełniane tkaniny do miseczek do zbierania jaj i uszczelki tkaninowej do wylęgarni larw
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	Suszarka do komory suszącej
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Środek masowy dla larw
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	Mikroskop iniekcyjny
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Źródło składników odżywczych dla czarnych płytek agarowych
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Bakteria używana na czarnych płytkach agarowych
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	Zasilacz ciśnieniowy do mikroiniekcji
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	Przenoszenie zarodków
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	Kapilary do wyciągania igieł
Forceps	Fine Science tools	11251-20	Obsługa próbek
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Utrzymywanie zarodków podczas usuwania chrząstki
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	Roztwór wybielający do usuwania chrząstki
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Kontener środka masowego dla larw
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	Zbieranie zarodków
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	Bułka LB do hodowania E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Mikroskop do przemieszczania i układania zarodków
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Używane do ładowania mieszanki iniekcyjnej do igieł
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Mikromanipulator do iniekcji
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Używane do filtrowania mieszanki iniekcyjnej
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	Bufor do iniekcji
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Pigment dla czarnych płytek agarowych
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Urządzenie do wyciągania igieł z kapilar
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	Bufor do iniekcji
Petri plates	VWR	391-0609	Petri na czarne płytki agarowe
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Barwnik do iniekcji
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Zatyczka komory suszącej
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	Środek masowy dla larw
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Szklane pokrywy do mikroiniekcji
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	Lampa fluorescencyjna i filtry do przesiewania larw
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	Rozprowadzanie bakterii na płytkach
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	Płukanie zarodków podczas usuwania chrząstki
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Usuwanie chrząstki z zarodków
Wash bottle	Safetyware	Z423335	Płukanie zarodków z powierzchni