Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Siła i czas trwania sygnału TCR w aktywacji i różnicowaniu pierwotnych komórek T CD8+ myszy: zestandaryzowane podejście in vitro

150 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71979

⸱

25 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje systematyczną metodę aktywacji naiwnych pierwotnych limfocytów T CD8+ myszy z wykorzystaniem stopniowanej stymulacji TCR, co umożliwia kompleksową analizę proliferacji, aktywacji i produkcji cytokin przez limfocyty T CD8+ przy różnych intensywnościach sygnału TCR.

Streszczenie

Intensywność i czas trwania sygnału receptora limfocytów T (TCR) są kluczowymi czynnikami determinującymi aktywację, proliferację i różnicowanie funkcjonalne limfocytów T CD8⁺. Jednak ustandaryzowane modele in vitro, które systematycznie porównują, w jaki sposób zróżnicowane sygnały TCR kształtują losy limfocytów T, są wciąż ograniczone. Niniejsze badanie przedstawia powtarzalną metodę aktywacji pierwotnych limfocytów T myszy in vitro z wykorzystaniem unieruchomionego na płytce przeciwciała anty-CD3 oraz rozpuszczalnego przeciwciała anty-CD28, z dodatkiem interleukiny-2 (IL-2), oraz analizuje, jak modulowanie stężenia anty-CD3 (siła sygnału) i czasu stymulacji (czas trwania sygnału) wpływa na wyniki aktywacji limfocytów T. Szczegółowo opisujemy protokół izolacji naiwnych limfocytów T z myszy C57BL/6, a następnie ich stymulacji w zakresie stężeń anty-CD3 (0,1–10 µg/mL) i czasów trwania (6–48 h). Przeprowadziliśmy analizę cytometryczną w celu oceny wczesnego sygnalizowania indukowanego przez TCR poprzez pomiar wewnątrzkomórkowej fosforylacji białka rybosomalnego S6 (p-S6) jako wskaźnika aktywności kompleksu 1 kinazy mTOR (mTORC1), a następnie oceniliśmy zdarzenia następcze, w tym powierzchniowe markery aktywacji (CD69, CD25, ICOS, PD-1), proliferację komórkową poprzez rozcieńczenie fioletowego barwnika do śledzenia proliferacji (CTV) oraz ekspresję cząsteczek efektorowych (Granzym B, TNF-α) jako wskaźniki różnicowania funkcjonalnego. Metoda ta zapewnia przejrzysty, etapowy przewodnik wizualny do przeprowadzania powtarzalnych stymulacji limfocytów T, umożliwiając badaczom analizę tego, jak konkretne parametry sygnału TCR kierują decyzjami o losach limfocytów T. Podejście to nie tylko wspiera badania mechanistyczne nad aktywacją i różnicowaniem limfocytów T, ale także oferuje platformę do optymalizacji kondycjonowania limfocytów T dla immunoterapii adoptywnej i testów primingu in vitro. Dzięki integracji demonstracji wideo z szczegółowym opisem protokołu, opracowanie to zwiększy przejrzystość metodologiczną i powtarzalność w badaniach nad immunologią limfocytów T.

Wprowadzenie

Limfocyty T są niezbędne dla ochronnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko patogenom i nowotworom. Naiwne limfocyty T są aktywnie utrzymywane w stanie spoczynku, aby zapewnić ich długoterminowe przetrwanie i persistencję1. Po stymulacji antygenem limfocyty T opuszczają stan spoczynku, przechodzą ekspansję klonalną i różnicowanie efektorowe2. Sygnały receptora limfocytów T (TCR) stanowią kluczowy proces inicjowania i regulowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych3. Po specyficznym rozpoznaniu cząsteczek kompleksu peptyd-główny układ zgodności tkankowej (pMHC) prezentowanych na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC), uruchamiana jest kaskada zdarzeń sygnalizacyjnych, co napędza ekspansję klonalną i różnicowanie funkcjonalne limfocytów T4,5,6.

Intensywność stymulacji TCR, determinowana przez kluczowe czynniki, takie jak powinowactwo, awidność i stężenie antygenu, odgrywa krytyczną rolę w regulowaniu stopnia aktywacji limfocytów T, nabywania funkcji efektorowych oraz trajektorii różnicowania w kierunku odrębnych podzbiorów efektorowych lub pamięciowych limfocytów T7,8,9. Obecne modele in vitro służące do badania TCR-zależnej aktywacji limfocytów T opierają się głównie na przeciwciałach anty-CD3 i anty-CD28 związanych z płytką lub sprzężonych z koralikami, co zapewnia jednoczesne dostarczenie sygnałów ligacji TCR oraz sygnałów kostymulujących10,11. Choć systemy te są szeroko stosowane, zazwyczaj wykorzystują one tylko jedno, często nasycające stężenie przeciwciała anty-CD3, co pozwala jedynie na binarne porównanie aktywacji limfocytów T w schemacie „wszystko albo nic”, zamiast uchwycić dynamiczny zakres siły sygnału TCR możliwy do osiągnięcia przy użyciu miareczkowanego gradientu stymulacji12,13.

Opisany tutaj protokół zapewnia zestandaryzowany i powtarzalny system in vitro do systematycznej oceny wpływu stopniowanej siły sygnału TCR na aktywację, proliferację i fenotypy funkcjonalne pierwotnych mysich limfocytów T CD8+, przy użyciu miareczkowanych gradientów przeciwciał anty-CD3 (0,1–10 µg/mL) oraz stałego stężenia przeciwciał anty-CD28 (1 µg/mL). Podejście to opiera się na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, która pozwala na analizę zarówno sygnalizacji w górę kaskady — poprzez wewnątrzkomórkowe fosforylowane białko rybosomalne S6 (p-S6) jako wskaźnik aktywności kompleksu 1 kinazy mTOR (mTORC1) — jak i końcowych efektów komórkowych, w tym proliferacji śledzonej poprzez rozcieńczenie CTV, powierzchniowych markerów aktywacji (CD69, CD25, indukowalnego kostymulatora limfocytów T [ICOS], białka śmierci programowanej 1 [PD-1]) oraz ekspresji cząsteczek efektorowych (granzyme B, czynnik martwicy nowotworów alfa [TNF-α]), w przedziale czasowym od 6 do 48 h.

Nasz protokół wykorzystuje gradient stężeń unieruchomionych na płytce przeciwciał anty-CD3 w celu precyzyjnej modulacji intensywności stymulacji, co pozwala na naśladowanie zróżnicowanej awidności wiązania TCR obserwowanej w warunkach fizjologicznych. Metoda ta charakteryzuje się wysoką wydajnością sieciowania TCR oraz silną aktywacją pierwotnych spoczynkowych limfocytów T. Ustandaryzowana procedura pokrywania zapewnia jednorodne rozmieszczenie przeciwciał na powierzchni płytki, co prowadzi do spójnej stymulacji komórek w obrębie tej samej partii oraz doskonałej powtarzalności eksperymentalnej. Taki format stanowi kosztowo efektywne i proste operacyjnie podejście do aktywacji limfocytów T.

Należy jednak uznać pewne ograniczenia tego podejścia. Stymulacja pośredniczona przez przeciwciała anty-CD3/CD28 znacząco różni się od fizjologicznego kontekstu in vivo. Choć metody eksperymentalne wykorzystujące wyłącznie agonistyczne przeciwciała anty-CD3 i anty-CD28 do oceny aktywacji limfocytów T mogą dostarczać skutecznych odczytów tej aktywacji, nie odtwarzają one w pełni oddziaływań między komórkami prezentującymi antygen a limfocytami T, a także kostymulacyjnego mikrośrodowiska występującego w warunkach fizjologicznych14.

Pomimo tych ograniczeń, niniejszy protokół oferuje systematyczną i powtarzalną platformę, która stanowi wartościowe i dostępne narzędzie do badania odpowiedzi limfocytów T zależnych od siły sygnału TCR i może uzupełniać bardziej złożone modele swoiste względem antygenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.

1. Przygotowanie odczynników i płytek

  1. Przygotować przeciwciała anty-CD3 do unieruchomienia na płytce w sterylnym PBS w stężeniach 0,1, 0,5, 1, 5 i 10 µg/mL.
  2. Do studzienek płytek 96-dołkowych o płaskim dnie dodać po 50 µL roztworu powlekającego anty-CD3 na studzienkę.
  3. Uszczelnić płytki folią uszczelniającą i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Odssać roztwór powlekający i dwukrotnie przemyć każdą studzienkę 200 µL sterylnego PBS przed dodaniem komórek.

2. Izolacja naiwnych limfocytów T CD8+ ze śledziony myszy

  1. Wybrać samce myszy C57BL/6 w wieku 6–8 tygodni (zakupione od Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) i poddać eutanazji poprzez inhalację CO2 , a następnie zwichnięcie stawów szyjnych. Myszy powinny być utrzymywane w warunkach wolnych od specyficznych patogenów, w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności, z wolnym dostępem do pożywienia i wody. W każdym niezależnym eksperymencie należy wykorzystać minimum 3 myszy.
  2. Ostrożnie naciąć otrzewną nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić śledzionę, chwycić i pobrać śledzionę za pomocą pęsety, a następnie umieścić ją w naczyniu zbierającym zawierającym schłodzone podłoże RPMI 1640 uzupełnione o 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (R2). Naczynie należy przechowywać w lodzie do czasu dysocjacji.
    UWAGA: Wszystkie truchła zwierząt i odpady z hodowli komórkowych należy zbierać do wyznaczonych worków na odpady biologiczne i autoklawować w temperaturze 121 °C przez 20 min przed utylizacją.
  3. Wyjąć śledzionę z naczynia zbierającego i przenieść ją do szalki 60 mm zawierającej 3 mL 1× buforu lizującego chlorek amonu-potasu (ACK).
  4. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, delikatnie rozcierając śledzionę przez sitko komórkowe 70 µm za pomocą tłoka strzykawki 3 mL.
  5. Inkubować zawiesinę przez 1 min w temperaturze pokojowej (RT), a następnie dodać 3 mL schłodzonego podłoża R2, aby zneutralizować bufor lizujący chlorek amonu-potasu (ACK).
  6. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej 15 mL i odwirować przy 500 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
  7. Po wirowaniu odessać nadsącz i zawiesić osad w 10 mL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej (PBS z 2% FBS).
  8. Przefiltrować zawiesinę przez sitko komórkowe 70 µm do nowej probówki stożkowej 15 mL, a następnie ponownie odwirować przy 500 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Azotek sodu powinien zostać pominięty w buforze do barwienia w cytometrii przepływowej, aby zachować żywotność komórek do testów funkcjonalnych. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i analizować niezwłocznie.
  9. Odessać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w 200 µL koktajlu przeciwciał biotynylowanych na każdą śledzionę myszy (zawierającego przeciwciała anty-CD16/32 (blokada Fc), anty-TER-119, anty-CD19, anty-CD4, anty-B220, anty-NK1.1, anty-Ly-6G, anty-CD11b, anty-CD11c, anty-CD49b, anty-CD44 i anty-F4/80).
  10. Inkubować w lodzie przez 25 min, delikatnie odwracając probówkę co 5 min, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
  11. Przemyć komórki dużą objętością buforu do barwienia w cytometrii przepływowej, odwirować przy 500 × g przez 5 min i odrzucić nadsącz.
  12. Zawiesić osad w tej samej objętości buforu do barwienia w cytometrii przepływowej, która była użyta do koktajlu przeciwciał biotynylowanych, dodać kuleczki magnetyczne powlekane streptawidyną w połowie tej objętości i inkubować w lodzie przez 15 min, delikatnie odwracając probówkę co 5 min, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
  13. Krótko odwirować probówkę, umieścić ją na statywie magnetycznym na 2–3 min i ostrożnie przenieść nadsącz (wzbogacone naiwne limfocyty T CD8+) do nowej probówki stożkowej 15 mL.
  14. Przemyć zebrane komórki raz buforem do barwienia w cytometrii przepływowej, a następnie ponownie odwirować przy 500 × g przez 5 min.
  15. Odrzucić nadsącz i zawiesić osad w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym o 10% FBS (R10) do dalszych zastosowań.

3. Znakowanie barwnikiem CTV do śledzenia proliferacji

  1. Przygotuj 2 × świeży roztwór roboczy CTV (10 µM) bezpośrednio przed użyciem. Dokładnie wymieszaj roztwór stokowy CTV 5 mM (w dimetylosulfotlenku [DMSO]) za pomocą wortexa, a następnie rozcieńcz go sterylnym PBS do uzyskania stężenia końcowego 10 µM.
    UWAGA: Z roztworem stokowym CTV (przygotowanym w DMSO) należy obchodzić się w dygestorium, używając rękawic nitrylowych, ponieważ DMSO ułatwia wchłanianie toksycznych związków przez skórę. Unikać wdychania i kontaktu ze skórą.
  2. Resuspenduj połowę wyizolowanych naiwnych limfocytów T CD8+ w schłodzonym PBS do gęstości 8 × 107 komórek/mL.
  3. Szybko dodaj równą objętość 2 × roztworu roboczego CTV (10 µM) do zawiesiny komórkowej i dobrze wymieszaj pipetując, aby uzyskać końcowe stężenie CTV wynoszące 5 µM.
  4. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności przez 20 min, delikatnie odwracając probówki co 5 min w celu zapewnienia dokładnego wymieszania.
  5. Dodaj do komórek 5 objętości pożywki hodowlanej (zawierającej co najmniej 10% FBS) i inkubuj przez 5 min na lodzie, aby usunąć wolny barwnik.
  6. Wiruj komórki z prędkością 500 × g przez 5 min, a osad resuspenduj w świeżo podgrzanej pełnej pożywce R10 uzupełnionej o przeciwciało anty-CD28 (stężenie końcowe: 1 µg/mL) oraz IL-2 (stężenie końcowe: 10 ng/mL).
  7. Do każdego dołka wcześniej powlekonych płytek 96-dołkowych dodaj 250 µL zawiesiny komórkowej (zawierającej 6 × 105 komórek).
  8. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ przez maksymalnie 48 h.

4. Wykrywanie CTV metodą cytometrii przepływowej

  1. Zbierz komórki do płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie w punktach czasowych 6, 36 i 48 h. Wirować z prędkością 500 × g przez 5 min i przemyć dwukrotnie buforem do barwienia w cytometrii przepływowej.
  2. W celu barwienia powierzchniowego inkubować komórki z 50 µL koktajlu przeciwciał zawierającego przeciwciała anty-CD8, barwnik do oceny żywotności (fixable viability dye) oraz anty-CD44 przez 30 min w lodzie w ciemności.
    UWAGA: Wszystkie nadsączniki zawierające przeciwciała sprzężone z fluoroforami należy zbierać do wyznaczonych pojemników na odpady uzupełnionych o 0,5% podchlorynu sodu w celu dekontaminacji, a następnie utylizować zgodnie z instytucjonalnymi protokołami dotyczącymi odpadów biologicznie niebezpiecznych.
  3. Przemyć komórki dwukrotnie buforem do barwienia w cytometrii przepływowej i resuspender w 200 µL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej w celu akwizycji w cytometrze przepływowym.
  4. Przeprowadzić akwizycję próbek na cytometrze przepływowym wyposażonym w trzy lasery. Przygotować probówki kontrolne jednobarwne z użyciem zabarwionych komórek w celu ustawienia parametrów kompensacji.
  5. Zastosować następującą strategię bramkowania: wykluczyć debris za pomocą bramkowania rozproszenia światła przedniego (FSC) względem bocznego (SSC), wyeliminować dublety poprzez bramkowanie singletów oraz wyselekcjonować do analizy żywe (ujemne względem barwnika do oceny żywotności) limfocyty T CD8+.
  6. Zebrać co najmniej 1 × 104 zdarzeń dla bramkowanych limfocytów T CD8+ na próbkę. Przeanalizować dane przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej i obliczyć proporcję komórek, które przeszły jedną lub więcej podziałów, korzystając z modułu analizy proliferacji.

5. Barwienie powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe w celu analizy aktywacji i sygnalizacji

  1. Ponownie zawiesić drugą połowę naiwnych limfocytów T CD8+ w medium R10 uzupełnionym o przeciwciało anty-CD28 w stężeniu 1 µg/mL oraz IL-2 w stężeniu 10 ng/mL, przy zagęszczeniu 2,4 × 106 komórek/mL.
  2. Do każdego dołka wcześniej powleczonych płytek 96-dołkowych dodać 250 µL zawiesiny komórkowej (6 × 105 komórek).
  3. Kulturować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ przez maksymalnie 48 h.
  4. W wyznaczonych punktach czasowych (6, 10, 12, 24 i 36 h) zebrać komórki do 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.
    UWAGA: Punkt 6 h pozwala na uchwycenie wczesnego sygnałowania TCR (fosfo-S6) oraz CD69; ten ostatni jest dodatkowo oceniany w godzinach 12, 24 i 36, aby uchwycić jego pełną kinetykę. Poziomy CD25, PD-1 i ICOS monitoruje się w godzinach 10, 12, 24 i 36; punkt czasowy 48 h jest zarezerwowany dla proliferacji (Rozdział 4) i detekcji cytokin (Rozdział 6).
  5. Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i zawiesić osad komórkowy w 200 µL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej.
  6. Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i odessać nadosad. Przemyć komórki dwukrotnie 200 µL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej.
  7. W celu barwienia powierzchniowego inkubować komórki z 50 µL koktajlem przeciwciał zawierającym anty-CD69, anty-CD25, anty-CD8, anty-PD-1, anty-ICOS oraz stabilny barwnik żywotności przez 30 min w lodzie, w ciemności.
  8. Przemyć komórki trzykrotnie buforem do barwienia w cytometrii przepływowej, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
  9. Zawiesić osad komórkowy w 200 µL 1% paraformaldehydu i utrwalić komórki w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności przez 15 min.
    OSTROŻNIE: Wszystkie etapy z użyciem paraformaldehydu należy przeprowadzać w dygestorium, aby zapobiec wdychaniu oparów. Wszystkie odpady ciekłe zawierające utrwalacz należy zbierać do oddzielnego pojemnika przeznaczonego do utylizacji niebezpiecznych odczynników chemicznych.
  10. Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i przemyć raz buforem do barwienia w cytometrii przepływowej.
  11. Podgrzać 5 × bufor do lizy i utrwalania (lyse/fix buffer) do temperatury pokojowej i przygotować 1 × roztwór roboczy za pomocą wody destylowanej.
  12. Do każdego dołka dodać 200 µL roztworu roboczego (1 × bufor do lizy i utrwalania) i inkubować komórki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 min.
  13. Przemyć dwukrotnie 1 × buforem do permeabilizacji i przemywania (permeabilization/wash buffer) stosowanym do barwienia fosfo-epitopów. Zawiesić osad w 1 × buforze do permeabilizacji i przemywania do fosfo-epitopów i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 min.
  14. Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i odlać nadosady.
  15. W celu barwienia wewnątrzkomórkowego inkubować komórki z 50 µL koktajlem przeciwciał zawierającym anty-p-S6 przez 60 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
  16. Przemyć komórki trzykrotnie 1 × buforem do permeabilizacji i przemywania do fosfo-epitopów.
  17. W celu barwienia przeciwciałem wtórnym inkubować komórki z 50 µL koktajlem przeciwciał zawierającym wtórne przeciwciało anty-królicze przez 30 min w lodzie, w ciemności.
  18. Przemyć komórki trzykrotnie 1 × buforem do permeabilizacji i przemywania do fosfo-epitopów, a następnie raz buforem do barwienia w cytometrii przepływowej.
  19. Zawiesić osad komórkowy w 200 µL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej i nabyć dane z próbek na tym samym cytometrze przepływowym.
  20. Zastosować tę samą strategię bramkowania (gating), która została opisana w Rozdziale 4.5, i zebrać co najmniej 1 × 104 limfocytów T CD8+ na próbkę.
  21. Przeanalizować medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla każdego markera przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

6. Blokowanie i detekcja cytokin wewnątrzkomórkowych

  1. Na 5 h przed zbiorem dodać do każdej studni 100 µL świeżego medium R10 uzupełnionego o PMA (50 ng/mL), jonomycynę (1 µg/mL), inhibitory transportu białek (monensyna) (1:1000) oraz inhibitory transportu białek (na bazie brefeldyny A) (1:1000). Delikatnie wymieszać i zwrócić płytki do inkubatora w temperaturze 37 °C, aby zablokować sekrecję cytokin i umożliwić ich akumulację wewnątrzkomórkową.
  2. W wybranym punkcie czasowym zebrać komórki do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem.
  3. Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i resuspendować osad komórkowy w 200 µL buforu barwiącego do cytometrii przepływowej.
  4. Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i odprowadzić nadsącz. Przemyć dwukrotnie 200 µL buforu barwiącego do cytometrii przepływowej.
  5. W celu barwienia markerów powierzchniowych inkubować komórki z 50 µL koktajlu przeciwciał zawierającego przeciwciała anty-CD44 i anty-CD8 oraz barwnik żywotności z możliwością utrwalania przez 30 min w lodzie i w ciemności.
  6. Przemyć trzykrotnie buforem barwiącym do cytometrii przepływowej, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
  7. Przeprowadzić permeabilizację komórek poprzez dodanie 200 µL roztworu do utrwalania i permeabilizacji, a następnie inkubować przez 30 min w lodzie i w ciemności.
    OSTROŻNIE: Wszystkie etapy z użyciem roztworu do utrwalania/permeabilizacji (zawierającego paraformaldehyd) należy przeprowadzać w dygestorium, aby zapobiec wdychaniu oparów. Wszystkie odpady ciekłe zawierające utrwalacz należy zbierać do oddzielnego pojemnika oznakowanego jako odpady chemiczne niebezpieczne.
  8. Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i odprowadzić nadsącz do odpadów chemicznych niebezpiecznych.
  9. Przemyć komórki trzykrotnie 1 × buforem do permeabilizacji/płukania.
  10. W celu barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych inkubować z 50 µL koktajlu przeciwciał zawierającego przeciwciała anty-TNF-α i anty-Granzyme B przez 30 min w lodzie i w ciemności.
  11. Przemyć komórki trzykrotnie 1 × buforem do permeabilizacji/płukania, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, a następnie przeprowadzić końcowe płukanie buforem barwiącym do cytometrii przepływowej.
  12. Resuspendować osad komórkowy w 200 µL buforu barwiącego do cytometrii przepływowej i analizować próbki na tym samym cytometrze przepływowym.
  13. Zastosować tę samą strategię bramkowania (gating), co opisano w sekcji 4.5, i zebrać co najmniej 1 × 104 limfocytów T CD8+ na próbkę. Przeanalizować procent pozytywnych komórek oraz MFI dla każdego markera przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać wpływ różnej intensywności stymulacji anty-CD3 na aktywację limfocytów T, wyizolowano splenocyty mysie i oczyszczono limfocyty T CD8+ do hodowli in vitro, a następnie przeprowadzono testy aktywacji limfocytów T oraz analizę cytometryczną. Do analizy danych najpierw wyodrębniono limfocyty za pomocą kombinacji FSC-A i SSC-A, następnie wyodrębniono singlety poprzez FSC-H i FSC-W, a potem SSC-H z SSC-W. Żywe limfocyty T CD8+ wyodrębniono dalej, łącząc CD8 z utrwalanym barwnikiem żywotności w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół przedstawia systematyczną i powtarzalną metodę badania odpowiedzi limfocytów T zależnej od siły sygnału TCR. Strategia stopniowanego powlekania przeciwciałami anty-CD3 pozwala na precyzyjną kontrolę intensywności stymulacji, umożliwiając badaczom analizę ilościowej zależności między sygnałem wejściowym TCR a wynikami funkcjonalnymi w dalszych etapach. Kluczowe punkty procedury obejmują oczyszczanie naiwnych limfocytów T CD8⁺, precyzyjną kontrolę gradientu stężenia powłoki anty-CD3 oraz ścisłą normaliza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Niniejsza praca była wspierana przez National Natural Science Foundation of China (Nr T2394504, LY) oraz Chief Scientist Research Startup Fund of Lilin Ye (Nr R2045, LY).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
probówka stożkowa 15 mlLabgicCD-002-15ASterylna stożkowa probówka wirówkowa 15 ml
4% paraformaldehydBeyotimeP00994% wodny utrwalacz do konserwacji komórek przed barwieniem
szalka 60 mmLabgic12211szalka do hodowli komórek 60 mm
70 µm sitko do oddzielania komórekLabgicBS-70-CS70 µm sitko z nylonowej siatki do przygotowywania zawiesin jednokomórkowych
płytka 96-dołkowa z okrągłym dnemBeyotimeFPT016płytka 96-dołkowa z okrągłym dnem do hodowli komórek i barwienia
bufor lizujący ACKBeyotimeC3702Bufor do lizy erytrocytów oparty na chlorku amonu
przeciwciało przeciw mysiemu CD25Biolegend101910przeciwciało anty-mysie CD25 sprzężone z APC, klon 3C7, do cytometrii przepływowej
anty-mysie CD28Bio X CellBE0015-1Oczyszczone przeciwciało anty-CD28 mysie, klon 37.51, do kostymulacji limfocytów T
anty-mysi CD3Bio X CellBP0001-1Oczyszczone przeciwciało anty-CD3 przeciwko myszyε przeciwciało, klon 145-2C11, do aktywacji limfocytów T
anty-mysie CD69BD Biosciences553237Przeciwciało anty-mysie anty-CD69 sprzężone z PE do barwienia markerów aktywacji
anty-mysie CD8Invitrogen17-0081-82przeciwciało anty-CD8a mysie sprzężone z APC, klon 53-6.7, do cytometrii przepływowej
przeciwciało przeciwko mysiej GZMBBiolegend372212Przeciwciało przeciwko ludzkiej/mysiej granzymie B sprzężone z PerCP/Cyanine5.5, klon QA16A02, do cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej
przeciwciało przeciwko mysiemu ICOSBD Biosciences565886Przeciwciało anty-mysie przeciwko ICOS (CD278) sprzężone z BV421 do cytometrii przepływowej
przeciwciało przeciw mysiemu PD-1Biolegend135220przeciwciało anty-mysie przeciwko PD-1 (CD279) sprzężone z BV605, klon 29F.1A12, do cytometrii przepływowej
przeciwmysi TNF-αInvitrogen46-7321-82przeciwciało anty-mysie przeciwko TNF- sprzężone z PerCP-eFluor 710α przeciwciało, klon MP6-XT22, do cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej
anty-mysi/ludzki CD44Biolegend103030przeciwciało przeciwko CD44 mysiemu/ludzkiemu, klon IM7, sprzężone z PE/Cyanine7, do cytometrii przepływowej
biotynilowane przeciwciało anty-mysi CD11bBiolegend101204Przeciwciało anty-mysi CD11b sprzężone z biotyną do deplecji linii komórkowej
biotynilowany przeciwciało anty-mysi CD11cBiolegend117304Przeciwciało anty-CD11c przeciwko myszy sprzężone z biotyną do deplecji linii komórkowej
biotynilowane przeciwciało przeciw mysie CD16/32Biolegend156604Przeciwciało anty-mysie CD16/32 koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowych
biotynilowane przeciwciało przeciwko mysiemu CD19Biolegend115504Przeciwciało anty-CD19 mysie koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowej
biotynilowane przeciwciało anty-CD4 mysieBiolegend100508Przeciwciało anty-CD4 mysie koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowej
biotynilowane przeciwciało anty-CD44 przeciwko myszyBiolegend103004Przeciwciało anty-CD44 mysie koniugowane z biotyną do usuwania linii komórkowych
biotynylowane przeciwciało anty-mysi CD45RBiolegend103204Przeciwciało anty-mysie CD45R/B220 koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowych
biotynilowane przeciwciało przeciwko mysiemu CD49bInvitrogen13-5971-85Przeciwciało anty-CD49b mysie koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowych
biotynowany przeciwciało przeciw mysiej antygenowi F4/80Biolegend123106Przeciwciało anty-mysie F4/80 sprzężone z biotyną do deplekcji linii komórkowej
biotynilowany przeciwciało anty-mysi Ly6GBiolegend127604Przeciwciało anty-mysie przeciwko Ly6G sprzężone z biotyną do deplekcji linii komórkowej
biotynowany przeciwciało anty-mysie NK1.1Biolegend108704Przeciwciało anty-mysie NK1.1 sprzężone z biotyną do deplecji linii komórkowych
biotynilowane przeciwciało anty-mysie TER119Biolegend116204Przeciwciało anty-mysie TER-119 sprzężone z biotyną do usuwania komórek linii określonych
myszy C57BL/6Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.Brak danych6–do eksperymentów wykorzystano 8-tygodniowe samce myszy
Dwutlenek węgla (CO2) inkubatorThermo Fisher3120Wilgotny CO22 inkubator do hodowli komórek ssaków
barwnik CellTrace VioletInvitrogenC34557Fioletowy barwnik fluorescencyjny do monitorowania proliferacji komórek
DMSOSigmaD2650Dimetylosulfotlenek; rozpuszczalnik do przygotowania roztworów zapasowych odczynników
osiołkowe przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H+L), silnie adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206przeciwciało wtórne osioł przeciw króliczym IgG (H+L) sprzężone z Alexa Fluor 488
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500Dulbecco’fosforan bufor fizjologiczny do płukania i przygotowywania odczynników
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GibcoC11995500BTSuplement surowiczy do pożywki do hodowli komórek ssaków
Barwnik do oceny żywotności z możliwością utrwalaniaInvitrogen65-0865-14Barwnik żywotności do utrwalania w celu wykluczenia martwych komórek podczas cytometrii przepływowej
Roztwór do fiksacji i permeabilizacjiBD Biosciences51-2090KZOdczyn do fiksacji i permeabilizacji do barwienia wewnątrzkomórkowego
Płytka 96-dołkowa z płaskim dnemLabgic11510płytka 96-dołkowa z płaskim dnem do hodowli komórek i testów stymulacji
Cytometr przepływowyBD Bioscienceslaser LSRFortessa-3Trójlazerowy cytometr przepływowy do wielobarwnej akwizycji fluorescencji
Korek aparatu GolgiegoBD Biosciences51-2301KZInhibitor transportu białek oparty na brefaldynie A do wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZInhibitor transportu białek oparty na monensynie do wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin
Sól wapniowa ionomycynySigmaI3909-1MLJonofor wapnia stosowany z PMA do stymulacji komórek
Bufor do permeabilizacji i płukaniaBD Biosciences51-20911KZBufor do permeabilizacji i przemywania do barwienia wewnątrzkomórkowego
Bufor do lizy i fiksacji PhosflowBD Biosciences5580495× bufor do jednoczesnej lizy erytrocytów i fiksacji leukocytów
Bufor do przepuszczania i płukania Phosflow Perm/Wash Buffer IBD Biosciences557885Bufor permeabilizujący na bazie metanolu do barwienia wewnątrzkomórkowych fosfoprotein
Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko fosforylowanemu białku rybosomalnemu S6 (Ser235/236) (D57.2.2E)Sygnalizacja komórkowa4858SKrólicze przeciwciało monoklonalne przeciwko fosforylowanemu białku rybosomalnemu S6 (Ser235/236), klon D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGPhorbol 12-mirystynian 13-octan; aktywator stosowany do stymulacji komórek ex vivo
Rekombinowana interleukina-2 mysiaGibco200-02-50UGRekombinowana mysia interleukina-2 do hodowli i ekspansji limfocytów T
RPMI 1640Life-LabAC01L064Pożywka Roswell Park Memorial Institute 1640 do hodowli komórek ssaków
Magnetyczne kulki streptawidynoweBOBER22307Magnetyczne kulki pokryte streptawidyną do usuwania komórek z wykorzystaniem przeciwciał biotynylowanych
Bufor barwiący do cytometrii przepływowejProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Bufor do barwienia w cytometrii przepływowej; nie podano dostawcy ani składu preparatu
folia laboratoryjna Parafilm MAmcorPM996Elastyczna samouszczelniająca folia laboratoryjna do uszczelniania płytek, probówek i naczyń hodowlanych
Bufor do lizy i utrwalaniaBD Biosciences5580495× bufor do jednoczesnej lizy erytrocytów i fiksacji leukocytów
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1Oprogramowanie, wersja 10.8.1, do analizy danych z cytometrii przepływowej

Bibliografia

  1. De Boer RJ, Yates AJ. Modeling T cell fate. Annu Rev Immunol. 2023;41:513–32.
  2. Chapman NM, Boothby MR, Chi H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):55–70.
  3. Liu D, et al. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction: T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol. 2024;227:116441.
  4. Mariuzza RA, Agnihotri P, Orban J. The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: an enduring enigma. J Biol Chem. 2020;295(4):914–25.
  5. Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009;27:591–619.
  6. Brownlie RJ, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):257–69.
  7. Au-Yeung BB, et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 2014;15(7):687–94.
  8. Daniels MA, et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature. 2006;444(7120):724–9.
  9. Snook JP, Kim C, Williams MA. TCR signal strength controls the differentiation of CD4+ effector and memory T cells. Sci Immunol. 2018;3(25):eaas9103.
  10. Flaherty S, Reynolds JM. Mouse naïve CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets. J Vis Exp. 2015;(98):e52739.
  11. Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003;275(1–2):251–5.
  12. Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol. 2002;2(4):251–62.
  13. Gottschalk RA, et al. Distinct NF-κB and MAPK activation thresholds uncouple steady-state microbe sensing from anti-pathogen inflammatory responses. Cell Syst. 2016;2(6):378–90.
  14. Gjergjova F, et al. A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex vivo assays for primary murine T cell activation. J Immunol Methods. 2026;548:114055.
  15. Rosenlehner T, et al. Reciprocal regulation of mTORC1 signaling and ribosomal biosynthesis determines cell cycle progression in activated T cells. Sci Signal. 2024;17(859):eadi8753.
  16. Salmond RJ, Emery J, Okkenhaug K, Zamoyska R. MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase, and mammalian target of rapamycin pathways converge at the level of ribosomal protein S6 phosphorylation to control metabolic signaling in CD8 T cells. J Immunol. 2009;183(11):7388–97.
  17. Motamedi M, Xu L, Elahi S. Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: the kinetics of expression of T cell activation markers. J Immunol Methods. 2016;437:43–52.
  18. Kalia V, et al. Prolonged interleukin-2Ralpha expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 2010;32(1):91–103.
  19. Caruso A, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997;27(1):71–6.
  20. Sutermaster BA, Darling EM. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 2019;9(1):227.
  21. Llufrio EM, Wang L, Naser FJ, Patti GJ. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox Biol. 2018;16:381–7.
  22. Quah BJ, Parish CR. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 2012;379(1–2):1–14.
  23. Lemieszek MB, Findlay SD, Siegers GM. CellTrace Violet flow cytometric assay to assess cell proliferation. Methods Mol Biol. 2022;2508:101–14.
  24. Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4+ and CD8+ T cell responses. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):448–55.
  25. Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247–58.
  26. Carbone F, et al. Cellular and molecular signaling towards T cell immunological self-tolerance. J Biol Chem. 2024;300(4):107134.
  27. Daniels MA, Teixeiro E. TCR signaling in T cell memory. Front Immunol. 2015;6:617.
  28. Knudson KM, et al. Cutting edge: the signals for the generation of T cell memory are qualitatively different depending on TCR ligand strength. J Immunol. 2013;191(12):5797–801.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

limfocyty T CD8+stymulacja in vitrostymulacja anty-CD3kostymulacja anty-CD28cytometria przepływowaizolacja naiwnych limfocytów Taktywność mTORC1różnicowanie limfocytów T

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.