Artykuł metodologiczny

Model trójwymiarowego angiogenesy oparty na mikronośnikach z zastosowaniem ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej

81 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71877

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Yunnan First People's Hospital, 2The Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology, 3The Affiliated Stomatology Hospital of Kunming Medical University, 4Yunnan Key Laboratory of Stomatology, Kunming Medical University, 5Kunming Stomatological Hospital North City District Branch, 6Shiyan Key Laboratory of Comprehensive Prevention and Treatment of Oral Cancer, Department of Stomatology, Taihe Hospital, Hubei University of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje trójwymiarowy model angiogeneszy oparty na mikronośnikach kulistych z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka żył żylnych pępowiny. Test pozwala na bezpośrednie uwidocznienie rozrastania się śródbłonka i tworzenia struktur przypominających światło naczynia oraz może być stosowany w badaniach nad mechanizmami angiogeneszy i interwencjami terapeutycznymi.

Streszczenie

Angiogenesza to wieloetapowy proces biologiczny, który obejmuje aktywację komórek śródbłonka, ich migrację, wydłużanie, tworzenie światła naczynia, rozgałęzianie się oraz anastomozę. Konwencjonalne dwuwymiarowej systemy kultury są przydatne do wstępnej oceny leków, genów lub warunków hodowli, ale nie umożliwiają adekwatnego odtworzenia przestrzennej organizacji morfogenezy śródbłonka w trójwymiarowym międzykomórkowym macierzy zewnątrzkomórkowym. Obecny protokół opisuje trójwymiarową metodę oceny angiogeneszy opartą na mikrokulorach z ludzkimi komórkami śródbłonka żył łożyskowych (HUVEC). HUVEC są najpierw wysiewane na mikrokulorach zawierających chemicznie sprzężony, odkażony kwasem kolagen typu I pochodzenia wieprzowego, a następnie osadzone w macierzy błony podstawnej. Na szczycie żelu wysiewają kolejno fibroblasty błony śluzowej jamy ustnej, aby zapewnić wsparcie parakrynowe dla kiełkowania śródbłonka i formowania struktur podobnych do naczyń. Środek hodowli jest wymieniany co 2 dni, a zachowanie kiełkowania oraz fenotypy angiogenezy są monitorowane za pomocą mikroskopii odwróconej. W odpowiednich warunkach kultury kiełki śródbłonka pojawiają się w ciągu kilku dni, a następnie tworzą się struktury przypominające światło naczynia oraz połączenia między kiełkami. Ta metoda zapewnia wygodną i powtarzalną platformę do badań in vitro nad morfogenezą śródbłonka i może być zastosowana do badań nad manipulacją genami, interwencją farmakologiczną i modelowaniem chorób.

Wprowadzenie

Kilkowanie śródbłonkowe jest kluczowym wydarzeniem w angiogenesie i obejmuje pojawienie się, migrację, proliferację i układanie komórek śródbłonkowych z istniejących już struktur naczyniowych, po którym następuje formacja światła naczynia i utworzenie połączonych sieci naczyniowych podobnych1,2. Chociaż konwencjonalne dwuwymiarowe systemy kulturowe i oparte na żelu testy tworzenia rurek są technicznie proste, są ograniczone w ich zdolności do odwzorowania przestrzennej reorganizacji komórek śródbłonkowych w trójwymiarowym mikrośrodowisku3,4. Klasyczna metoda oparta na kuleczkach mikronośnika i trójwymiarowym assayu kiłkowania reprodukuje kilka etapów angiogenesy in vitro, w tym kiłkowanie śródbłonkowe, wydłużanie, formacja światła naczynia i układanie sieci, stąd stała się szeroko stosowaną metodą w badaniach nad angiogenesą.

W niniejszym protokole ustanowiono trójwymiarowy model kiłkowania oparty na kuleczkach mikronośnika z użyciem normalnych komórek śródbłonkowych żyły pępowinowej człowieka. Oparty na wcześniej opisywanych assayach kiłkowania kuleczek mikronośnika śródbłonkowego5,6,7, ta metoda zachowuje podstawową strukturę powlekania komórek śródbłonkowych na kuleczki mikronośnika, osadzenia ich w trójwymiarowym macierzy i hodowli fibroblastów, zastępując jednocześnie konwencjonalny żel fibrynowy macierzą podstawną, aby uprościć procedurę i ułatwić rutynowe obserwacje. Macierz podstawna została wybrana w tym zmodyfikowanym protokole z kilku praktycznych i biologicznych powodów. Eksperymentalnie, zapewnia gotowy do użycia trójwymiarowy macierz, który umożliwia szybkie formowanie żelu, proste osadzanie kuleczek i wygodne rutynowe obserwacje mikroskopowe bez dodatkowych etapów polimeryzacji wymaganych do przygotowania żelu fibrynowego. Biologicznie, macierz podstawna zawiera komponenty macierzy pozakomórkowej, które wspierają adhezję komórek śródbłonkowych, ich migrację, wydłużanie kiłków i formowanie struktur podobnych do światła naczynia. Dlatego ta modyfikacja jest odpowiednia dla badań wymagających bezpośredniej wizualizacji zachowania kiłkowania śródbłonkowego, porównania fenotypi angiogennych i oceny interwencji farmakologicznych lub genetycznych w trójwymiarowym środowisku kulturowym. Jednakże, ponieważ macierz podstawna różni się od żelu fibrynowego pod względem składu macierzy, właściwości mechanicznych, degradacji i bioaktywnych wskazówek, niniejszy assay powinien być interpretowany jako zmodyfikowany model kiłkowania oparty na kuleczkach mikronośnika, a nie jako bezpośrednia zamianę klasycznego assayu opartego na fibrynie. Te różnice związane z macierzą mogą wpływać na kinetykę kiłkowania, stabilność światła naczynia i morfologię sieci, a należy je uwzględnić przy porównywaniu wyników różnych trójwymiarowych systemów angiogenesy. Ten model jest odpowiedni do obserwacji zachowania kiłkowania śródbłonkowego w trzech wymiarach i może być dalej stosowany do badań nad interwencją farmakologiczną, manipulacją genów i mechanizmami angiogennymi.

Protokół

Komórki śródbłonka żył pępowiny ludzkiej użyte w tym protokoła zostały izolowane i hodowane z tkanek pępowiny ludzkiej zebranych z Kliniki Położnictwa, Pierwszego Szpitala Prowincji Junnan. Pisemna zgoda świadoma została uzyskana od wszystkich darczyńców przed pobraniem próbek. Wszystkie procedury obejmujące materiały pochodzenia ludzkiego zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Lekarskiej Pierwszego Szpitala Prowincji Junnan (numer zgody KHLL2023-KY198). Ludzkie fibroblasty śluzówki jamy ustnej (HOMF) zostały uprzejmie dostarczone przez grupę badawczą dr Jiemei Zhai w Filii Szpitala Stomatologicznego Uniwersytetu Medycznego w Kunming. Reagenty i użyte sprzęty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie komórek

  1. Hoduj komórki śródbłonka żył pępowiny ludzkiej (HUVEC) w pożywce do wzrostu śródbłonka uzupełnionej o dodatkowe surowicy płodowej byka (FBS) do końcowej koncentracji 10% w temperaturze 37 °C w inkubatorze wilgotnym z 5% CO₂. Komórki używane do badania powinny być wolne od skażenia, wykazywać stabilny wzrost i znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego. Używaj komórek na przebiegu 4–6.
  2. Hoduj ludzkie fibroblasty śluzówki jamy ustnej (HOMF) w pożywce podstawowej z wysokim stężeniem glukozy uzupełnionej o 10% surowicy płodowej byka (FBS) w temperaturze 37 °C w inkubatorze wilgotnym z 5% CO₂. Używaj komórek na przebiegu 4–6.
  3. Przed pokryciem mikrokulek, upewnij się, że oba typy komórek mają odpowiednią konfluencję. Unikaj nadmiernie skonfluowanych kultur lub nadmiernej trawienia enzymatycznego, ponieważ mogą one niekorzystnie wpłynąć na następne kiełkowanie.

2. Przygotowanie mikrokulek

  1. Namnaż 0,5 g suchych  mikrokulek w 50 mL PBS przez co najmniej 3 godziny. Po umyciu, resuspenduj kulki w 50  mL PBS, aby uzyskać zawiesinę mikrokulek o stężeniu 10 mg/mL, odpowiadającą około 3 × 10⁴ kulki/mL.
  2. Przenieś  zawiesinę do szkłanego butelki silikonizowanego,  wysterylizuj go autoklawowaniem w 115 °C przez 15 minut i przechowuj go w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Przed pokryciem komórek śródbłonka, usuń roztwór przechowywania i umyj kulki sterylnym PBS. Urównowaź kulki w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
  4. Delikatnie resuspenduj zrównoważone kulki tuż przed użyciem, aby uniknąć sedymentacji i skupiania się kulki.
  5. Przed pokryciem komórek, sprawdź małą aliquot zawiesiny kulki pod mikroskopem odwróconym. Rozpocznij tylko wtedy, gdy kulki są w pełni namnażone, równomiernie zawieszone i wolne od widocznych agregatów lub rozdrobnionych cząstek.

3. Pokrycie komórek śródbłonka na mikrokulkach

  1. Odłącz HUVEC za pomocą trypsyny i resuspenduj komórki w pożywce do wzrosku komórek śródbłonka.
  2. Pokryj mikrokulki z gęstością 1500 komórek na kulce. Wymieszaj 3 × 106 HUVEC z 2000 mikrokulkami w 1,5 mL pożywki do wzrosku komórek śródbłonka.
  3. Przenieś mieszaninę komórek i kulki do mikroprobówki i inkubatoruj przez 12 godzin w inkubatorze do hodowli komórek. Przez cały okres inkubacji o długości 12 godzin, lekko przewracaj probówkę raz na 20 minut, aby utrzymać odpowiedni kontakt między komórkami i kulkami i promować jednolite przyleganie komórek śródbłonka.
  4. Po 12 godzinach, przenieś pokryte kulki do kolby do hodowli komórek o powierzchni 25 cm2 zawierającej 4 mL pożywki do wzrosku komórek śródbłonka i kontynuuj inkubację przez noc, aby umożliwić mocne przyleganie komórek śródbłonka do powierzchni mikrokulki.
  5. Przed osadzeniem, sprawdź reprezentatywne pokryte kulki pod mikroskopem odwróconym. Przejdź do osadzenia matrycy tylko wtedy, gdy więcej niż 80% sprawdzonych kulki wykazuje ciągłą i stosunkowo jednolitą warstwę komórek śródbłonka na powierzchni kulki, z minimalnymi komórkami unoszącymi się swobodnie, bez oczywistych skupień komórek i bez poważnego skupiania się kulki. Kulki o nierównomiernym pokryciu, dużych skupiskach komórek lub rozległym skupianiu się nie powinny być używane do osadzenia.
  6. Jeśli kulki przylegają do dna kolby, lekko wstrząśnij kolbą, aby je uwolnić. Unikaj energicznego pipetowania, które może powodować skupianie się kulki lub oderwanie komórek.

4. Osadzenie pokrytych kulki w trójwymiarowym szkielecie

  1. Przenieś pokryte mikrokulki

Wyniki

Angiogeneza w trójwymiarowym modelu HUVEC

W pomyślnie ustanowionych hodowlach komórki śródbłonka są równomiernie rozmieszczone na powierzchni kulek mikronośników i nie obserwuje się wyraźnej agregacji kulek. Obserwacja dynamiczna wykazała postępujące kiełkowanie śródbłonka oraz tworzenie sieci podobnych do mikronaczyniowych w dniach 7, 9 i 11 (Rysunek 1A). Analiza ilościowa dodatkowo potwierdziła postępującą odpowiedź angiogenną w tym modelu. Przyjmując dzień 7 jako punkt odniesienia, tempo angiogenezy ustalono na 0% w dniu 7, a osiągnęło ono 66,94% ± 18,49% w dniu 9 oraz 169,51% ± 100,83% w dniu 11, co wskazuje na postępującą ekspansję obszaru unaczynionego podczas hodowli (Rysunek 1B). Reprezentatywne obrazy w polu jasnym wykazały, że po 7 dniach hodowli z powierzchni kulek radialnie wyłoniły się pąki śródbłonka do otaczającej trójwymiarowej macierzy (Rysunek 1C). Ponadto mikroskopia konfokalna zapewniła przegląd ogólnej morfologii i organizacji przestrzennej trójwymiarowego systemu hodowli (Rysunek 1D). Średnia liczba pąków na jedną kulkę mikronośnika wyniosła 31,3 sprouts/bead, na podstawie niezależnych obliczeń trzech obserwatorów (Rysunek 1E). Wyniki te wskazują, że model ten wspiera kiełkowanie, elongację śródbłonka, tworzenie morfologii przypominającej światło naczynia oraz przebudowę typu naczyniowego w środowisku trójwymiarowym.

Nieoptymalne wyniki w trójwymiarowym modelu HUVEC

W kulturach nieudanych lub suboptymalnych można zaobserwować szereg charakterystycznych nieprawidłowości, w tym śmierć komórek (Rysunek 2A), pękanie kulek mikronośnika (Rysunek 2B), nieprawidłową agregację komórek na powierzchni kulek (Rysunek 2C), rozległe tworzenie się pęcherzyków powietrza wewnątrz żelu (Rysunek 2D), lokalne zapadanie się macierzy (Rysunek 2E), zbyt wysoką gęstość kulek (Rysunek 2F), nierównomierne pokrycie kulek mikronośnika komórkami (Rysunek 2G), agregację kulek (Rysunek 2H) oraz brak widocznego kiełkowania lub jedynie ograniczone tworzenie się wypustek (Rysunek 2I, J). Nieprawidłowości te sugerują, że na skuteczne ustanowienie modelu może wpływać niewystarczająca żywotność komórek, niepełne pokrycie komórkami, niewłaściwa kontrola temperatury macierzy błony podstawnej, zbyt intensywna resuspensja lub naruszenie żelu podczas wymiany medium.

figure-results-1
Rycina 1: Angiogeneza w trójwymiarowym modelu HUVEC. (A) Dynamiczna ocena angiogenezy w trójwymiarowym modelu HUVEC w dniach 7., 9. i 11. Obrazy uzyskano przy użyciu powiększenia 20×. Pasek skali = 10 µm. (B) Analiza ilościowa tempa angiogenezy. Tempo angiogenezy zdefiniowano jako względną zmianę obszaru unaczynionego w czasie w dniach 7., 9. i 11., przyjmując dzień 7. jako punkt odniesienia. Obliczono je według wzoru: tempo angiogenezy = [(obszar unaczyniony w wskazanym punkcie czasowym − obszar unaczyniony w dniu 7.) / obszar unaczyniony w dniu 7.] × 100%. Dane dotyczące tempa angiogenezy przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów. (C) Reprezentatywny obraz kiełkowania śródbłonka w komórkach HUVEC po 7 dniach hodowli. Obraz uzyskano przy użyciu powiększenia 20×. Pasek skali = 10 µm. (D) Przeglądowy obraz konfokalny przedstawiający ogólną morfologię trójwymiarowego systemu hodowli. Obraz uzyskano przy użyciu skanowania 4×. Pasek skali = 500 µm. (E) Analiza ilościowa liczby kiełków w komórkach HUVEC. Liczbę kiełków liczyli niezależnie trzech obserwatorów, a do analizy wykorzystano wartość średnią. Dla tych opisowych analiz ilościowych nie przeprowadzono porównań statystycznych. Struktury kiełkowania śródbłonka przedstawione na tej rycini pochodzą z mikronośników pokrytych komórkami HUVEC; jako nadkładające komórki wspierające wykorzystano HOMFs, których nie znakowano specyficznie na obrazach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Nieoptymalne wyniki w trójwymiarowym modelu HUVEC. (A) Śmierć komórek. Jak wskazuje biała strzałka, komórki widoczne są jako punktowe szczątki, a powierzchnia kuleczki mikronośnika staje się gładka. Pasek skali = 50 µm. (B) Pęknięcie kuleczki mikronośnika, wskazane białą strzałką. Pasek skali = 50 µm. (C) Agregacja komórek na powierzchni kuleczki mikronośnika. Jak wskazuje biała strzałka, komórki wykazują skupienie o wyglądzie kuleczkowatym. Pasek skali = 50 µm. (D) Rozległe tworzenie się pęcherzyków wewnątrz żelu, wskazane białą strzałką. Pasek skali = 100 µm. (E) Lokalny kolaps macierzy, wskazany białą strzałką. Pasek skali = 10 µm. (F) Nadmiernie wysoka gęstość kuleczek mikronośnika. Pasek skali = 10 µm. (G) Nierównomierne pokrycie kuleczki mikronośnika komórkami. Jak wskazuje biała strzałka, jedna strona powierzchni kuleczki pozostaje gładka. Pasek skali = 50 µm. (H) Agregacja kuleczek. Pasek skali = 50 µm. (I,J) Brak wyraźnego wypuszczania pąków lub tylko ograniczone tworzenie się pąków. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Schematyczny opis przebiegu eksperymentu. (A) Przygotowanie HUVEC, HOMF oraz kulek mikronośników z chemicznie sprzężonym, denaturowanym kwasem kolagenem świńskim typu I w odpowiednich warunkach przed rozpoczęciem analizy. (B) Mieszanie HUVEC z przygotowanymi kulkami mikronośników w celu promowania przylegania komórek śródbłonka do powierzchni kulek. (C) Inkubacja w celu powlekania kulek z delikatnym odwracaniem co 20 min przez 12 h dla zapewnienia równomiernego przylegania komórek śródbłonka. (D) Przeniesienie powlekanych kulek do kolby hodowlanej w celu dalszej inkubacji, aby umożliwić trwałe przyleganie komórek śródbłonka do powierzchni kulek mikronośników. (E) Osadzenie kulek mikronośników powlekanych HUVEC w macierzy błony podstawnej, a następnie wysiew HOMF na wierzch żelu w celu zapewnienia pochodzącego ze zrębu wsparcia parakrynowego dla kiełkowania śródbłonka i przebudowy przypominającej naczynia krwionośne. (F) Obserwacje mikroskopowe i analiza ilościowa kiełkowania śródbłonka, tworzenia struktur przypominających światło naczynia, połączeń między kiełkami, liczby kiełków oraz obszaru unaczynionego w dniach 7, 9 i 11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje zmodyfikowany trójwymiarowy model rozrastania komórek endotelialnych oparty na kulkach mikronośnika. Rysunek 3 zawiera schematyczne przedstawienie przepływu eksperymentu. Protokół został dostosowany z klasycznego testu angiogeneszy opisanego przez Nakatsu i Hughes i zoptymalizowany, aby spełnić cele niniejszego badania8,9. W klasycznym układzie komórki endotelialne są pokrywane na nasionkach mikronośnika pokrytych kolagenem, osadzone w trójwymiarowym macierzy i hodowane razem z fibroblastami, aby wspierać rozrastanie, wydłużanie, tworzenie światła i łączenie naczyń krwionośnych podobne do naczyń krwionośnych7,10. W niniejszym protokole zastosowano macierz błony podstawnej zamiast żelu fibryny, a jako komórki wspierające zastosowano fibroblasty śluzówki jamy ustnej człowieka, co umożliwiło utworzenie wygodnego trójwymiarowego układu hodowlany do in vitro obserwacji zachowania angiogeneszy endotelialnej. Struktury rozrastania przedstawione na reprezentatywnych obrazach pochodzą z pokrytych HUVEC kulek mikronośnika, podczas gdy fibroblasty śluzówki jamy ustnej człowieka są wysiewane jako komórki wspierające nakładki i nie są specjalnie oznakowane na tych obrazach.

Ważną cechą tego protokołu jest zastosowanie macierzy błony podstawnej zamiast klasycznego układu żelu fibryny. Z punktu widzenia eksperymentu macierz błony podstawnej upraszcza przygotowanie testu, ponieważ jest gotowa do użycia, ulega szybkiej żelifikacji zależnej od temperatury i umożliwia wygodne osadzenie pokrytych komórkami endotelialnymi kulek mikronośnika bez konieczności osobnego przygotowania fibrynogenu, trombiny lub aprotyniny. Ta cecha sprawia, że protokół jest stosunkowo prosty i odpowiedni do rutynowej obserwacji mikroskopowej. Jednak ta modyfikacja zmienia również środowisko biologiczne testu. W przeciwieństwie do żelu fibryny macierz błony podstawnej zawiera składniki pozakomórkowej macierzy związane z błoną podstawną oraz bioaktywne sygnały, które mogą wpływać na adhezję endotelialną, migrację, rozciąganie pędów, morfologię przypominającą światło i remodelację sieci. Ponadto różnice w sztywności macierzy, degradacji i składzie ligandów mogą wpływać na kinetykę rozrastania i morfologię sieci. Dlatego wyniki uzyskane za pomocą tego zmodyfikowanego testu należy interpretować jako wyniki modelu rozrastania kulek mikronośnika opartego na macierzy błony podstawnej, a nie jako bezpośredni odpowiednik oryginalnego testu opartego na fibrynie.

Skuteczne utworzenie tego modelu zależy od kilku kluczowych kroków. Równomierne pokrycie komórek endotelialnych na powierzchni kulki mikronośnika jest niezbędne do spójnego inicjowania i rozrastania pędów. Nieodpowiednie lub nierównomierne pokrycie może prowadzić do zmniejszenia liczby pędów, słabego wzrostu kierunkowego i zmniejszenia powtarzalności. Stabilne tworzenie żelu to kolejny kluczowy czynnik wpływający na wydajność testu. Podczas przygotowywania macierzy i osadzenia niewłaściwa kontrola temperatury może prowadzić do przedwczesnego żelowania, nierównomiernego rozkładu kulek lub tworzenia pęcherzyków, co może przeszkadzać w rozrostanciu endotelialnym. Ponadto fibroblasty wspierające są wymagane do zapewnienia trwałych sygnałów parakrynnych, które sprzyjają wzrostowi i stabilizacji pędów. Staranne sterowanie tymi krokami jest zatem niezbędne do uzyskania stabilnych i powtarzalnych wyników.

Kilka środków może poprawić spójność testu. Reprezentatywne nieoptymalne wyniki przedstawione na Rysunku 2 mogą być użyte jako praktyczne wskazówki do rozwiązywania problemów. Rozległa śmierć komórek może wynikać z niskiej żywotności komórek, nadmiernego trawienia podczas odczepiania komórek, niewłaściwej liczby przejść lub opóźnionej wymiany pożywki; dlatego zaleca się używanie zdrowych komórek endotelialnych w fazie logistycznej i delikatnego trawienia enzymatycznego. Pękanie kulek mikronośnika lub skupianie się kulek może być spowodowane energicznym pipetowaniem, nadmiernym wzburzeniem mechanicznym lub nieodpowiednim resuspendowaniem kulek, co można zmniejszyć delikatnym mieszaniem i ostrożnym postępowaniem podczas przygotowywania i pokrywania kulek. Równomierne pokrycie komórek endotelialnych lub duże skupienia komórek na powierzchni kulki zazwyczaj wskazują na niedostateczne mieszanie, nadmierną gęstość komórek lub nieodpowiedni kontakt kula-komórka podczas okresu pokrywania; w takim przypadku zawiesina komórek i kulek należy delikatnie odwracać w regularnych odstępach czasu i badać przed osadzeniem. Tworzenie pęcherzyków i lokalne zapadnięcie się macierzy są zwykle związane z niewłaściwym postępowaniem z macierzą, przedwczesnym żelowaniem lub zaburzeniem żelu podczas dodawania lub wymiany pożywki; utrzymywanie macierzy na lodzie przed użyciem, unikanie pęcherzyków powietrza podczas rozdzielania, pozwolenie na całkowite żelowanie i powolne dodawanie pożywki wzdłuż ścianki dołka mogą zmniejszyć te problemy. Kultury, które nie wykazują wyraźnego rozrastania lub tylko ograniczonego tworzenia pędów, mogą wskazywać

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy wyrażają wdzięczność za wsparcie finansowe ze strony Stacji Eksperckiej Zhang Yi Prowincji Junnan (202305AF150444) oraz Funduszu Innowacji Edukacji Podyplomowej Uniwersytetu Medycznego w Kunming (2025S234).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1.5 mL microcentrifuge tubeBeyotimeFTUB306Przezroczysty, wolny od nukleaz
15 mL centrifuge tubeHaier311005Stożkowe dno, sterylne, zapakowane w worki
24-well cell culture plateHaier612003Płaskie dno, przeznaczone do hodowli tkankowej, indywidualnie zapakowane, do hodowli komórek przywierających
Automated cell counting slideCountstar12-0005-50Jednorazowa płytka do automatycznego licznika komórek, 50 płytek/opakowanie
CO2 cell culture incubatorThermo Fisher Scientific3110Używany do hodowli komórek w 37 °C z 5% CO2
Cytodex 3 microcarriersCytiva17048503Suchy proszek; kolażenowo-dekstranowe kulki mikronosników
Dotted Line pluginN/AN/AWtyczka do wizualizacji regionu zainteresowania, używana do wyświetlania obrysowanych obszarów unaczynnione
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucoseEvaCell (EVA Life Sciences)E2102Podstawowe DMEM (1×), zawierające 4,5 g/L D-glukozy, L-glutaminę i 110 mg/L sodu pirogronianu, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)ScienCell Research Laboratories1001Podstawowe medium do hodowli komórek śródbłonkowych uzupełnione dodatkowym FBS do końcowej koncentracji 10% przed użyciem
Fetal bovine serum (FBS)Gibco10099141CSprawdzone, jednorazowego użytku, pochodzenia australijskiego, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical UniversityN/APierwotne fibroblasty izolowany z ludzkiej błony śluzowej jamy ustnej; uprzejmie dostarczone przez inne laboratorium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)In-houseN/APierwotne komórki śródbłonkowe izolowany z ludzkich żył pępowinowych; bez numeru katalogowego
ImageJ softwareNational Institutes of Health (NIH), USAN/AOprogramowanie open-source; wersja 1.54p
Inverted microscopeOlympus, JapanN/ADo obrazowania w świetle przeciwnym, kontraście fazowym i fluorescencji
Laser scanning confocal microscopeNikon, JapanN/ADo obrazowania konfokalnego; model nie określony
Matrigel basement membrane matrixCorning354262Wysokie stężenie (HC), bez fenolu czerwonego, bez LDEV, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)Gibco15140-122Roztwór penicyliny i streptomycyny do hodowli komórek, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)LiJi BioAC08L0111×, sterylne, 500 mL
T25 cell culture flaskABCBIOABC707008T25, naczynie z wentylem, przeznaczone do hodowli komórek, do hodowli przywierających komórek
Trypsin-EDTA (0.25%)Gibco25200-056Roztwór trypsyny-EDTA 0,25%, 100 mL

Bibliografia

  1. Shaw P, et al. VEGF signaling: role in angiogenesis and beyond. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2024;1879(2):189079.
  2. Dudley AC, Griffioen AW. The modes of angiogenesis: an updated perspective. Angiogenesis. 2023;26(4):477-480.
  3. Naderi-Meshkin H, et al. Vascular organoids: unveiling advantages, applications, challenges, and disease modelling strategies. Stem Cell Res Ther. 2023;14(1):292.
  4. Davis GE, Kemp SS. Extracellular matrix regulation of vascular morphogenesis, maturation, and stabilization. Cold Spring Harb Perspect Med. 2023;13(4):a041156.
  5. Berndt S, et al. Angiogenesis is differentially modulated by platelet-derived products. Biomedicines. 2021;9(3):251.
  6. Eglinger J, Karsjens H, Lammert E. Quantitative assessment of angiogenesis and pericyte coverage in human cell-derived vascular sprouts. Inflamm Regen. 2017;37:2.
  7. Carpentier G, et al. Angiogenesis Analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of endothelial tube formation assay and fibrin bead assay. Sci Rep. 2020;10:11568.
  8. Boscolo E, et al. NRASQ61R mutation in human endothelial cells causes vascular malformations. Angiogenesis. 2022;25(3):331-342.
  9. Nakatsu MN, Hughes CCW. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 2008;443:65-82.
  10. Gordon E, Schimmel L, Frye M. The importance of mechanical forces for in vitro endothelial cell biology. Front Physiol. 2020;11:684.
  11. Huang X, et al. Current advances in 3D dynamic cell culture systems. Gels. 2022;8(12):829.
  12. Langhans SA. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Front Pharmacol. 2018;9:6.
  13. Friend NE, McCoy AJ, Stegemann JP, Putnam AJ. A combination of matrix stiffness and degradability dictate microvascular network assembly and remodeling in cell-laden poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 2023;295:122050.
  14. Wang WY, et al. Direct comparison of angiogenesis in natural and synthetic biomaterials reveals that matrix porosity regulates endothelial cell invasion speed and sprout diameter. Acta Biomater. 2021;135:260-273.
  15. Liu J, et al. Synthetic extracellular matrices with tailored adhesiveness and degradability support lumen formation during angiogenic sprouting. Nat Commun. 2021;12(1):3402.
  16. Boos F, et al. The endothelial-enriched lncRNA LINC00607 mediates angiogenic function. Basic Res Cardiol. 2023;118(1):5.
  17. Lee S, et al. Angiogenesis-on-a-chip coupled with single-cell RNA sequencing reveals spatially differential activations of autophagy along angiogenic sprouts. Nat Commun. 2024;15:230.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

BiologiaNumer 234Numer 234Warto pustaNumerkuleczki mikrono nikowetr jwymiarowa hodowla kom rekkie kowanie r db onkamacierz b ony podstawnejkokultura fibroblast wtworzenie wiat a naczynia
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły