Ocena wpływu związków farmakologicznych na morfologię mitochondriów w modelach starzenia się myszy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metody pomiaru efektów leków podawanych za pomocą implantowalnych osmotycznych minipomp na morfologię mitochondriów w starzejących się modelach mysich. Przeprowadza się trójwymiarowe (3D) superrozdzielcze obrazowanie konfokalne wątrobek mysich i opracowuje się ścieżkę nieuprzednionego segmentowania, klasyfikacji oraz ilościowej analizy struktur mitochondriów.

Streszczenie

Akumulację uszkodzeń molekularnych związanych ze starzeniem może przyczyniać się do zmian w morfologii mitochondriów i dysfunkcji metabolicznej, szczególnie w tkankach o wysokim zużyciu energii. Związki farmaceutyczne, które poprawiają dysfunkcję metaboliczną i przywracają zdrowe, 'młode' morfologię mitochondriów, mogą więc stanowić skuteczne metody przedłużenia długości zdrowia (czyli części życia wolnej od obciążenia chorobami przewlekłymi związanymi ze starzeniem) u ssaków. Niniejszy opis metod wykonywania podskórnych implantacji pomp osmotycznych u starszych myszy w celu stabilnego dostarczania hydrofobowych związków farmaceutycznych. Następnie tkanki są fiksowane, wykonywane krojenia kryogeniczne, barwienie i obrazowanie przy użyciu super-rozdzielczej mikroskopii konfokalnej. Wreszcie przedstawiono zautomatyzowany proces segmentacji trójwymiarowej, klasyfikacji i pomiaru ilościowego struktur mitochondriów. Zatem te metody mogą być przydatne do ilościowej oceny zmian w trójwymiarowej strukturze mitochondriów w różnych tkankach w całym okresie życia myszy. Co więcej, te techniki mogą pomóc w reprodukowalnym identyfikowaniu leków małocząsteczkowych, które łagodzą dysfunkcję metaboliczną związaną ze starzeniem.

Wprowadzenie

Mitochondria są organellami o podwójnej błonie, która jest zorganizowana przestrzenno-czasowo w taki sposób, aby dostosować się do bieżących zapotrzebowań metabolicznych ich komórki macierzystej i tkanki¹. Zagłębienia w wewnętrznej błonie, zwane krystami, są formowane i zorganizowane poprzez dynamiczną koordynację między fosfolipidami wewnętrznej błony niezbiorczych takich jak kardiolipina i fosfatydyloetanolamina, rzędami dimerów ATP syntazy na końcach kryst, oligomerami wiązanymi kardiolipina, dynaminopodobną GTP-azą Optycznej Atrofii 1 (OPA1) na szczycie kryst oraz kompleksami Układu Organizującego Kontakty Mitochondriów i Krysty (MICOS) na stykach kryst¹. Te struktury wewnętrznej błony poddzielają mitochondria na pojedyncze funkcjonalne jednostki² i zapewniają większą powierzchnię, na której mogą składać się mitochondrialne kompleksy oddechowe wytwarzające potencjał transbłonowy¹. Jako dynamiczne organelle o wtórze funkcji komórkowych związanych z sygnałowaniem apoptozy³, homeostazą Ca²⁺ i gatunków reaktywnych tlenu³ oraz biosyntezą lipidów⁴, morfologiczne struktury mitochondrialne są wysoce wrażliwe na zmiany środowiskowe takie jak zmniejszona dostępność tlenu⁵ oraz zwiększone uwalnianie Ca²⁺ z retikulum endoplazmatycznego^6,7.

Akumulacja uszkodzeń molekularnych przyczynia się do zmian w strukturze i funkcji mitochondriów podczas starzenia⁸. Pionierskie badania tomografii kriogenicznej z elektronami (cryo-ET) przeprowadzone przez grupę Kühlbrandt na kilku organizmach modelowych wykazały wyraźną korelację między gęstością kryst a zdolnością do oddychania, jak również zależne od wieku zmniejszenie gęstości kryst i związaną z tym utratą dimerów ATP syntazy^9,10. Ponadto, zmiany w objętości mitochondriów mogą wynikać z upośledzonej dynamiki podziału i fuzji mitochondriów¹¹, zwiększonego gromadzenia się lipidów¹² oraz zwiększonego obrzęku¹³. W mięśniach szkieletowych, maksymalna konsumpcja tlenu (VO₂ max), która jest silnym predyktore średniego czasu życia^14,15, może być dokładnie przewidywana na podstawie stopnia fragmentacji mitochondriów pomiędzy miofibrilami i gęstości kryst¹⁶.

Nie jest zaskakujące, że związane ze starzeniem się zmiany strukturalne i funkcjonalne w mitochondriach mogą przyczyniać się do patogenezy wielu przewlekłych chorób^17,18,19,20. Zwiększona fragmentacja mitochondriów oraz zmiany w biogenezie i morfologii mitochondriów są związane zarówno z chorobą Alzheimera jak i chorobą Parkinsona²⁰. Zmiany te prowadzą do dysfunkcji kompleksów fosforylacji oksydacyjnej, upośledzając generowanę siłę motywującą protony i prowadząc do nadmiernej produkcji reaktywnych gatunków tlenu^20,21,22. W związanych ze starzeniem się dysfunkcjach serca i niewydolności serca, zwiększona fragmentacja mitochondriów, obrzęk, wakuolizacja i utrata gęstości kryst przyczyniają się do zmniejszonej produkcji ATP^23,24. Te strukturalne zmiany mogą być częściowo związane ze zmienionym działaniem mitochondrialnego Ca²⁺ oraz zwiększoną aktywnością poru przejściowego mitochondrialnej przepuszczalności^6,7,13,25. Jako możliwy regulator mitofagii, nadmiernie otwieranie poru przejściowego mitochondrialnej przepuszczalności podczas starzenia się może zamiast tego być destrukcyjne i prowadzić do niekontrolowanej śmierci komórki¹³. Wreszcie, wiadomo, że związane ze starzeniem się niedobory w mitochondrialnym metabolizmie lipidów i mitofagii mogą również przyczyniać się do rozwoju niealkoholowej choroby wątroby²⁶. W szczególności, stwierdzono, że steatoza wątroby jest towarzyszona zwiększonym stresem oksydacyjnym i zwiększonym tworzeniem struktur mitochondrialnych przypominających pączki^3,27.

W związku z tym, istnieje znaczne zainteresowanie opracowaniem leków przeciwstarzeniowych, które działają na związane ze starzeniem się upośledzenie funkcji mitochondriów w celu poprawy jakości życia osób cierpiących na określone przewlekłe choroby. Forzinity (elamipretyd), peptyd działający na lipidy, który zmniejsza potencjał powierzchni wewnętrznej błony²⁸ i zwiększa produkcję ATP mitochondrialnego^29,30

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt laboratoryjnych zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi stosowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Brigham and Women's Hospital oraz Harvard Medical School Institutional Animal Care and Use Committees w ramach Protokołu nr. 2016N000368. Badacze zainteresowani zastosowaniem tego protokołu w innych krajach powinni skonsultować się z lokalnymi instytucjami i organami regulacyjnymi, aby zapewnić zgodność z obowiązującymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Podskórna implantacja pompy osmotycznej

UWAGA: Operacje na zwierzętach powinny być wykonywane tylko przez doświadczony, przeszkolony personel, i należy zachować ogromną ostrożność, aby zminimalizować stres i/lub cierpienie zwierząt. Procedury z udziałem zwierząt laboratoryjnych powinny być wykonywane wyłącznie zgodnie z zatwierdzonymi protokołami badawczymi. Wszelkie badania z udziałem zwierząt powinny ściśle przestrzegać zasady 3R – Zastępowanie, Redukowanie i Rafinowanie. Ten protokół opisuje podskórną implantację pompy osmotycznej, która jest klasyfikowana jako mała procedura chirurgiczna. Można również wykonać implantację pompy osmotycznej do jamy brzusznej, ale jest to bardziej skomplikowana procedura klasyfikowana jako większa procedura chirurgiczna. Dlatego zaleca się wykonanie procedury podskórnej, chyba że istnieją mocne naukowe uzasadnienia na korzyść implantacji do jamy brzusznej.

1. Wypełnienie pomp osmotycznych
   UWAGA: Przygotowanie roztworów leków i napełnianie pomp osmotycznych należy wykonywać w szafce bezpieczeństwa biologicznego z zachowaniem techniki sterylnej. Modele pomp należy wybierać w oparciu o pożądaną objętość rezerwuaru i długość dostarczania leczenia. W tym badaniu zastosowano model 2004 (~200 μL objętość rezerwuaru, dostarczanie leczenia przez 4 tygodnie).
   1. Przygotuj roztwór leku w rozpuszczalniku zgodnym z pompami osmotycznymi. Odnoś się do https://alzet.com/formulating-the-solution/. Użyj przepływu (μL/h) wymienionego na partii zamówionych pomp osmotycznych, aby określić stężenie leku potrzebne do osiągnięcia docelowanego dziennego dawki.
      UWAGA: Roztwór 50% v/v DMSO i 50% v/v PEG₃₀₀ stabilnie uwalnia związki hydrofobowe i jest zgodny z pompami osmotycznymi. Wszystkie związki i rozpuszczalniki powinny mieć jakość farmaceutyczną, jeśli to możliwe.
   2. Przefiltruj sterylnie roztwór leku przez 0,22 μm filtr strzykawkowy i przechowuj w temperaturze pokojowej.
   3. Umieść moderator przepływu w pompie i wciśnij go na dół, aż wpasuje się do mikrofugowej probadkowiczka. Nie wciszaj moderatora przepływu do końca.
   4. Ustaw wagę analityczną na pustej mikrofugowej probadkowiczce, a następnie odnotuj wagę pompy osmotycznej.
   5. Dołącz rurkę wypełniającą do 1 mL strzykawki i zasysz co najmniej 1,5 razy więcej niż objętość rezerwuaru pompy. Usuń bąbelki powietrza, ciągnąc tłok w dół, przetrząsając strzykawkę i popychając w górę, aż płyn uformuje się na szczycie rurki wypełniającej.
   6. Wyjmij moderator przepływu, trzymając pompę pionowo.
   7. Wsuń rurkę wypełniającą przez otwór na szczycie pompy, aż nie będzie można jej wsunąć dalej.
   8. Powoli wciśnij tłok w dół, trzymając pompę pionowo. Kontynuuj napełnianie, aż roztwór pojawi się na wylocie. Następnie usuń rurkę wypełniającą i zetrzyj nadmiar roztworu delikatnym ściereczkiem.
   9. Wsuń moderator przepływu, aż czapka będzie na wysokości szczytu pompy.
   10. Umieść wypełnioną pompę z powrotem w mikrofugowej probadkowiczce i waży. Określ wagę roztworu i upewnij się, że objętość wypełnienia wynosi co najmniej 90% objętości rezerwuaru (różnica wag w miligramach ≈ objętość w mikrolitrach).
   11. Wypełnij 15 mL stożkową probówkę 5 mL sterylnego 1x fosforanowego buforu salinowskiego (PBS) i dodaj wstępnie wypełnioną pompę. Uszczelnij folią parafinową i wypełnij pompę(y) przez inkubację w 37 °C przez czas wymagany przez model pomp osmotycznych. W przypadku modelu 2004 wynosi to 40 h.
2. Przygotowanie meloksikam
   UWAGA: Powinno to być wykonywane w szafce bezpieczeństwa biologicznego z zachowaniem techniki sterylnej. Meloksykam, niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ), nie jest substancją kontrolowaną, ale może wymagać licencji na substancję kontrolowaną do jej uzyskania.
   1. Za pomocą igły 27-G i strzykawki Luer-lok o pojemności 3 mL, rozcieńcz 5 mg/mL stoks meloksikam do 1 mg/mL za pomocą sterylnego PBS w 5 mL sterylnej szklanej flaszce. Przygotuj w dzień i przechowuj w temperaturze pokojowej.
3. Przygotowanie miejsca operacji
   UWAGA: Nie jest konieczne wykonywanie implantacji pompy osmotycznej w szafce bezpieczeństwa biologicznego, ani nie jest możliwe utrzymanie sterylności podczas procedur chirurgicznych. Jednak miejsce operacji powinno nadal przestrzegać surowych standardów czystości i praktyki aseptycznej. Miejsce operacji powin

Wyniki

Opisany wyżej protokół przeprowadzono (Rysunek 1) na 20-miesięcznych samcach myszy UM-HET3. Myszom podawano albo pojazd (Kontrola) albo koktajl chemiczny do reprogramowania (Leczony) za pomocą osmotycznych minipomp modelu 2004⁵³. Wątroby zostały następnie przecięte i sfilmowane na konfokalnym mikroskopie Airyscan2 przed przetworzeniem z-stacków za pomocą potoku analitycznego.

3D obrazy fluorescencyjne przetwarzano i analizowano za pomocą oprogramowania ZEISS arivis Pro Software 4.1.2. Przed segmentacją mitochondriów zastosowano algorytm wzmocnienia cząstek, aby odszumić obrazy i usunąć tło, światło poza ogniskowaniem, autofluorescencję i/lub fluorescencje pochodzące od niespecyficznego wiązania. Wzmocnienie cząstek selektywnie wzmacnia sygnał z danego średnicy. Po odszumieniu pojedyncze mitochondria zostały zsegmentowane w 3D za pomocą algorytmu Blob Finder, który wykrywa obiekty na podstawie lokalnych maksimów intensywności w określonym zakresie wielkości. Wreszcie, segmentacja obiektów redukuje każdy 2D przekrój do binarne obrazu.

Aby zilustrować przepływ segmentacji, Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne optyczne przekroje na każdym etapie potoku przetwarzania dla próbek kontrolnych i leczonych. Surowy obraz fluorescencyjny pokazuje nieprzetworzony sygnał Tom20, który zawiera mieszaninę specyficznej mitochondriowej fluorescencji i niepożądanego tła, światła poza ogniskowaniem i autofluorescencji. Po zastosowaniu odszumienia za pomocą wzmocnienia cząstek, sygnał tła został znacznie zmniejszony, a pozostała fluorescencja ograniczyła się do dyskretnych, dobrze zdefiniowanych struktur (Rysunek 2). Wynika to z czystszego przedstawienia granic mitochondriów, które ułatwia dokładną segmentację.

Wynik segmentacji Blob Finder jest pokazany na zielono. Aby potwierdzić, że z-stacki są dokładnie zsegmentowane, odszumione 2D przekroje z powiązanymi zsegmentowanymi obrazami binarne zostały nałożone (Rysunek 2). Jeśli proces segmentacji jest wystarczająco zoptymalizowany, powinno zaobserwować silną i spójną ko-lokalizację mitochondriowej fluorescencji z obiektami binarne. Jeśli proces segmentacji nadmiernie segmentuje (tj. dzielenie pojedynczych mitochondriów na wiele obiektów) lub niedostatecznie segmentuje (tj. łączenie wielu mitochondriów w jeden), dostosuj parametry segmentacji. Wizualna inspekcja insetów potwierdza wysokiej jakości segmentację: wykryte obiekty precyzyjnie ko-lokalizują się z odszumionym sygnałem fluorescencji Tom20, bez żadnych dowodów na nadmierną segmentację, przerośnięcie obiektów, niewłaściwe scalanie sąsiednich przestrzennie mitochondriów w pojedyncze obiekty, lub generowanie fałszywych obiektów w regionach bez jakiegokolwiek sygnału Tom20. Ten poziom wierności segmentacji był konsekwentnie osiągany zarówno w próbkach kontrolnych, jak i leczonych, co pokazuje, że parametry potoku zoptymalizowane w oprogramowaniu ZEISS arivis są solidne i ogólne dla grup eksperymentalnych. Razem, te wyniki potwierdzają podejście segmentacji i wspierają niezawodność pomiarów morfologicznych pochodzących z niego.

Zsegmentowane obiekty mogą być mierzone pod kątem parametrów mitochondriów takich jak objętość, sferyczność i powierzchnia (Rysunek 3). Aby uwzględnić dużą liczbę mitochondriów wykrytych na próbkę biologiczną i niezależność poszczególnych organelli w komórce, obliczono mediany na próbki i użyto ich jako jednostkę porównania statystycznego. Różnice między grupami oceniono za pomocą testu Wilcoxona. Próbki leczone wykazywały znacznie wyższą objętość i powierzchnię mitochondriów w porównaniu z kontrolami, co wskazuje, że chemiczna reprogramacja indukuje znaczne remodelowanie morfologii mitochondriów.

Wreszcie, zsegmentowane mitochondria mogą być sklasyfikowane na różne podtypy^54,55 (Rysunek 4). Metoda łokcia⁵⁶ została użyta do określenia optymalnej liczby klastrów dla klastrowania k-średnich^57,58 (Rysunek 4A). Następnie, za pomocą k = 4 klastrów, losowe podpróbki mitochondriów dla grup Kontrolnych i Leczonych zostały przedstawione poprzez jednolitą aproksymację manifoldu i projekcję (UMAP) redukcji wymiarowości (Rysunek 4B), kolorowane zarówno pod względem podtypu mitochondriów (lewo) jak i grupy leczenia (prawo). Wreszcie, proporcje każdego podtypu mitochondriów (Rysunek 4C) dla grup Kontrolnych i Leczonych zostały przedstawione. W grupie leczonej było mniej zfragmentowanych mitochondriów, ale nie zanotowano istotnej zmiany w proporcji połączonych lub wydłużonych mitochondriów.

Rysunek 1: Przegląd protokołu. Myszy są leczone lekami lub pojazdem przez maksymalnie 6

Dyskusja

Dwie najważniejsze kroki dla pomyślnego wykonania tego protokołu to (i) zamknięcie nacięcia podczas implantacji pompy osmotycznej oraz (ii) dokładna segmentacja. W pierwszym przypadku, należy szczególnie zadbać o stworzenie kieszonki podskórnej, która jest wystarczająco duża dla pompy, ale nie za duża, aby pompa mogła się ślizgać wzdłuż boku zwierzęcia. Po zamknięciu nacięcia, pompa powinna być umieszczona wystarczająco daleko, aby nie wywołać napięcia na otaczającej skórze, co może prowadzić do rozejścia się nacięcia. Upewnij się, że pociągasz za skórę otaczającą zamknięte nacięcie we wszystkich kierunkach, aby zweryfikować, że rana jest wystarczająco zamknięta przed rozpoczęciem odzyskiwania zwierzęcia. Zastawki ranne są korzystne, ponieważ są szybkie do założenia i zdjęcia. Jednak jeśli pojawią się jakiekolwiek problemy z niemożnością prawidłowego zamknięcia nacięć, można zastosować szycie przerywane. W drugim przypadku, dokładna segmentacja wymaga ciągłego porównywania wyników segmentacji z obrazami bezgłosowymi, aż osiągnie się wystarczające podobieństwo obrazu. Zdjęcia Z-stacks od zwierząt kontrolnych i leczonych muszą być zbierane przy użyciu tych samych parametrów zbierania i najlepiej podczas tej samej sesji obrazowania. Podobnie, wszystkie kroki przetwarzania muszą być zastosowane do wszystkich obrazów przy użyciu dokładnie tych samych parametrów. Parametr segmentacji średnicy definiuje oczekiwaną wielkość obiektów do wykrycia. Dobrym punktem wyjściowym jest zmierzona średnia szerokość mitochondria z kilku obiektów sprawdzonych ręcznie przy użyciu jednego optycznego skrawka. Próg prawdopodobieństwa kontroluje minimalne prawdopodobieństwo wykrycia wymagane dla obiektu, aby został zaakceptowany. Niższe wartości zwiększają czułość i wykrywają więcej obiektów, ale niektóre z tych obiektów mogą być fałszywe. Z kolei wyższe wartości poprawiają swoistość, ale mogą powodować utratę obiektów o niższym sygnale. Zalecana początkowa zakres to 25%–30%. Wreszcie, czułość podziału określa, jak agresywnie są rozdzielane stykające się lub nakładające się obiekty na pojedyncze obiekty. Niska czułość podziału pozostawi skupiska mitochondria jako pojedyncze połączone obiekty. Z drugiej strony, wysoka czułość podziału może prowadzić do nadmiernego podziału wydłużonych lub rozgałęzionych mitochondria na fragmenty. Wartości między 15%–30% są rozsądne dla typowych badań morfologicznych mitochondria. Jeśli dokładna segmentacja nadal stanowi wyzwanie, segmentację można wykonać przy użyciu Analizatora Mitochondriów⁵⁹ w FIJI⁶⁰. Semi-zautomatyzowana metoda kwantyfikacji morfologii mitochondria w komórkach i tkankach przy użyciu oprogramowania Huygens Professional i niestandardowego skryptu Pythona została również niedawno opisana⁶¹.

Jednym z ograniczeń jest limit rozdzielczości konfokalnego mikroskopu Airyscan2, który wynosi ~150 nm w XY i ~350 nm w płaszczyźnie Z. Uniemożliwia to wykonywanie wysokorozdzielczych obrazów chropowatej mitochondrialnej, ponieważ odległości między pojedynczymi chropowatościami wynoszą ~40–120 nm^62,63,64. W przeciwieństwie do tego, stymulowane wyczerpywanie emisji (STED) może osiągnąć limity rozdzielczości ~20–50 nm w kierunku bocznym i może wyraźnie rozróżnić pojedyncze mitochondrialne chropowate^62,63,64. Kilka barwników STED zostało niedawno opracowane, które pozwalają na efektywne barwienie i obracanie mitochondrialnej błony wewnętrznej zarówno w komórkach żywych, jak i fiksowanych^63,64,65. Biorąc pod uwagę, że analiza morfologii chropowatej może dać wgląd w zdrowotny stan bioenergiczny mitochondria¹⁰, takie dane są zatem pożądane. Jednak morfologię mitochondrialną różni mocno między tkankami ssaków a hodowlą komórkową (omówione w głębi poniżej), i obecnie nie ma metodyki do barwienia wewnętrznej błony tkanek dla obracania i analizy struktur chropowatej STED.

Ilościowe określenie morfologii mitochondrialnej w całym tkankach stanowi unikalne wyzwania w porównaniu do systemów hodowlany komórkowych. W hodowanych komórkach, mitochondria są zazwyczaj rozmieszczone w całym cytoplazmie w dobrze rozdzielonych sieciach z minimalnym nakładaniem się między komórkami. W sekcjach tkankowych lub preparatach całoci, komórki są gęsto upakowane, a ich granice nie są dobrze określone. Jeśli wymagana jest analiza na poziomie komórki, należy włączyć dodatkową fluorescencyjną etykietę ukierunkowaną na błonę plazmatyczną lub marker specyficzny dla typu komórki, wraz z odpowiednią krokami segmentacji w rurociągu analizy obrazów, aby zdefiniować pojedyncze granice komórek przed kwantyfikacją morfologii mitochondrialnej. Druga ważna różnica polega na tym, że w hodowanych komórkach, mitochondria często tworzą ciągłe, powiązane siatki siatkowe, które są łatwe do wizualiza

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Airyscan2 point scanning confocal microscope	ZEISS	LSM 980 with Airyscan2	ZEISS point scanning LSM 980 confocal built around a ZEISS Axio Observer Z1 and equipped with two multi-alkali PMTs and a GaASP 32 channel spectral detector, an environmental enclosure, and a Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III objective. The microscope used in this study is also equipped with two external NIR detectors, as well as the following laser lines: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639, and 730 nm.
Aluminum foil	Essendant	BWK7112
Analytical balance	Mettler Toledo	MR204
Anti-roll glass plate	Gel Company	LGI70
Arivis Pro Software	ZEISS	Version 4.1.2
Bath sonicator	Branson Ultrasonics	71020-MT
Bovine serum albumin	Research Products International	A30075
Centrifuge tubes, 15 mL	CELLTREAT	229411
Charged microscope slides	Globe Scientific	1358W
Clip remover	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
Cotton-tipped applicators	Puritan Medical	25-8061WC
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S
Cryostat blades	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Prepare to 5 mg/mL in ddH2O, aliquot, and store at -20 °C protected from light
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
EasyDip slide staining system	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
Embedding molds, 22 mm × 22 mm × 20 mm	Polysciences	18646A-1
Ethanol, 200 proof	Decon Labs	V1001
Fenestrated sterile drape sheets	Dukal	20001
Fine forceps	Fine Science Tools	11445-12
Glass bead sterilizer	VWR	75999-324
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
Heating pad	CVS	215313
Hemostatic forceps	World Precision Instruments	501705
Immersion oil Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
Induction chamber	World Precision Instruments	EZ178
Insulin syringes, 0.3 mL	BD	328431
Iris surgical scissors	Sklar Surgical Instruments	47-1135
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Luer-Lok 1 mL syringes	BD	309628
Luer-Lok 3 mL syringes	BD	309657
Luer-Lok 50 mL syringes	BD	309653
Meloxivet (meloxicam)	Patterson Veterinary	07-894-8524
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	CELLTREAT	229443
Microscope slide box	Heathrow Scientific	15994E
Microscope slide cover glass, #1.5, 22 mm × 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
Non-CO2 incubator	Benchmark Scientific	H2200-H
Non-fenestrated sterile drape sheets	Dukal	20-002
OCT Compound	Sakura Finetek USA Inc	4583
Opthalmic ointment	Patterson Veterinary	07-888-2572
Osmotic minipumps	Alzet	2004
Parafilm	Bemis	PM999
Paraformaldehyde, 4% w/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1×	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
PES syringe filters, 0.22 μm	CELLTREAT	229747
Povidone iodine 10% USP swabsticks	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
Rabbit anti-Tom20 antibody	Novus Biologicals	NBP2-67501
Razor blades, 0.22 mm	VWR	55411-050
Rotator/rotisserie	Labnet	H5500
RStudio	The R Project for Statistical Computing	version 4.3.2
Scale	Fisher Scientific	S72422
SomnoSuite low-flow anesthesia system	Kent Scientific	SS-01
Steam sterilization indicator strips	Crosstex	SIS-250
Sterile glass vials, 5 mL	Thermo Scientific	ST5
Sterile needles, 0.5", 23 G	BD	305145
Sterile needles, 0.5", 27 G	BD	305109
Sterilization pouches	Cardinal Health	92510
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	Prepare a solution of 30% w/v in 1× PBS
Surgical clippers	3M	9680
Surgical gloves	Cardinal Health	2D73DP75
Tissue forceps	Sklar Surgical Instruments	47-1447
Toploading balance	Cole-Parmer	EW-55000-14
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Weighing boats, 85 mL	Heathrow Scientific	14