Niniejszy protokół opisuje systematyczną metodę aktywacji naiwnych pierwotnych limfocytów T CD8+ myszy z wykorzystaniem stopniowanej stymulacji TCR, co umożliwia kompleksową analizę proliferacji, aktywacji i produkcji cytokin przez limfocyty T CD8+ przy różnych intensywnościach sygnału TCR.
Artykuł metodologiczny
Siła i czas trwania sygnału TCR w aktywacji i różnicowaniu pierwotnych komórek T CD8+ myszy: zestandaryzowane podejście in vitro
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Intensywność i czas trwania sygnału receptora limfocytów T (TCR) są kluczowymi czynnikami determinującymi aktywację, proliferację i różnicowanie funkcjonalne limfocytów T CD8⁺. Jednak ustandaryzowane modele in vitro, które systematycznie porównują, w jaki sposób zróżnicowane sygnały TCR kształtują losy limfocytów T, są wciąż ograniczone. Niniejsze badanie przedstawia powtarzalną metodę aktywacji pierwotnych limfocytów T myszy in vitro z wykorzystaniem unieruchomionego na płytce przeciwciała anty-CD3 oraz rozpuszczalnego przeciwciała anty-CD28, z dodatkiem interleukiny-2 (IL-2), oraz analizuje, jak modulowanie stężenia anty-CD3 (siła sygnału) i czasu stymulacji (czas trwania sygnału) wpływa na wyniki aktywacji limfocytów T. Szczegółowo opisujemy protokół izolacji naiwnych limfocytów T z myszy C57BL/6, a następnie ich stymulacji w zakresie stężeń anty-CD3 (0,1–10 µg/mL) i czasów trwania (6–48 h). Przeprowadziliśmy analizę cytometryczną w celu oceny wczesnego sygnalizowania indukowanego przez TCR poprzez pomiar wewnątrzkomórkowej fosforylacji białka rybosomalnego S6 (p-S6) jako wskaźnika aktywności kompleksu 1 kinazy mTOR (mTORC1), a następnie oceniliśmy zdarzenia następcze, w tym powierzchniowe markery aktywacji (CD69, CD25, ICOS, PD-1), proliferację komórkową poprzez rozcieńczenie fioletowego barwnika do śledzenia proliferacji (CTV) oraz ekspresję cząsteczek efektorowych (Granzym B, TNF-α) jako wskaźniki różnicowania funkcjonalnego. Metoda ta zapewnia przejrzysty, etapowy przewodnik wizualny do przeprowadzania powtarzalnych stymulacji limfocytów T, umożliwiając badaczom analizę tego, jak konkretne parametry sygnału TCR kierują decyzjami o losach limfocytów T. Podejście to nie tylko wspiera badania mechanistyczne nad aktywacją i różnicowaniem limfocytów T, ale także oferuje platformę do optymalizacji kondycjonowania limfocytów T dla immunoterapii adoptywnej i testów primingu in vitro. Dzięki integracji demonstracji wideo z szczegółowym opisem protokołu, opracowanie to zwiększy przejrzystość metodologiczną i powtarzalność w badaniach nad immunologią limfocytów T.
Wprowadzenie
Limfocyty T są niezbędne dla ochronnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko patogenom i nowotworom. Naiwne limfocyty T są aktywnie utrzymywane w stanie spoczynku, aby zapewnić ich długoterminowe przetrwanie i persistencję1. Po stymulacji antygenem limfocyty T opuszczają stan spoczynku, przechodzą ekspansję klonalną i różnicowanie efektorowe2. Sygnały receptora limfocytów T (TCR) stanowią kluczowy proces inicjowania i regulowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych3. Po specyficznym rozpoznaniu cząsteczek kompleksu peptyd-główny układ zgodności tkankowej (pMHC) prezentowanych na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC), uruchamiana jest kaskada zdarzeń sygnalizacyjnych, co napędza ekspansję klonalną i różnicowanie funkcjonalne limfocytów T4,5,6.
Intensywność stymulacji TCR, determinowana przez kluczowe czynniki, takie jak powinowactwo, awidność i stężenie antygenu, odgrywa krytyczną rolę w regulowaniu stopnia aktywacji limfocytów T, nabywania funkcji efektorowych oraz trajektorii różnicowania w kierunku odrębnych podzbiorów efektorowych lub pamięciowych limfocytów T7,8,9. Obecne modele in vitro służące do badania TCR-zależnej aktywacji limfocytów T opierają się głównie na przeciwciałach anty-CD3 i anty-CD28 związanych z płytką lub sprzężonych z koralikami, co zapewnia jednoczesne dostarczenie sygnałów ligacji TCR oraz sygnałów kostymulujących10,11. Choć systemy te są szeroko stosowane, zazwyczaj wykorzystują one tylko jedno, często nasycające stężenie przeciwciała anty-CD3, co pozwala jedynie na binarne porównanie aktywacji limfocytów T w schemacie „wszystko albo nic”, zamiast uchwycić dynamiczny zakres siły sygnału TCR możliwy do osiągnięcia przy użyciu miareczkowanego gradientu stymulacji12,13.
Opisany tutaj protokół zapewnia zestandaryzowany i powtarzalny system in vitro do systematycznej oceny wpływu stopniowanej siły sygnału TCR na aktywację, proliferację i fenotypy funkcjonalne pierwotnych mysich limfocytów T CD8+, przy użyciu miareczkowanych gradientów przeciwciał anty-CD3 (0,1–10 µg/mL) oraz stałego stężenia przeciwciał anty-CD28 (1 µg/mL). Podejście to opiera się na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, która pozwala na analizę zarówno sygnalizacji w górę kaskady — poprzez wewnątrzkomórkowe fosforylowane białko rybosomalne S6 (p-S6) jako wskaźnik aktywności kompleksu 1 kinazy mTOR (mTORC1) — jak i końcowych efektów komórkowych, w tym proliferacji śledzonej poprzez rozcieńczenie CTV, powierzchniowych markerów aktywacji (CD69, CD25, indukowalnego kostymulatora limfocytów T [ICOS], białka śmierci programowanej 1 [PD-1]) oraz ekspresji cząsteczek efektorowych (granzyme B, czynnik martwicy nowotworów alfa [TNF-α]), w przedziale czasowym od 6 do 48 h.
Nasz protokół wykorzystuje gradient stężeń unieruchomionych na płytce przeciwciał anty-CD3 w celu precyzyjnej modulacji intensywności stymulacji, co pozwala na naśladowanie zróżnicowanej awidności wiązania TCR obserwowanej w warunkach fizjologicznych. Metoda ta charakteryzuje się wysoką wydajnością sieciowania TCR oraz silną aktywacją pierwotnych spoczynkowych limfocytów T. Ustandaryzowana procedura pokrywania zapewnia jednorodne rozmieszczenie przeciwciał na powierzchni płytki, co prowadzi do spójnej stymulacji komórek w obrębie tej samej partii oraz doskonałej powtarzalności eksperymentalnej. Taki format stanowi kosztowo efektywne i proste operacyjnie podejście do aktywacji limfocytów T.
Należy jednak uznać pewne ograniczenia tego podejścia. Stymulacja pośredniczona przez przeciwciała anty-CD3/CD28 znacząco różni się od fizjologicznego kontekstu in vivo. Choć metody eksperymentalne wykorzystujące wyłącznie agonistyczne przeciwciała anty-CD3 i anty-CD28 do oceny aktywacji limfocytów T mogą dostarczać skutecznych odczytów tej aktywacji, nie odtwarzają one w pełni oddziaływań między komórkami prezentującymi antygen a limfocytami T, a także kostymulacyjnego mikrośrodowiska występującego w warunkach fizjologicznych14.
Pomimo tych ograniczeń, niniejszy protokół oferuje systematyczną i powtarzalną platformę, która stanowi wartościowe i dostępne narzędzie do badania odpowiedzi limfocytów T zależnych od siły sygnału TCR i może uzupełniać bardziej złożone modele swoiste względem antygenu.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.
1. Przygotowanie odczynników i płytek
- Przygotować przeciwciała anty-CD3 do unieruchomienia na płytce w sterylnym PBS w stężeniach 0,1, 0,5, 1, 5 i 10 µg/mL.
- Do studzienek płytek 96-dołkowych o płaskim dnie dodać po 50 µL roztworu powlekającego anty-CD3 na studzienkę.
- Uszczelnić płytki folią uszczelniającą i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Odssać roztwór powlekający i dwukrotnie przemyć każdą studzienkę 200 µL sterylnego PBS przed dodaniem komórek.
2. Izolacja naiwnych limfocytów T CD8+ ze śledziony myszy
- Wybrać samce myszy C57BL/6 w wieku 6–8 tygodni (zakupione od Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) i poddać eutanazji poprzez inhalację CO2 , a następnie zwichnięcie stawów szyjnych. Myszy powinny być utrzymywane w warunkach wolnych od specyficznych patogenów, w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności, z wolnym dostępem do pożywienia i wody. W każdym niezależnym eksperymencie należy wykorzystać minimum 3 myszy.
- Ostrożnie naciąć otrzewną nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić śledzionę, chwycić i pobrać śledzionę za pomocą pęsety, a następnie umieścić ją w naczyniu zbierającym zawierającym schłodzone podłoże RPMI 1640 uzupełnione o 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (R2). Naczynie należy przechowywać w lodzie do czasu dysocjacji.
UWAGA: Wszystkie truchła zwierząt i odpady z hodowli komórkowych należy zbierać do wyznaczonych worków na odpady biologiczne i autoklawować w temperaturze 121 °C przez 20 min przed utylizacją. - Wyjąć śledzionę z naczynia zbierającego i przenieść ją do szalki 60 mm zawierającej 3 mL 1× buforu lizującego chlorek amonu-potasu (ACK).
- Przygotować zawiesinę jednokomórkową, delikatnie rozcierając śledzionę przez sitko komórkowe 70 µm za pomocą tłoka strzykawki 3 mL.
- Inkubować zawiesinę przez 1 min w temperaturze pokojowej (RT), a następnie dodać 3 mL schłodzonego podłoża R2, aby zneutralizować bufor lizujący chlorek amonu-potasu (ACK).
- Przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej 15 mL i odwirować przy 500 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
- Po wirowaniu odessać nadsącz i zawiesić osad w 10 mL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej (PBS z 2% FBS).
- Przefiltrować zawiesinę przez sitko komórkowe 70 µm do nowej probówki stożkowej 15 mL, a następnie ponownie odwirować przy 500 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Azotek sodu powinien zostać pominięty w buforze do barwienia w cytometrii przepływowej, aby zachować żywotność komórek do testów funkcjonalnych. Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i analizować niezwłocznie. - Odessać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w 200 µL koktajlu przeciwciał biotynylowanych na każdą śledzionę myszy (zawierającego przeciwciała anty-CD16/32 (blokada Fc), anty-TER-119, anty-CD19, anty-CD4, anty-B220, anty-NK1.1, anty-Ly-6G, anty-CD11b, anty-CD11c, anty-CD49b, anty-CD44 i anty-F4/80).
- Inkubować w lodzie przez 25 min, delikatnie odwracając probówkę co 5 min, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
- Przemyć komórki dużą objętością buforu do barwienia w cytometrii przepływowej, odwirować przy 500 × g przez 5 min i odrzucić nadsącz.
- Zawiesić osad w tej samej objętości buforu do barwienia w cytometrii przepływowej, która była użyta do koktajlu przeciwciał biotynylowanych, dodać kuleczki magnetyczne powlekane streptawidyną w połowie tej objętości i inkubować w lodzie przez 15 min, delikatnie odwracając probówkę co 5 min, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
- Krótko odwirować probówkę, umieścić ją na statywie magnetycznym na 2–3 min i ostrożnie przenieść nadsącz (wzbogacone naiwne limfocyty T CD8+) do nowej probówki stożkowej 15 mL.
- Przemyć zebrane komórki raz buforem do barwienia w cytometrii przepływowej, a następnie ponownie odwirować przy 500 × g przez 5 min.
- Odrzucić nadsącz i zawiesić osad w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym o 10% FBS (R10) do dalszych zastosowań.
3. Znakowanie barwnikiem CTV do śledzenia proliferacji
- Przygotuj 2 × świeży roztwór roboczy CTV (10 µM) bezpośrednio przed użyciem. Dokładnie wymieszaj roztwór stokowy CTV 5 mM (w dimetylosulfotlenku [DMSO]) za pomocą wortexa, a następnie rozcieńcz go sterylnym PBS do uzyskania stężenia końcowego 10 µM.
UWAGA: Z roztworem stokowym CTV (przygotowanym w DMSO) należy obchodzić się w dygestorium, używając rękawic nitrylowych, ponieważ DMSO ułatwia wchłanianie toksycznych związków przez skórę. Unikać wdychania i kontaktu ze skórą. - Resuspenduj połowę wyizolowanych naiwnych limfocytów T CD8+ w schłodzonym PBS do gęstości 8 × 107 komórek/mL.
- Szybko dodaj równą objętość 2 × roztworu roboczego CTV (10 µM) do zawiesiny komórkowej i dobrze wymieszaj pipetując, aby uzyskać końcowe stężenie CTV wynoszące 5 µM.
- Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności przez 20 min, delikatnie odwracając probówki co 5 min w celu zapewnienia dokładnego wymieszania.
- Dodaj do komórek 5 objętości pożywki hodowlanej (zawierającej co najmniej 10% FBS) i inkubuj przez 5 min na lodzie, aby usunąć wolny barwnik.
- Wiruj komórki z prędkością 500 × g przez 5 min, a osad resuspenduj w świeżo podgrzanej pełnej pożywce R10 uzupełnionej o przeciwciało anty-CD28 (stężenie końcowe: 1 µg/mL) oraz IL-2 (stężenie końcowe: 10 ng/mL).
- Do każdego dołka wcześniej powlekonych płytek 96-dołkowych dodaj 250 µL zawiesiny komórkowej (zawierającej 6 × 105 komórek).
- Hoduj komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ przez maksymalnie 48 h.
4. Wykrywanie CTV metodą cytometrii przepływowej
- Zbierz komórki do płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie w punktach czasowych 6, 36 i 48 h. Wirować z prędkością 500 × g przez 5 min i przemyć dwukrotnie buforem do barwienia w cytometrii przepływowej.
- W celu barwienia powierzchniowego inkubować komórki z 50 µL koktajlu przeciwciał zawierającego przeciwciała anty-CD8, barwnik do oceny żywotności (fixable viability dye) oraz anty-CD44 przez 30 min w lodzie w ciemności.
UWAGA: Wszystkie nadsączniki zawierające przeciwciała sprzężone z fluoroforami należy zbierać do wyznaczonych pojemników na odpady uzupełnionych o 0,5% podchlorynu sodu w celu dekontaminacji, a następnie utylizować zgodnie z instytucjonalnymi protokołami dotyczącymi odpadów biologicznie niebezpiecznych. - Przemyć komórki dwukrotnie buforem do barwienia w cytometrii przepływowej i resuspender w 200 µL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej w celu akwizycji w cytometrze przepływowym.
- Przeprowadzić akwizycję próbek na cytometrze przepływowym wyposażonym w trzy lasery. Przygotować probówki kontrolne jednobarwne z użyciem zabarwionych komórek w celu ustawienia parametrów kompensacji.
- Zastosować następującą strategię bramkowania: wykluczyć debris za pomocą bramkowania rozproszenia światła przedniego (FSC) względem bocznego (SSC), wyeliminować dublety poprzez bramkowanie singletów oraz wyselekcjonować do analizy żywe (ujemne względem barwnika do oceny żywotności) limfocyty T CD8+.
- Zebrać co najmniej 1 × 104 zdarzeń dla bramkowanych limfocytów T CD8+ na próbkę. Przeanalizować dane przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej i obliczyć proporcję komórek, które przeszły jedną lub więcej podziałów, korzystając z modułu analizy proliferacji.
5. Barwienie powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe w celu analizy aktywacji i sygnalizacji
- Ponownie zawiesić drugą połowę naiwnych limfocytów T CD8+ w medium R10 uzupełnionym o przeciwciało anty-CD28 w stężeniu 1 µg/mL oraz IL-2 w stężeniu 10 ng/mL, przy zagęszczeniu 2,4 × 106 komórek/mL.
- Do każdego dołka wcześniej powleczonych płytek 96-dołkowych dodać 250 µL zawiesiny komórkowej (6 × 105 komórek).
- Kulturować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ przez maksymalnie 48 h.
- W wyznaczonych punktach czasowych (6, 10, 12, 24 i 36 h) zebrać komórki do 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.
UWAGA: Punkt 6 h pozwala na uchwycenie wczesnego sygnałowania TCR (fosfo-S6) oraz CD69; ten ostatni jest dodatkowo oceniany w godzinach 12, 24 i 36, aby uchwycić jego pełną kinetykę. Poziomy CD25, PD-1 i ICOS monitoruje się w godzinach 10, 12, 24 i 36; punkt czasowy 48 h jest zarezerwowany dla proliferacji (Rozdział 4) i detekcji cytokin (Rozdział 6). - Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i zawiesić osad komórkowy w 200 µL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej.
- Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i odessać nadosad. Przemyć komórki dwukrotnie 200 µL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej.
- W celu barwienia powierzchniowego inkubować komórki z 50 µL koktajlem przeciwciał zawierającym anty-CD69, anty-CD25, anty-CD8, anty-PD-1, anty-ICOS oraz stabilny barwnik żywotności przez 30 min w lodzie, w ciemności.
- Przemyć komórki trzykrotnie buforem do barwienia w cytometrii przepływowej, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
- Zawiesić osad komórkowy w 200 µL 1% paraformaldehydu i utrwalić komórki w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności przez 15 min.
OSTROŻNIE: Wszystkie etapy z użyciem paraformaldehydu należy przeprowadzać w dygestorium, aby zapobiec wdychaniu oparów. Wszystkie odpady ciekłe zawierające utrwalacz należy zbierać do oddzielnego pojemnika przeznaczonego do utylizacji niebezpiecznych odczynników chemicznych. - Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i przemyć raz buforem do barwienia w cytometrii przepływowej.
- Podgrzać 5 × bufor do lizy i utrwalania (lyse/fix buffer) do temperatury pokojowej i przygotować 1 × roztwór roboczy za pomocą wody destylowanej.
- Do każdego dołka dodać 200 µL roztworu roboczego (1 × bufor do lizy i utrwalania) i inkubować komórki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 min.
- Przemyć dwukrotnie 1 × buforem do permeabilizacji i przemywania (permeabilization/wash buffer) stosowanym do barwienia fosfo-epitopów. Zawiesić osad w 1 × buforze do permeabilizacji i przemywania do fosfo-epitopów i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 min.
- Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i odlać nadosady.
- W celu barwienia wewnątrzkomórkowego inkubować komórki z 50 µL koktajlem przeciwciał zawierającym anty-p-S6 przez 60 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Przemyć komórki trzykrotnie 1 × buforem do permeabilizacji i przemywania do fosfo-epitopów.
- W celu barwienia przeciwciałem wtórnym inkubować komórki z 50 µL koktajlem przeciwciał zawierającym wtórne przeciwciało anty-królicze przez 30 min w lodzie, w ciemności.
- Przemyć komórki trzykrotnie 1 × buforem do permeabilizacji i przemywania do fosfo-epitopów, a następnie raz buforem do barwienia w cytometrii przepływowej.
- Zawiesić osad komórkowy w 200 µL buforu do barwienia w cytometrii przepływowej i nabyć dane z próbek na tym samym cytometrze przepływowym.
- Zastosować tę samą strategię bramkowania (gating), która została opisana w Rozdziale 4.5, i zebrać co najmniej 1 × 104 limfocytów T CD8+ na próbkę.
- Przeanalizować medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla każdego markera przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
6. Blokowanie i detekcja cytokin wewnątrzkomórkowych
- Na 5 h przed zbiorem dodać do każdej studni 100 µL świeżego medium R10 uzupełnionego o PMA (50 ng/mL), jonomycynę (1 µg/mL), inhibitory transportu białek (monensyna) (1:1000) oraz inhibitory transportu białek (na bazie brefeldyny A) (1:1000). Delikatnie wymieszać i zwrócić płytki do inkubatora w temperaturze 37 °C, aby zablokować sekrecję cytokin i umożliwić ich akumulację wewnątrzkomórkową.
- W wybranym punkcie czasowym zebrać komórki do płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem.
- Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i resuspendować osad komórkowy w 200 µL buforu barwiącego do cytometrii przepływowej.
- Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i odprowadzić nadsącz. Przemyć dwukrotnie 200 µL buforu barwiącego do cytometrii przepływowej.
- W celu barwienia markerów powierzchniowych inkubować komórki z 50 µL koktajlu przeciwciał zawierającego przeciwciała anty-CD44 i anty-CD8 oraz barwnik żywotności z możliwością utrwalania przez 30 min w lodzie i w ciemności.
- Przemyć trzykrotnie buforem barwiącym do cytometrii przepływowej, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.
- Przeprowadzić permeabilizację komórek poprzez dodanie 200 µL roztworu do utrwalania i permeabilizacji, a następnie inkubować przez 30 min w lodzie i w ciemności.
OSTROŻNIE: Wszystkie etapy z użyciem roztworu do utrwalania/permeabilizacji (zawierającego paraformaldehyd) należy przeprowadzać w dygestorium, aby zapobiec wdychaniu oparów. Wszystkie odpady ciekłe zawierające utrwalacz należy zbierać do oddzielnego pojemnika oznakowanego jako odpady chemiczne niebezpieczne. - Wirować z prędkością 500 × g przez 1 min i odprowadzić nadsącz do odpadów chemicznych niebezpiecznych.
- Przemyć komórki trzykrotnie 1 × buforem do permeabilizacji/płukania.
- W celu barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych inkubować z 50 µL koktajlu przeciwciał zawierającego przeciwciała anty-TNF-α i anty-Granzyme B przez 30 min w lodzie i w ciemności.
- Przemyć komórki trzykrotnie 1 × buforem do permeabilizacji/płukania, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, a następnie przeprowadzić końcowe płukanie buforem barwiącym do cytometrii przepływowej.
- Resuspendować osad komórkowy w 200 µL buforu barwiącego do cytometrii przepływowej i analizować próbki na tym samym cytometrze przepływowym.
- Zastosować tę samą strategię bramkowania (gating), co opisano w sekcji 4.5, i zebrać co najmniej 1 × 104 limfocytów T CD8+ na próbkę. Przeanalizować procent pozytywnych komórek oraz MFI dla każdego markera przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
Wyniki
Aby zbadać wpływ różnej intensywności stymulacji anty-CD3 na aktywację limfocytów T, wyizolowano splenocyty mysie i oczyszczono limfocyty T CD8+ do hodowli in vitro, a następnie przeprowadzono testy aktywacji limfocytów T oraz analizę cytometryczną. Do analizy danych najpierw wyodrębniono limfocyty za pomocą kombinacji FSC-A i SSC-A, następnie wyodrębniono singlety poprzez FSC-H i FSC-W, a potem SSC-H z SSC-W. Żywe limfocyty T CD8+ wyodrębniono dalej, łącząc CD8 z utrwalanym barwnikiem żywotności w celu przeprowadzenia dalszych analiz (Rysunek 1A).
Aby potwierdzić, że system stymulacji przeciwciałem unieruchomionym na płytce skutecznie aktywuje limfocyty T in vitro, zbadaliśmy fosforylację białka rybosomalnego S6 (p-S6), która jest uznanym wskaźnikiem aktywności mTORC1 oraz punktem zbieżności dla szlaków PI3K-mTOR i MEK-ERK MAPK poniżej sygnałów TCR15,16. Zgodnie z tymi ustaleniami zaobserwowaliśmy zależny od dawki wzrost poziomów p-S6 6 h po stymulacji przy rosnących stężeniach przeciwciał anty-CD3 (0,1–10 µg/mL) (Rysunek 1B), co potwierdza, że system anty-CD3 unieruchomiony na płytce aktywuje oś TCR-mTORC1-S6 w sposób zależny od siły sygnału. To wczesne zdarzenie fosforylacji jest zgodne z uruchomieniem zależnych od mTORC1 szlaków metabolicznych, które wspierają późniejszą proliferację limfocytów T oraz różnicowanie efektorowe.
Proliferację komórek oceniono za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem rozcieńczania CTV po stymulacji TCR stopniowanymi stężeniami przeciwciał anty-CD3 (0,1–10 µg/mL) w trzech punktach czasowych po stymulacji: 6, 36 i 48 h. W wczesnym punkcie czasowym sygnalizacji (6 h) we wszystkich warunkach stymulacji zaobserwowano jedynie minimalne rozcieńczenie proliferacyjne. Do 36 h w grupie stymulowanej niską dawką (0,1 µg/mL) nadal nie udało się wywołać istotnej ekspansji klonalnej, podczas gdy w grupach stymulowanych dawkami średnimi i wysokimi (5 i 10 µg/mL) wystąpiły wyraźne piki rozcieńczenia CTV, co wskazywało na rozpoczęcie progresji cyklu komórkowego. W 48 h różnice w fenotypach proliferacyjnych w zależności od stężenia stymulacji były najbardziej wyraźne. Słaba stymulacja TCR (0,1 µg/mL) doprowadziła do uzyskania jedynie 1,25% komórek proliferujących i pojedynczego, nierozcieńczonego piku CTV, co wskazywało na suboptymalną aktywację. Stymulacja średnia (1–5 µg/mL) wywoła trzy wyraźne piki podziałów, przy czym frakcje proliferujące wzrosły od 70,8% do 84,0%. Silna stymulacja (10 µg/mL) osiągnęła najwyższą frakcję proliferującą (89,5%), wykazując maksymalną liczbę generacji podziałów i wskazując na nasycenie detekcji proliferacji (Rycina 2).
Następnie zbadano ekspresję wczesnych markerów aktywacji CD69 i CD25. Warto zauważyć, że niniejsze badanie wykazało szybką i zależną od dawki nadrzędną regulację ekspresji CD69, w oparciu o medianę intensywności fluorescencji (MFI). Przy umiarkowanej i silnej stymulacji (5 i 10 µg/mL) poziom CD69 gwałtownie wzrósł po 24 h, po czym nastąpił stopniowy spadek między 24 a 36 h. Jednak przy słabej stymulacji (0,1, 0,5 i 1 µg/mL) poziom CD69 progresywnie wzrastał przez cały okres stymulacji. Powyższy profil kinetyki ekspresji CD69 jest zgodny z jego rolą jako wczesnego markera aktywacji limfocytów T (Rycina 3A)17. Co ciekawe, zaobserwowano, że ekspresja CD25 wykazywała progresywny wzrost w sposób zależny od dawki i czasu (Rycina 3B). Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, nadrzędna regulacja CD25 przebiegała wolniej niż w przypadku CD69, szczególnie przy optymalnej stymulacji18,19.
Aby dalej zbadać wpływ siły stymulacji TCR na ekspresję receptorów hamujących i cząsteczek kostymulujących w limfocytach T CD8+, przeanalizowano poziomy ekspresji PD-1 oraz ICOS. Indukowalna ekspresja PD-1 zależy od wysokiej intensywności stymulacji TCR. W grupie o niskiej intensywności stymulacji (0,5–1 µg/mL) PD-1 był wyrażany na niskim poziomie przez cały okres stymulacji. W przeciwieństwie do tego, w grupie o średniej i wysokiej intensywności stymulacji (5–10 µg/mL) ekspresja PD-1 stopniowo wzrastała od 10 h i osiągnęła szczyt w 36 h (Rysunek 4A). Ekspresja ICOS również wzrastała wraz ze wzrostem siły stymulacji i osiągnęła maksymalny poziom przy 5–10 µg/mL w 36 h (Rysunek 4B). Wyniki te sugerują, że wysokointensywna stymulacja TCR może znacząco zwiększyć poziomy ekspresji PD-1 i ICOS.
Na koniec zbadano wydolność funkcjonalną stymulowanych limfocytów T po ponownej stymulacji PMA i ionomycyną w 24. i 48. godzinie po stymulacji. W 24. godzinie ilościowo określono produkcję TNF-α i granzymu B; zaobserwowano, że częstotliwość występowania komórek TNF-α+, granzymu B+ oraz TNF-α+granzymu B+ stopniowo rosła w sposób zależny od dawki przeciwciała anty-CD3 (Rysunek 5A, B). Spójnie z tym, MFI dla TNF-α i granzymu B również wykazywało wzrost zależny od stężenia i osiągnęło maksimum przy intensywnej stymulacji (10 µg/mL) (Rysunek 5C), co odzwierciedla zależną od dawki wczesną różnicowanie efektorowe napędzane przez stopniowaną siłę sygnału TCR. Jednak w 48. godzinie wzorzec ten uległ wyraźnemu odwróceniu. Wyższe stężenia anty-CD3 znacząco zmniejszyły odsetek komórek TNF-α+granzymu B+ i obniżyły poziomy ekspresji cząsteczek efektorowych w przeliczeniu na jedną komórkę.
Wszystkie przedstawione dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej lub dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Tukeya; dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Żywotność komórek konsekwentnie przekraczała 90%, a dla każdej próbki zarejestrowano minimum 1 × 104 zdarzeń żywych komórek T CD8+.
Rysunek 1: Aktywacja in vitro i analiza cytometryczna przepływowa CD8+ Limfocyty T. (A) Oczyszczone CD8+ Limfocyty T z splesenocytów mysich stymulowano in vitro różnymi stężeniami przeciwciał anty-CD3 (0,1–10 µg/mL) w połączeniu ze stałym stężeniem przeciwciał anty-CD28 (1 µg/mL) przez 6 do 48 h, a następnie przeprowadzono analizę aktywacji komórkowej metodą cytometrii przepływowej. Odpady komórkowe wykluczono poprzez bramkowanie na podstawie rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC), dublety wykluczono za pomocą bramkowania singletów, a komórki negatywne dla barwnika żywotności (fixable viability dye) oraz CD8+ W końcowym etapie wyodrębniono limfocyty T (gating) do dalszych analiz.B) Fosforylacja białka rybosomalnego S6 (p-S6) w komórkach CD8+ Komórki T w 6. godzinie po stymulacji wskazanymi stężeniami przeciwciał anty-CD3 (0,1–10 µg/mL) oraz stałe przeciwciało anty-CD28 (1 µg/mL). Reprezentatywny histogram (po lewej) i podsumowanie MFI (po prawej). Wykresy cytometrii przepływowej są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Dane przedstawiają średnią ± SEM. Statystyka: jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami z testem post-hoc Tukeya. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,01; ns, nieistotne statystycznie. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2Analiza proliferacji pierwotnych komórek CD8 myszy z wykorzystaniem fioletowego barwnika do śledzenia proliferacji (CTV)+ Limfocyty T poddane gradacyjnej stymulacji TCR. CD8+ Komórki T znakowane CTV i stymulowane in vitro przeciwciałem anty-CD3 w stężeniach gradientowych od 0,1–10 µg/mL przez 6 do 48 h. Proliferację komórek oceniano na podstawie rozcieńczenia i osłabienia fluorescencji CTV w komórkach CD8+ limfocyty T za pomocą analizy cytometrycznej. Histogramy przedstawiają rozkład fluorescencji CTV dla każdej grupy stężeń, z zaznaczeniem procentowego udziału komórek, które przeszły jedną lub więcej podziałów. Wykresy z cytometrii przepływowej są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Kinetyka ekspresji wczesnych markerów aktywacji CD69 i CD25 na komórkach CD8+ Limfocyty T po stymulacji przeciwciałem anty-CD3. Naiwne limfocyty CD8++ Limfocyty T stymulowano przeciwciałem anty-CD3 unieruchomionym na płytce w wskazanych stężeniach (0,1–10 µg/mL) oraz stałe przeciwciało anty-CD28 (1 µg/mL). Poziom CD69 mierzono w 6., 12., 24. i 36. godzinie, a poziom CD25 w 10., 12., 24. i 36. godzinie, a następnie analizowano je metodą cytometrii przepływowej. Panele lewe przedstawiają reprezentatywne histogramy w określonych punktach czasowych; panele prawe prezentują dynamiczne zmiany MFI w czasie. (A) CD69. (B) CD25. Wykresy z cytometrii przepływowej są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Statystyka: dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami z testem post-hoc Tukeya. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,01; ns, nieistotne statystycznie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Kinetyka ekspresji receptora hamującego PD-1 oraz cząsteczki kostymulującej ICOS na komórkach CD8+ Limfocyty T po stymulacji przeciwciałami anty-CD3. naiwne komórki CD8+ Limfocyty T stymulowano unieruchomionym na płytce przeciwciałem anty-CD3 w wskazanych stężeniach (0,1–10 µg/mL) oraz stałe przeciwciało anty-CD28 (1 µg/mL). Komórki zebrano po 10, 12, 24 i 36 h, a następnie poddano analizie metodą cytometrii przepływowej. Panele lewe przedstawiają reprezentatywne histogramy w zaznaczonych punktach czasowych; panele prawe przedstawiają dynamiczne zmiany MFI w czasie. (A) PD-1. (B) ICOS. Wykresy cytometrii przepłyewej są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Statystyka: dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami z testem post-hoc Tukeya. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,001; ns, nieistotne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 5: Wewnątrzkomórkowa produkcja cytokin przez komórki CD8+ Aktywacja limfocytów T zależy od siły sygnału TCR. Naiwne limfocyty CD8++ Limfocyty T stymulowano rosnącymi stężeniami przeciwciał anty-CD3 (0,1–10 µg/mL) oraz stałego przeciwciała anty-CD28 (1 µg/mL). W 24. i 48. godzinie po stymulacji komórki zebrano po 5-godzinnej inkubacji z inhibitorami transportu białek (monenzyną i brefeldyną A) w obecności PMA i jonomycyny, aby zablokować wydzielanie cytokin i umożliwić ich akumulację wewnątrzkomórkową. (AWykresy konturowe przedstawiają częstość występowania komórek pozytywnych pod kątem TNF-α i granzymu B dla każdego wskazanego stężenia i punktu czasowego. Komórki niestymulowane służyły jako kontrola negatywna.B) Proporcje TNF-α+, Granzym B+oraz TNF-α+ Granzym B+ komórki. (C) MFI dla TNF-α i granzymu B. Wykrezy cytometrii przepływowej są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Statystyka: dwuczynnikowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami z testem post-hoc Tukeya. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,001; ns, nieistotne. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Dyskusja
Niniejszy protokół przedstawia systematyczną i powtarzalną metodę badania odpowiedzi limfocytów T zależnej od siły sygnału TCR. Strategia stopniowanego powlekania przeciwciałami anty-CD3 pozwala na precyzyjną kontrolę intensywności stymulacji, umożliwiając badaczom analizę ilościowej zależności między sygnałem wejściowym TCR a wynikami funkcjonalnymi w dalszych etapach. Kluczowe punkty procedury obejmują oczyszczanie naiwnych limfocytów T CD8⁺, precyzyjną kontrolę gradientu stężenia powłoki anty-CD3 oraz ścisłą normalizację liczby komórek w każdej studience. Aby zapewnić porównywalność danych między eksperymentami, zalecamy również stosowanie spójnych ustawień aparatury, macierzy kompensacyjnych i strategii bramkowania, a także używanie tych samych partii przeciwciał i barwników do oceny żywotności komórek (fixable viability dyes), jeśli jest to możliwe. Niezawodność tych krytycznych kroków bezpośrednio determinuje, czy wyniki eksperymentalne mogą dokładnie odzwierciedlać wpływ różnych intensywności stymulacji TCR na dynamikę fenotypową limfocytów T.
W niniejszym protokole zastosowano stymulację przeciwciałami unieruchomionymi na płytce, w której przeciwciała anty-CD3 są bezpośrednio naniesione na powierzchnię płytki hodowlanej w celu sieciowania kompleksu TCR-CD3. Podejście to zapewnia efektywność kosztową, jednorodne rozmieszczenie przeciwciał, minimalną zmienność między dołkami oraz doskonałą powtarzalność. Co istotne, miareczkowanie stężeń nanoszonych przeciwciał umożliwia precyzyjną, stopniową modulację intensywności stymulacji; jest to cecha odróżniająca ten system od stymulacji za pomocą kulek sprzężonych z ligandem, gdzie gęstość ligandu jest zazwyczaj stała i znajduje się na poziomie nasycenia, co ogranicza możliwość precyzyjnej modulacji sygnału14. Jednak stymulacja unieruchomiona na płytce wywołuje suprafizjologiczne i trwałe sieciowanie TCR, co zasadniczo różni się od przejściowego, zależnego od powinowactwa oddziaływania indukowanego przez kompleksy pMHC na komórkach prezentujących antygen. Chociaż stymulacja oparta na pMHC jest bardziej istotna fizjologicznie, jest ona wymagająca technicznie, wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie produkcji multimerów i wiąże się ze znacznie wyższymi kosztami. Do izolacji komórek zastosowano negatywną selekcję immunomagnetyczną, która jest prosta, szybka i ekonomiczna. Mimo że zapewnia ona niższą czystość w porównaniu z FACS, pozwala uniknąć stresu mechanicznego i znakowania fluorescencyjnego, które mogą pogorszyć stan fizjologiczny sortowanych komórek20,21.
Kluczowe problemy, które mogą wystąpić podczas realizacji protokołu, obejmują niską czystość sortowania, słabą proliferację, cytotoksyczność indukowaną przez CTV, niską żywotność po hodowli oraz niespójne barwienie. W przypadku niskiej czystości należy zapewnić odpowiednie wymieszanie komórek z koktajlem przeciwciał biotynylowanych i kuleczkami powlekanymi streptawidyną, w razie potrzeby wydłużyć czas separacji magnetycznej oraz zoptymalizować stosunek kuleczek do przeciwciał dla każdej nowej partii odczynników. Jeśli obserwowana jest minimalna proliferacja nawet przy najwyższym stężeniu anty-CD3, należy zweryfikować żywotność i czystość (zwłaszcza zanieczyszczenie komórkami CD44hi) wyizolowanych komórek naiwnych, potwierdzić procedurę powlekania anty-CD3 (szczelne zamknięcie płytek folią uszczelniającą podczas inkubacji nocnej w 4 °C oraz zapewnienie równomiernej warstwy przeciwciał) i sprawdzić stężenie IL-2, ponieważ cytokina ta jest niezbędna do wspierania ekspansji limfocytów T. W przypadku cytotoksyczności indukowanej przez CTV należy zmniejszyć stężenie barwnika, zachowując jednocześnie wyraźną rozdzielczość pików podziałów, oraz upewnić się, że etap gaszenia jest przeprowadzany ściśle w lodzie przez pełne 5 min w celu usunięcia pozostałego wolnego barwnika22,23. W przypadku niskiej żywotności po hodowli należy kontrolować gęstość komórek, zapewnić wystarczającą objętość pożywki i przestrzegać technik sterylnych. Jeśli zaobserwowano niespójne barwienie lub wysoką zmienność w cytometrii przepływowej, należy przygotowywać koktajle przeciwciał w formie mieszanin matrycowych (master mixes), chronić wszystkie zabarwione próbki przed światłem oraz używać tych samych partii przeciwciał i serii utrwalanych barwników do oceny żywotności we wszystkich powtórzeniach.
Niemniej jednak protokół ten posiada pewne ograniczenia. Jako system in vitro nie jest on w stanie odtworzyć złożonego mikrośrodowiska tkankowego, interakcji komórkowych ani środowiska cytokinowego wtórnych narządów limfatycznych. Okno hodowli jest ograniczone do 48 h, co zawęża analizę do wczesnych zdarzeń aktywacyjnych i uniemożliwia ocenę różnicowania w późnej fazie, wyczerpania lub tworzenia pamięci. Ponadto protokół w dużej mierze opiera się na odczytach z cytometrii przepływowej, które wymagają rygorystycznej standaryzacji ustawień instrumentu, macierzy kompensacji i strategii bramkowania w niezależnych eksperymentach. Co więcej, wyniki uzyskane za pomocą tego systemu opartego na przeciwciałach anty-CD3/CD28 pochodzą wyłącznie z limfocytów T CD8+ i mogą nie być bezpośrednio generalizowalne do limfocytów T CD4+, których progi aktywacji, wymagania kostymulacyjne i trajektorie różnicowania w dół są znane jako odmienne12,24,25. Dodatkowo podstawowy stan aktywacji limfocytów T może różnić się między poszczególnymi koloniami myszy ze względu na różnice w mikrobiocie komensalnej, co stanowi potencjalne źródło zmienności międzylaboratoryjnej, którą należy wziąć pod uwagę podczas interpretacji wyników w różnych badaniach.
Opisany tutaj system stopniowanej stymulacji umożliwia badaczom dostosowanie siły sygnału TCR do konkretnych celów eksperymentalnych w oparciu o odmienne wzorce odpowiedzi obserwowane w różnych analizach. Dane te wskazują, że wybór stężenia przeciwciała anty-CD3 oraz czasu zbioru powinien być podyktowany rozważanym pytaniem biologicznym. W przypadku wczesnych markerów aktywacji, wzrost ekspresji CD69 jest wykrywalny już po 6–12 h przy wszystkich stężeniach, lecz wykazuje odmienną kinetykę: wysokie stężenia (5–10 µg/mL) indukują szybki szczyt, po którym następuje spadek, natomiast niskie stężenia (0,5–1 µg/mL) powodują stopniowy, trwały wzrost. W testach proliferacji stężenia poniżej 1 µg/mL są suboptymalne i mogą służyć jako wewnętrzne kontrole negatywne, podczas gdy 5–10 µg/mL niezawodnie indukują silną ekspansję klonalną, wykrywalną poprzez rozcieńczenie CTV po 48 h. Ekspresja koreceptora hamującego PD-1 oraz cząsteczki kostymulującej ICOS wymaga intensywnej stymulacji (5–10 µg/mL) i osiąga szczyt po 36 h, co wskazuje, że badania nad tymi cząsteczkami powinny unikać wcześniejszych punktów czasowych lub niższych dawek. W przypadku odczytów funkcji efektorowych (TNF-α i Granzyme B), zależność między siłą stymulacji a produkcją cytokin jest zależna od czasu i wykazuje charakterystyczny wzorzec dwufazowy. Po 24 h produkcja cząsteczek efektorowych koreluje dodatnio ze stężeniem anty-CD3, gdzie wyższe dawki prowadzą do większej produkcji cytokin. Jednak po 48 h, mimo że bezwzględne poziomy komórek produkujących cytokiny są znacznie podwyższone we wszystkich warunkach w porównaniu do 24 h, relacja dawka-odpowiedź ulega odwróceniu: niższe stężenia stymulujące (0,5–1 µg/mL) dają relatywnie wyższą częstotliwość komórek TNF-α⁺ Granzyme B⁺ niż wysokie dawki (5–10 µg/mL). Ta inwersja sugeruje, że utrzymujące się silne sygnalizowanie TCR, mimo że sprzyja początkowej różnicowaniu efektorowemu, może nakładać relatywne ograniczenie na utrzymanie zdolności produkcyjnej cytokin na pojedynczą komórkę, co potencjalnie odzwierciedla początek wyczerpania indukowanego aktywacją lub hiporeaktywności.
Wszystkie te obserwacje empiryczne pozycjonują nasz protokół jako ramy referencyjne, które pozwalają użytkownikom na wstępny wybór warunków stymulacji w oparciu o konkretne końcowe punkty analizy, co poprawia efektywność planowania eksperymentów oraz interpretowalność danych. Poza podstawowymi badaniami mechanistycznymi, system ten może również służyć do optymalizacji protokołów ekspansji limfocytów T w immunoterapii adoptywnej, gdzie precyzyjna regulacja siły sygnału TCR może pomóc w ukierunkowaniu różnicowania w stronę korzystnych fenotypów efektorowych lub pamięciowych26,27,28.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez National Natural Science Foundation of China (Nr T2394504, LY) oraz Chief Scientist Research Startup Fund of Lilin Ye (Nr R2045, LY).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| probówka stożkowa 15 ml | Labgic | CD-002-15A | Sterylna stożkowa probówka wirówkowa 15 ml |
| 4% paraformaldehyd | Beyotime | P0099 | 4% wodny utrwalacz do konserwacji komórek przed barwieniem |
| szalka 60 mm | Labgic | 12211 | szalka do hodowli komórek 60 mm |
| 70 µm sitko do oddzielania komórek | Labgic | BS-70-CS | 70 µm sitko z nylonowej siatki do przygotowywania zawiesin jednokomórkowych |
| płytka 96-dołkowa z okrągłym dnem | Beyotime | FPT016 | płytka 96-dołkowa z okrągłym dnem do hodowli komórek i barwienia |
| bufor lizujący ACK | Beyotime | C3702 | Bufor do lizy erytrocytów oparty na chlorku amonu |
| przeciwciało przeciw mysiemu CD25 | Biolegend | 101910 | przeciwciało anty-mysie CD25 sprzężone z APC, klon 3C7, do cytometrii przepływowej |
| anty-mysie CD28 | Bio X Cell | BE0015-1 | Oczyszczone przeciwciało anty-CD28 mysie, klon 37.51, do kostymulacji limfocytów T |
| anty-mysi CD3 | Bio X Cell | BP0001-1 | Oczyszczone przeciwciało anty-CD3 przeciwko myszyε przeciwciało, klon 145-2C11, do aktywacji limfocytów T |
| anty-mysie CD69 | BD Biosciences | 553237 | Przeciwciało anty-mysie anty-CD69 sprzężone z PE do barwienia markerów aktywacji |
| anty-mysie CD8 | Invitrogen | 17-0081-82 | przeciwciało anty-CD8a mysie sprzężone z APC, klon 53-6.7, do cytometrii przepływowej |
| przeciwciało przeciwko mysiej GZMB | Biolegend | 372212 | Przeciwciało przeciwko ludzkiej/mysiej granzymie B sprzężone z PerCP/Cyanine5.5, klon QA16A02, do cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej |
| przeciwciało przeciwko mysiemu ICOS | BD Biosciences | 565886 | Przeciwciało anty-mysie przeciwko ICOS (CD278) sprzężone z BV421 do cytometrii przepływowej |
| przeciwciało przeciw mysiemu PD-1 | Biolegend | 135220 | przeciwciało anty-mysie przeciwko PD-1 (CD279) sprzężone z BV605, klon 29F.1A12, do cytometrii przepływowej |
| przeciwmysi TNF-α | Invitrogen | 46-7321-82 | przeciwciało anty-mysie przeciwko TNF- sprzężone z PerCP-eFluor 710α przeciwciało, klon MP6-XT22, do cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej |
| anty-mysi/ludzki CD44 | Biolegend | 103030 | przeciwciało przeciwko CD44 mysiemu/ludzkiemu, klon IM7, sprzężone z PE/Cyanine7, do cytometrii przepływowej |
| biotynilowane przeciwciało anty-mysi CD11b | Biolegend | 101204 | Przeciwciało anty-mysi CD11b sprzężone z biotyną do deplecji linii komórkowej |
| biotynilowany przeciwciało anty-mysi CD11c | Biolegend | 117304 | Przeciwciało anty-CD11c przeciwko myszy sprzężone z biotyną do deplecji linii komórkowej |
| biotynilowane przeciwciało przeciw mysie CD16/32 | Biolegend | 156604 | Przeciwciało anty-mysie CD16/32 koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowych |
| biotynilowane przeciwciało przeciwko mysiemu CD19 | Biolegend | 115504 | Przeciwciało anty-CD19 mysie koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowej |
| biotynilowane przeciwciało anty-CD4 mysie | Biolegend | 100508 | Przeciwciało anty-CD4 mysie koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowej |
| biotynilowane przeciwciało anty-CD44 przeciwko myszy | Biolegend | 103004 | Przeciwciało anty-CD44 mysie koniugowane z biotyną do usuwania linii komórkowych |
| biotynylowane przeciwciało anty-mysi CD45R | Biolegend | 103204 | Przeciwciało anty-mysie CD45R/B220 koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowych |
| biotynilowane przeciwciało przeciwko mysiemu CD49b | Invitrogen | 13-5971-85 | Przeciwciało anty-CD49b mysie koniugowane z biotyną do deplekcji linii komórkowych |
| biotynowany przeciwciało przeciw mysiej antygenowi F4/80 | Biolegend | 123106 | Przeciwciało anty-mysie F4/80 sprzężone z biotyną do deplekcji linii komórkowej |
| biotynilowany przeciwciało anty-mysi Ly6G | Biolegend | 127604 | Przeciwciało anty-mysie przeciwko Ly6G sprzężone z biotyną do deplekcji linii komórkowej |
| biotynowany przeciwciało anty-mysie NK1.1 | Biolegend | 108704 | Przeciwciało anty-mysie NK1.1 sprzężone z biotyną do deplecji linii komórkowych |
| biotynilowane przeciwciało anty-mysie TER119 | Biolegend | 116204 | Przeciwciało anty-mysie TER-119 sprzężone z biotyną do usuwania komórek linii określonych |
| myszy C57BL/6 | Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | Brak danych | 6–do eksperymentów wykorzystano 8-tygodniowe samce myszy |
| Dwutlenek węgla (CO2) inkubator | Thermo Fisher | 3120 | Wilgotny CO22 inkubator do hodowli komórek ssaków |
| barwnik CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | Fioletowy barwnik fluorescencyjny do monitorowania proliferacji komórek |
| DMSO | Sigma | D2650 | Dimetylosulfotlenek; rozpuszczalnik do przygotowania roztworów zapasowych odczynników |
| osiołkowe przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H+L), silnie adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor™ 488 | Invitrogen | A-21206 | przeciwciało wtórne osioł przeciw króliczym IgG (H+L) sprzężone z Alexa Fluor 488 |
| D-PBS | VivaCell Biosciences | C3590-0500 | Dulbecco’fosforan bufor fizjologiczny do płukania i przygotowywania odczynników |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Gibco | C11995500BT | Suplement surowiczy do pożywki do hodowli komórek ssaków |
| Barwnik do oceny żywotności z możliwością utrwalania | Invitrogen | 65-0865-14 | Barwnik żywotności do utrwalania w celu wykluczenia martwych komórek podczas cytometrii przepływowej |
| Roztwór do fiksacji i permeabilizacji | BD Biosciences | 51-2090KZ | Odczyn do fiksacji i permeabilizacji do barwienia wewnątrzkomórkowego |
| Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem | Labgic | 11510 | płytka 96-dołkowa z płaskim dnem do hodowli komórek i testów stymulacji |
| Cytometr przepływowy | BD Biosciences | laser LSRFortessa-3 | Trójlazerowy cytometr przepływowy do wielobarwnej akwizycji fluorescencji |
| Korek aparatu Golgiego | BD Biosciences | 51-2301KZ | Inhibitor transportu białek oparty na brefaldynie A do wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin |
| Golgi Stop | BD Biosciences | 51-2092KZ | Inhibitor transportu białek oparty na monensynie do wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin |
| Sól wapniowa ionomycyny | Sigma | I3909-1ML | Jonofor wapnia stosowany z PMA do stymulacji komórek |
| Bufor do permeabilizacji i płukania | BD Biosciences | 51-20911KZ | Bufor do permeabilizacji i przemywania do barwienia wewnątrzkomórkowego |
| Bufor do lizy i fiksacji Phosflow | BD Biosciences | 558049 | 5× bufor do jednoczesnej lizy erytrocytów i fiksacji leukocytów |
| Bufor do przepuszczania i płukania Phosflow Perm/Wash Buffer I | BD Biosciences | 557885 | Bufor permeabilizujący na bazie metanolu do barwienia wewnątrzkomórkowych fosfoprotein |
| Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko fosforylowanemu białku rybosomalnemu S6 (Ser235/236) (D57.2.2E) | Sygnalizacja komórkowa | 4858S | Królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko fosforylowanemu białku rybosomalnemu S6 (Ser235/236), klon D57.2.2E |
| PMA | Sigma | P1585-1MG | Phorbol 12-mirystynian 13-octan; aktywator stosowany do stymulacji komórek ex vivo |
| Rekombinowana interleukina-2 mysia | Gibco | 200-02-50UG | Rekombinowana mysia interleukina-2 do hodowli i ekspansji limfocytów T |
| RPMI 1640 | Life-Lab | AC01L064 | Pożywka Roswell Park Memorial Institute 1640 do hodowli komórek ssaków |
| Magnetyczne kulki streptawidynowe | BOBER | 22307 | Magnetyczne kulki pokryte streptawidyną do usuwania komórek z wykorzystaniem przeciwciał biotynylowanych |
| Bufor barwiący do cytometrii przepływowej | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. | Bufor do barwienia w cytometrii przepływowej; nie podano dostawcy ani składu preparatu |
| folia laboratoryjna Parafilm M | Amcor | PM996 | Elastyczna samouszczelniająca folia laboratoryjna do uszczelniania płytek, probówek i naczyń hodowlanych |
| Bufor do lizy i utrwalania | BD Biosciences | 558049 | 5× bufor do jednoczesnej lizy erytrocytów i fiksacji leukocytów |
| FlowJo | BD Biosciences | v10.8.1 | Oprogramowanie, wersja 10.8.1, do analizy danych z cytometrii przepływowej |
Bibliografia
- De Boer RJ, Yates AJ. Modeling T cell fate. Annu Rev Immunol. 2023;41:513–32.
- Chapman NM, Boothby MR, Chi H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):55–70.
- Liu D, et al. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction: T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol. 2024;227:116441.
- Mariuzza RA, Agnihotri P, Orban J. The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: an enduring enigma. J Biol Chem. 2020;295(4):914–25.
- Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009;27:591–619.
- Brownlie RJ, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):257–69.
- Au-Yeung BB, et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 2014;15(7):687–94.
- Daniels MA, et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature. 2006;444(7120):724–9.
- Snook JP, Kim C, Williams MA. TCR signal strength controls the differentiation of CD4+ effector and memory T cells. Sci Immunol. 2018;3(25):eaas9103.
- Flaherty S, Reynolds JM. Mouse naïve CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets. J Vis Exp. 2015;(98):e52739.
- Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003;275(1–2):251–5.
- Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol. 2002;2(4):251–62.
- Gottschalk RA, et al. Distinct NF-κB and MAPK activation thresholds uncouple steady-state microbe sensing from anti-pathogen inflammatory responses. Cell Syst. 2016;2(6):378–90.
- Gjergjova F, et al. A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex vivo assays for primary murine T cell activation. J Immunol Methods. 2026;548:114055.
- Rosenlehner T, et al. Reciprocal regulation of mTORC1 signaling and ribosomal biosynthesis determines cell cycle progression in activated T cells. Sci Signal. 2024;17(859):eadi8753.
- Salmond RJ, Emery J, Okkenhaug K, Zamoyska R. MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase, and mammalian target of rapamycin pathways converge at the level of ribosomal protein S6 phosphorylation to control metabolic signaling in CD8 T cells. J Immunol. 2009;183(11):7388–97.
- Motamedi M, Xu L, Elahi S. Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: the kinetics of expression of T cell activation markers. J Immunol Methods. 2016;437:43–52.
- Kalia V, et al. Prolonged interleukin-2Ralpha expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 2010;32(1):91–103.
- Caruso A, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997;27(1):71–6.
- Sutermaster BA, Darling EM. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 2019;9(1):227.
- Llufrio EM, Wang L, Naser FJ, Patti GJ. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox Biol. 2018;16:381–7.
- Quah BJ, Parish CR. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 2012;379(1–2):1–14.
- Lemieszek MB, Findlay SD, Siegers GM. CellTrace Violet flow cytometric assay to assess cell proliferation. Methods Mol Biol. 2022;2508:101–14.
- Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4+ and CD8+ T cell responses. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):448–55.
- Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247–58.
- Carbone F, et al. Cellular and molecular signaling towards T cell immunological self-tolerance. J Biol Chem. 2024;300(4):107134.
- Daniels MA, Teixeiro E. TCR signaling in T cell memory. Front Immunol. 2015;6:617.
- Knudson KM, et al. Cutting edge: the signals for the generation of T cell memory are qualitatively different depending on TCR ligand strength. J Immunol. 2013;191(12):5797–801.
Przedruki i uprawnienia
