Znaczenie kliniczne, krajobraz infiltracji immunologicznej i analiza sieci funkcjonalnych miR-192-5p w raku jelita grubego

Podsumowanie

Niniejsze badanie integruje publiczne zestawy danych, walidację w parach tkanek, testy migracji komórek, przewidywanie sieci celów oraz analizę sygnatury immunologicznej w celu oceny roli miR-192-5p w raku jelita grubego. Wyniki wskazują na rozbieżność między danymi ekspresji z TCGA/GDC a lokalnymi wynikami qRT-PCR i przestrzegają przed nadinterpretacją jego znaczenia diagnostycznego, prognostycznego, funkcjonalnego oraz związanego z odpowiedzią immunologiczną.

Streszczenie

Rak jelita grubego (CRC) jest heterogennym nowotworem złośliwym, w którym mikroRNA mogą przyczyniać się do progresji guza i odkrywania biomarkerów. W niniejszym badaniu oceniono znaczenie kliniczne, powiązania immunologiczne i sieć funkcjonalną miR-192-5p w CRC poprzez integrację analiz bioinformatycznych TCGA/GDC i GEO, walidację qRT-PCR w parach tkanek, przewidywanie celów, analizę sygnatury immunologicznej oraz eksperymenty z gojeniem ran w komórkach HT29. Reanaliza danych miRNA-seq z TCGA/GDC obejmująca 616 próbek nowotworowych i 11 prawidłowych próbek COADREAD wykazała wyższy sygnał hsa-mir-192 na poziomie bazy danych w próbkach nowotworowych niż w prawidłowych (test Mann-Whitneya p = 9,96 x 10^-8). Ten sam trend zaobserwowano w 11 sparowanych przypadkach TCGA (mediana różnicy nowotwór-prawidłowa = 3,13 log2[RPM + 1], test Wilcoxona p = 0,0029), podczas gdy lokalne badanie qRT-PCR w sparowanych tkankach klinicznych wykazało niższą ekspresję dojrzałego miR-192-5p w tkankach CRC. Analiza ROC oparta na danych TCGA wykazała silną separację między tkanką nowotworową a prawidłową, jednak zbalansowany resampling oraz analiza typu „leave-one-normal-out” potwierdziły, że wynik ten należy interpretować ostrożnie ze względu na ograniczoną liczbę próbek prawidłowych. Analiza kliniczno-patologiczna zasugerowała powiązania ze stopniem N oraz wiekiem w kohorcie TCGA, podczas gdy stopień T i stopień M nie były istotne w zestawieniu tabelarycznym, a analiza przeżycia całkowitego nie wykazała istotnego związku prognostycznego. Analizy kandydackich genów centralnych (hub-genes) z wykorzystaniem RNA-seq TCGA dostarczyły eksploracyjnych dowodów na ekspresję, korelację i przeżycie, ale nie ustanowiły bezpośredniego celowania miR-192-5p. Analiza sygnatury immunologicznej wykazała heterogenne, głównie słabe korelacje. Funkcjonalnie, transfekcja mimiku miR-192-5p zredukowała zamykanie rany w komórkach HT29. Wyniki te wskazują, że miR-192-5p jest biologicznie istotny dla CRC, jednak kierunek jego ekspresji i interpretacja kliniczna zależą od platformy badawczej i wymagają dalszej walidacji eksperymentalnej.

Wprowadzenie

Rak jelita grubego (CRC) jest jednym z najczęstszych nowotworów złośliwych na świecie i pozostaje główną przyczyną śmiertelności związanej z rakiem^1,2. Chociaż kolonoskopia, immunochemiczne testy kału, badanie metylacji SEPT9, krążące markery nowotworowe oraz profilowanie molekularne poprawiły wykrywalność CRC i zarządzanie kliniczne^3,4, w biologii guza, odpowiedzi na leczenie i wynikach pacjentów nadal występuje znaczna heterogenność^5,6,7. Biomarkery pomagające charakteryzować biologię CRC mogą zatem przyczynić się do stratyfikacji ryzyka i opracowania bardziej zindywidualizowanych strategii terapeutycznych⁸.

MikroRNA (miRNA) to małe niekodujące RNA o długości około 19–24 nukleotydów, które regulują ekspresję genów głównie poprzez mechanizmy posttranskrypcyjne⁹. Zaburzona ekspresja miRNA może wpływać na proliferację, migrację, inwazję, apoptozę komórek nowotworowych, interakcje immunologiczne oraz odpowiedź na leczenie¹⁰. Wykazano, że miR-192-5p działa w sposób zależny od kontekstu w różnych chorobach i nowotworach, wykazując powiązania onkogenne lub supresyjne w zależności od typu tkanki, tła molekularnego i systemu eksperymentalnego^{11,12,13,14,15,16}. W przypadku CRC wcześniejsze badania zgłaszały zmienione profile miRNA w próbkach klinicznych oraz funkcjonalną regulację fenotypów złośliwych w komórkach raka jelita grubego^12,14,15. Jednak analizy publicznych baz danych nie zawsze wykazują ten sam kierunek ekspresji, a znaczenie kliniczne, sieć celów i powiązania immunologiczne miR-192-5p w CRC wymagają ostrożnej oceny.

W niniejszym badaniu oceniono rolę miR-192-5p w CRC, integrując analizy bioinformatyczne z baz TCGA/GDC i GEO, walidację qRT-PCR w dobranych tkankach klinicznych, testy migracji in vitro, przewidywanie genów docelowych, analizę wzbogacania szlaków oraz analizę korelacji sygnatur immunologicznych. Badanie oparto na hipotezie, że dojrzały miR-192-5p może być obniżony w tkankach CRC i może wywierać efekt supresorowy przeciwnowotworowy. Ponieważ reanaliza sygnałów miRNA-seq z TCGA/GDC wykazała przeciwny kierunek ekspresji, wyniki te interpretuje się jako eksploracyjne i zależne od platformy, a nie jako jednolity, definitywny wzorzec ekspresji.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Zgoda została wydana przez Komisję Etyczną Uniwersytetu Medycznego w Mongolii Wewnętrznej w dniu 21 października 2021 r. Od wszystkich uczestników włączonych do badania uzyskano pisemną świadomą zgodę.

Pobieranie próbek klinicznych

Pobrano pary tkanek z CRC oraz sąsiednich tkanek niezwyrodniałych od 45 pacjentów, którzy zostali poddani radykalnej resekcji między grudniem 2017 r. a lutym 2020 r. Żaden z pacjentów nie otrzymał przedoperacyjnej radioterapii ani chemioterapii, a pacjenci z innymi nowotworami złośliwymi zostali wykluczeni. Sąsiednią tkankę niezwyrodniałą pobrano w odległości co najmniej 5 cm od marginesu guza. Próbki zamrożono niezwłocznie po usunięciu chirurgicznym i przechowywano w ciekłym azocie do czasu ekstrakcji RNA. Kohorta obejmowała 27 mężczyzn i 18 kobiet; 13 pacjentów było w wieku poniżej 60 lat, a 32 w wieku 60 lat lub starszych. Zmienne kliniczno-patologiczne obejmowały średnicę guza, stopień TNM, stopień zróżnicowania, zakrzepicę naczyń w obrębie guza, przerzuty do węzłów chłonnych oraz przedoperacyjny poziom CEA.

Pozyskiwanie i wstępne przetwarzanie danych publicznych

Ogólnodostępne dane miRNA-seq, RNA-seq oraz dane kliniczne dla TCGA-COAD i TCGA-READ zostały pobrane z portalu Genomic Data Commons. Próbki guzów pierwotnych i prawidłowej tkanki litej zidentyfikowano zgodnie z typem próbki w GDC. Próbki guzów przerzutowych i nawrotowych wykluczono z analizy różnicowej ekspresji między guzem a tkanką prawidłową. W przypadku plików miRNA-seq z TCGA, wpis na poziomie bazy danych wykryty w tej analizie to hsa-mir-192; wartości ekspresji analizowano jako log2(RPM + 1), gdzie RPM oznacza liczbę odczytów na milion zmapowanych odczytów miRNA. W przypadku dostępności dopasowanych próbek przeprowadzono analizy guz-tkanka prawidłowa zarówno w wariancie nieparzystym, jak i parzystym. Do przesiewowego wyboru potencjalnych genów docelowych wykorzystano zbiory danych GEO GSE89076 oraz GSE156355. Geny o różnej ekspresji z GEO wyłoniono przy zastosowaniu skorygowanego p < 0,05 oraz bezwzględnej wartości log2 fold-change ≥ 2. Nazwy zbiorów danych sprawdzono pod kątem spójności w całym tekście pracy.

Analizy diagnostyczne, kliniczno-patologiczne oraz analizy przeżywalności

Do oceny wstępnej separacji tkanek nowotworowych i prawidłowych w zbiorach TCGA-COAD, TCGA-READ oraz połączonej kohorcie COADREAD wykorzystano analizę charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Ze względu na niewielką liczbę próbek prawidłowych przeprowadzono dodatkowe analizy wrażliwości, w tym zrównoważone ponowne próbkowanie tkanek nowotworowych i prawidłowych z 5000 iteracjami oraz analizę z wykluczeniem jednej próbki prawidłowej (leave-one-normal-out). W analizach powiązań kliniczno-patologicznych próbki guza pierwotnego podzielono na grupy o wysokim i niskim poziomie ekspresji, przyjmując za granicę medianę poziomu ekspresji miR-192 w TCGA. Analizy powtórzono dla połączonej kohorty COADREAD oraz oddzielnie dla COAD i READ, o ile wielkość próby na to pozwalała. Przeżywalność całkowitą oceniano za pomocą analizy Kaplana-Meiera z testem log-rank oraz jednowymiarowej regresji Coxa. Wyniki analiz diagnostycznych, kliniczno-patologicznych i przeżywalności raportowano oddzielnie, aby uniknąć nadinterpretacji wniosków prognostycznych.

Analizy genów docelowych i genów węzłowych (hub-genes)

Kandydackie geny docelowe zidentyfikowano poprzez integrację predykcji miRWalk z genami o różnym poziomie ekspresji z zestawów GSE89076 oraz GSE156355. Część wspólna tych trzech źródeł została zachowana do dalszych analiz eksploracyjnych. Sieć oddziaływań białko-białko skonstruowano przy użyciu STRING, a geny centralne (hub genes) wybrano na podstawie stopnia węzła i łączności modułów, wykorzystując analizy cytoHubba oraz MCODE w programie Cytoscape. Wybrane geny centralne (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 oraz KIF5C) poddano dalszej ocenie z wykorzystaniem danych RNA-seq z TCGA. Różnice w ekspresji między tkanką nowotworową a prawidłową, korelacje Spearmana z ekspresją miR-192 w TCGA oraz powiązania z całkowitym przeżyciem podsumowano jako uzupełniające analizy eksploracyjne. Geny te uznano jedynie za potencjalne cele; na podstawie danych bioinformatycznych nie wywnioskowano bezpośredniego wiązania, efektu ratowania (rescue effect) ani regulacji na poziomie białka w szlakach downstream.

Analiza wzbogacenia GO i KEGG

Analizy wzbogacenia Gene Ontology (GO) oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) przeprowadzono dla zestawu genów kandydackich i istotnych modułów sieci. Terminy GO podzielono na kategorie: proces biologiczny, komponent komórkowy oraz funkcja molekularna. Wyniki wzbogacenia z p < 0.05 uznano za istotne statystycznie i zinterpretowano jako sygnały ścieżek służące do generowania hipotez, a nie jako mechanizmy potwierdzone eksperymentalnie.

Izolacja RNA i analiza qRT-PCR

Całkowity RNA wyekstrahowano z 45 par próbek tkanek CRC oraz sąsiadujących tkanek nieznowotworowych przy użyciu odczynnika TRIzol zgodnie z protokołem producenta. Czystość i stężenie RNA oceniono spektrofotometrycznie; do odwrotnej transkrypcji wykorzystano próbki o wartościach A₂₆₀/A₂₈₀ w zakresie od 1,8 do 2,1. qRT-PCR przeprowadzono z wykorzystaniem systemu odwrotnej transkrypcji miRNA oraz odczynników do qPCR miRNA opartych na SYBR Green firmy TransGen Biotech. Odwrotną transkrypcję oraz amplifikację qPCR przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta odczynników. Każdą reakcję qRT-PCR wykonano w trzech powtórzeniach technicznych. Jako wewnętrzną referencję wykorzystano RNU6B. Primery dla miR-192-5p to 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (forward) oraz 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (reverse). Primery dla RNU6B to 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (forward) oraz 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (reverse). W przypadku wsparcia przez platformę qPCR, do oceny specyficzności amplifikacji wykorzystano analizę krzywych topnienia. Ekspresję względną obliczono metodą 2^-ΔΔCt. Wyniki dla par guza i sąsiadującej tkanki analizowano jako sparowane pomiary kliniczne.

Hodowla komórek i transfekcja

Ludzka linia komórkowa CRC HT29 została pobrana z zasobów laboratoryjnych autorów; została ona uwierzytelniona i potwierdzono brak zanieczyszczenia mycoplasma. Komórki HT29 hodowano w pożywce McCoy's 5A uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny w temperaturze 37 ^oC w atmosferze 5% CO₂. Pasażowanie komórek przeprowadzano po osiągnięciu przez nie konfluencji na poziomie około 80%. Mimetyki miR-192-5p oraz oligonukleotyd kontrolny negatywny con238 zakupiono w firmie Sangon Biotech (Szanghaj, Chiny) i wykorzystano do transfekcji przejściowej. Komórki HT29 wysiano na płytki 6-dołkowe i poddano transfekcji, gdy gęstość komórek osiągnęła około 20–30%, stosując końcowe stężenie oligonukleotydów 50 nM oraz protokół transfekcji oparty na lipidach, przeprowadzony zgodnie z instrukcjami producenta odczynników. Dokładny stosunek odczynnika do oligonukleotydu oraz ilość odczynnika były zgodne z protokołem zalecanym przez producenta, użytym w dokumentacji laboratoryjnej autorów. Komórki inkubowano z kompleksami transfekcyjnymi w standardowych warunkach hodowli, a obrazowanie po transfekcji oraz testy gojenia ran przeprowadzono zgodnie z harmonogramem eksperymentalnym. W niniejszym badaniu uwzględniono dane wyłącznie dla linii komórkowej HT29.

Test gojenia ran

Ztransfekowane komórki HT29 wysiano do płytek 6-dołkowych i hodowano do czasu utworzenia zgodnej monowarstwy. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety 200 µL wykonano liniowe zadrapanie, a oderwane komórki usunięto poprzez przemycie PBS. Następnie pożywkę zastąpiono pożywką bezsurowiczą, aby ograniczyć efekty związane z proliferacją podczas oceny migracji. Obrazy rany wykonano w czasie 0 h, 24 h i 48 h. Test gojenia ran przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych, a dla każdej grupy i punktu czasowego zmierzono wiele pól mikroskopowych. Szerokość rany określono na podstawie obrazów mikroskopowych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu; dokładna wersja oprogramowania użytego do pierwotnych pomiarów nie była dostępna w dokumentacji źródłowej. Tempo gojenia ran obliczono według wzoru [(szerokość rany w 0 h - szerokość rany w wskazanym punkcie czasowym) / szerokość rany w 0 h] x 100%. Ponieważ dostępne dane z manuskryptu nie obejmują oddzielnego eksperymentu kontrolnego dotyczącego proliferacji, wyniki gojenia ran zinterpretowano jako związane z migracją, jednak nie jako całkowite wykluczenie efektów proliferacji.

Analiza korelacji sygnatury immunologicznej

Związek między ekspresją miR-192 w TCGA a sygnaturami związanymi z odpornością został ponownie oceniony przy użyciu danych RNA-seq z guza pierwotnego. W analizie korelacji wyniku sygnatury uwzględniono łącznie 425 próbek guza z dopasowanymi danymi miRNA i RNA-seq. Ekspresja miR-192 wykazała statystycznie istotne, lecz słabe ujemne korelacje z kilkoma sygnaturami immunologicznymi po korekcie na poziom fałszywych odkryć (FDR), w tym z komórkami Tfh (rho = -0,205, FDR = 0,00049), aktywowanymi komórkami dendrytycznymi (rho = -0,186, FDR = 0,00098), komórkami Treg (rho = -0,185, FDR = 0,00098), plazmocytopodobnymi komórkami dendrytycznymi (rho = -0,169, FDR = 0,0027) oraz makrofagami (rho = -0,149, FDR = 0,0092). Korelacje dodatnie zaobserwowano głównie dla sygnatur eozynofili (rho = 0,139, FDR = 0,0155) i komórek Th17 (rho = 0,121, FDR = 0,0296). Wyniki te wskazują na heterogeniczne i ogólnie słabe powiązania immunologiczne, a nie na jednolity wzorzec dodatniej infiltracji immunologicznej.

Analiza statystyczna

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 oraz R 3.6.3. Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe lub medianę z rozstępem międzykwartylowym, w zależności od potrzeby. Porównania tkanek sparowanych analizowano za pomocą testów dla prób zależnych w przypadkach, gdy próbki guza i tkanki sąsiedniej były dopasowane. W sytuacjach, gdy założenia o rozkładzie normalnym nie zostały spełnione, stosowano testy nieparametryczne. Do wstępnej oceny dyskryminacji diagnostycznej wykorzystano krzywe ROC, zrównoważone ponowne próbkowanie (balanced resampling) oraz analizę leave-one-normal-out; do analizy powiązań kliniczno-patologicznych dla zmiennych kategorycznych zastosowano testy chi-kwadrat; do analiz przeżywalności wykorzystano test log-rank oraz modele Coxa; natomiast do analizy genów hubowych i immunologicznych użyto korelacji Spearmana. Za statystycznie istotne uznano dwustronne p < 0,05, a dla korelacji sygnatur immunologicznych podano korektę dla stopy odkryć fałszywych (false-discovery rate).

Wyniki

Analiza ekspresji w publicznych zbiorach danych i sparowanych tkankach klinicznych

Wzorzec ekspresji miR-192 ponownie oceniono przy użyciu danych miRNA-seq z TCGA-COAD i TCGA-READ pochodzących z GDC (Rysunek 1). W tych plikach wpis na poziomie bazy danych został opisany jako hsa-mir-192, a nie bezpośrednio jako dojrzały gatunek hsa-miR-192-5p; w związku z tym wynik z tej publicznej bazy danych zinterpretowano jako sygnał TCGA dla miR-192. W połączonej kohorcie COADREAD przeanalizowano 616 guzów pierwotnych i 11 prawidłowych próbek tkanek stałych. Próbki guza wykazały wyższą ekspresję miR-192 niż próbki prawidłowe (mediana 16,05 vs 13,46 log2[RPM + 1], test Mann-Whitney p = 9,96 x 10^-8). Taki sam trend wzrostowy w guzach zaobserwowano osobno dla COAD (455 guzów i 8 próbek prawidłowych, p = 9,89 x 10^-8) oraz osobno dla READ (161 guzów i 3 próbki prawidłowe, p = 1,94 x 10^-5). Analiza par w TCGA również wykazała wyższą ekspresję w guzach w 11 dopasowanych przypadkach (mediana różnicy guz-norma = 3,13 log2[RPM + 1], test Wilcoxona p = 0,0029). Wyniki te pozostawały rozbieżne z lokalnym wynikiem qRT-PCR dla par próbek, który wskazywał na obniżoną ekspresję dojrzałego miR-192-5p w tkankach CRC (Rysunek 2).

Wydajność diagnostyczna i powiązania kliniczno-patologiczne

Analizę ROC w oparciu o dane TCGA powtórzono, stosując opisane powyżej kryteria różnicowania próbek nowotworowych i prawidłowych (Rycina 3). Wartość AUC wyniosła 0,968 dla połączonej kohorty COADREAD, 0,947 dla samego COAD oraz 0,994 dla samego READ. Dodatkowe zrównoważone ponowne próbkowanie (resampling) przyniosło mediany AUC wynoszące 0,983 dla COADREAD, 0,984 dla COAD i 1,000 dla READ; jednakże 95% przedziały ufności były szerokie dla COADREAD (0,868–1,000) i COAD (0,781–1,000), a grupa READ obejmowała tylko trzy próbki prawidłowe. Analiza typu leave-one-out dla próbek prawidłowych wykazała również, że szacunek ROC był wrażliwy na niewielką liczebność grupy kontrolnej. W związku z tym wynik ROC zachowano jedynie jako wstępny dowód na rozdzielność tkanek nowotworowych i prawidłowych, a nie jako wystarczający dowód dla klinicznego biomarkera diagnostycznego. Analiza korelacji kliniczno-patologiczna w oparciu o medianę ekspresji miR-192 w TCGA wykazała istotne powiązania z stopniem N (p = 0,019) oraz wiekiem (p = 0,004), podczas gdy stopień T (p = 0,110) i stopień M (p = 0,932) nie były istotne (Tabela 1).

Analiza przeżywalności

Analiza przeżycia całkowitego nie wykazała istotnego związku prognostycznego dla ekspresji miR-192 w TCGA w przypadku CRC (Rysunek 3). W połączonej kohorcie COADREAD porównanie metodą Kaplana-Meiera z podziałem medianowym nie było istotne (log-rank p = 0,857), a jednowymiarowa regresja Coxa również nie wykazała istotnego związku (HR = 0,934 na jednostkę ekspresji log2, p = 0,374). Taki sam wniosek zaobserwowano w COAD (log-rank p = 0,889; Cox p = 0,493) i READ (log-rank p = 0,807; Cox p = 0,716). Zatem dane nie potwierdzają silnej roli miR-192 jako biomarkera prognostycznego w CRC.

Kandydackie geny docelowe i wzbogacenie funkcjonalne

Analizę genów docelowych przeprowadzono poprzez integrację przewidywań miRWalk z genami różnicowo wyrażonymi z zestawów danych GEO GSE89076 i GSE156355. W ramach tego przesiewu zidentyfikowano 93 geny kandydackie do dalszych analiz sieciowych oraz analiz wzbogaceń (Rycyna 4). Analiza oddziaływań białkowych pozwoliła wyłonić KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 oraz KIF5C jako eksploracyjne geny centralne (hub genes) (Rycyna 5). Analiza wrażliwości RNA-seq z bazy TCGA wykazała, że poziomy KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1 i CDK1 były wyższe w tkance nowotworowej niż w tkance prawidłowej, natomiast poziomy PLP1, NRXN1, GRIK3 i KIF5C były niższe w tkance nowotworowej. Analiza korelacji z ekspresją miR-192 w TCGA dała niejednoznaczne wyniki: CDCA5, CCNB1 i CDK1 wykazały korelacje dodatnie, natomiast PLP1, NRXN1 i KIF5C wykazały korelacje ujemne. Analiza wzbogaceń wyróżniła reprezentatywne terminy związane z metabolizmem leków przez cytochrom P450, metabolizmem ksenobiotyków przez cytochrom P450, metabolizmem retinolu, terminami związanymi z synapsą glutaminergiczną oraz organizacją presynaptyczną (Rycyna 6). Wyniki te potwierdzają biologiczną istotność sieci genów centralnych, jednak nie dowodzą bezpośredniego celowania przez miR-192-5p.

Test migracji komórek

Komórki HT29 poddano transfekcji mimetykami miR-192 w celu oceny funkcjonalnych skutków nadekspresji miR-192. Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła pomyślną transfekcję w grupach z mimetykiem miR-192-5p oraz w grupie kontrolnej negatywnej (Rysunek 7). W teście gojenia ran (wound-healing assay) szybkość migracji komórek HT29 po transfekcji miR-192 była niższa niż w przypadku nietransfekowanych komórek HT29 oraz komórek z grupą kontrolną negatywną, zarówno po 24 h, jak i po 48 h (Rysunek 8). Po 24 h szybkość migracji wynosiła 9,75 +/- 2,43% w grupie z transfekcją miR-192 w porównaniu z 15,69 +/- 3,47% w grupie nietransfekowanej i 15,45 +/- 3,92% w grupie kontrolnej negatywnej (P = 0,010). Po 48 h szybkość migracji wynosiła 20,04 +/- 2,54% w grupie z transfekcją miR-192 w porównaniu z odpowiednio 26,84 +/- 7,65% i 27,98 +/- 6,78% w dwóch grupach kontrolnych (P = 0,021). Wyniki te sugerują, że nadekspresja miR-192 hamuje migrację komórek HT29 in vitro.

Analiza korelacji sygnatur immunologicznych

Związek między ekspresją miR-192 w TCGA a sygnaturami powiązanymi z odpornością został ponownie oceniony przy użyciu danych RNA-seq z guza pierwotnego (Rysunek 9). W analizie korelacji wyników sygnatur uwzględniono łącznie 425 próbek nowotworowych z dopasowanymi danymi miRNA i RNA-seq. Ekspresja miR-192 wykazała słabe ujemne korelacje z wieloma sygnaturami komórek odpornościowych, w tym z komórkami Tfh (rho = -0,205, p = 2,15e-05), aktywowanymi komórkami dendrytycznymi (rho = -0,186, p = 0,00011), komórkami Treg (rho = -0,185, p = 0,00013), plazmocytoidalnymi komórkami dendrytycznymi (rho = -0,169, p = 0,00046), makrofagami (rho = -0,149, p = 0,0020), komórkami Tcm (rho = -0,136, p = 0,0050), komórkami NK CD56bright (rho = -0,132, p = 0,0065) oraz komórkami Tem (rho = -0,129, p = 0,0078). Zaobserwowano słabe korelacje dodatnie dla sygnatur eozynofilów (rho = 0,139, p = 0,0040) oraz komórek Th17 (rho = 0,121, p = 0,0129). Zatem powiązanie immunologiczne miR-192 w CRC wydaje się heterogeniczne i nie powinno być opisywane jako jednolicie dodatnie we wszystkich naciekach odpornościowych.

Dostępność danych

Publiczne zbiory danych analizowane w niniejszym badaniu są dostępne w portalu GDC/TCGA oraz w bazie Gene Expression Omnibus (GEO) pod numerami dostępu GSE89076 oraz GSE156355. Analizy typu dry-lab oraz ponowne analizy przeprowadzone w ramach tego badania zostały przedstawione w Tabeli uzupełniającej 1. Podstawowe dane eksperymentalne stanowiące wsparcie dla analiz qRT-PCR oraz gojenia ran, w tym surowe wartości Ct dla qRT-PCR, pomiary szerokości rany, oryginalne obrazy mikroskopowe oraz powiązane dane eksperymentalne, znajdują się w Folderze uzupełniającym 1.

Rycina 1: Przegląd ekspresji miR-192 w wielu typach nowotworów w bazie TCGA. Oś X przedstawia skróty nazw nowotworów, a oś Y względną ekspresję miR-192. Kolor niebieski oznacza tkankę prawidłową, a czerwony tkankę nowotworową. Istotność statystyczną określono następująco: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001; NS = brak istotności statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Ekspresja miR-192/miR-192-5p w zbiorach danych CRC i tkankach sparowanych. (A) Analiza miRNA-seq z TCGA/GDC wykazująca wyższy sygnał hsa-mir-192 na poziomie bazy danych w próbkach nowotworowych CRC niż w próbkach prawidłowych. (B) Analiza qRT-PCR sparowanych lokalnych próbek tkanek wykazująca niższą ekspresję dojrzałego miR-192-5p w tkankach CRC niż w sąsiadujących tkankach nowotworowych. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3: Eksploracyjne analizy diagnostyczne i przeżywalności w oparciu o ekspresję hsa-mir-192 w TCGA. (A–C) Krzywe przeżywalności Kaplana-Meiera. Analiza przeżywalności nie wykazała istotnego związku prognostycznego. (D) Krzywa ROC dla dyskryminacji tkanki nowotworowej i prawidłowej w kohorcie TCGA. Wartość AUC należy interpretować ostrożnie ze względu na niewielką liczbę próbek prawidłowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: Przesiewanie genów docelowych kandydujących oraz analiza interakcji białek. (A) Diagram Venna pokazujący nakładanie się wyników przewidywania celów miRNA oraz genów różnicowo ekspresyjnych z zestawów GSE89076 i GSE156355. (B) Sieć interakcji białko-białko dla 93 genów kandydujących. Węzły reprezentują geny, a krawędzie reprezentują przewidywane lub opracowane powiązania genowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Przesiewanie genów hubowych z sieci potencjalnych celów. (A,B) Moduły sieci zidentyfikowane w drodze przesiewania modułowego. (C) Ranking genów hubowych oparty na łączności sieci. (D) Wybrane potencjalne cele hubowe po zintegrowaniu przesiewania modułowego i opartego na stopniu łączności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Wybrane terminy wzbogacenia GO i KEGG dla genów kandydacyjnych oraz istotnych modułów sieci. Wykres bąbelkowy podsumowuje reprezentatywne wzbogacone funkcje biologiczne i szlaki. Wyniki wzbogacenia mają charakter eksploracyjny i wymagają walidacji eksperymentalnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 7: Obrazy transfekcji komórek HT29. (A) Reprezentatywne komórki HT29. (B) Obraz fluorescencyjny komórek HT29 transfekowanych mimikiem miR-192-5p. (C) Obraz fluorescencyjny komórek HT29 transfekowanych negatywną kontrolą con238. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 8: Test gojenia ran w komórkach HT29. (A) Reprezentatywne obrazy zarysowań w 0 h, 24 h i 48 h w nietransfekowanych komórkach HT29, komórkach HT29 ztransfected mimikiem miR-192-5p oraz komórkach HT29 ztransfected con238. (B) Ilościowe określenie szybkości gojenia ran w 24 h i 48 h, przedstawione w procentach. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Korelacja między ekspresją TCGA miR-192 a wynikiem sygnatur powiązanych z odpornością w próbkach guza CRC.Analiza wykazała niejednorodne powiązania immunologiczne, z kilkoma słabymi korelacjami ujemnymi oraz, głównie w przypadku sygnatur eozynofili i komórek Th17, korelacjami dodatnimi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Charakterystyka	Niska ekspresja TCGA miR-192	Wysoka ekspresja TCGA miR-192	wartość p	Metoda
n	308	308
Stopień T, n (%)			0.11	Test chi-kwadrat
T1	9 (1.5%)	11 (1.8%)
T2	44 (7.2%)	59 (9.6%)
T3	209 (34.1%)	211 (34.4%)
T4	43 (7%)	27 (4.4%)
stopień N, n (%)			0.019	test.chisq
N0	156 (25.5%)	190 (31%)
N1	88 (14.4%)	63 (10.3%)
N2	61 (10%)	54 (8.8%)
stopień M, n (%)			0.932	Test chi-kwadrat
M0	214 (39.9%)	234 (43.7%)
M1	41 (7.6%)	47 (8.8%)
Wiek, mediana (IQR)	66 (56, 75)	69 (60, 77)	0.004	Wilcoxona

Tabela 1: Związek między grupami ekspresji miR-192 w TCGA a cechami kliniczno-patologicznymi w CRC. Grupy wysokiej i niskiej ekspresji zdefiniowano na podstawie mediany poziomu ekspresji miR-192 w TCGA. W podsumowującej tabeli stadium N oraz wiek były istotne, natomiast stadium T i stadium M nie były istotne.

Tabela uzupełniająca 1: Wyniki ponownej analizy bioinformatycznej (dry-lab) przeprowadzonych na potrzeby niniejszego badania. Arkusz zawiera porównania ekspresji TCGA/GDC, zrównoważone analizy czułości ROC, analizy z pominięciem jednej próbki prawidłowej (leave-one-normal-out), analizy powiązań kliniczno-patologicznych, analizy przeżywalności, podsumowania ekspresji i korelacji genów węzłowych (hub-genes) oraz wyniki korelacji sygnatur immunologicznych.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Folder uzupełniający 1: Surowe dane eksperymentalne wspierające eksperymenty qRT-PCR, transfekcji komórek oraz gojenia ran.Pliki te zawierają oryginalne wartości Ct dla qRT-PCR, dane z cytometrii przepływowej/transfekcji, pomiary szerokości rany oraz reprezentatywne obrazy mikroskopowe wykorzystane w analizach przedstawionych w manuskrypcie.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym badaniu oceniono znaczenie kliniczne i biologiczne miR-192-5p w CRC, łącząc analizę publicznych zbiorów danych, walidację na lokalnych tkankach, przewidywanie sieci celów, analizę sygnatury immunologicznej oraz eksperymenty z migracją in vitro. W analizach wykorzystano zweryfikowane definicje próbek TCGA, w miarę możliwości oddzielono COAD od READ, zastosowano wartości miRNA log2(RPM + 1), rozróżniono porównania sparowane od niesparowanych, przetestowano odporność ROC oraz dodano analizy wrażliwości RNA-seq dla genów hubowych. Głównym wnioskiem jest to, że sygnał miR-192 z publicznej bazy TCGA/GDC oraz lokalny wynik qRT-PCR dla dojrzałego miR-192-5p wskazują na przeciwstawne kierunki ekspresji, co podkreśla konieczność rozróżniania adnotacji prekursorów na poziomie bazy danych od pomiarów dojrzałych miRNA^9,11.

Rozbieżności te nie powinny być wyjaśniane wyłącznie nierównymi rozmiarami próbek. Grupa prawidłowa w TCGA była mała, jednak analizy nieparowane, parowane, dotyczące wyłącznie COAD oraz wyłącznie READ wykazały w TCGA/GDC ten sam kierunek wzrostu poziomu w guzie. Mogą do tego przyczyniać się liczne czynniki, w tym różnice w źródle próbek, platformy sekwencjonowania w porównaniu z qRT-PCR, adnotacja hsa-mir-192 na poziomie bazy danych w stosunku do pomiaru dojrzałego hsa-miR-192-5p, przetwarzanie RNA, czystość guza, definicja tkanki sąsiedniej oraz charakterystyka populacji. Podobne wątpliwości dotyczące interpretacji biomarkerów i heterogeniczności guza podkreślano w badaniach nad CRC^5,6,7,8. Zatem uzyskane wyniki wspierają interpretację miR-192-5p w CRC jako zależną od kontekstu i platformy, a nie jako wykazującą jeden uniwersalny kierunek ekspresji.

Analizę diagnostyczną należy również interpretować z ostrożnością. Chociaż analiza ROC oparta na danych TCGA wykazała wysoką wartość AUC, porównanie obejmowało znacznie więcej próbek nowotworowych niż prawidłowych, przy czym w połączonej kohorcie COADREAD znajdowało się jedynie 11 próbek prawidłowych. Zrównoważona resemplacja nadal wykazała wysokie medianowe wartości AUC, jednak przedziały były szerokie, ponieważ każde zrównoważone porównanie było ograniczone przez małą liczebność grupy prawidłowej. Zatem wynik ROC wspiera eksploracyjny podział na nowotwór i tkankę prawidłową w obrębie TCGA/GDC, ale jest niewystarczający do uznania miR-192-5p za kliniczny biomarker diagnostyczny. Interpretacja ta jest spójna z ogólnym rozróżnieniem między eksploracyjnymi sygnałami biomarkerów a klinicznie zwalidowanymi biomarkerami diagnostycznymi lub prognostycznymi^4,8.

Analiza przeżywalności nie wykazała istotnego związku między ekspresją miR-192 a przeżywalnością całkowitą w grupach COADREAD, COAD lub READ. W niniejszej analizie miR-192 może być powiązany z wybranymi zmiennymi kliniczno-patologicznymi, jednak dostępne dane nie pozwalają na sformułowanie silnego wniosku dotyczącego jego roli jako biomarkera prognostycznego. Rozróżnienie to jest istotne, ponieważ biomarkery prognostyczne wymagają dowodów na to, że status markera jest powiązany z wynikiem w sposób niezależny i powtarzalny w istotnych klinicznie kontekstach⁸.

Test gojenia ran in vitro dostarcza funkcjonalnych dowodów na to, że zwiększona ekspresja miR-192 może ograniczać migrację komórek HT29. Wynik ten jest spójny z potencjalną funkcją supresora nowotworowego w komórkach CRC oraz z kierunkiem zmian zaobserwowanym w lokalnym qRT-PCR. Wcześniejsze prace potwierdziły również rolę miRNA, w tym szlaków związanych z miR-192, w regulacji przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego, losu komórek oraz fenotypów związanych z migracją^15,16,17. Niemniej jednak dane funkcjonalne pozostają niepełne. Aby wesprzeć mechanistyczny model supresji nowotworu, konieczna byłaby dodatkowa walidacja laboratoryjna, obejmująca powtórne transfekcje w co najmniej jednej dodatkowej linii komórkowej CRC, kontrole proliferacji dla testów gojenia ran, testy migracji/inwazji w systemie Transwell, walidację wybranych celów za pomocą testu dualnego lucyferazy, pomiary mRNA i białek docelowych oraz eksperymenty ratunkowe.

Analizę genów centralnych (hub-gene) należy traktować jako generującą hipotezy. Uzupełniające dane RNA-seq z TCGA wykazały silne różnice w ekspresji między tkanką nowotworową a prawidłową dla zachowanych genów centralnych, jednak ich korelacje z miR-192 były niejednoznaczne. Kilka genów cyklu komórkowego, w tym CDCA5, CCNB1 i CDK1, korelowało dodatnio, a nie ujemnie z miR-192, co nie pasuje do prostego modelu bezpośredniej represji celu przez miRNA. W przeciwieństwie do nich, PLP1, NRXN1 i KIF5C wykazały korelacje ujemne. Wyniki te potwierdzają biologiczną istotność sieci, ale wskazują, że nie można wyciągnąć wniosków o bezpośrednim celowaniu bez walidacji za pomocą testu lucyferazowego, analizy na poziomie białka oraz eksperymentów ratunkowych (rescue). Taka ostrożna interpretacja jest zgodna z eksploracyjnym charakterem analiz sieci celów in silico^10,11.

Analiza immunologiczna dodatkowo uzasadnia ostrożną interpretację. Wyniki oceny sygnatur immunologicznych w sekwencjonowaniu RNA guza (RNA-seq) wykazały, że ekspresja miR-192 była ujemnie skorelowana z kilkoma sygnaturami immunologicznymi oraz dodatnio skorelowana głównie z sygnaturami eozynofili i komórek Th17. Większość korelacji była słaba, nawet po korekcie stopnia fałszywych odkryć (FDR). Ponieważ metody sygnatur immunologicznych wnioskują o wzbogaceniu szlaków lub stanów komórkowych na podstawie danych z ekspresji zbiorczej (bulk expression), wyniki te należy uznać za wstępne i wymagają one walidacji przy użyciu ortogonalnych metod profilowania immunologicznego¹³.

Niniejsze badanie posiada kilka ograniczeń. Po pierwsze, lokalna kohorta walidacyjna była stosunkowo mała i pochodziła z jednego ośrodka. Po drugie, analiza publicznych zbiorów danych i lokalna walidacja qRT-PCR wykorzystywały różne platformy i poziomy pomiaru. Po trzecie, liczba próbek normalnego miRNA-seq z TCGA była niewielka, co ogranicza wnioskowanie diagnostyczne. Po czwarte, analizy genów centralnych (hub genes) oraz analizy immunologiczne miały charakter obliczeniowy i wymagają walidacji eksperymentalnej. Po piąte, dostępne eksperymenty funkcjonalne ograniczały się do danych z testu gojenia ran w komórkach HT29. Ograniczenia te uzasadniają przedstawienie badania jako zintegrowanej analizy eksploracyjnej, a nie jako ostatecznego dowodu na to, że miR-192-5p jest zwalidowanym biomarkerem diagnostycznym, prognostycznym lub mechanistycznym w CRC^6,8.

Podsumowując, miR-192-5p wydaje się być biologicznie istotny w przypadku CRC, jednak wzorzec jego ekspresji oraz interpretacja kliniczna są złożone. Analiza TCGA/GDC wykazała wyższy sygnał miR-192 w próbkach guza CRC, podczas gdy qRT-PCR w lokalnej kohorcie tkanek sparowanych wykazał niższą ekspresję dojrzałego miR-192-5p. Analiza ROC wskazała na wstępną możliwość rozdzielenia tkanki nowotworowej od prawidłowej, lecz była ona ograniczona przez małą liczebność grupy kontrolnej w TCGA. Nie zaobserwowano istotnego związku z przeżyciem całkowitym. Analizy genów centralnych (hub-genes) oraz analizy immunologiczne dostarczają dowodów pozwalających na formułowanie hipotez, a dane z testu gojenia rany w komórkach HT29 sugerują, że nadekspresja miR-192-5p może ograniczać migrację komórek. Przed uznaniem miR-192-5p za zwalidowany biomarker diagnostyczny, prognostyczny lub mechanistyczny w CRC niezbędne są dalsze badania na niezależnych kohortach oraz ukierunkowane eksperymenty laboratoryjne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25%+2:60 trypsyna-EDTA	Biological Industries	03-054-1	Trawienie/pasażowanie komórek
10% nadsiarczan amonu	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	A8090	Odczynik do SDS-PAGE
10% dodecylosiarczan sodu	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	SIS1070	Odczynik do SDS-PAGE
4x bufor do nakładania białek	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1016	Przygotowanie próbek białek
Zamrażarka ultraniskotemperaturowa -80 C	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	Przechowywanie próbek
Odczynnik Anti-Myc do usuwania mykoplazm	Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	P-CMR-001	Dekontaminacja z mykoplazm
Zestawy starterów ARL2, BATF2, MEN1 i beta-aktyny	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	Custom synthesized	Startery qPCR dla mRNA
Automatyczny czytnik mikropłytek	PerkinElmer, USA	VICTOR Nivo	Pomiar absorbancji
Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Fisher Scientific	23225	Kwantyfikacja białek
Kabina bezpieczna biologicznie / komora z laminarnym przepływem powietrza	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	Aseptyczna hodowla komórkowa
Komora do liczenia komórek / hemocytometr	Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd.	http://www.shqiujing.net/	Liczenie komórek
Zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8)	Biosharp	BS350B	Test proliferacji/cytotoksyczności komórek
Kolby do hodowli komórek, płytki hodowlane, probówki do wirowania i końcówki do pipet	Corning	https://www.corning.com/in/en.html	Ogólne materiały zużywalne do hodowli komórek
Zestaw do detekcji cyklu komórkowego i apoptozy	Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China	https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_EN.htm	Analiza cyklu komórkowego/apoptozy metodą cytometrii przepływowej
Inkubator CO2 do komórek	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	Hodowla komórkowa
Oligonukleotyd kontrolny negatywny con238	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	Custom synthesized	Kontrola transfekcji
Oprogramowanie Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	Wizualizacja modułów sieci i genów hubowych
Cyfrowy termostatyczny mieszadło magnetyczne	Changzhou Saipu Experimental Instrument Factory	https://czxtyq.en.alibaba.com/	Przygotowanie roztworów
Elektryczny termostatyczny szafowy piekarnik do suszenia	Nanjing Wohuan Technology Industry Co., Ltd.	https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/	Wsparcie suszenia/sterylizacji
System elektroforetyczny	Bio-Rad Laboratories	Mini-PROTEAN 3 Cell	Elektroforeza w żelu
System do elektrotransferu	Hoefer	TE77XP	Transfer białek
Płodowa surowica bydlęca	Biological Industries	04-001-1ACS	Suplement do hodowli komórkowej
Cytometr przepływowy	ACEA Biosciences	NovoCyte	Cytometria przepływowa
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Ningbo Sunny Instruments Co., Ltd.	https://www.sunny-instrument.com/en	Obrazowanie komórek i ran
Portal GDC/TCGA	National Cancer Institute	Open-access database	Publiczne dane miRNA-seq, RNA-seq i dane kliniczne
Baza danych GEO	National Center for Biotechnology Information	GSE89076 and GSE156355	Publiczne zestawy danych ekspresji genów
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9	Analiza statystyczna i tworzenie wykresów
Szybka chłodzona wirówka	Shanghai Huxiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd.	https://www.bioridgecentrifuge.com/	Przygotowanie próbek
Komórki HT29	Zasoby komórkowe laboratorium autorów	Not applicable	Ludzka linia komórkowa raka jelita grubego
Oprogramowanie do analizy obrazu	ImageJ	Not applicable	Kwantyfikacja szerokości rany
System obrazowania	Tanon Science & Technology Co., Ltd.	Tanon-5200	Obrazowanie żeli/blotów
System dynamicznej obserwacji i analizy funkcjonalnej komórek IncuCyte S3	Beijing Sensi Wantong Technology Co., Ltd.	IncuCyte S3	Obrazowanie żywych komórek/analiza funkcji
Inteligentna termostatyczna kąpiel wodna	Leica	HI1210	Inkubacja w kontrolowanej temperaturze
Lentiwirus i odczynnik do infekcji	Shanghai GeneChem Co., Ltd.	https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4	Stabilna transdukcja komórek
Pipety manualne	Gilson	PIPETMAN P	Obsługa cieczy
Podłowo podstawowe McCoy's 5A	Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	PM150710	Podłoże do hodowli komórek HT29
Wirówka medyczna	Producent z Zhuhai nieokreślony	3200	Przygotowanie próbek
Lodówka-zamrażarka medyczna	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	Przechowywanie odczynników/próbek
Meilunbio Fixer Supersensitive ECL Substrat Chemiluminescencyjny	Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China	MA0186	Detekcja immunoblottingowa
Miniwirówka	Beijing DLAB Scientific Co., Ltd.	https://www.dlabsci.com/	Przygotowanie próbek
Zestawy starterów miR-192-5p i U6	TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China	Custom synthesized	Startery qPCR dla miRNA
Mimik miR-192-5p	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	Custom synthesized	Oligonukleotyd do transfekcji przejściowej
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA miRNA miRcute Enhanced	TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China	KR211	Odwrotna transkrypcja miRNA
Zestaw do fluorescencyjnej kwantyfikacji miRNA miRcute Enhanced (SYBR Green FP)	TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China	FP411	qPCR dla miRNA
miRWalk	Publiczna baza danych	Web database	Baza danych do predykcji celów miRNA
Membrana nitrocelulozowa	Millipore	HATF00010	Membrana do transferu białek
Beztłuszczowe mleko w proszku	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	D8340	Odczynnik blokujący do immunoblottingu
Sparowane tkanki raka jelita grubego i sąsiadujące tkanki niezwyrodniałe	Instytucja autorów	Not applicable	Próbki kliniczne
Probówki PCR	Corning	PCR-02-C	Przygotowanie PCR/qRT-PCR
Roztwór penicyliny-streptomycyny	Biological Industries	03-031-1B	Antybiotyk do hodowli komórkowej
Zestaw PerfectStart Uni RT&qPCR	TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China	AUQ-01	Odwrotna transkrypcja mRNA i qPCR
Bufor fosforanowy (PBS)	Biological Industries	02-023-1A	Bufor do płukania komórek
Barwiony marker białkowy	Fermentas	26619	Marker masy cząsteczkowej białek
System do przygotowania czystej wody	China Moer	Not available	Przygotowanie czystej wody
Puromycyna	Phygene	PH1143	Selekcja komórek transdukowanych
Oprogramowanie R	R Foundation for Statistical Computing	Version 3.6.3	Analiza statystyczna i bioinformatyka
Szybki bufor do transferu	Crisbio	Not applicable	Elektrotransfer białek
System fluorescencyjnego ilościowego PCR w czasie rzeczywistym	Applied Biosystems (ABI), USA	Not available	Detekcja qRT-PCR
Bufor do lizy RIPA	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	R0020	Ekstrakcja białek
Mikroprowbówki wolne od RNazy	Corning	3208	Obsługa RNA
Bezsurowicze podłoże do krio konserwacji komórek	New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd.	C40100	Kriokonserwacja komórek
SPSS Statistics	IBM	Version 25	Analiza statystyczna
Stabilizowany rozcieńczalnik przeciwciał	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Not applicable	Rozcieńczanie przeciwciał pierwszorzędowych/drugorzędowych
Sterylne końcówki do pipet	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	TP-10-C	Narzędzie do robienia zarysowań w teście gojenia ran
Baza danych STRING	STRING Consortium	Web database	Analiza sieci oddziaływań białkowych
TEMED	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8090	Odczynik do SDS-PAGE
TransZol Up	TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China	ET111-01	Ekstrakcja RNA
Bufor Tris-HCl, pH 6,8	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1020	Bufor do żelu ładującego SDS-PAGE
Bufor Tris-HCl, pH 8,8	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1010	Bufor do żelu rozdzielczego SDS-PAGE
Tween-20	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8220	Odczynnik do płukania immunoblotów
Pionowy autoklaw parowy	Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Corp.	BXM-30R	Sterylizacja