Pobieranie krwi z tętnicy ogonowej szczurów w znieczuleniu izofluranem pozwala na niskostresową, kontrolowaną kolekcję stosunkowo dużych objętości krwi. Szybka rekonwalescencja oraz możliwość wielokrotnego pobierania próbek sprawiają, że metoda ta jest idealna do badań podłużnych wymagających wiarygodnych parametrów fizjologicznych.
Szybki raport
Pobieranie krwi z tętnicy ogonowej u szczurów zanestezjowanych izofluranem zmniejsza stres i zwiększa wiarygodność wyników
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metoda ta opisuje pobieranie krwi z tętnicy ogonowej u szczurów znieczulonych izofluranem. Zastosowanie izofluranu minimalizuje ruchy obronne, co umożliwia przeprowadzenie procedury w sposób kontrolowany i niskostresowy zarówno dla zwierzęcia, jak i badacza. Dalsze zalety obejmują szybki powrót zwierząt do sprawności po pobraniu krwi ze względu na krótki czas działania izofluranu, możliwość pobrania stosunkowo dużych objętości krwi z jednego miejsca nakłucia oraz przydatność tej techniki do wielokrotnego pobierania krwi. Ponadto szybki przepływ krwi tętniczej może zmniejszać prawdopodobieństwo wystąpienia artefaktów krzepnięcia, choć nie zostało to specyficznie ocenione w niniejszym badaniu. Wyniki określono w ramach badania farmakokinetycznego. Pobranie krwi zakończyło się powodzeniem u wszystkich zwierząt, co przełożyło się na 100% skuteczność pobierania. Po 24 h od pobrania krwi nie zaobserwowano istotnej utraty masy ciała, a zwierzęta szybko wróciły do sprawności bez widocznych oznak stresu czy powikłań związanych z procedurą. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to jest wysoce odpowiednie do warunków eksperymentalnych wymagających niezawodnego i powtarzalnego pobierania krwi przy minimalnym stresie związanym z manipulacją. Po krótkiej fazie nauki procedura okazała się niezawodna w rutynowym zastosowaniu eksperymentalnym. Należy jednak wziąć pod uwagę potencjalny wpływ znieczulenia izofluranem na parametry gazometryczne, metaboliczne i endokrynne podczas planowania eksperymentów i interpretacji wyników.
Wprowadzenie
Pobieranie krwi jest kluczową techniką w badaniach eksperymentalnych z wykorzystaniem szczurów, służącą do oceny parametrów fizjologicznych i farmakokinetycznych. Do zalecanych technik należą: nacięcie ogona, pobieranie krwi z bocznej żyły ogonowej, żyły saphénous, żyły podjęzykowej, żyły jugularis oraz zatoki zaocznej, a także kaniulacja1,2,3,4,5,6,7. Wybór metody zależy jednak od oczekiwanych rezultatów, a każda z nich posiada określone ograniczenia.
Pobieranie krwi z bocznej części żyły ogonowej oraz nacinanie ogona mogą dostarczyć ograniczone objętości krwi, natomiast pobieranie krwi z zatoki żylnej oczodołowej, choć wydajne, jest bardziej inwazyjne, wpływa na rekonwalescencję1 i wiąże się z ryzykiem uszkodzenia tkanek4,8 oraz budzi wątpliwości etyczne. Pobieranie krwi z żyły saphnenous wymaga unieruchomienia zwierzęcia i ogolenia miejsca nakłucia2, co może wywołać stres i wpłynąć na wyniki eksperymentalne. Wielokrotne pobrania krwi z żyły saphnenous mogą być również utrudnione ze względu na krótką długość żyły oraz hemostazę. To samo dotyczy żyły podjęzykowej. Chociaż za pomocą nakłucia żyły szyjnej można szybko uzyskać duże objętości krwi, istnieje ryzyko uszkodzenia płuc prowadzące do odmy opłucnowej. Ponadto, ponieważ żyła nie jest widoczna, nakłucie musi być wykonane „na ślepo”6.
W tym kontekście coraz większego znaczenia nabierają udoskonalone metody, które minimalizują cierpienie zwierząt, zapewniając jednocześnie wysoką jakość próbek. Pobieranie krwi z tętnicy ogonowej w znieczuleniu izofluranem stanowi takie podejście. Zastosowanie krótko działającego znieczulenia wziewnego ogranicza stres związany z manipulacją zwierzęciem i ułatwia kontrolowany przebieg procedury. Ponadto oczekuje się, że pobranie krwi tętniczej dostarczy wysokiej jakości próbek z mniejszym ryzykiem wystąpienia artefaktów krzepnięcia dzięki szybkiemu przepływowi krwi. Technika ta jest szczególnie odpowiednia do wielokrotnego pobierania próbek oraz w badaniach podłużnych, ponieważ zwierzęta szybko się regenerują, a zaburzenia fizjologiczne są zminimalizowane. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta łączy niezawodność techniczną z poprawą dobrostanu zwierząt, przez co jest dobrze dostosowana do warunków eksperymentalnych wymagających precyzyjnych i powtarzalnych pomiarów krwi.
Protokół
Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem przedstawionej metody zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu oraz Austriackie Ministerstwo Edukacji, Nauki i Badań.
1. Przygotowanie
UWAGA: Przed podaniem znieczulenia należy przygotować wszystkie niezbędne materiały, aby zapewnić płynny i wydajny przebieg procedury.
- Napełnić strzykawkę 3,2% cytratem (ilość zależna od pożądanych parametrów), aby zapobiec krzepnięciu krwi.
- Ustawić przepływ tlenu na 0,5 L/min, kierując go do komory indukcyjnej i maski.
- Zatkaj wąż podłączony do maski, aby upewnić się, że gaz indukcyjny i tlen są kierowane wyłącznie do komory.
- Wyjąć szczura z klatki i umieścić go w komorze indukcyjnej.
- Zamknąć pokrywę komory indukcyjnej, upewniając się, że ogon lub łapy szczura nie zostały przytrzaśnięte.
- Ustawić stężenie izofluranu na 3% (zależnie od systemu przewodów) i utrzymywać do momentu, aż zwierzę wykaże utratę spontanicznych ruchów oraz odruchu przywracania równowagi.
- Delikatnie kołysać komorą w przód i w tył, aby potwierdzić utratę odruchu przywracania równowagi.
- Zatkaj wąż podłączony do pojemnika, aby przekierować gaz i tlen do maski.
- Otworzyć pokrywę komory i wyjąć szczura.
- Umieścić szczura w pozycji grzbietnej na podkładce grzewczej (38 °C), z nosem umieszczonym w masce (Rysunek 1).
- Oczyścić ogon wodą i osuszyć papierową chusteczką.
- Zdezynfekować ogon alkoholem.
- Potwierdzić brak odruchu między palcami poprzez uciśnięcie przestrzeni między palcami tylnej kończyny szczura i zweryfikowanie braku reakcji wycofania.
Rysunek 1: Pozycja szczura. Szczur znajduje się w pozycji na plecach z nosem umieszczonym w masce do znieczulenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
2. Pobieranie krwi
UWAGA: Tętnica znajduje się po stronie brzusznej ogona. Optymalne miejsce nakłucia znajduje się pomiędzy środkową a dystalną częścią ogona. Tętnicę rozpoznaje się przede wszystkim na podstawie jej położenia anatomicznego, jednak u szczurów o słabej pigmentacji (np. Sprague Dawley) tętnica brzuszna ogona może być okazjonalnie widoczna jako słabo zarysowane niebieskawe naczynie. W takim przypadku tętnicę brzuszną ogona można zazwyczaj łatwo zidentyfikować u podstawy ogona dzięki jej położeniu anatomicznemu w linii środkowej strony brzusznej. Po jej zidentyfikowaniu można śledzić jej przebieg dystalnie aż do zamierzonego miejsca nakłucia.
- Śledź przebieg tętnicy od strony proksymalnej do dystalnej.
- Zorientuj ścięcie igły skierowane do góry.
- Wprowadź igłę pod kątem około 30 ° (Rysunek 2).
- Przesuwaj igłę w kierunku kranialnym, a następnie równolegle do ogona (Rysunek 2).
- Pobierz krew do strzykawki (Rysunek 2).
UWAGA: Jeśli igła wchodzi łatwo, pobierz wymaganą objętość krwi zgodnie z obowiązującymi wytycznymi. Jeśli ciśnienie krwi jest zbyt niskie do pobrania próbek, zmniejsz stężenie izofluranu do 2,5% i powtórz procedurę bez wyjmowania igły z miejsca nakłucia. Każde kolejne pobranie krwi powinno odbywać się z miejsca nakłucia położonego kranialnie względem poprzedniego miejsca. - Przed wyjęciem igły użyj tamponu, aby docisnąć miejsce wstrzyknięcia.
- Wyłącz anestezyję gazową i sprawdź miejsce wkłucia.
UWAGA: Po ustąpieniu krwawienia przenieś szczura z powrotem do jego klatki.
Rycina 2: Miejsce nakłucia. Miejsce nakłucia znajduje się brzusznie pomiędzy środkową a dystalną częścią ogona, a igłę należy wprowadzić pod kątem 30°. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
3. Przetwarzanie krwi
- Przelej pobraną krew do probówki.
- Przechowuj krew w lodzie do momentu wirowania.
Wyniki
Dane przedstawione w niniejszym artykule metodologicznym uzyskano podczas badania farmakokinetycznego. Do badania włączono wyłącznie samce szczurów Sprague Dawley w wieku 6–8 tygodni, o masie ciała od 393 g do 429 g. W dniu 0 pobrano pojedynczą próbkę krwi (0.3 mL) z tętnicy ogonowej. Masę ciała odnotowano bezpośrednio przed pobraniem krwi oraz ponownie po 24 h od próbkowania. Gaz anestetyczny został szybko wydychany, a zwierzęta szybko odzyskały sprawność. Krótko potem zaczęły jeść i nie wykazywały oznak upośledzenia ogólnego stanu zdrowia. Szczury nie wykazywały oznak stresu ani lęku podczas wyjmowania z klatki w celu kolejnego pobrania krwi. Ponadto w dniach następujących po procedurze nie zaobserwowano zachowań obronnych. Przy prawidłowym wykonaniu procedury na ogonie nie były widoczne żadne krwiaki. Zwierzęta nie wykazywały oznak bólu ani bezpośrednio po pobraniu krwi, ani w dniach następnych, a miejsca pobrania krwi na ogonach były również bezbolesne w dotyku. W ciągu 24 h po pobraniu krwi nie zaobserwowano spadku masy ciała. Średnia masa ciała wzrosła z 409 g w dniu 0 do 419 g w dniu 1, co odpowiada średniemu przyrostowi masy ciała o 2.6% ±± 1.1%, co sugeruje, że procedura pobierania krwi była dobrze tolerowana (Rycina 3).
Rycina 3: Zmiana masy ciała. Masa ciała (g) przed (d0) i 24 h po (d1) pobraniu krwi u szczurów (n = 12). Po pobraniu krwi nie zaobserwowano spadku masy ciała. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Przedstawiona technika pobierania krwi z tętnicy ogonowej jest szczególnie odpowiednia do badań wymagających wielokrotnego pobierania krwi lub stosunkowo dużych objętości próbek. W porównaniu z pobieraniem krwi z żyły ogonowej, technika ta ułatwia zebranie większych objętości krwi z jednego miejsca nakłucia i może oferować praktyczne zalety przy wielokrotnym pobieraniu, ponieważ ponowne nakłucia żyły mogą stać się trudniejsze ze względu na tworzenie się krwiaków i ograniczoną dostępność żyły. Zgodnie z zaleceniami Die Gesellschaft für Versuchstierkunde / Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS) oraz Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), pojedyncze pobranie krwi nie powinno przekraczać 10% krążącej objętości krwi, natomiast wielokrotne pobieranie codzienne powinno być ograniczone do około 1% krążącej objętości krwi na 24 h, po czym powinien nastąpić odpowiedni okres regeneracji. Opisana technika pozwala na niezawodne i powtarzalne uzyskanie tych zalecanych objętości pobierania, co czyni ją odpowiednią zarówno dla protokołów jednorazowego, jak i wielokrotnego pobierania krwi.
Idealna technika pobierania krwi powinna zapewnić objętość krwi wystarczającą do planowanych analiz, minimalizując jednocześnie stres związany z procedurą i gwarantując wysoką jakość próbek. Pobieranie krwi z splotu żylnego zaocznego oraz z żyły podjęzykowej może prowadzić do problemów z krzepliwością z powodu urazów tkanek8,9, co byłoby niekorzystne w badaniach krzepnięcia. Podobnie techniki okroplne — takie jak "dojenie" żyły ogonowej — mogą również prowadzić do krzepnięcia indukowanego pobieraniem próbek. W porównaniu z tymi metodami, krew tętnicza pobierana z ogona wydaje się mniej podatna na przedwczesne krzepnięcie. Może to wynikać z szybkiego procesu pobierania, braku urazów tkanek oraz natychmiastowego kontaktu krwi z cytrynianem w strzykawce, co skutecznie zapobiega koagulacji. Inne techniki, takie jak nakłucie żyły szyjnej, niosą ze sobą ryzyko uszkodzenia narządów1,6, a zalecane procedury cewnikowania wymagają znieczulenia ogólnego, a następnie opieki pooperacyjnej i pielęgnacji rany. Regularne przemywanie cewnika jest niezbędne, aby zapobiec niedrożności, a zawsze istnieje ryzyko usunięcia cewnika przez zwierzęta.
Pobieranie krwi z tętnicy ogonowej wymaga krótkiej sedacji, ponieważ zwierzęta muszą zostać ułożone w pozycji na plecach, a samo nakłucie jest bolesne, co może powodować ruchy obronne. Zastosowanie anestezji izofluranem minimalizuje te ruchy, umożliwiając przeprowadzenie procedury w sposób kontrolowany i wydajny. Dzięki temu pobranie krwi może zostać wykonane szybko, co zmniejsza ogólne obciążenie organizmu zwierzęcia w porównaniu z technikami wenipunkcji z żyły ogonowej, gdzie zebranie pożądanej ilości krwi może trwać dłużej. Brak ruchów obronnych zmniejsza również prawdopodobieństwo wielokrotnych nakłuć igłą. Co istotne, zwierzęta nie rejestrują świadomie przebiegu procedury, szybko się budzą i zazwyczaj powracają do normalnego zachowania krótko po pobraniu próbek1. Po pobraniu krwi zwierzęta szybko wybudzały się z anestezji izofluranem i zazwyczaj wkrótce potem wznawiały normalne zachowanie. W niniejszym badaniu masa ciała zmierzona 24 h po pobraniu krwi wykazała niewielki wzrost w porównaniu z wartością wyjściową, co sugeruje, że pobieranie pokarmu nie zostało negatywnie wpłynąć przez procedurę i potwierdza bezpowłudniowy przebieg krótkoterminowego powrotu do sprawności.
Znane jest, że izofluran obniża ciśnienie krwi10,11, co może utrudniać pobieranie krwi żylnej z powodu zmniejszonego napełnienia żył. Z kolei pobieranie krwi żylnej bez znieczulenia wymaga unieruchomienia zwierzęcia1,2, co może wywołać znaczny stres i potencjalnie wpłynąć na wyniki eksperymentu. Ponadto stres powoduje skurcz naczyń krwionośnych, co również może utrudnić pobieranie krwi. Obniżone ciśnienie krwi może wpływać także na pobieranie krwi tętniczej; jednak w naszym doświadczeniu problem ten można łatwo rozwiązać poprzez dostosowanie stężenia izofluranu, utrzymując tym samym wystarczający przepływ krwi do pobrania próbek.
Znane jest jednak to, że izofluran wpływa na parametry fizjologiczne, w szczególności na wartości gazometryczne krwi, ze względu na depresję oddechową12,13. Izofluran może wpływać na funkcję oddechową i wymianę gazową, potencjalnie zmieniając poziomy tlenu i dwutlenku węgla w krwi tętniczej. Kilka badań wykazało, że izofluran może również zmieniać parametry metaboliczne i endokrynne, w tym poziom glukozy we krwi, mleczanów, insuliny, kortykosteronu oraz metabolizm lipidów14,15,16. Niemniej jednak wykazano, że izofluran indukuje mniej zmian w parametrach związanych ze stresem niż wiele innych schematów znieczulenia i zapewnia zalety w postaci szybkiej indukcji, krótkiego czasu wybudzania oraz precyzyjnej kontroli głębokości znieczulenia, co czyni go odpowiednim do rutynowych procedur pobierania krwi14. W związku z tym potencjalny wpływ izofluranu należy wziąć pod uwagę podczas planowania i interpretacji eksperymentów, ponieważ próbki krwi tętniczej pobrane w znieczuleniu mogą nie odzwierciedlać dokładnie podstawowych warunków fizjologicznych. W przypadku badań farmakokinetycznych efekty te mają jednak często drugorzędne znaczenie w porównaniu z korzyściami wynikającymi z uzyskania powtarzalnych próbek krwi przy jednoczesnym zminimalizowaniu stresu związanego z manipulacją zwierzęciem.
Kolejną kwestią jest narażenie zawodowe eksperymentatora na izofluran. Ponieważ system nie jest całkowicie zamknięty, podczas procedury istnieje ryzyko kontaktu z gazem anestetycznym. Praca pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza lub z zastosowaniem odpowiednich systemów odprowadzania gazów zminimalizowałaby to narażenie, jednak taki sprzęt może nie być dostępny we wszystkich warunkach eksperymentalnych.
Ogólnie rzecz biorąc, opisana technika stanowi wartościową alternatywę dla konwencjonalnych metod pobierania krwi, łącząc oczekiwaną wysoką jakość próbek z redukcją stresu i poprawą warunków manipulacji. Przynosi ona wyraźne korzyści w zakresie dobrostanu zwierząt oraz efektywności procedury. Jej przydatność zależy ostatecznie od konkretnego pytania badawczego, jednak jest ona szczególnie korzystna w warunkach eksperymentalnych, w których niezbędne są wiarygodne parametry krwi oraz minimalne zaburzenia fizjologiczne.
Oświadczenia
Autor nie deklaruje żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorka pragnie podziękować Katharinie Tillmann za zainspirowanie jej do opublikowania tej metody.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System do znieczulenia | Dräger | https://www.draeger.com/en-us_us/Productfinder/Anaesthesia/Anaesthesia-Machines#products | Znieczulenie gazowe |
| Probówka Vacuette z cytrynianem (cytrynian sodu 3,2%) | Greiner Bio-One | 454332 | Antykoagulant |
| Probówka Eppendorf 1,5 mL | Eppendorf | 3,01,25,150 | Przechowywanie krwi |
| Izofluran w płynie (Isospire) | Dechra | Znieczulenie gazowe | |
| Igła (25 G ´ 5/8'') | BD Microlance | 300600 | Pobieranie krwi |
| Strzykawka 1 mL (tuberkulinowa Luer) | Chirana | CHTUB01 | Pobieranie krwi |
| Thermomaquet 2000 | Maquet | Thermomaquet 2000 | System grzewczy |
| Celulozowe gaziki Zelletten 5 cm ´ 4 cm | Lohmann&Rauscher | Hemostaza |
Bibliografia
- Toft, M., Peterson, M. H., Dragsted, N., Hansen, A. K. The impact of different blood sampling methods on laboratory rats under different types of anaesthesia. Laboratory Animals. 40, 261-274 (2006).
- Hem, A., Smith, A. J., Solberg, P. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guineapig, ferret and mink. Laboratory Animals. 32, 364-368 (1998).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- National Institutes of Health, Office of Animal Care and Use. . Guidelines for survival blood collection in mice and rats. , (2025).
- Xu, Y., Zhu, Y., Lin, J., Borlak, J. Serial blood collection in anaesthetised rats: Enhancing animal welfare without the need for jugular vein catheterisation. Regul Toxicol Pharmacol. 164, 105988 (2026).
- Fluttert, M., Dalm, S., Oitzl, M. S. A refined method for sequential blood sampling by tail incision in rats. Laboratory Animals. 34, 372-378 (2000).
- Salemink, P. J. M., Korsten, J., de Leeuw, P. Prothrombin times and activated partial thromboplastin times in toxicology: a comparison of different blood withdrawal sites for Wistar rats. Comp Haematol Int. 4, 173-176 (1994).
- Seibel, J., et al. Comparison of haematology, coagulation and clinical chemistry parameters in blood samples from the sublingual vein and vena cava in Sprague-Dawley rats. Laboratory Animals. 44, 344-351 (2010).
- Albrecht, M., et al. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: a telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Vet Res. 10, 310 (2014).
- Janssen, B. J. A., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H1618-H1624 (2004).
- Flecknell, P. . Laboratory animal anaesthesia. , (2009).
- Tsukamoto, A., et al. Combining isoflurane anesthesia with midazolam and butorphanol in rats. Exp Anim. 65 (3), 223-230 (2016).
- Arnold, M., Langhans, W. Effects of anesthesia and blood sampling techniques on plasma metabolites and corticosterone in the rat. Physiol Behav. 99, 592-598 (2010).
- Rauch, E., Ari, C., D'Agostino, D. P., Kovács, Z. Exogenous ketone supplement administration abrogated isoflurane-anesthesia-induced increase in blood glucose level in female WAG/Rij rats. Nutrients. 16 (10), 1477 (2024).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comp Med. 67 (2), 122-132 (2017).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie