Artykuł metodologiczny

Anestezja elektryczna wspomagana izofluaranem u szczurów z modelem oligoasthenozoospermii

DOI:

10.3791/71878

⸱

16 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ningxia Medical University School of Traditional Chinese Medicine, 2Medical College of Acu-Moxi and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Dryness Syndrome in Chinese Medicine, Ministry of Education, Ningxia Regional Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Regional High Incidence Disease, Ningxia Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje ustanowienie modelu oligoastenoteratozoospermii indukowanej adeniną u szczurów i późniejsze stosowanie elektroakupunktury w punktach CV3, CV4, ST36 i SP6 pod znieczuleniem izofluranem. Wyniki zostały zweryfikowane za pomocą komputerowej analizy nasienia pod kątem liczby i ruchliwości plemników, a także za pomocą histologii jąder z barwieniem hematoksyliną i eozyną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligoasthenozoospermia jest jedną z najczęstszych form męskich zaburzeń rozrodczych. W badaniach na gryzoniach, stosowanie elektroakupunktury (EA) konsekwentnie przez wielokrotne sesje stanowi wyzwanie techniczne, szczególnie przy łączeniu punktów akupunkturowych linii środkowej brzucha i kończyn dolnych, gdzie stabilny kontakt elektrod jest krytyczny. Punkty Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) i Sanyinjiao (SP6) zostały wybrane, ponieważ są często stosowane w protokołach akupunktury w przypadku niepłodności i nieprawidłowości nasienia, a konfiguracja linii środkowej brzucha plus kończyn dolnych pasuje do standaryzowanego łączenia elektrod. Niniejszy raport opisuje praktyczny protokół ustanowienia modelu szczurów z oligoasthenozoospermią indukowaną adeniną oraz stosowania elektroakupunktury wspomaganej izofluaranem z pojedynczą stymulacją CV3–CV4 i ST36–SP6. Samicom szczurów Sprague-Dawley podawane było adenina drogą doustną codziennie przez 28 dni w celu wywołania upośledzenia rozrodczego. Następnie, przez 28 dni podawano EA codziennie pod znieczuleniem inhalacyjnym, stosując 3% izofluarane do indukcji i 1,5% do utrzymania znieczulenia maską, aby umożliwić stabilne umieszczenie igieł i łączenie elektrod (CV3–CV4 i ST36–SP6) z określonymi parametrami stymulacji (2 Hz, 1,5 mA, 30 min). Efekty leczenia oceniono za pomocą komputerowej analizy nasienka na liczbę i ruchliwość plemników, uzupełnionej histologią jąder hematoksyliną i eozyną (HE). Wyniki pokazują, że ekspozycja na adeninę zmniejszyła liczbę plemników i ich ruchliwość oraz zaburzyła architekturę kanalików nasiennych, podczas gdy EA była związana z częściowym powrótem do normy zarówno w parametrach nasienka, jak i w morfologii jąder. Ten protokół oferuje gotowy wzorzec do badań wymagających spójnego stosowania EA i weryfikacji nasienka/histologicznej w modelowaniu szczurów z oligoasthenozoospermią.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynniki związane z mężczyzną znacząco przyczyniają się do niepłodności, stanowiąc około połowy wszystkich par z niepłodnością, przy czym nieprawidłowości w liczbie i ruchliwości plemników należą do najczęstszych ustaleń klinicznych1,2. Oligoasthenozoospermia, charakteryzująca się obniżoną koncentracją plemników i upośledzoną ruchliwością, jest jedną z najczęstszych postaci męskiej dysfunkcji rozrodczej3,4. Mimo dostępności wspomaganej terapii rozrodczej i empirycznych terapii medycznych, efektywne strategie poprawy jakości spermy pozostają ograniczone, co podkreśla potrzebę dalszych badań przedklinicznych5,6,7. Te kliniczne i translacyjne potrzeby motywują rozwój odtwarzalnych eksperymentalnych przepływów pracy do badania męskiej dysfunkcji rozrodczej w kontrolowanych warunkach.

Interwencje akupunkturowe były badane w kontekście nieprawidłowości spermy i męskiej niepłodności zarówno w kontekście klinicznym, jak i eksperymentalnym8. Chociaż badania kliniczne sugerują potencjalne korzyści dla niektórych parametrów spermy, ich projekty, protokoły interwencji i mierniki wyników różnią się znacznie9. Elektroakupunktura (EA) jest szczególnie odpowiednia do badań laboratoryjnych, ponieważ oferuje kontrolowane parametry stymulacji i bardziej jednolite regulacje niż manualna akupunktura, co ułatwia ocenę zmian związanych z leczeniem w wymiaralnych wynikach rozrodczych10,11,12. Ta przeważająca przewaga proceduralna sprawia, że EA jest dobrze dostosowany do strukturalnych przepływów pracy przedklinicznych w badaniach nad męską funkcją rozrodczą.

Modele zwierzęce są kluczowe dla takiej oceny, ale wybór modelu pozostaje kluczową kwestią metodologiczną w badaniach nad oligoasthenozoospermią. Niedawny przegląd systematyczny stwierdził, że metody modelowania indukowane busulfanem są kontrowersyjne i wykazują znaczną niejednorodność w wskaźnikach oceny, podkreślając potrzebę jasniejszych procedur i bardziej spójnych wyników13. Modele oparte na adeninie zapewniają praktyczne podejście eksperymentalne, ponieważ podawanie adeniny przez sondę może wywoływać upośledzenie funkcji rozrodczych u szczurów, w tym zmniejszenie wskaźników związanych ze spermą i uszkodzenie histologiczne tkanki jąder14,15. W naszych wcześniejszych badaniach, model szczura z oligoasthenozoospermią indukowaną adeniną był leczony EA w zestawie punktów akupunkturowych Shu-Mu (Epangsanxian, BL23, GB25 i KI3), obok warunków kontrolnych bez punktów akupunkturowych i warunków kontrolnych z lekiem, z rozszerzonymi miernikami wyników, w tym współczynnikami narządów i poziomami hormonów w surowicy określonymi przez ELISA16. Budując na tej eksperymentalnej podstawie i rozpoznając niejednorodność w wyborze punktów akupunkturowych, projekcie kontrolnym, parametrach stymulacji i miernikach wyników w istniejących badaniach EA, obecny protokół został zaprojektowany w celu udoskonalenia i rozszerzenia metodologicznego przepływu pracy dla stabilnej dostarczenia EA.

Zatem obecny protokół koncentruje się na dostarczaniu, uwzględniając dwie praktyczne zmienne krytyczne dla powtarzanych sesji EA u szczurów. Po pierwsze, aby zapobiec przemieszczeniu się igły i przerywanemu kontaktowi elektrod spowodowanym ruchem zwierzęcia i ciągnięciu przewodów, opisujemy procedurę utrzymywaną z izofluarane, która stabilizuje pozycjonowanie podczas stymulacji i zapewnia niezawodny kontakt elektrod w różnych sesjach; jest to szczególnie ważne przy łączeniu punktów środkowych linii brzusznej z punktami kończyn tylnych. Po drugie, na podstawie wcześniejszych przeglądów i analiz przepisów punktów akupunkturowych9,17, identyfikując CV4, SP6, ST36 i CV3 jako wspólne punkty akupunkturowe rozrodcze w protokołach niepłodności i nieprawidłowości spermy, wybraliśmy CV3, CV4, ST36 i SP6 i zastosowaliśmy sparowaną stymulację do CV3-CV4 i ST36-SP6. Ta konfiguracja, która łączy punkty środkowe linii brzusznej i punkty kończyn tylnych, standaryzuje połączenia elektrod, minimalizuje zmienność spowodowana niestabilnym przymocowaniem przewodów i wspiera odtwarzalne dostarczanie EA w powtarzanych sesjach leczenia. Aby zachować zakres zorientowany na protokół i uniknąć powtarzania wcześniej zgłaszanych modułów dotyczących endokrynologii, mechanizmu działania lub kontroli pozytywnej, weryfikacja wyników jest ograniczona do podstawowego zestawu odczytów dotyczących spermy i jąder. Zestaw ten obejmuje komputerową analizę plemników i barwienie HE jąder, co jest wystarczające, aby potwierdzić pomyślne wywołanie fenotypu i zmiany związane z leczeniem w ramach tego przepływu pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zwierzęce zgodne były z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Ningxia Medical University (numer zgody IACUC-NYLAC-2021-130). Samiec szczura Sprague-Dawley, w wieku 8 tygodni i o wadze 180–220 g, zostały uzyskane z Experimental Animal Center Ningxia Medical University (numer licencji SYXK (Ning) 2020-0001). Zwierzęta były przetrzymywane w standardowych warunkach laboratoryjnych w temperaturze 22–24 °C i 52%–56% wilgotności względnej z cyklem 12 godzin światła/12 godzin ciemności, a miały swobodny dostęp do pokarmu i wody.

1. Przygotowanie zwierząt, przydział do grup i utworzenie modelu indukowanego adeniną

  1. Aklimatyzuj szczury przez 7 dni przed eksperymentem i monitoruj ich ogólny stan codziennie.
  2. Po aklimatyzacji, przypisz dziewięciu szczurom unikalne numery identyfikacyjne i losowo przydziel je w proporcji 1:1:1 do trzech grup za pomocą komputerowej sekwencji losowej: grupa kontrolna (n = 3), grupa modelowa (n = 3) i grupa EA (n = 3). Używaj każdego szczura jako jednostki eksperymentalnej i uwzględnij wszystkie zwierzęta i próbki w końcowej analizie, chyba że spełnione są wcześniej określone kryteria wykluczenia.
  3. Zachowaj ślepotę badaczy przeprowadzających komputerową analizę nasienia i oceny histologicznej.
    UWAGA: Badacze stosujący EA nie mogą być ślepi, ponieważ interwencja obejmuje widoczne procedury specyficzne dla grupy.
  4. Przygotuj zawiesinę 20 mg/mL adeniny w fizjologicznym roztworze soli zawierającą 0,5% (w/v) gumy arabskiej jako środka zawieszającego i dokładnie wymieszaj zarówno przed jak i podczas oro-sondowania, aby zapobiec sedymentacji.
  5. Podawaj fizjologiczny roztwór soli szczurom z grupy kontrolnej i zawiesinę adeniny grupom modelowej i EA oro-sondową w dawce 10 mL/kg, równoważnej 1 mL/100 g masy ciała, raz dziennie przez 28 kolejnych dni. Zastosuj dawkę adeniny 200 mg/kg/dzień.
  6. Rejestruj masę ciała i ogólny stan przez cały okres modelowania.
    UWAGA: Adenina jest podawana jako zawiesina i ma tendencję do sedymentacji podczas manipulacji. Podczas oro-sondowania utrzymuj ciągłe mieszanie, aby zminimalizować osadzanie, które w przeciwnym razie może powodować nierównomierność dawkowania i blokadę igły do oro-sondowania. Jeśli wystąpi zatkanie, ponownie dokładnie zawieś roztwór i wymień igłę do oro-sondowania przed kontynuowaniem.

2. Znieczulenie izofluranu dla dostarczenia elektroakupunktury (Rysunek 1)

  1. Przygotuj system znieczulenia izofluranu z komorą indukcyjną, maską na nos i podgrzewaną poduszką.
  2. Wprowadź znieczulenie z 3% izofluranu w komorze indukcyjnej, aż samoistna aktywność znacząco zmniejszy się.
  3. Przenieś szczura na podgrzaną poduszkę w pozycji leżącej na plecach i utrzymuj znieczulenie z 1,5% izofluranu przez maskę na nos przez cały czas elektroakupunktury.
  4. Potwierdź adekwatne znieczulenie poprzez zmniejszenie samoistnego ruchu i utrata odruchu mruganki przy zachowaniu regularnego oddychania.

3. Wierność dostarczenia stymulacji i kontrola jakości

  1. Użyj podgrzanej poduszki, aby utrzymać temperaturę ciała przez całe trwanie sesji i zmniejszyć zmienność fizjologiczną z powodu hipotermii.
  2. Zastosuj jednolite ustawienia znieczulenia dla wszystkich zwierząt i sesji, stosując 3% izofluran do indukcji i 1,5% izofluran do utrzymania. Utrzymuj głębokość znieczulenia na minimalnym poziomie potrzebnym, aby zapobiec zmaganiom, zachowując jednocześnie regularne oddychanie.
  3. Wsuń sterylne jednorazowe igły akupunkturowe (0,25 mm × 13 mm) pionowo w wybranych punktach akupunkturowych. Wsuń igły na głębokość około 2 mm w punkcie CV3 i CV4, 7 mm w punkcie ST36 i 5 mm w punkcie SP6.
  4. Po włożeniu igieł i podłączeniu elektrod, wizualnie upewnij się, że każda igła pozostaje stabilnie ustawiona, bez obserwowalnego luzu z powodu oddechu lub ruchu kończyn. Jeśli wystąpi przemieszczenie, ponownie wsuń igłę pionowo na oryginalną głębokość i upewnij się stabilnego kontaktu elektrod przed wznowieniem stymulacji.
  5. Przytnij przewody elektrodowe w pobliżu proksymalnego końca trzonka igły, a następnie poprowadź je i zabezpiecz, aby zminimalizować naciąg, ponieważ ciężar przewodów i ich pociąganie są częstymi przyczynami oderwania.
  6. Potwierdź efektywną stymulację, obserwując łagodny drżenie mięśniowe w punkcie akupunkturowym bez ogólnego ruchu ciała. Jeśli brak drżenia, ponownie sprawdź i potwierdź kontakt elektrod i umiejscowienie igieł.
  7. Wykonaj pojedynczą standaryzowaną kontrolę w połowie sesji po 15 minutach. Jeśli konieczne, ponownie wyreguluj igły i potwierdź łagodne dr

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza nasienia (Rysunek 3)
Suspensje plemników z najądrza przeanalizowano za pomocą komputerowego systemu analizy nasienia w celu określenia liczby i ruchliwości plemników. W tym reprezentatywnym zestawie danych, podawanie adeniny znacząco zmniejszyło oba parametry względem grupy kontrolnej, potwierdzając pomyślne utworzenie modelu. Interwencja EA następnie zwiększyła liczbę i ruchliwość plemników w porównaniu z grupą modelową (Rysunek 3). Analiza jednoczynnikowa ANOVA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mając na uwadze wieloczynnikową etiologię oligoasthenozoospermii oraz ograniczoną skuteczność dostępnych farmakologicznych metod leczenia, akupunktura i EA zyskały uznanie jako powtarzalne, niefarmakologiczne interwencje19. Istniejąca literatura kliniczna i eksperymentalna sugeruje kilka prawdopodobnych mechanizmów, za pomocą których akupunktura lub EA mogą wpływać na funkcję rozrodczą mężczyzn, w tym modulacja regulacji neuroendokrynnych, poprawa mikrokrążenia w narządach rozrodczych oraz zmniejs...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych lub niefinansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez Narodowe Fundusz Nauki Przyrodniczej Regionu Chin 2024 (82460972) oraz Narodowe Fundusz Nauki Przyrodniczej Regionu Chin 2022 (82260967); Program Kluczowych Badań i Rozwoju Regionu Autonomicznego Ningxia Hui 2022 (2022BEG02040); Projekt Budowy Dyscypliny Pierwszej Klasy Szkoły Medycyny Tradycyjnej Chińskiej, Ningxia Medical University (ZY0019110305); Program Kluczowych Badań i Rozwoju Powiatu Yanchi 2023 (2023YCYDCT003); oraz Specjalny Program Nauki i Technologii na rzecz Ludu Regionu Autonomicznego Ningxia Hui (2024CMG03054).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdenineBeijing Solarbio Science & Technology Co.Ltd.A8330
CASA computer-assisted semen analysis systemNanning Songjing Tianlun Biotechnology Co.,Ltd.VICOS-SPERM
CentrifugeSartoriusA-14C
Differentiation fluidShanghai Biyuntian Biotechnology Co.,LtdC0163M
Disposable sterile acupuncture needlesHanyi brand0.25 mm ´ 13 mm
Drying machineLeicaHI1220
Electrical stimulatorChangzhou Yingdi Electronic Medical Device Co., LtdKWD-808I
Electronic balanceHangzhou Youheng Weighing Equipment Co.,LtdHLD-6002
Eosin Y Stain SolutionLanke BiotechBS248
Hematoxylin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co. LTDBA-4041
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10
MicrotomeLeicaRM2255
Neutral balsamBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.,LtdZli-9555
Paraffin embedding machineLeicaHistoCore Arcadia H
SD ratsAnimal Center of Ningxia Medical University8-week-old,Male,180-220 g
Slide scannerLeicaAperio LV1
Small Animal Anesthesia MachineRWD Life Science Co., Ltd.R500
Vortex oscillatorHaimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co.,LtdQL-902
Warming padDongguan Hongda Electronics Co., Ltd.45W-80X28CM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Björndahl, L., et al. The sixth edition of the WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen: ensuring quality and standardization in basic examination of human ejaculates. Fertil Steril. 117 (2), 246-251 (2022).
  2. Agarwal, A., et al. Male infertility. Lancet. 397 (10271), 319-333 (2021).
  3. Abu-Halima, M., et al. Sperm motility annotated genes: are they associated with impaired fecundity? Cells. 12 (9), 21(2023).
  4. Li, S. L., et al. Mechanisms of traditional Chinese medicine in regulating Nrf2-related signaling pathways for the treatment of oligoasthenozoospermia: a review. J Ethnopharmacol. 360, 21(2026).
  5. Pathak, U. I., Gabrielsen, J. S., Lipshultz, L. Cutting-edge evaluation of male infertility. Urol Clin North Am. 47 (2), 129(2020).
  6. Kimmins, S., et al. Frequency, morbidity and equity - the case for increased research on male fertility. Nat Rev Urol. 21 (2), 102-124 (2024).
  7. Assidi, M. Infertility in men: advances towards a comprehensive and integrative strategy for precision theranostics. Cells. 11 (10), 29(2022).
  8. Feng, J. X., et al. The efficacy and mechanism of acupuncture in the treatment of male infertility: a literature review. Front Endocrinol. 13, 14(2022).
  9. You, F., Ruan, L. G., Zeng, L., Zhang, Y. Efficacy and safety of acupuncture for the treatment of oligoasthenozoospermia: a systematic review. Andrologia. 52 (1), 9(2020).
  10. Wei, J. Q., et al. Bibliometric and visualized analysis of electroacupuncture in the past 10 years. Complement Ther Med. 69, 10(2022).
  11. Yu, Y., et al. Effects and mechanism of action of transcutaneous electrical acupuncture point stimulation in patients with abnormal semen parameters. Acupunct Med. 37 (1), 25-32 (2019).
  12. Jia, W., Wang, C. A., Yin, Y. Acupuncture for oligospermia and asthenozoospermia: a systematic review and meta-analysis. Medicine. 100 (48), 8(2021).
  13. Pu, R. Y., et al. Modeling methods for busulfan-induced oligospermia and asthenozoospermia in mice: a systematic review and meta-analysis. J Assist Reprod Genet. 40 (1), 19-32 (2023).
  14. Yu, Z. Z., Chen, J., Shou, P. Q., Feng, L. Effects of micronutrients on the reproduction of infertility rat model induced by adenine. Int J Clin Exp Med. 7 (9), 2754-2762 (2014).
  15. Zhu, C. Z., et al. Short-term oral gavage administration of adenine induces a model of fibrotic kidney disease in rats. J Pharmacol Toxicol Methods. 94, 34-43 (2018).
  16. Li, K. Y., et al. Mechanism of Shu-Mu brain-kidney acupoint in treating oligoasthenospermia in rats via the hypothalamic-pituitary-testicular axis. J Vis Exp. (219), e67912(2025).
  17. Liu, J., et al. Exploration of acupoint compatibility patterns in acupuncture treatment for infertility based on data mining. Int J Womens Health. 18, 15(2026).
  18. Tang, Y. Experimental Acupuncture and Moxibustion Science. , Shanghai Science and Technology Press. Shanghai. (2021).
  19. Wang, Z., et al. Efficacy and safety of nonpharmacological strategies for the treatment of oligoasthenozoospermia: a systematic review and Bayesian network meta-analysis. Eur J Med Res. 28 (1), 16(2023).
  20. He, Y., et al. Acupuncture treatment of male infertility: a systematic review. Zhonghua Nan Ke Xue. 21 (7), 637-645 (2015).
  21. Napadow, V., et al. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
  22. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Front Vet Sci. 10, 13(2023).
  23. Rinwa, P., Eriksson, M., Cotgreave, I., Backberg, M. 3R-refinement principles: elevating rodent well-being and research quality. Lab Anim Res. 40 (1), 11(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oligoasthenozoospermia ModelElectroacupuncture ProtocolIsoflurane AnesthesiaRat Reproductive DysfunctionAdenine Induced ModelSperm MotilitySperm CountAcupuncture AcupointsSemen AnalysisTesticular Histology

Powiązane artykuły