To studium opisuje in vitro model do oceny efektów ochronnych Sanqi Baiji San przeciwko uszkodzeniom komórek nabłonka żołądka wywołanym etanolem oraz jego udział w sygnalizacji związanej z PI3K/AKT.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
To studium opisuje in vitro model do oceny efektów ochronnych Sanqi Baiji San przeciwko uszkodzeniom komórek nabłonka żołądka wywołanym etanolem oraz jego udział w sygnalizacji związanej z PI3K/AKT.
Celem tej pracy było wyjaśnienie mechanizmu ochronnego Sanqi Baiji San (SQBJ) przeciwko uszkodzeniom komórek nabłonka żołądka wywołanym alkoholem oraz zbadanie jego potencjalnego związku z wrzodem żołądka (WU). Zastosowano farmakologię sieciową do przesiewowego wyznaczenia aktywnych składników SQBJ (Baza Danych Farmakologii Systemowej Tradycyjnej Medycyny Chińskiej i Platforma Analityczna [TCMSP], Biodostępność Ustna [OB] ≥ 20%, Podobieństwo do Leku [DL] ≥ 0.1), zmapowano ich cele (Universal Protein Resource [UniProt]), zebrano cele związane z WU (GeneCards/OMIM/DrugBank) i przeanalizowano nakładające się cele poprzez wzbogacanie Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) oraz dokowanie molekularne. Komórki linii komórek nabłonka żołądka z uszkodzeniem wywołanym alkoholem (GES-1) były traktowane SQBJ lub inhibitorem PI3K LY294002. CCK-8 stosowano do określenia optymalnego stężenia SQBJ. Analizy farmakologii sieciowej zidentyfikowały 126 wspólnych celów wzbogaconych w kaskadach związanych z PI3K/AKT/MAPK i sugerowały potencjalne interakcje między głównymi składnikami SQBJ i białkami związanymi z PI3K/AKT. W komórkach wyzwalanych alkoholem SQBJ łagodził uszkodzenia komórek poprzez zmniejszenie uwalniania czynników zapalnych i stresu oksydacyjnego, co potwierdzono poprzez zmniejszenie poziomu reaktywnych form tlenu wewnątrzkomórkowych i malondialdehydu. SQBJ przywracał potencjał błony mitochondrialnej i zawartość ATP oraz zmniejszał zmiany związane z apoptozą w poziomach białka białaczo-limfocytowego-2, rozszczepionej kaspazy-3 i białka związanego z Bcl-2. SQBJ modulował również markery sygnałowe związane z PI3K/AKT i MAPK. Te efekty ochronne były w dużej mierze osłabione przez LY294002, co sugeruje, że sygnałowanie związane z PI3K/AKT jest zaangażowane w cytoprotekcję wywołaną przez SQBJ. Te odkrycia dostarczają podstawy mechanistycznych badań in vitro dla potencjalnego zastosowania SQBJ w leczeniu WU, chociaż wymagana jest dalsza walidacja na modelach zwierzęcych wrzodów żołądka wywołanych alkoholem.
Wrzod żołądka (GU) jest powszechnym zaburzeniem przewodu pokarmowego na całym świecie, charakteryzującym się uogólnionowym zapaleniem, erozją i owrzodzeniem błony śluzowej żołądka. Według oszacowań wynikających z analizy Globalnego Obciążenia Chorobami 2021 (GBD 2021), choroba wrzodowa przewodu pokarmowego (PUD) nadal wywiera znaczny wpływ kliniczny i ekonomiczny na miliony pacjentów na całym świecie. Chociaż ogólna częstość występowania PUD spadła wraz z powszechnym i rozległym klinicznym wykorzystaniem przeciwzakaźnych reżimów i inhibitorów pompy protonowej (PPI) hamujących wydzielanie kwasu, ten trend spadkowy uległ stabilizacji, a nawet zaobserwowano odbiór w niektórych regionach1. Warto zauważyć, że spożywanie alkoholu (etanolu) jest krytycznym czynnikiem patogennym niezależnym od infekcji Helicobacter pylori (H. pylori) oraz użycia niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ). Długotrwałe nadmierne spożywanie alkoholu uszkadza barierę śluzową żołądka, przyspiesza rozwój wrzodu i nawet zwiększa podatność na nowotwory żołądka—czyniąc ten stan krytycznym międzynarodowym kryzysem zdrowotnym2. W krajach rozwijających się częstość występowania uszkodzeń błony śluzowej żołądka związanych z alkoholem wzrasta z wielu powodów, w tym ze względu na wzrost spożycia alkoholu i zmiany stylu życia, co tworzy pilną potrzebę skutecznych i bezpiecznych strategii zapobiegania i leczenia.
Mechanizm patologiczny leżący u podstaw uszkodzeń błony śluzowej żołądka wywołanych etanolem jest wieloczynnikowy i wielowarstwowy. Przy bezpośrednim kontakcie z błoną śluzową żołądka, etanol szybko niszczy barierę śluzu-węglanu i wyzwala niekontrolowany wzrost reaktywnych form tlenu (ROS). Ta utrata kontroli nad utlenianiem następnie inicjuje peroksydacje lipidów (oznakowaną podwyższonym poziomem malondialdehydu, MDA), wyczerpywa endogeenne przeciwutleniacze w wyściółce żołądka, w tym supertlenek dysmutazę (SOD), a także glutation (GSH), i ostatecznie indukuje dysfunkcję mitochondrialną3. Rosnące dowody wskazują, że ROS wywołane przez etanol pochodzą głównie z mitochondriów i są ściśle związane z zaburzeniem potencjału błony mitochondrialnej (Δψm) i hamowaniem syntezy adenozynotrójfosforanu (ATP)4. Tymczasem stres oksydacyjny dodatkowo aktywuje kaskady prozapalne pod komendą czynnika nuklearnego kappa B (NF-κB). Ta aktywacja następnie promuje masywne uwalnianie mediatorów zapalnych głównie czynnika nekrozującego guzów-α (TNF-α), interleukiny-6 (IL-6) i białka C-reaktywnego (CRP), tworząc w ten sposób krąg zachęcający do dalszego "stresu oksydacyjnego-odpowiedzi zapalnej"5. Na tej podstawie inicjowana jest intrinsyczna kaskadowa apoptoza napędzana przez mitochondria, co jest udowodnione przez zakłócony stosunek Bcl-2 do Bax oraz sekwencyjne enzymatyczne proteolityczne rozszczepienie cysteinylo-aspartatowej specyficznej proteazy 3 (Kaspaz-3), co w końcu prowadzi do masowego obumierania komórek nabłonka błony śluzowej żołądka i tworzenie wrzodu6. Odpowiednio, jednoczesne ukierunkowanie na trzy kluczowe łącza patologiczne stresu oksydacyjnego, reakcji zapalnej i apoptozy reprezentuje kluczowa strategię efektywnej interwencji w uszkodzeniu błony śluzowej żołądka spowodowanym przez alkohol.
Szlak sygnałowy fosfoinozytyd 3-kinazy/białka kinazy B (PI3K/AKT) stanowi centralną oś regulacyjną kontrolującą długowieczność komórkową, proliferację i zaprogramowaną śmierć, pełniąc istotną funkcję w utrzymaniu homeostazy błony śluzowej żołądka. Po aktywacji, sygnał PI3K/AKT fosforyluje wiele substratów znajdujących się dalej w kaskadzie, hamuje aktywność proapoptotycznego czynnika Bad, uniemożliwiając w ten sposób ucieczkę niszczącego cytochromu c z mitochondriów, utrzymując homeostazę ΔΨm i promując przetrwanie komórek7. Ponadto istnieje złożona antagonistyczna interakcja między kaskadą PI3K/AKT a sieciami białek aktywowanych mitogenem (MAPK): nadregulacja aktywacji PI3K/AKT może osłabić przekaźnictwo sygnałów zapalnych i kaskady apoptotyczne poprzez hamowanie aktywacji kinaz stresowych, w tym p38, c-Jun N-końcowej kinazy (JNK) i zewnątrzkomórkowych regulowanych kinaz białkowych (ERK)8. Wiele badań wskazuje, że zmniejszona aktywność szlaku PI3K/AKT jest ściśle związana z zaostrzonym zapaleniem i zwiększoną apoptozą w modelach uszkodzeń błony śluzowej żołądka, podczas gdy przywrócenie aktywności tego szlaku może znacząco poprawić uszkodzenie błony śluzowej9. Jednakże obecnie brakuje systematycznej eksperymentalnej weryfikacji przyczynowo-skutkowej dotyczącej precyzyjnego mechanizmu regulacyjnego PI3K/AKT w uszkodzeniu błony śluzowej żołądka spowodowanym etanolem, szczególnie jego synergistycznej
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
To badania nie obejmowały udziału ludzkich uczestników, ludzkich próbek tkanki, próbek klinicznych lub eksperymentów na zwierzętach. Do analizy farmakologii sieciowej wykorzystano publicznie dostępne i anonimowe zasoby baz danych, a do eksperymentów in vitro zastosowano komórki GES-1 dostępne komercyjnie. Dlatego nie było konieczności formalnej zgody etycznej i pisemnej zgody pacjenta. Szczegółowe informacje dotyczące głównych odczynników, przeciwciał, zestawów do badań, instrumentów, producentów, numerów katalogowych oraz identyfikatorów zasobów badawczych (RRID), tam gdzie to dotyczy, zostały podsumowane w Tabeli Materiałów.
Przygotowanie i kontrola jakości wodnego ekstraktu SQBJ
Surowce ziołowe
Surowcami były Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (korzeń i kłącze) i Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (bulwy), uzyskane od komercyjnego dostawcy medycyny tradycyjnej chińskiej, a następnie zaautentifikowany przez starszego farmaceutę medycyny tradycyjnej chińskiej zgodnie z Farmakopeą Chińską (wydanie 2025). Specimeny (Numer SQBJ-20240301, Numer PN-20240301, Numer BS-20240301) zdeponowane zostały w herbarium naszej instytucji. Dwie zioła zostały zmiażdżone i wymieszane w proporcji masowej 1:1, aby przygotować proszek SQBJ.
Przygotowanie wodnego ekstraktu SQBJ
Proszek SQBJ poddano dwóm kolejnym ekstrakcjom z refluksem wodą dejonizowaną w proporcji masy do płynu 1:10 (g/mL) przez 1 h na sesję. Następnie połączone ekstrakty przepuszczono przez cztery warstwy gazy medycznej w celu usunięcia pozostałości materiału. Uzyskany filtrate skoncentrowano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 60 °C do osiągnięcia względnej gęstości 1,05–1,10, a następnie poddano liofilizacji w próżni w celu uzyskania proszku wodnego ekstraktu SQBJ, z końcowym wyjściem ekstrakcji 18,2 % ± 0,6 %. Proszek ekstraktu został uszczelniony i przechowywany w temperaturze -20 °C, rozpuszczony w pożywce DMEM bez surowicy, a następnie przepuszczony przez filtr membranowy 0,22 µm w celu sterylizacji przed eksperymentami na komórkach.
Kontrola jakości wodnego ekstraktu SQBJ
Aby ocenić spójność i standaryzację partii wodnego ekstraktu SQBJ, przeprowadziliśmy ilościowe oznaczenia wraz z profilowaniem chromatograficznym wysokosprawnej likwidacji cieczy (HPLC). Tabela Materiałów zawiera szczegółowe parametry techniczne dotyczące systemu HPLC. Na podstawie profili chemicznych obu składników ziołowych, nastawiliśmy się na cztery reprezentatywne markery: notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 i militarine. Jednak ta strategie kontroli jakości oparta na HPLC odzwierciedlała głównie kilka reprezentatywnych składników i nie zapewniała kompleksowego profilu chemicznego wszystkich aktywnych związków w SQBJ.
Rozdzielczosć chromatograficzną osiągnięto za pomocą kolumny odwrotnej fazy C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 µm). Operacja była utrzymywana w temperaturze kolumny 30 °C, z prędkością przepływu 1,0 mL/min, objętością wtrysku 10 µL i długością fali wykrycia 203 nm. Skład fazy ruchomej składał się z acetonitrylu (A) i 0,1% roztworu wodnego kwasu fosforowego (B), z wykorzystaniem następującego gradientu elucji: 0–15 min, 19% A; 15–35 min, 19%–35% A; 35–55 min, 35%–55% A; i 55–60 min, 55%–19% A. Szczegółowe informacje o urządzeniu i kolumnie są podane w Tabeli Materiałów.
Przygotowanie substancji referencyjnej
Aby przeprowadzić analizę ilościową, zakupiliśmy komercyjne standardy notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 i militarine, wszystkie o czystości ≥ 98%. Poszczególne referencyjne chemikalia zostały precyzyjnie zważone i rozpuszczone w pojedynczym stoku metanolowym, aby uzyskać jednolite mieszane rozwiązanie referencyjne o końcowej koncentracji 50 µg/mL dla każdego składnika.
Przygotowanie próbki:
Dokładnie zmierano proszek suchego ekstraktu SQBJ (50 mg), a następnie rozpuszczono w 25 mL metanolowego rozpuszczalnika analitycznego. Ta mieszanina poddana została kąpieli ultradźwiękowej przez 30 min według kontrolowanych parametrów urządzeń (moc: 250 W; częstotliwość: 40 kHz). Po doprowadzeniu do równowagi do temperatury pokojowej, ciecz przepuszczono przez 0,22 µm membranę filtra organicznego, aby uzyskać końcowy analityczny roztwór badawczy.
Wyniki oznaczenia zawartości:
Średnie zawartości głównych charakterystycznych składników w trzech kolejnych partiach wodnego ekstraktu SQBJ były następujące: notoginsenoside R1 3,12 ± 0,11 mg/g, ginsenoside Rg1 8,45 ± 0,23 mg/g,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bioinformatic dissection of SQBJ-mediated mechanisms in gastric ulcer
Aby zbadać, jak SQBJ może wywierać swoje działanie farmakologiczne na GU, początkowo przewidzieliśmy cele odpowiadające jego podstawowym składnikom bioaktywnym. Korzystając z programowania R, wyodrębniliśmy i usunęliśmy nadmiarowe wpisy wśród tych składników bioaktywnych, co ostatecznie dało 411 potencjalnych celów. Następnie, poprzez zapytanie do GeneCards i OMIM, zebrano GU-związane patologiczne cele, izolowano 1643 odrębne mie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Głównym celem niniejszego badania była ocena, czy SQBJ, klasyczna formuła złożona z Panax notoginseng i Bletilla striata, posiada działanie cytoprotekcyjne przeciw uszkodzeniom nabłonka śluzówki żołądka wywołanym etanolem w modelu komórkowym GES-1, z udziałem sygnalizacji związanej z PI3K/AKT oraz związanymi z nią zmniejszeniami markerów zapalnych, wskaźników stresu oksydacyjnego, dysfunkcji mitochondrialnej i zdarzeń apoptotycznych. Główne wyniki niniejszego badania są następujące: analiza farmakologii...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.
To badania zostały sfinansowane przez Jiangsu Provincial Traditional Chinese Medicine Science and Technology Development Plan Project-General Project (2023), Numer projektu: MS2023118.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Apoptosis assay | Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit | Beyotime | C1062L |
| ATP assay | Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 |
| Buffer | PBS | Solarbio | — |
| Cell digestion reagent | 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 |
| Cell line | GES-1 human gastric mucosal epithelial cells | Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | SCSP-533 |
| Cell viability assay | CCK-8 reagent | — | — |
| Confocal microscope | LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 |
| Culture medium | RPMI-1640 | Gibco | — |
| ELISA kit | Human CRP ELISA Kit | R&D Systems | DCPR00 |
| ELISA kit | Human IL-6 ELISA Kit | R&D Systems | DTAM00D |
| ELISA kit | Human TNF-α ELISA Kit | R&D Systems | — |
| Flow cytometer | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| Herbal material | Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher No. BS-20240301 |
| Herbal material | Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (root and rhizome) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher No. PN-20240301 |
| Herbal material | Sanqi Baiji San powder | In-house preparation | Voucher No. SQBJ-20240301 |
| HPLC column | ZORBAX SB-C18 column | Agilent Technologies | 4.6 mm × 250 mm, 5 μm |
| HPLC system | 1260 Infinity II HPLC system | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| IF secondary antibody | Alexa Fluor 594–conjugated anti-rabbit IgG | Invitrogen | A11012 |
| Inverted microscope | CKX41 inverted phase-contrast microscope | Olympus | CKX41 |
| Luminescence reader | Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | Infinite 200 PRO |
| Membrane | PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 |
| Microplate reader | iMark microplate reader | Bio-Rad | iMark |
| Mitochondrial membrane potential kit | JC-1 Assay Kit | Beyotime | C2006 |
| Nuclear stain | DAPI | Beyotime | C1002 |
| Online platform | Online bioinformatics plotting platform | Bioinformatics online analysis platform | Online platform |
| Online platform | Web-based enrichment analysis platform | Metascape | Online platform |
| Oxidative stress assay | GSH Assay Kit | Beyotime | S0052 |
| Oxidative stress assay | MDA Assay Kit | Beyotime | S0131 |
| Oxidative stress assay | SOD Assay Kit | Beyotime | S0109 |
| PI3K inhibitor | LY294002 | MCE | S1105 |
| Positive control drug | Omeprazole | MCE | HY-B0053 |
| Primary antibody | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| Primary antibody | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| Primary antibody | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| Primary antibody | Cleaved Caspase-3 Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| Primary antibody | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| Primary antibody | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| Primary antibody | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| Primary antibody | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| Primary antibody | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Primary antibody | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| Primary antibody | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| Primary antibody | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| Primary antibody | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| Primary antibody | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| Primer | AKT forward | — | — |
| Primer | AKT reverse | — | — |
| Primer | ERK forward | — | — |
| Primer | ERK reverse | — | — |
| Primer | GAPDH forward | — | — |
| Primer | GAPDH reverse | — | — |
| Primer | JNK forward | — | — |
| Primer | JNK reverse | — | — |
| Primer | p38 forward | — | — |
| Primer | p38 reverse | — | — |
| Primer | PI3K forward: | — | — |
| Primer | PI3K reverse | — | — |
| Protease inhibitor | PMSF | Beyotime | ST506 |
| Protein assay | BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 |
| Protein lysis buffer | RIPA buffer | Beyotime | P0013B |
| Public database | DrugBank | DrugBank Online | Online database |
| Public database | GeneCards | Weizmann Institute of Science | Online database |
| Public database | Online Mendelian Inheritance in Man | Johns Hopkins University | Online database |
| Public database | PubChem compound database | National Center for Biotechnology Information | Online database |
| Public database | RCSB Protein Data Bank | RCSB PDB | Online database |
| Public database | STRING protein interaction database | STRING Consortium | Online database |
| Public database | Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform | TCMSP | Online database |
| Public database | Universal Protein Resource | UniProt Consortium | Online database |
| Real-time PCR system | CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
| Reverse transcription kit | PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio | RR047A |
| RNA extraction reagent | TRIzol reagent | — | — |
| ROS probe | DCFH-DA | Beyotime | S0033 |
| Secondary antibody | HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 7074 |
| Software | Cytoscape | Cytoscape Consortium | 3.9.1 |
| Software | GraphPad Prism | GraphPad Software |