Wzbogacanie tyreotropi z przysadki mysich z hipotyreoidyzmem za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie opartych na CD90

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wzbogacanie tyreotropi z dorosłych gruczołów przytarczy myszy z niedoczynnością tarczycy za pomocą dysocjacji enzymatycznej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie opartych na CD90, umożliwiając analizy molekularne i krótkoterminową kulturę pierwotną populacji komórek wzbogaconych w tyreotropi.

Streszczenie

Tyrotrpy to specjalistyczne komórki gruczołu przedniego przysadki, które wydziela hormon stymulujący tarczycę (TSH) i regulują jej aktywność. Wydzielanie TSH jest pozytywnie regulowane przez hormon uwalniający tyreotropiny podwzgórza i negatywnie regulowane przez krążące hormony tarczycy. Tyrotropy stanowią tylko niewielką frakcję komórek przysadki (~5%), co komplikuje wysiłki związane z izolacją i badaniem ich fizjologii. Przedstawiamy tu ulepszoną metodę izolacji tyrotrpów z dorosłych myszy z niedoczynnością tarczycy. Niedoczynność tarczycy została wywołana w celu rozszerzenia populacji tyrotrpów przed enzymatyczną dysocjacją gruczołu przedniego przysadki i sortowaniem komórek aktywowane przez fluorescencję z wykorzystaniem antygenu powierzchniowego CD90.2. Przetwarzanie gruczołów przednich przysadki z dwunastu myszy dało około 1,5 × 10⁶ CD90.2-dodatnich komórek wzbogaconych w ekspresję RNA kurierskiej Tshb. Komórki CD90.2-dodatnie stanowiły około 25% komórek gruczołu przedniego przysadki i wykazywały około pięciokrotnie wyższą ekspresję Tshb w porównaniu z komórkami CD90.2-ujemnymi, co wskazuje na znaczne wzbogacenie w tyrotrpy. Izolowane komórki pozostały żywotne w krótkotrwałej kulturze i zachowały odpowiedź na leczenie trijodotyroniną. Ten protokół umożliwia wzbogacanie i hodowlę myszych tyrotrpów do analizy molekularnych, transkryptomowych, epigenomowych i fizjologicznych.

Wprowadzenie

Przysadka to gruczoł dokrewny zlokalizowany u podstawy mózgu, który sprawuje hierarchiczną kontrolę nad homeostazą hormonalną. Jego aktywność jest regulowana przez sygnały podwzgórza, które stymulują lub hamują produkcję hormonów przysadki, które z kolei rządzą funkcją obwodowych gruczołów dokrewnych. Gruczoł zawiera niejednorodną i dynamiczną populację komórek, w tym komórek macierzystych/przodkowych i zróżnicowanych komórek wytwarzających hormony¹. W odpowiedzi na fizjologiczny stres lub uszkodzenie komórki macierzyste/przodkowe przysadki mogą aktywować się, samoregenerować i zróżnicować na wiele linii wytwarzających hormony^2,3. Strukturalnie, przysadka jest zorganizowana w dwa główne płaty: tylny płat (PL), złożony z pituicytów i neurosekrecyjnych zakończeń, które uwalniają oksytocynę i wazopरेssin, oraz przedni płat (AL), który zawiera specjalizowanych komórek wydzielniczych wydzielających hormon wzrostu, prolaktynę, hormon stymulujący tarczycę (TSH), hormon adrenokortykotropowy oraz gonadotropiny, czyli hormon folikulotropowy (FSH) i hormon luteinizujący (LH). Przednia przysadka zawiera również typy komórek niewydzielniczych, takie jak komórki follikulostelarne dodatnie na S100B, komórki śródbłonka i perycyte, które wspierają funkcję wydzielniczą^4,5,6. Gryzonie dodatkowo zawierają melanotrofy w płacie środkowym gruczołu przysadki^7,8.

Zainteresowanie funkcją, różnicowaniem i rozwojem przysadki napędzało rozwój wielu protokołów mających na celu izolację dorosłych komórek macierzystych i przodkowych przysadki w modelach gryzoni. Szczury są często używane w badaniach fizjologii przysadki, ponieważ ich większe gruczoły przysadkowe dają większą liczbę komórek i poprawiają odzyskiwanie podczas przetwarzania tkanek^4,9. W przeciwieństwie do tego, izolowanie komórek przysadki z myszy jest nadal technicznie trudne, a zstandardyzowane protokoły są ograniczone. Ostatnie protokoły wykorzystujące agregaty dorosłych komórek macierzystych i przodkowych przysadki dostarczają przydatnych narzędzi do modelowania rozwoju i funkcji przysadki¹⁰; jednakże, te systemy nie pozwalają jeszcze na bezpośrednią izolację określonych populacji komórek wydzielniczych. Wśród hormonotwórczych typów komórek przedniej przysadki, tyrotrpofy są głównymi regulatorami osi podwzgórze-przysadka-tarczyca (HPT), kontrolującymi syntezę i wydzielanie hormonu tarczycy (TH) u ssaków. TSH wytwarzane przez tyrotrpofy jest heterodimericzną glikoproteiną składającą się z wspólnej podjednostki α (zakodowanej przez Cga i wspólnej z FSH i LH) oraz podjednostki β (zakodowanej przez Tshb), która nadaje specyficzność receptorową. Te komórki są bardzo wrażliwe na krążące poziomy trijodotyroniny (T3) i tyroksyny (T4). Populacja tyrotrpofi powiększa się, gdy poziomy T3 i T4 są niskie podczas niedoczynności tarczycy i kurczy się podczas nadczynności tarczycy poprzez klasyczny mechanizm sprzężenia zwrotnego ujemnego^11,12,13.

Mimo ich zasadniczej roli fizjologicznej, tyrotrpofy są trudne do badania, ponieważ stanowią tylko małą frakcję komórek przedniej przysadki (około 5%) i dzielą cechy fenotypowe z innymi populacjami dokrewnymi. Ta rzadkość, wraz z brakiem solidnych modeli in vitro, ogranicza badania mechanistyczne nad regulacją tyrotrpofi i kontrolą osi HPT. Linia komórkowa TαT1 reprezentuje powszechnie stosowany model przypominający tyrotrpofy¹⁴, ale nie odzwierciedla w pełni fizjologicznych reakcji; w szczególności, represja zależna od T3 Tshb jest często trudna do oceny z powodu bardzo niskiego bazalnego poziomu transkrypcji¹⁵. W związku z tym, wiele badań opierało się na liniach komórkowych niebędących tyrotrpofy, takich jak HEK293, COS, CV1, GH3 lub komórki JEG3 wytwarzające różne konstrukty Tshb¹⁵. Jednakże, są to systemy heterologowe, które mogą wprowadzać niefizjologiczne artefakty regulacyjne, w tym efekty wynikające z plemników plastydowych, a nie z endogennych mechanizmów transkrypcyjnych.

Przedstawiamy tutaj krok po kroku protokół izolacji tyrotrpofi z dorosłej gruczołu przysadkowego myszy, dostosowany z wcześniej ustanowionych metod u szczurów⁹, i zoptymalizowany pod kątem mniejszego rozmiaru i niższej zawartości tyrotrpofi w przysadce myszy. Wprowadzono kilka kluczowych modyfikacji w celu zwiększenia wydajności komórek wytwarzających Tshb i zapewnienia niezawodnej analizy dółstrumienia. Protokół wykorzystuje ekspresję antygenu powierzchniowego CD90, markera powierzchniowego wzbogaconego w tyrotrpofy. CD90 (znany również jako THY1) jest gliko

Protokół

Ten protokół opisuje izolację tyreotropi z AL świeżo sekcji gruczołów przytarczyczych uzyskanych od dorosłych myszy po co najmniej 1 tygodniu indukcji niedoczynności tarczycy. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania. Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania Uniwersytetu Medycznego w Teksasie zatwierdził wszystkie procedury dotyczące zwierząt.

Samce i samice myszy były łączone podczas eksperymentów, ponieważ nie zaobserwowano różnic w wydajności tyreotropi ani w analizach sekwencyjnych. W każdym eksperymencie użyto około 12 myszy, choć większe grupy do 20 zwierząt można przetworzyć, proporcjonalnie skalując wszystkie objętości reagentów.

Sukces izolacji zależy od szybkiej i konsekwentnej perfuzji, minimalnego czasu sekcji, całkowitego usunięcia PL i wysoko zagęszczonego rozmieszczenia komórek pierwotnych. Zalecane maksymalne przetwarzanie czas między eutanazją, perfuzją, sekcja gruczołu przytarczyczego a rozpoczęciem trawienia enzymatycznego wynosiło 6 godzin. Komórki były hodować w gęstości 2,0-2,5 × 10⁵ komórek na 0,7 cm² dołka (powierzchnia jednego dołka na szklanej kasecie 8-dołkowej). Minimalna żywotność 95% była wymagana do wsparcia krótkotrwałej kultury tyreotropi.

Wszystkie reagenty użyte do wytwarzania pojedynczej zawiesiny komórkowej były przygotowywane w sterylnych warunkach. Powierzchnie robocze były sterylizowań za pomocą 70% etanolu, narzędzia do sekcji były autoklawowane przed użyciem, a wszystkie kroki przygotowania kultury komórek były wykonywane w szafce bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu techniki aseptycznej. Ten protokół został standaryzowany dla 12 zwierząt. Skorzystaj proporcjonalnie ze wszystkich woluminów reagentów, gdy używasz innej liczby myszy. Odwołaj się do Tabeli Materiałów w celu uzyskania informacji na temat wszystkich reagentów, materiałów jednorazowych i sprzętu.

Podczas indukcji niedoczynności tarczycy myszy były trzymane w warunkach bez specyficznych patogenów przy 20°C-24°C i wilgotności względnej 40%-60% z cyklem 12 h światła/12 h ciemności oraz dostępem ad libitum do żywności i wody. Zwierzęta były trzymane w grupach (do trzech myszy na klatkę) w indywidualnie wentylowanych klatkach zawierających standardowe łoże i wzbogacenie środowiskowe, w tym materiał gniazdowy i schronienie. Sukces indukcji niedoczynności tarczycy został potwierdzony poprzez pomiar ekspresji jodothyroninowej deiodylazy wątroby (Dio1). Zmniejszenie o co najmniej 50% ekspresji ribonukleowego kwasu (RNA) messengerowego Dio1 względem kontroli eutyreoidalnych zostało uznane za wskaźnik pomyślnej indukcji niedoczynności tarczycy.

1. Indukcja niedoczynności tarczycy u myszy C57BL/6

UWAGA: Wykonaj ten proces w ciągu 7-10 dni, aby wywołać niedoczynność tarczycy in vivo poprzez dietę biedną w jod i chemiczną inhibicję funkcji tarczycy. Zobacz Rysunek 1A dotyczący projektu eksperymentu i Rysunek 1B dotyczący walidacji indukcji niedoczynności tarczycy.

Rysunek 1. Indukcja niedoczynności tarczycy u myszy C57BL/6. (A) Schematyczne przedstawienie warunków eksperymentu użytych do wywołania niedoczynności tarczycy u dorosłych myszy C57BL/6. Myszy otrzymywały 0,05% metymazol (MMI) i 0,1% perchloranu potasu (KClO₄) w wodzie pitnej razem z dietą biedną w jod przez 7 dni przed izolacją przedniego płata przytarczycy. (B) Analiza odwrotnej transkrypcji ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-qPCR) ekspresji rybonukleinowego kwasu messengerowego (mRNA) Dio1 wątroby u myszy eutyreoidalnych i hipotyreoidalnych. Cyklofilina A (CyA) została użyta jako gen referencyjny. Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) (n = 6 na grupę). Statystyczne znaczenie zostało określone za pomocą testu Studenta. **P < 0,001. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotuj wodę pitną MMI/KClO₄
   1. Rozpuść 1 g MMI i 2 g KClO₄ w 2 L przefiltrowanej wody.
   2. Mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej (20°C-25°C) przez 1 h do całkowitego rozpuszczenia.
      UWAGA: MMI i KClO₄ to niebezpieczne chemikalia. Podczas przygotowywania i obsługi należy nosić rękawiczki, fartuch

Wyniki

Dwanaście 8-tygodniowych myszy C57BL/6 (6 samców i 6 samic) było leczone MMI i KClO₄ w wodzie pitnej razem z dietą ubożą w jod przez 1 tydzień w celu wywołania niedoczynności tarczycy (Rysunek 1A). Ilościowa analiza ekspresji mRNA typu 1 Dio1 w wątrobie została przeprowadzona u myszy eutyreotycznych i hipotyreotycznych, aby potwierdzić pomyślne wywołanie niedoczynności tarczycy²⁹. Myszy hipotyreotyczne wykazywały około 60% redukcję ekspresji mRNA Dio1

Dyskusja

Opisany tutaj protokół FACS oparty na CD90 zapewnia reproduktywnę metodę wzbogacania pierwotnych tyrotropodów z dorosłych tkanek przysadki myszy, zachowując reaktywność hormonalną. Ta metoda rozwiązuje długotrwałą techniczną ograniczenia w badaniach nad biologią tyrotropodów i regulacją osi HPT. Historycznie, badania nad regulacją tyrotropodów opierały się w dużej mierze na linii komórek TαT1; jednak komórki TαT1 wykazują bardzo niską bazową ekspresję Tshb i nie wykazują konsekwentnie kanonicznego tłumienia T3, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.22 µm filter	Corning	430769	Do sterylizacji medium pobierającego
0.22 µm syringe filter	Pall Life Sciences	PN4602	Do sterylizacji kolagenazy
0.5% Trypsin–EDTA	Gibco	15400-054	Do dysocjacji komórek
1.5 mL low-binding microcentrifuge tubes	Invitrogen	AM12450	Do barwienia FACS
15 mL polypropylene tubes	Falcon	352097	Do pobierania płata przedniego i dysocjacji komórek
23-gauge needle	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	Do perfuzji serca
8-well glass chamber slide	Millipore	PEZGS0816	Do hodowli po-FACS
Accudrop beads	BD Biosciences	345249	Do kalibracji opóźnienia kropli podczas FACS
Anti-mouse PE-Cy7 anti-CD90.2 antibody	Invitrogen	25-0902-82	Do barwienia FACS
Automated cell counter	DeNovix	s-10700	Do liczenia komórek
Charcoal-stripped fetal bovine serum	Gibco	12676029	Do hodowli tyreotropi po-FACS
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	Do dysocjacji komórek
Collection pan	Standard laboratory dissection tray	N/A	Do perfuzji serca
Custom-prepared HEPES-buffered saline solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+	N/A	N/A	Do perfuzji i dysocjacji komórek
Cyclophilin A (CyA) oligonucleotide primer forward	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	Do RT-qPCR
Cyclophilin A (CyA) oligonucleotide primer reverse	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	Do RT-qPCR
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	Do medium pobierającego
DNase I solution	Promega	M6101	Do dysocjacji komórek
Enoxaparin sodium injection	Sandoz	0781-3119-64	Do perfuzji
Fetal bovine serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	Do medium pobierającego
Flow cytometry staining buffer	Invitrogen	00-4222-26	Do barwienia FACS
Hemostat	Fine Science Tools	13008-12	Do stabilizacji jamy klatki piersiowej
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	Do medium pobierającego
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	Do przygotowania HBSS
Iodine-deficient diet	Envigo	TD.95007	Do indukcji hipotyreozy in vivo
Iris forceps	Fine Science Tools	11065-07	Do sekcji przysadki
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-017-25	Do znieczulenia
L-glutamine	Gibco	35050-061	Do medium pobierającego
Medium 199	Gibco	11150-059	Do hodowli po-FACS
Methimazole (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	Do indukcji hipotyreozy in vivo
MicroAmp Fast 96-well reaction plate	Applied Biosystems	4346907	Do RT-qPCR
Penicillin–Streptomycin	Gibco	15140122	Do hodowli po-FACS
Peristaltic pump	Fisher Scientific	GP1000	Do perfuzji serca
Potassium perchlorate (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	Do indukcji hipotyreozy in vivo
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	Do RT-qPCR
Propidium iodide	eBioscience	00-6990-50	Do barwienia do oceny żywotności podczas FACS
QIAzol lysis reagent	Qiagen	79306	Do ekstrakcji RNA
Silicone tubing	Cole-Parmer	EW-96410-13	Do perfuzji serca
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745T	Do sekcji płata przedniego
StepOnePlus Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600	Do RT-qPCR
Surgical spoon	Fine Science Tools	10090-13	Do unieruchamiania mózgu podczas ekspozycji przysadki
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit	Roche	4379012001	Do przygotowania cDNA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	Do liczenia komórek
Tshb oligonucleotide primer forward	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	Do RT-qPCR
Tshb oligonucleotide primer reverse	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	Do RT-qPCR
Water bath	Fisher Scientific Isotemp Water Bath	15-462-5Q	Do trawienia enzymatycznego