Urządzenie przenośne do przetwarzania śliny w celu poprawy wykrywania kortyzolu

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szybki metodę przetwarzania przedpłynku do poprawy wykrywania kortyzolu. Używany jest przenośny urządzenie do filtrowania w celu usunięcia mucyn i innych substancji interferencyjnych przy zachowaniu docelowego analitu. Przetworzony przedpłyn wykazuje ulepszony przepływ kapilarny, co umożliwia bardziej spójne i bardziej powtarzalne wykonanie testu.

Streszczenie

Wykrywanie kortyzolu w ślinie oferuje nieinwazyjną alternatywę dla analiz opartych na krwi. Jednak jego praktyczne wdrożenie jest nadal ograniczone przez wewnętrzną lepkość śliny oraz obecność składników interferencyjnych. W szczególności mucyny i białka ślinowe utrudniają przepływ napędzany kapilarnie i zmniejszają wiarygodność późniejszych testów przepływowych (LFA), co sprawia, że konieczne są skuteczne i dostępne strategie pre-obróbki. Prezentujemy tu przenośne urządzenie do pre-obróbki śliny, o nazwie SaliFilter, do wykrywania kortyzolu w punkcie opieki. Urządzenie wykorzystuje mechanizm filtracji, który selektywnie usuwa składniki interferencyjne o dużej masie cząsteczkowej, pozwalając jednocześnie na przejście małych cząsteczek, w tym kortyzolu. Obsługiwane przez prostą ręczną presję, umożliwia szybkie przetwarzanie próbek (ok. 2 min) bez potrzeby zewnętrznego sprzętu, czyniąc je odpowiednim dla zdecentralizowanych ustawień. Wydajność urządzenia została oceniona za pomocą pomiarów mętności, ilościowego oznaczania białek i SDS-PAGE, które potwierdziły efektywne usuwanie mucyn i białek ślinowych. Przetworzone próbki wykazywały zwiększony przepływ kapilarny, co skutkowało stabilnym i wiarygodnym działaniem LFA. Analiza ilościowa wykazała poprawę powtarzalności sygnału, a wykrywanie kortyzolu osiągnęło limit wykrywalności 1,47 ng mL⁻¹ w klinicznie istotnych zakresach stężeń. Ten protokół ustanawia skuteczną strategię pre-obróbki śliny, która poprawia czułość analityczną i wiarygodność bez kompromisu dla integralności analitu. Proponowany podejście zapewnia praktyczne, przenośne rozwiązanie dla diagnostyki opartej na ślinie, z potencjalnym zastosowaniem do testów w punkcie opieki i samodzielnego monitorowania.

Wprowadzenie

Kortyzol, hormon glikokortykoidowy wydzielan przez korę nadnerczy, jest kluczowym biomarkerem do oceny stresu fizjologicznego^1,2. Może być mierzony w wielu płynach biologicznych, w tym w surowicy, osoczu, moczu, płynie międzykomórkowym i ślinie, przy czym krew i ślina są najczęściej stosowane w praktyce klinicznej³. Chociaż pomiary oparte na krwi dostarczają wiarygodnych informacji ilościowych, wymagają inwazyjnego pobrania krwi i wykwalifikowanego personelu, co ogranicza ich przydatność do częstego lub podłużnego monitorowania^4,5,6. Natomiast pomiar kortyzolu w ślinie oferuje nieinwazyjną i wygodną alternatywę, umożliwiającą zastosowania w punkcie opieki i samodzielne monitorowanie^7,8. Należy zauważyć, że poziomy kortyzolu w ślinie koreluje silnie z stężeniami we krwi, co potwierdza ślinę jako wiarygodną próbkę zastępczą⁹. Jednakże, właściwa lepkość śliny i obecność zakłócających składników znacznie utrudniają analityczne osiągi, wymagając skutecznej pretrakmentacji przed analizą^10,11,12.

Zostało zbadane wiele strategii pretrakmentacji w celu rozwiązania tych wyzwań. Odwirowanie jest szeroko stosowane do usuwania dużych składników, takich jak mucyny, białka i pozostałości komórkowe. Jednakże, wymaga ono obszernego sprzętu laboratoryjnego i wielu etapów przetwarzania, co ogranicza jego przydatność w ustawieniach zdecentralizowanych^13,14. Rozcieńczanie buforami może zmniejszyć lepkość i poprawić przepływ próbek¹⁵. Niemniej jednak, jednocześnie obniża stężenie analitu, co kompromituje czułość analityczną. W rezultacie, istniejące podejścia pozostają niewystarczające dla aplikacji w punkcie opieki, gdzie szybkie, niewymagające sprzętu przetwarzanie i zachowanie analitów docelowych są niezbędne.

Aby pokonać te ograniczenia, opracowaliśmy SaliFilter, ręczne urządzenie do pretrakmentacji śliny, dostosowane do wykrywania kortyzolu w punkcie opieki. Urządzenie wykorzystuje mechanizm filtracji, który selektywnie usuwa substancje zakłócające o wysokiej masie cząsteczkowej, zezwalając na przejście małych cząsteczek, w tym kortyzolu¹⁶. Urządzenie obsługiwane ręcznie umożliwia szybkie, przyjazne dla użytkownika przetwarzanie bez konieczności używania sprzętu zewnętrznego. Eliminując zakłócające składniki, to podejście poprawia przepływ kapilarny w testach przepływowych bocznych, zwiększając w ten sposób niezawodność analityczną. Ten protokół opisuje wykonanie urządzenia i jego zastosowanie do szybkiego pretrakmentacji śliny przed wykrywaniem kortyzolu za pomocą testów przepływowych bocznych.

Protokół

W tym badaniu zastosowano komercyjnie pozyskiwaną, anonimową, zbiorczą ślinę ludzką. Nie rekrutowano żadnych uczestników ludzkich, a zgoda instytucjonalna na etykę nie była wymagana.

1. Przygotowanie próbki śliny

1. Instruuj uczestników, aby powstrzymali się od jedzenia i picia przez co najmniej 30 min przed pobraniem próbki.
2. Przygotuj próbkę śliny zgodnie z instrukcjami dostawcy.
   UWAGA: W tym badaniu do walidacji na poziomie protokołu zastosowano komercyjnie dostępną zbiorczą ślinę ludzką.
3. Delikatnie wymieszaj próbkę śliny przed użyciem, aby zapewnić jednorodność.
4. Przechowywaj próbki śliny w temperaturze 4 °C i używaj ich w okresie przechowywania zalecanym przez dostawcę.

2. Przygotowanie membrany pokrytej RBCM (Rysunek 1A)

1. Izoluję RBCM z pełnej krwi zgodnie z wcześniej opisanym protokołem¹⁶.
   1. Użyj komercyjnie pozyskiwanej ludzkiej pełnej krwi antikoagulowanej K2EDTA jako źródła RBCM.
   2. Centryfuguj pełną krew w 800 × g przez 5 min i po odjęciu osocza i pokrywy zbiorniczkowej zebraj frakcję czerwonych krwinek.
   3. Umyj izolowaną frakcję czerwonych krwinek trzykrotnie lodowatą buforowaną solą fosforanowo-fosforanową (PBS) przy użyciu delikatnego mieszania ręcznego.
   4. Resuspenduj umytą frakcję czerwonych krwinek w lodowanej 0,25 × PBS na 30 min, aby wywołać hemolizę.
   5. Oddziel wolny hemoglobinę, centryfugując zlizywaną zawiesinę w 20 000 × g przez 30 min i zebranie pelletu RBCM.
   6. Umyj zebrany pellet RBCM dodatkowo trzykrotnie w 0,25 × PBS i przechowuj blado różowy pellet RBCM w -80 °C do dalszego użytku.
2. Przygotuj membranę polietersulfonową (PES) o wielkości porów 30 nm i średnicy 13 mm.
3. Nanieś 100 μL 2% (w/v) roztworu RBCM na jedną stronę membrany PES. Delikatnie rozprowadź lub wydziel kroplowo roztwór, aż cała powierzchnia membrany zostanie w pełni zwilżona.
4. Inkubować membranę w 50 °C przez 30 min, aby zapewnić jednolite pokrycie i wysuszenie.
5. Przechowywaj pokrytą membranę w temperaturze pokojowej i używaj jej w ciągu 15 dni po przygotowaniu¹⁷.
   UWAGA: Szczegółowa charakterystyka pokrytej RBCM membrany PES została opisana w naszym poprzednim badaniu¹⁶.

3. Wykonanie urządzenia SaliFilter (Rysunek 1B)

1. Umieść membranę pokrytą RBCM w wyznaczonym uchwycie filtra.
2. Złóż urządzenie, mocując mocno komponenty wejściowe i wyjściowe.
3. Przymocuj strzykawkę 1 mL do wejścia urządzenia.
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie komponenty są szczelnie zamknięte, aby zapobiec wyciekowi podczas działania.

4. Pretreatowanie śliny

1. Naładuj 500 μL śliny do strzykawki podłączonej do urządzenia SaliFilter.
2. Naładuj ręcznie, aby przepuścić próbkę śliny przez membranę (ok. 2 min).
3. Zbierz przetretowaną ślinę z wyjścia.
4. Użyj przetretowanej próbki natychmiast lub przechowuj w 4 °C do dalszej analizy.

5. Analiza białek śliny metodą SDS-PAGE

1. Wymieszaj 15 μL próbki z 5 μL buforu próbki Laemmli.
2. Wprowadź mieszaninę do osobnych dołków żelu SDS-PAGE 8%.
3. Przeprowadź elektroforezę z 150 V przez 40 min.
4. Barw żel niebieskim Coomassie przez 2 godz.
5. Odbarw żel w wodzie destylowanej na noc.
6. Zdrap zdjęcia żelu za pomocą smartfonu lub systemu obrazowania.

6. Wykrywanie kortyzolu za pomocą testu bocznego przepływu (LFA)

1. Nanieś 150 μL przetretowanej śliny na próbnik LFA.
2. Pozwól próbce na migrację wzdłuż paska przez 10 min.
3. Zdrap zdjęcia wyników testu za pomocą smartfonu lub systemu obrazowania.
4. Otwórz zdjęcie LFA w ImageJ i użyj Obraz > Kolor > Rozdziel kanały, aby rozdzielić kanały RGB.
5. Użyj obrazu kanału zielonego do analizy intensywności linii testowej.
6. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 100 × 10 pikseli, pokrywający linię testową i zastosuj ten sam rozmiar ROI do wszystkich obrazów paska.
7. Zmierzyj średnią wartość intensywności linii testowej ROI. Wybierz przyległy pusty obszar membrany o tej samej wielkości ROI i zmierzyj intensywność tła.</

Wyniki

Skuteczne przygotowanie śliny wymaga usunięcia komponentów zakłócających, w tym mucyn i białek, które pogarszają wydajność późniejszych analiz. Zdolność filtracyjną SaliFilter oceniono początkowo poprzez porównanie zmian mętności z wynikami uzyskanymi przy użyciu komercyjnych zestawów do pobierania śliny (Rysunek 2A). Nieprzetworzona ślina wykazywała wysoką mętność, podczas gdy próbki poddane działaniu SaliFilter były widocznie klarowne, co wskazuje na efektywne usunięcie mucyn i zawiesiny. ...

Dyskusja

Diagnostyka oparta na śluzie oferuje bezinwazyjną alternatywę dla analizy krwi. Jednak ich szersze zastosowanie było ograniczone przez wewnętrzną lepkość śliny i obecność zakłócających składników, takich jak mucyny i białka. Czynniki te zakłócają przepływ napędzany przez kapilarność i obniżają wydajność prostych platform analitycznych, w tym LFA, co wymaga skutecznej pretrakmentacji próbki.

W niniejszym badaniu udowodniliśmy, że proponowany przenośny urządzenie do filtracji, SaliFilter, skutec...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Artificial saliva	Solarbio, China	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad, USA	5000006	Dla badania Bradford
Coomassie blue	Abcam, UK	ab119211	Do wizualizacji pasków białkowych
Cortisol ELISA Kit	Abcam, UK	ab154996
Cortisol LFA	In-house
Hot plate	Daihan Scientific, Republic of Korea)
Hydrocortisone (Cortisol)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
Laemmli sample buffer	GenDEPOT, USA	L1200-001	Do denaturacji białka przed SDS-PAGE
Membrane holder	GVS Filter Technology	1220950	Przyrząd średnicy 13mm
Mini-PROTEAN® Tetra Cell for 0.75 mm Gels	Bio-Rad, USA	1658000	Do elektroforetycznej separacji białek
Mucin	Sigma-Aldrich, USA	M2378
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA		Do badania białka
PES membranes	STERLITECH, USA	PES00313100	0.03 Mikron, 13 mm membrana PES
Phosphate-buffered saline (PBS)	DUKSAN, Republic of Korea	LB004
Pooled Human Saliva	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	In-house
Resolving Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad, USA	1610798	Do przygotowania paska rozdzielającego
Salivette Cortisol	SARSTEDT, Germany	51.1534.500	Zestaw do pobierania śliny
Stacking Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad, USA	1610799	Do przygotowania paska zbierającego
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	Zestaw do pobierania śliny
Syringe	koreavaccine, Republic of Korea)		Objętość 1 mL
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	Do polimeryzacji akryloamidu