Model trójwymiarowego angiogenesy oparty na mikronośnikach z zastosowaniem ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje trójwymiarowy model angiogeneszy oparty na mikronośnikach kulistych z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka żył żylnych pępowiny. Test pozwala na bezpośrednie uwidocznienie rozrastania się śródbłonka i tworzenia struktur przypominających światło naczynia oraz może być stosowany w badaniach nad mechanizmami angiogeneszy i interwencjami terapeutycznymi.

Streszczenie

Angiogenesza to wieloetapowy proces biologiczny, który obejmuje aktywację komórek śródbłonka, ich migrację, wydłużanie, tworzenie światła naczynia, rozgałęzianie się oraz anastomozę. Konwencjonalne dwuwymiarowej systemy kultury są przydatne do wstępnej oceny leków, genów lub warunków hodowli, ale nie umożliwiają adekwatnego odtworzenia przestrzennej organizacji morfogenezy śródbłonka w trójwymiarowym międzykomórkowym macierzy zewnątrzkomórkowym. Obecny protokół opisuje trójwymiarową metodę oceny angiogeneszy opartą na mikrokulorach z ludzkimi komórkami śródbłonka żył łożyskowych (HUVEC). HUVEC są najpierw wysiewane na mikrokulorach zawierających chemicznie sprzężony, odkażony kwasem kolagen typu I pochodzenia wieprzowego, a następnie osadzone w macierzy błony podstawnej. Na szczycie żelu wysiewają kolejno fibroblasty błony śluzowej jamy ustnej, aby zapewnić wsparcie parakrynowe dla kiełkowania śródbłonka i formowania struktur podobnych do naczyń. Środek hodowli jest wymieniany co 2 dni, a zachowanie kiełkowania oraz fenotypy angiogenezy są monitorowane za pomocą mikroskopii odwróconej. W odpowiednich warunkach kultury kiełki śródbłonka pojawiają się w ciągu kilku dni, a następnie tworzą się struktury przypominające światło naczynia oraz połączenia między kiełkami. Ta metoda zapewnia wygodną i powtarzalną platformę do badań in vitro nad morfogenezą śródbłonka i może być zastosowana do badań nad manipulacją genami, interwencją farmakologiczną i modelowaniem chorób.

Wprowadzenie

Kilkowanie śródbłonkowe jest kluczowym wydarzeniem w angiogenesie i obejmuje pojawienie się, migrację, proliferację i układanie komórek śródbłonkowych z istniejących już struktur naczyniowych, po którym następuje formacja światła naczynia i utworzenie połączonych sieci naczyniowych podobnych^1,2. Chociaż konwencjonalne dwuwymiarowe systemy kulturowe i oparte na żelu testy tworzenia rurek są technicznie proste, są ograniczone w ich zdolności do odwzorowania przestrzennej reorganizacji komórek śródbłonkowych w trójwymiarowym mikrośrodowisku^3,4. Klasyczna metoda oparta na kuleczkach mikronośnika i trójwymiarowym assayu kiłkowania reprodukuje kilka etapów angiogenesy in vitro, w tym kiłkowanie śródbłonkowe, wydłużanie, formacja światła naczynia i układanie sieci, stąd stała się szeroko stosowaną metodą w badaniach nad angiogenesą.

W niniejszym protokole ustanowiono trójwymiarowy model kiłkowania oparty na kuleczkach mikronośnika z użyciem normalnych komórek śródbłonkowych żyły pępowinowej człowieka. Oparty na wcześniej opisywanych assayach kiłkowania kuleczek mikronośnika śródbłonkowego^5,6,7, ta metoda zachowuje podstawową strukturę powlekania komórek śródbłonkowych na kuleczki mikronośnika, osadzenia ich w trójwymiarowym macierzy i hodowli fibroblastów, zastępując jednocześnie konwencjonalny żel fibrynowy macierzą podstawną, aby uprościć procedurę i ułatwić rutynowe obserwacje. Macierz podstawna została wybrana w tym zmodyfikowanym protokole z kilku praktycznych i biologicznych powodów. Eksperymentalnie, zapewnia gotowy do użycia trójwymiarowy macierz, który umożliwia szybkie formowanie żelu, proste osadzanie kuleczek i wygodne rutynowe obserwacje mikroskopowe bez dodatkowych etapów polimeryzacji wymaganych do przygotowania żelu fibrynowego. Biologicznie, macierz podstawna zawiera komponenty macierzy pozakomórkowej, które wspierają adhezję komórek śródbłonkowych, ich migrację, wydłużanie kiłków i formowanie struktur podobnych do światła naczynia. Dlatego ta modyfikacja jest odpowiednia dla badań wymagających bezpośredniej wizualizacji zachowania kiłkowania śródbłonkowego, porównania fenotypi angiogennych i oceny interwencji farmakologicznych lub genetycznych w trójwymiarowym środowisku kulturowym. Jednakże, ponieważ macierz podstawna różni się od żelu fibrynowego pod względem składu macierzy, właściwości mechanicznych, degradacji i bioaktywnych wskazówek, niniejszy assay powinien być interpretowany jako zmodyfikowany model kiłkowania oparty na kuleczkach mikronośnika, a nie jako bezpośrednia zamianę klasycznego assayu opartego na fibrynie. Te różnice związane z macierzą mogą wpływać na kinetykę kiłkowania, stabilność światła naczynia i morfologię sieci, a należy je uwzględnić przy porównywaniu wyników różnych trójwymiarowych systemów angiogenesy. Ten model jest odpowiedni do obserwacji zachowania kiłkowania śródbłonkowego w trzech wymiarach i może być dalej stosowany do badań nad interwencją farmakologiczną, manipulacją genów i mechanizmami angiogennymi.

Protokół

Komórki śródbłonka żył pępowiny ludzkiej użyte w tym protokoła zostały izolowane i hodowane z tkanek pępowiny ludzkiej zebranych z Kliniki Położnictwa, Pierwszego Szpitala Prowincji Junnan. Pisemna zgoda świadoma została uzyskana od wszystkich darczyńców przed pobraniem próbek. Wszystkie procedury obejmujące materiały pochodzenia ludzkiego zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Lekarskiej Pierwszego Szpitala Prowincji Junnan (numer zgody KHLL2023-KY198). Ludzkie fibroblasty śluzówki jamy ustnej (HOMF) zostały uprzejmie dostarczone przez grupę badawczą dr Jiemei Zhai w Filii Szpitala Stomatologicznego Uniwersytetu Medycznego w Kunming. Reagenty i użyte sprzęty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie komórek

1. Hoduj komórki śródbłonka żył pępowiny ludzkiej (HUVEC) w pożywce do wzrostu śródbłonka uzupełnionej o dodatkowe surowicy płodowej byka (FBS) do końcowej koncentracji 10% w temperaturze 37 °C w inkubatorze wilgotnym z 5% CO₂. Komórki używane do badania powinny być wolne od skażenia, wykazywać stabilny wzrost i znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego. Używaj komórek na przebiegu 4–6.
2. Hoduj ludzkie fibroblasty śluzówki jamy ustnej (HOMF) w pożywce podstawowej z wysokim stężeniem glukozy uzupełnionej o 10% surowicy płodowej byka (FBS) w temperaturze 37 °C w inkubatorze wilgotnym z 5% CO₂. Używaj komórek na przebiegu 4–6.
3. Przed pokryciem mikrokulek, upewnij się, że oba typy komórek mają odpowiednią konfluencję. Unikaj nadmiernie skonfluowanych kultur lub nadmiernej trawienia enzymatycznego, ponieważ mogą one niekorzystnie wpłynąć na następne kiełkowanie.

2. Przygotowanie mikrokulek

1. Namnaż 0,5 g suchych  mikrokulek w 50 mL PBS przez co najmniej 3 godziny. Po umyciu, resuspenduj kulki w 50  mL PBS, aby uzyskać zawiesinę mikrokulek o stężeniu 10 mg/mL, odpowiadającą około 3 × 10⁴ kulki/mL.
2. Przenieś  zawiesinę do szkłanego butelki silikonizowanego,  wysterylizuj go autoklawowaniem w 115 °C przez 15 minut i przechowuj go w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
3. Przed pokryciem komórek śródbłonka, usuń roztwór przechowywania i umyj kulki sterylnym PBS. Urównowaź kulki w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
4. Delikatnie resuspenduj zrównoważone kulki tuż przed użyciem, aby uniknąć sedymentacji i skupiania się kulki.
5. Przed pokryciem komórek, sprawdź małą aliquot zawiesiny kulki pod mikroskopem odwróconym. Rozpocznij tylko wtedy, gdy kulki są w pełni namnażone, równomiernie zawieszone i wolne od widocznych agregatów lub rozdrobnionych cząstek.

3. Pokrycie komórek śródbłonka na mikrokulkach

1. Odłącz HUVEC za pomocą trypsyny i resuspenduj komórki w pożywce do wzrosku komórek śródbłonka.
2. Pokryj mikrokulki z gęstością 1500 komórek na kulce. Wymieszaj 3 × 10⁶ HUVEC z 2000 mikrokulkami w 1,5 mL pożywki do wzrosku komórek śródbłonka.
3. Przenieś mieszaninę komórek i kulki do mikroprobówki i inkubatoruj przez 12 godzin w inkubatorze do hodowli komórek. Przez cały okres inkubacji o długości 12 godzin, lekko przewracaj probówkę raz na 20 minut, aby utrzymać odpowiedni kontakt między komórkami i kulkami i promować jednolite przyleganie komórek śródbłonka.
4. Po 12 godzinach, przenieś pokryte kulki do kolby do hodowli komórek o powierzchni 25 cm² zawierającej 4 mL pożywki do wzrosku komórek śródbłonka i kontynuuj inkubację przez noc, aby umożliwić mocne przyleganie komórek śródbłonka do powierzchni mikrokulki.
5. Przed osadzeniem, sprawdź reprezentatywne pokryte kulki pod mikroskopem odwróconym. Przejdź do osadzenia matrycy tylko wtedy, gdy więcej niż 80% sprawdzonych kulki wykazuje ciągłą i stosunkowo jednolitą warstwę komórek śródbłonka na powierzchni kulki, z minimalnymi komórkami unoszącymi się swobodnie, bez oczywistych skupień komórek i bez poważnego skupiania się kulki. Kulki o nierównomiernym pokryciu, dużych skupiskach komórek lub rozległym skupianiu się nie powinny być używane do osadzenia.
6. Jeśli kulki przylegają do dna kolby, lekko wstrząśnij kolbą, aby je uwolnić. Unikaj energicznego pipetowania, które może powodować skupianie się kulki lub oderwanie komórek.

4. Osadzenie pokrytych kulki w trójwymiarowym szkielecie

1. Przenieś pokryte mikrokulki

Wyniki

Angiogenesa w trójwymiarowym modelu HUVEC

W pomyślnie utworzonych kulturach komórek śródbłonkowych komórki są równomiernie rozmieszczone na powierzchni kulek mikronośnika i nie obserwuje się wyraźnego skupiania się kulek. Dynamiczna obserwacja wykazała progresywne kiełkowanie śródbłonka i tworzenie się sieci podobnej do mikrokrążenia w dniach 7, 9 i 11 (Rysunek 1A). Analiza ilościowa potwierdziła dalsze postępy w angiogenezie w tym modelu. Używając dnia 7 jako wartości początkowej, wskaźnik angiogenezy został ustawiony na 0% w dniu 7 i osiągnął 66,94% ± 18,49% w dniu 9 i 169,51% ± 100,83% w dniu 11, co wskazuje na progresywne rozszerzanie się zvascularyzowanego obszaru podczas kultury (Rysunek 1B). Reprezentatywne zdjęcia światłem przeciwstawnym pokazały, że wypustki śródbłonkowe wyłoniły się promieniście z powierzchni kulek do otoczenia trójwymiarowej matrycy po 7 dniach kultury (Rysunek 1C). Ponadto mikroskop konfokalny zapewnił przegląd ogólnej morfologii i organizacji przestrzennej trójwymiarowego układu kultury (Rysunek 1D). Średnia liczba wypustek na jednej kulce mikronośnika wynosiła 31,3 wypustki/kula na podstawie niezależnych pomiarów wykonanych przez trzech obserwatorów (Rysunek 1E). Te ustalenia wskazują, że model wspiera kiełkowanie śródbłonkowe, wydłużanie, przestrzeń przypominającą światło i przekształcanie podobne do naczyń w trójwymiarowym środowisku.

Niedostateczne wyniki w trójwymiarowym modelu HUVEC

W zaniedbanych lub nieoptymalnych kulturach można zaobserwować kilka charakterystycznych nieprawidłowości, w tym śmierć komórek (Rysunek 2A), pękanie kulek mikronośnika (Rysunek 2B), nieprawidłowe skupianie się komórek na powierzchni kulek (Rysunek 2C), rozległe tworzenie pęcherzyków w żelu (Rysunek 2D), lokalne zapadnięcie się matrycy (Rysunek 2E), nadmiernie wysoka gęstość kulek (Rysunek 2F), nierównomierne pokrywanie kulek mikronośnika komórkami (Rysunek 2G), skupianie się kulek (Rysunek 2H) oraz brak wyraźnego kiełkowania lub tylko ograniczone tworzenie się wypustek (Rysunek 2I,J). Te nieprawidłowości sugerują, że pomyślne utworzenie modelu może być wpłynięte przez nieodpowiednią żywotność komórek, niedostateczne pokrywanie kulek, niewłaściwą kontrolę temperatury matrycy podstawnej, zbyt intensywne resuspendowanie lub zaburzenie żelu podczas wymiany medium.

Rysunek 1: Angiogenesa w trójwymiarowym modelu HUVEC. (A) Dynamiczna ocena angiogenesy w trójwymiarowym modelu HUVEC w dniach 7, 9 i 11. Zdjęcia zostały zrobione przy powiększeniu 20×. Skala = 10 µm. (B) Analiza ilościowa wskaźnika angiogenesy. Wskaźnik angiogenesy został zdefiniowany jako względna zmiana powierzchni zvascularyzowanej w czasie w dniach 7, 9 i 11, używając dnia 7 jako wartości początkowej. Obliczono go jako: wskaźnik angiogenesy = [(powierzchnia zvascularyzowana w wskazanym punkcie czasowym − powierzchnia zvascularyzowana w dniu 7) / powierzchnia zvascularyzowana w dniu 7] × 100%. Dane dotyczące wskaźnika angiogenesy są przedstawione jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów. (C) Reprezentatywne zdjęcie kiełkowania śródbłonkowego w HUVEC po 7 dniach kultury. Zdjęcie zostało zrobione przy powiększeniu 20×. Skala = 10 µm. (D) Konfokalny obraz przeglądowy pokazujący ogólną morfologię trójwymiarowego układu kultury. Zdjęcie zostało zrobione przy użyciu skanowania 4×. Skala = 500 µm. (E) Analiza ilościowa liczby wypustek w HUVEC. Liczbę wypustek zliczono niezależnie przez trzech obserwatorów, a wartość średnia została użyta do analizy. Żadne statystyczne porównanie nie zostało wykonane dla tych opisowych analiz ilościowych. Struktury kiełkowania śródbłonkowego przedstawione na tym rysunku pochodzą z kulek mikronośnika pokrytych HUVEC; HOMFs zostały użyte jako komórki wspierające nakładki i nie były specjalnie oznaczone na obrazach. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje zmodyfikowany trójwymiarowy model rozrastania komórek endotelialnych oparty na kulkach mikronośnika. Rysunek 3 zawiera schematyczne przedstawienie przepływu eksperymentu. Protokół został dostosowany z klasycznego testu angiogeneszy opisanego przez Nakatsu i Hughes i zoptymalizowany, aby spełnić cele niniejszego badania^8,9. W klasycznym układzie komórki endotelialne są pokrywane na nasionkach mikronośnika pokrytych kolagenem, osadzone w trójwymiarowym macierzy i hodowane razem z fibroblastami, aby wspierać rozrastanie, wydłużanie, tworzenie światła i łączenie naczyń krwionośnych podobne do naczyń krwionośnych^7,10. W niniejszym protokole zastosowano macierz błony podstawnej zamiast żelu fibryny, a jako komórki wspierające zastosowano fibroblasty śluzówki jamy ustnej człowieka, co umożliwiło utworzenie wygodnego trójwymiarowego układu hodowlany do in vitro obserwacji zachowania angiogeneszy endotelialnej. Struktury rozrastania przedstawione na reprezentatywnych obrazach pochodzą z pokrytych HUVEC kulek mikronośnika, podczas gdy fibroblasty śluzówki jamy ustnej człowieka są wysiewane jako komórki wspierające nakładki i nie są specjalnie oznakowane na tych obrazach.

Ważną cechą tego protokołu jest zastosowanie macierzy błony podstawnej zamiast klasycznego układu żelu fibryny. Z punktu widzenia eksperymentu macierz błony podstawnej upraszcza przygotowanie testu, ponieważ jest gotowa do użycia, ulega szybkiej żelifikacji zależnej od temperatury i umożliwia wygodne osadzenie pokrytych komórkami endotelialnymi kulek mikronośnika bez konieczności osobnego przygotowania fibrynogenu, trombiny lub aprotyniny. Ta cecha sprawia, że protokół jest stosunkowo prosty i odpowiedni do rutynowej obserwacji mikroskopowej. Jednak ta modyfikacja zmienia również środowisko biologiczne testu. W przeciwieństwie do żelu fibryny macierz błony podstawnej zawiera składniki pozakomórkowej macierzy związane z błoną podstawną oraz bioaktywne sygnały, które mogą wpływać na adhezję endotelialną, migrację, rozciąganie pędów, morfologię przypominającą światło i remodelację sieci. Ponadto różnice w sztywności macierzy, degradacji i składzie ligandów mogą wpływać na kinetykę rozrastania i morfologię sieci. Dlatego wyniki uzyskane za pomocą tego zmodyfikowanego testu należy interpretować jako wyniki modelu rozrastania kulek mikronośnika opartego na macierzy błony podstawnej, a nie jako bezpośredni odpowiednik oryginalnego testu opartego na fibrynie.

Skuteczne utworzenie tego modelu zależy od kilku kluczowych kroków. Równomierne pokrycie komórek endotelialnych na powierzchni kulki mikronośnika jest niezbędne do spójnego inicjowania i rozrastania pędów. Nieodpowiednie lub nierównomierne pokrycie może prowadzić do zmniejszenia liczby pędów, słabego wzrostu kierunkowego i zmniejszenia powtarzalności. Stabilne tworzenie żelu to kolejny kluczowy czynnik wpływający na wydajność testu. Podczas przygotowywania macierzy i osadzenia niewłaściwa kontrola temperatury może prowadzić do przedwczesnego żelowania, nierównomiernego rozkładu kulek lub tworzenia pęcherzyków, co może przeszkadzać w rozrostanciu endotelialnym. Ponadto fibroblasty wspierające są wymagane do zapewnienia trwałych sygnałów parakrynnych, które sprzyjają wzrostowi i stabilizacji pędów. Staranne sterowanie tymi krokami jest zatem niezbędne do uzyskania stabilnych i powtarzalnych wyników.

Kilka środków może poprawić spójność testu. Reprezentatywne nieoptymalne wyniki przedstawione na Rysunku 2 mogą być użyte jako praktyczne wskazówki do rozwiązywania problemów. Rozległa śmierć komórek może wynikać z niskiej żywotności komórek, nadmiernego trawienia podczas odczepiania komórek, niewłaściwej liczby przejść lub opóźnionej wymiany pożywki; dlatego zaleca się używanie zdrowych komórek endotelialnych w fazie logistycznej i delikatnego trawienia enzymatycznego. Pękanie kulek mikronośnika lub skupianie się kulek może być spowodowane energicznym pipetowaniem, nadmiernym wzburzeniem mechanicznym lub nieodpowiednim resuspendowaniem kulek, co można zmniejszyć delikatnym mieszaniem i ostrożnym postępowaniem podczas przygotowywania i pokrywania kulek. Równomierne pokrycie komórek endotelialnych lub duże skupienia komórek na powierzchni kulki zazwyczaj wskazują na niedostateczne mieszanie, nadmierną gęstość komórek lub nieodpowiedni kontakt kula-komórka podczas okresu pokrywania; w takim przypadku zawiesina komórek i kulek należy delikatnie odwracać w regularnych odstępach czasu i badać przed osadzeniem. Tworzenie pęcherzyków i lokalne zapadnięcie się macierzy są zwykle związane z niewłaściwym postępowaniem z macierzą, przedwczesnym żelowaniem lub zaburzeniem żelu podczas dodawania lub wymiany pożywki; utrzymywanie macierzy na lodzie przed użyciem, unikanie pęcherzyków powietrza podczas rozdzielania, pozwolenie na całkowite żelowanie i powolne dodawanie pożywki wzdłuż ścianki dołka mogą zmniejszyć te problemy. Kultury, które nie wykazują wyraźnego rozrastania lub tylko ograniczonego tworzenia pędów, mogą wskazywać

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Przezroczysty, wolny od nukleaz
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Stożkowe dno, sterylne, zapakowane w worki
24-well cell culture plate	Haier	612003	Płaskie dno, przeznaczone do hodowli tkankowej, indywidualnie zapakowane, do hodowli komórek przywierających
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Jednorazowa płytka do automatycznego licznika komórek, 50 płytek/opakowanie
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Używany do hodowli komórek w 37 °C z 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Suchy proszek; kolażenowo-dekstranowe kulki mikronosników
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Wtyczka do wizualizacji regionu zainteresowania, używana do wyświetlania obrysowanych obszarów unaczynnione
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	Podstawowe DMEM (1×), zawierające 4,5 g/L D-glukozy, L-glutaminę i 110 mg/L sodu pirogronianu, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Podstawowe medium do hodowli komórek śródbłonkowych uzupełnione dodatkowym FBS do końcowej koncentracji 10% przed użyciem
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Sprawdzone, jednorazowego użytku, pochodzenia australijskiego, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Pierwotne fibroblasty izolowany z ludzkiej błony śluzowej jamy ustnej; uprzejmie dostarczone przez inne laboratorium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Pierwotne komórki śródbłonkowe izolowany z ludzkich żył pępowinowych; bez numeru katalogowego
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Oprogramowanie open-source; wersja 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	Do obrazowania w świetle przeciwnym, kontraście fazowym i fluorescencji
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	Do obrazowania konfokalnego; model nie określony
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	Wysokie stężenie (HC), bez fenolu czerwonego, bez LDEV, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Roztwór penicyliny i streptomycyny do hodowli komórek, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, sterylne, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, naczynie z wentylem, przeznaczone do hodowli komórek, do hodowli przywierających komórek
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Roztwór trypsyny-EDTA 0,25%, 100 mL