Model trójwymiarowego angiogenesy oparty na mikronośnikach z zastosowaniem ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje trójwymiarowy model angiogeneszy oparty na mikronośnikach kulistych z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka żył żylnych pępowiny. Test pozwala na bezpośrednie uwidocznienie rozrastania się śródbłonka i tworzenia struktur przypominających światło naczynia oraz może być stosowany w badaniach nad mechanizmami angiogeneszy i interwencjami terapeutycznymi.

Streszczenie

Angiogenesza to wieloetapowy proces biologiczny, który obejmuje aktywację komórek śródbłonka, ich migrację, wydłużanie, tworzenie światła naczynia, rozgałęzianie się oraz anastomozę. Konwencjonalne dwuwymiarowej systemy kultury są przydatne do wstępnej oceny leków, genów lub warunków hodowli, ale nie umożliwiają adekwatnego odtworzenia przestrzennej organizacji morfogenezy śródbłonka w trójwymiarowym międzykomórkowym macierzy zewnątrzkomórkowym. Obecny protokół opisuje trójwymiarową metodę oceny angiogeneszy opartą na mikrokulorach z ludzkimi komórkami śródbłonka żył łożyskowych (HUVEC). HUVEC są najpierw wysiewane na mikrokulorach zawierających chemicznie sprzężony, odkażony kwasem kolagen typu I pochodzenia wieprzowego, a następnie osadzone w macierzy błony podstawnej. Na szczycie żelu wysiewają kolejno fibroblasty błony śluzowej jamy ustnej, aby zapewnić wsparcie parakrynowe dla kiełkowania śródbłonka i formowania struktur podobnych do naczyń. Środek hodowli jest wymieniany co 2 dni, a zachowanie kiełkowania oraz fenotypy angiogenezy są monitorowane za pomocą mikroskopii odwróconej. W odpowiednich warunkach kultury kiełki śródbłonka pojawiają się w ciągu kilku dni, a następnie tworzą się struktury przypominające światło naczynia oraz połączenia między kiełkami. Ta metoda zapewnia wygodną i powtarzalną platformę do badań in vitro nad morfogenezą śródbłonka i może być zastosowana do badań nad manipulacją genami, interwencją farmakologiczną i modelowaniem chorób.

Wprowadzenie

Kilkowanie śródbłonkowe jest kluczowym wydarzeniem w angiogenesie i obejmuje pojawienie się, migrację, proliferację i układanie komórek śródbłonkowych z istniejących już struktur naczyniowych, po którym następuje formacja światła naczynia i utworzenie połączonych sieci naczyniowych podobnych^1,2. Chociaż konwencjonalne dwuwymiarowe systemy kulturowe i oparte na żelu testy tworzenia rurek są technicznie proste, są ograniczone w ich zdolności do odwzorowania przestrzennej reorganizacji komórek śródbłonkowych w trójwymiarowym mikrośrodowisku^3,4. Klasyczna metoda oparta na kuleczkach mikronośnika i trójwymiarowym assayu kiłkowania reprodukuje kilka etapów angiogenesy in vitro, w tym kiłkowanie śródbłonkowe, wydłużanie, formacja światła naczynia i układanie sieci, stąd stała się szeroko stosowaną metodą w badaniach nad angiogenesą.

W niniejszym protokole ustanowiono trójwymiarowy model kiłkowania oparty na kuleczkach mikronośnika z użyciem normalnych komórek śródbłonkowych żyły pępowinowej człowieka. Oparty na wcześniej opisywanych assayach kiłkowania kuleczek mikronośnika śródbłonkowego^5,6,7, ta metoda zachowuje podstawową strukturę powlekania komórek śródbłonkowych na kuleczki mikronośnika, osadzenia ich w trójwymiarowym macierzy i hodowli fibroblastów, zastępując jednocześnie konwencjonalny żel fibrynowy macierzą podstawną, aby uprościć procedurę i ułatwić rutynowe obserwacje. Macierz podstawna została wybrana w tym zmodyfikowanym protokole z kilku praktycznych i biologicznych powodów. Eksperymentalnie, zapewnia gotowy do użycia trójwymiarowy macierz, który umożliwia szybkie formowanie żelu, proste osadzanie kuleczek i wygodne rutynowe obserwacje mikroskopowe bez dodatkowych etapów polimeryzacji wymaganych do przygotowania żelu fibrynowego. Biologicznie, macierz podstawna zawiera komponenty macierzy pozakomórkowej, które wspierają adhezję komórek śródbłonkowych, ich migrację, wydłużanie kiłków i formowanie struktur podobnych do światła naczynia. Dlatego ta modyfikacja jest odpowiednia dla badań wymagających bezpośredniej wizualizacji zachowania kiłkowania śródbłonkowego, porównania fenotypi angiogennych i oceny interwencji farmakologicznych lub genetycznych w trójwymiarowym środowisku kulturowym. Jednakże, ponieważ macierz podstawna różni się od żelu fibrynowego pod względem składu macierzy, właściwości mechanicznych, degradacji i bioaktywnych wskazówek, niniejszy assay powinien być interpretowany jako zmodyfikowany model kiłkowania oparty na kuleczkach mikronośnika, a nie jako bezpośrednia zamianę klasycznego assayu opartego na fibrynie. Te różnice związane z macierzą mogą wpływać na kinetykę kiłkowania, stabilność światła naczynia i morfologię sieci, a należy je uwzględnić przy porównywaniu wyników różnych trójwymiarowych systemów angiogenesy. Ten model jest odpowiedni do obserwacji zachowania kiłkowania śródbłonkowego w trzech wymiarach i może być dalej stosowany do badań nad interwencją farmakologiczną, manipulacją genów i mechanizmami angiogennymi.

Protokół

Komórki śródbłonka żył pępowiny ludzkiej użyte w tym protokoła zostały izolowane i hodowane z tkanek pępowiny ludzkiej zebranych z Kliniki Położnictwa, Pierwszego Szpitala Prowincji Junnan. Pisemna zgoda świadoma została uzyskana od wszystkich darczyńców przed pobraniem próbek. Wszystkie procedury obejmujące materiały pochodzenia ludzkiego zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Lekarskiej Pierwszego Szpitala Prowincji Junnan (numer zgody KHLL2023-KY198). Ludzkie fibroblasty śluzówki jamy ustnej (HOMF) zostały uprzejmie dostarczone przez grupę badawczą dr Jiemei Zhai w Filii Szpitala Stomatologicznego Uniwersytetu Medycznego w Kunming. Reagenty i użyte sprzęty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie komórek

1. Hoduj komórki śródbłonka żył pępowiny ludzkiej (HUVEC) w pożywce do wzrostu śródbłonka uzupełnionej o dodatkowe surowicy płodowej byka (FBS) do końcowej koncentracji 10% w temperaturze 37 °C w inkubatorze wilgotnym z 5% CO₂. Komórki używane do badania powinny być wolne od skażenia, wykazywać stabilny wzrost i znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego. Używaj komórek na przebiegu 4–6.
2. Hoduj ludzkie fibroblasty śluzówki jamy ustnej (HOMF) w pożywce podstawowej z wysokim stężeniem glukozy uzupełnionej o 10% surowicy płodowej byka (FBS) w temperaturze 37 °C w inkubatorze wilgotnym z 5% CO₂. Używaj komórek na przebiegu 4–6.
3. Przed pokryciem mikrokulek, upewnij się, że oba typy komórek mają odpowiednią konfluencję. Unikaj nadmiernie skonfluowanych kultur lub nadmiernej trawienia enzymatycznego, ponieważ mogą one niekorzystnie wpłynąć na następne kiełkowanie.

2. Przygotowanie mikrokulek

1. Namnaż 0,5 g suchych  mikrokulek w 50 mL PBS przez co najmniej 3 godziny. Po umyciu, resuspenduj kulki w 50  mL PBS, aby uzyskać zawiesinę mikrokulek o stężeniu 10 mg/mL, odpowiadającą około 3 × 10⁴ kulki/mL.
2. Przenieś  zawiesinę do szkłanego butelki silikonizowanego,  wysterylizuj go autoklawowaniem w 115 °C przez 15 minut i przechowuj go w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
3. Przed pokryciem komórek śródbłonka, usuń roztwór przechowywania i umyj kulki sterylnym PBS. Urównowaź kulki w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
4. Delikatnie resuspenduj zrównoważone kulki tuż przed użyciem, aby uniknąć sedymentacji i skupiania się kulki.
5. Przed pokryciem komórek, sprawdź małą aliquot zawiesiny kulki pod mikroskopem odwróconym. Rozpocznij tylko wtedy, gdy kulki są w pełni namnażone, równomiernie zawieszone i wolne od widocznych agregatów lub rozdrobnionych cząstek.

3. Pokrycie komórek śródbłonka na mikrokulkach

1. Odłącz HUVEC za pomocą trypsyny i resuspenduj komórki w pożywce do wzrosku komórek śródbłonka.
2. Pokryj mikrokulki z gęstością 1500 komórek na kulce. Wymieszaj 3 × 10⁶ HUVEC z 2000 mikrokulkami w 1,5 mL pożywki do wzrosku komórek śródbłonka.
3. Przenieś mieszaninę komórek i kulki do mikroprobówki i inkubatoruj przez 12 godzin w inkubatorze do hodowli komórek. Przez cały okres inkubacji o długości 12 godzin, lekko przewracaj probówkę raz na 20 minut, aby utrzymać odpowiedni kontakt między komórkami i kulkami i promować jednolite przyleganie komórek śródbłonka.
4. Po 12 godzinach, przenieś pokryte kulki do kolby do hodowli komórek o powierzchni 25 cm² zawierającej 4 mL pożywki do wzrosku komórek śródbłonka i kontynuuj inkubację przez noc, aby umożliwić mocne przyleganie komórek śródbłonka do powierzchni mikrokulki.
5. Przed osadzeniem, sprawdź reprezentatywne pokryte kulki pod mikroskopem odwróconym. Przejdź do osadzenia matrycy tylko wtedy, gdy więcej niż 80% sprawdzonych kulki wykazuje ciągłą i stosunkowo jednolitą warstwę komórek śródbłonka na powierzchni kulki, z minimalnymi komórkami unoszącymi się swobodnie, bez oczywistych skupień komórek i bez poważnego skupiania się kulki. Kulki o nierównomiernym pokryciu, dużych skupiskach komórek lub rozległym skupianiu się nie powinny być używane do osadzenia.
6. Jeśli kulki przylegają do dna kolby, lekko wstrząśnij kolbą, aby je uwolnić. Unikaj energicznego pipetowania, które może powodować skupianie się kulki lub oderwanie komórek.

4. Osadzenie pokrytych kulki w trójwymiarowym szkielecie

1. Przenieś pokryte mikrokulki

Wyniki

Angiogeneza w trójwymiarowym modelu HUVEC

W pomyślnie ustanowionych kulturach komórki śródbłonka są równomiernie rozmieszczone na powierzchni kuleczek mikronośników i nie obserwuje się wyraźnej agregacji kuleczek. Obserwacja dynamiczna wykazała postępujące pączkowanie śródbłonka i tworzenie sieci przypominającej mikronaczynia w dniach 7, 9 i 11 (Rysunek 1A). Analiza ilościowa dodatkowo potwierdziła postępującą odpowiedź angiogenną w tym modelu. Pr...

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje zmodyfikowany trójwymiarowy model rozrastania komórek endotelialnych oparty na kulkach mikronośnika. Rysunek 3 zawiera schematyczne przedstawienie przepływu eksperymentu. Protokół został dostosowany z klasycznego testu angiogeneszy opisanego przez Nakatsu i Hughes i zoptymalizowany, aby spełnić cele niniejszego badania^8,9. W klasycznym układzie komórki endotelialne są pokrywane na nasionkach mikronoś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Przezroczysty, wolny od nukleaz
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Stożkowe dno, sterylne, zapakowane w worki
24-well cell culture plate	Haier	612003	Płaskie dno, przeznaczone do hodowli tkankowej, indywidualnie zapakowane, do hodowli komórek przywierających
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Jednorazowa płytka do automatycznego licznika komórek, 50 płytek/opakowanie
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Używany do hodowli komórek w 37 °C z 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Suchy proszek; kolażenowo-dekstranowe kulki mikronosników
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Wtyczka do wizualizacji regionu zainteresowania, używana do wyświetlania obrysowanych obszarów unaczynnione
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	Podstawowe DMEM (1×), zawierające 4,5 g/L D-glukozy, L-glutaminę i 110 mg/L sodu pirogronianu, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Podstawowe medium do hodowli komórek śródbłonkowych uzupełnione dodatkowym FBS do końcowej koncentracji 10% przed użyciem
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Sprawdzone, jednorazowego użytku, pochodzenia australijskiego, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Pierwotne fibroblasty izolowany z ludzkiej błony śluzowej jamy ustnej; uprzejmie dostarczone przez inne laboratorium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Pierwotne komórki śródbłonkowe izolowany z ludzkich żył pępowinowych; bez numeru katalogowego
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Oprogramowanie open-source; wersja 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	Do obrazowania w świetle przeciwnym, kontraście fazowym i fluorescencji
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	Do obrazowania konfokalnego; model nie określony
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	Wysokie stężenie (HC), bez fenolu czerwonego, bez LDEV, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Roztwór penicyliny i streptomycyny do hodowli komórek, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, sterylne, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, naczynie z wentylem, przeznaczone do hodowli komórek, do hodowli przywierających komórek
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Roztwór trypsyny-EDTA 0,25%, 100 mL