Wpływ Tuina na ekspresję oreksyny-A w podwzgórzu i zachowanie senne u szczurów z pierwotnym bezsennością

Podsumowanie

Badanie to zbada, czy Tuina łagodzi bezsenność w modelu szczurzym poprzez regulację wyrażania oreksyny-A w podwzgórzu, stosując testy behawioralne, immunohistochemikę i czasowo ilościową PCR.

Streszczenie

Bezsenność jest częstym zaburzeniem snu, które prowadzi do upośledzenia czynności dziennych i zwiększonego ryzyka współistnienia chorób, znacząco wpływając na jakość życia pacjentów. Obecne leczenie, głównie terapia poznawczo-behawioralna i farmakoterapia, ograniczone są przez problemy takie jak uzależnienie od leków, tolerancja i odbicie po odstawieniu. Terapia Tuina wykazała się regulacją układu nerwowego, dokrewnego i odpornościowego, podczas gdy układ oreksyny jest kluczowym regulatorem cyklu snu i czuwania. To skłoniło do zbadania, czy Tuina łagodzi bezsenność poprzez modulacje podwzgórzowego układu oreksyny. Ten protokół opisuje metody interwencji Tuina w modelu szczurzym pierwotnej bezsenności wywołanej zmodyfikowaną metodą wielostojakową środowiska wodnego. Randomizowałyśmy 64 szczury Wistar do czterech grup: kontrolna, modelowa, Tuina i antagonista oreksyny. Przeprowadzono oceny behawioralne (test otwartego pola, test snu indukowanego pentobarytolem) oraz wykryto ekspresję Oreksyny-A w podwzgórzu za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym i immunohistochemii. Protokół ma na celu ocenę skuteczności Tuina i zbadanie jego potencjalnego mechanizmu związanego z układem oreksyny, dostarczając referencji dla zastosowania i badania mechanistycznego Tuina w zaburzeniach snu.

Wprowadzenie

Bezsenność, charakteryzująca się niezadowoleniem z czasu lub jakości snu prowadzącą do zaburzeń w ciągu dnia, jest powszechnym problemem zdrowotnym na całym świecie, obciążającym znacząco jednostki i systemy opieki zdrowotnej^1,2. W Chinach częstość występowania bezsenności jest znacząco wysoka, co dodatkowo zaostrza jej wpływ na zdrowie publiczne³. Zaburzenie to wiąże się z zaburzeniami funkcji poznawczych, zwiększonym ryzykiem chorób układu krążenia oraz wysoką współwystępowaniem z chorobami psychicznymi, takimi jak depresja i lęk^4,5. Obecne podejście kliniczne opiera się głównie na terapii poznawczo-behawioralnej i farmakoterapii, zwłaszcza na benzodiazepinach i nie-benzodiazepinowych lekach uspokajających i nasennych. Jednak ich długotrwała stosowanie jest ograniczone przez uzależnienie od leków, tolerancję, pozostałe działania w ciągu dnia i objawy odstawienia, co podkreśla potrzebę skutecznych alternatyw niefarmakologicznych⁶. W praktyce klinicznej Tuina jest szczególnie odpowiednia dla pacjentów z przewlekłą pierwotną bezsennością, którzy szukają niefarmakologicznych interwencji, zwłaszcza dla osób starszych z wysokim ryzykiem uzależnienia od leków, a także kobiet w ciąży lub karmiących piersią⁷.

Jako filar zewnętrznej terapii medycyny tradycyjnej chińskiej, Tuina wykazała unikalne zalety w leczeniu bezsenności⁸. Dowody metaanalityczne pokazują, że Tuina znacząco przewyższa leki lub akupunkturę samodzielnie w łącznej skuteczności (OR = 4,12), jakości snu i stanach lęku-depresji, z wysoką bezpieczeństwem⁹. Specyficzne protokoły Tuina oferują wyraźne zalety: tradycyjna Tuina osiąga 89,5% skuteczności w przypadku bezsenności typu flegm-ciepło, a masaż brzucha zmniejsza wskaźniki nawrotów do 14,7% (wobec 38,2% przy konwencjonalnej Tuinie)¹⁰. Trójdzielna metoda Tuina zwiększa skuteczność terapii ziołowej z 80,49% do 92,68%, poprawiając jednocześnie strukturę snu i profile neuroprzekaźników¹¹. Badania kliniczne i przeglądy systematyczne potwierdziły, że Tuina może znacząco poprawić jakość snu, zmniejszyć wyniki lęku i depresji oraz modulować poziomy neuroprzekaźników w surowicy, takich jak 5-hydroksytryptamina (5-HT)¹². Uważa się, że jej działania terapeutyczne są pośredniczone przez holistyczną regulację sieci neuroendokrynologiczno-immunologicznej. Ostatnie badania coraz częściej koncentrują się na układzie oreksyny, kluczowy system neuropeptydów, który ma swój początek w bocznej hipotalamusie i jest niezbędny do promowania i utrzymania czuwania¹³. Nienormalna nadaktywność neuronów oreksyny jest implikowana w patofizjologii bezsenności, podczas gdy hamowanie tej ścieżki wykazało potencjał terapeutyczny¹⁴. Wstępne dowody sugerują, że manipulacje takie jak masaż brzucha mogą wpływać na poziomy Oreksyny-A w mózgu szczurów z niedoborem snu¹², jednakże brakuje systematycznego badania, czy Tuina wywiera swoje przeciwbezsenności działania specyficznie poprzez modulacje układu oreksyny.

Dlatego, na podstawie modelu szczurów z pierwotną bezsennością, niniejsze badanie ma na celu: (1) Ocenić poprawę zachowań snu po standaryzowanym interwencji Tuina za pomocą testów behawioralnych; oraz (2) Zbadać mechanizm leżący u podstaw, badając, czy efekt Tuina jest związany z obniżeniem ekspresji Oreksyny-A w podwzgórzu, porównując jego skuteczność z efektywnością antagonisty receptora oreksyny. Badania te mają na celu dostarczenie dowodów eksperymentalnych na temat centralnego mechanizmu Tuina w leczeniu bezsenności.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne i oceny dobrostanu zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Etykę Zwierząt Xinjiang Medical University (numer zgody etycznej: IACUC-20020158). Protokół zgodny jest z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich użytkowania. Stosowany sprzęt i odczynniki są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Umieść 64 szczurzy w wieku 250 g ± 50 g, z równym rozkładem płci, w systemie SPF (specific pathogen-free) w temperaturze 18–22 °C przy cyklu światło-ciemność 12 h. Zapewnić żywność i wodę ad libitum.
2. Po tygodniu adaptacyjnego karmienia losowo podzielić szczury na 4 grupy (n = 16 na grupę): kontrolną (Grupa A), modelową (Grupa B), Tuina (Grupa C) oraz antagonistyczną (Grupa D).

2. Ustanowienie pierwotnego modelu bezsenności

UWAGA: z wyjątkiem Grupy A, szczury w Grupach B, C i D poddawane są następującej procedurze modelowania.

1. Przygotować plastikowy pojemnik w kształcie cylindra (średnica góry: 30 cm, wysokość: 40 cm) jako skrzynię dla szczurów.
2. Zamocować cylindryczną platformę (średnica: 6 cm, wysokość: 10 cm) na dnie pojemnika.
3. Wlać wodę do pojemnika aż poziom wody znajdzie się 1 cm poniżej powierzchni platformy. Utrzymać temperaturę wody na poziomie 20 °C.
4. Umieścić poziomo wewnątrz pojemnika okrągłą siatkę żelazną (średnica: 25 cm, wielkość siatki: 1 cm) 15 cm nad platformą. Zabezpieczyć siatkę do krawędzi pojemnika za pomocą cienkich drutów żelaznych.
5. Umieścić wodę pitną i żywność na siatce. Codziennie wymieniać wodę oraz czyścić i dezynfekować pojemnik.
6. Umieścić po jednym szczurze na platformie w każdej skrzynce przez 8 kolejnych dni.

3. Ocena modelu za pomocą testu snu synergistycznego z użyciem pentobarbitalu sodowego

1. Roztwór pentobarbitalu sodowego przygotowywany jest poprzez bezpośrednie wprowadzanie ultraczystej wody. Ważąć 1,0 g proszku, dodać sterylizowaną ultraczystą wodę do 100 mL, rozpuścić i przefiltrować w 0,22 μm, aby uzyskać 1% (10 mg/mL) roztwór.
2. W dzień 9 wstrzyknąć do wszystkich szczurów dootrzewnowo roztwór pentobarbitalu sodowego w minimalnej dawce progowej, która wywołuje sen (określona w wstępnych eksperymentach).
3. Rejestrować czas senności (od chwili wstrzyknięcia do pierwszej utraty odruchu prawidłowej pozycji ciała) i czas trwania snu (od chwili utraty do odzyskania odruchu prawidłowej pozycji ciała). Utrata odruchu prawidłowej pozycji ciała przez 1 min utrzymywaną jako początek snu i jego odzyskanie jako koniec snu.

4. Interwencja Tuina

UWAGA: Interwencje rozpoczynają się w dzień po udanej ocenie modelu i kontynuują raz dziennie przez 14 kolejnych dni. Grupa A i Grupa B poddawane są ograniczeniom w ramach urządzenia do fiksacji przez 10 min dziennie. Operatorzy przed eksperymentem przechodzą rygorystyczne szkolenie, aby zapewnić spójność w sile, częstotliwości i rytmie.

1. Dla Grupy C, fiksować szczura w pozycji leżącej na plecach na stole operacyjnym.
2. Delikatnie fiksować cztery kończyny szczura za pomocą pięciu palców lewej ręki, całkowicie rozciągając brzuch.
3. Wykonać Tuina brzucha prawą ręką: za pomocą guzika dalszego palca środkowego wykonywać siłę w punkcie Guanyuan (CV4, zlokalizowany 25 mm poniżej pępka). Pozostałe cztery palce pozostawić naturalnie rozluźnione.
4. Prowadzić palec środkowy małymi przednio-bocznymi ruchami okrężnymi od stawu ramiennego, wykonując okrężny ruch translacyjny w przeciwnym kierunku wskazówek zegara na brzuchu.
5. Przebiegać zamkniętą ścieżką okrężną uformowaną przez Jiuwei (CV15, 5 mm poniżej wyrostka mieczykowatego), Guanyuan (CV4) oraz punktów Daimai po bokach (GB26, punkt położony w połowie odległości między wolnym końcem 12. żebra a górną krawędzią grzebienia biodrowego).
6. Utrzymać gładki, stały i ciągły ruch okrężny z częstotliwością 5–7 cykli/min.
7. Wykonywać ruch przeciwny do wskazówek zegara przez 5 min, a następnie ruch zgodny z wskazówkami zegara przez 5 min.
8. Upewnić się, że siła jest stała i mocna, a szczur pozostaje spokojny i nie zwalnia. Stosować interwencję raz dziennie przez 14 dni.

5. Podawanie antagonisty

1. Dla Grupy D, podawać MK-4305 (10 mg/kg) przez sondę żołądkową raz dziennie przez 14 dni. Rozpuścić MK-4305 w fisiologicznym roztworze soli, aby przygotować 5 mL roztworu.

Wyniki

Tabela 1 pokazuje, że w porównaniu z grupą A, czas snu w grupach B, C i D był znacznie przedłużony, a czas trwania snu był znacznie skrócony po modelowaniu, co wskazuje, że model szczura z bezsennością pierwotną został pomyślnie ustanowiony. Wyniki przedstawione w Tabeli 2 i Tabeli 3 oferuje wstępne wsparcie dla efektu terapeutycznego Tuina w leczeniu bezsenności. Test na otwartym polu (OFT) jest jednym z najklasyczniejszych i najczęściej stosowanych paradygmatów w neurobiologii behawioralnej do oceny zachowań podobnych do lęku u gryzoni¹⁵. Badania wykazały, że preferencja dla czterech narożnych obszarów jest wrażliwym wskaźnikiem do mierzenia zachowań podobnych do lęku i może być bardziej dyskryminacyjna niż wskaźnik centralny na umiarkowanym do niskim poziomie lęku. Szczury z modelu bezsenności wykazywały znaczne zachowania podobne do lęku i zmiany^16,17 w zachowaniu eksploracyjnym, podczas gdy interwencja Tuina skutecznie łagodziła te zachowania u tych szczurów. Wyniki biologii molekularnej przedstawione w Tabeli 4 i Tabeli 5, oraz Rycina 1 pokazują dalsze, że Tuina skutecznie hamuje nadekspresję Orexin-A w podwzgórzu szczurów z modelem bezsenności.

Rycina 1: Wyniki barwienia immunohistochemicznego Orexin-A w podwzgórzu szczurów z każdej grupy (40×, 100×, 200×, 400×). (A) Neurony Orexin-A dodatnie obserwowano w tkance podwzgórza szczurów, pojawiając się jako ciemnobrązowe granulacyjne sygnały. Wynik punktacji intensywności barwienia wynosił 3 punkty, odsetek komórek dodatnich wynosił 40% (w zakresie 26%–50%, oceniana na 2 punkty), a wynik łączny wynosił 6 punktów, co mieści się w zakresie wysokiej ekspresji. (B) Liczba neuronów Orexin-A dodatnich w tkance podwzgórza szczurów była znacznie większa w porównaniu z grupą kontrolną, z gęstszym rozmieszczeniem dodatnich komórek. Wynik punktacji intensywności barwienia wynosił 3 punkty (ciemnobrązowy), odsetek dodatnich komórek osiągnął 80% (w zakresie 76%–100%, oceniana na 4 punkty), a wynik łączny wynosił 12 punktów, co mieści się w zakresie wysokiej ekspresji. (C) Liczba neuronów Orexin-A dodatnich w tkance podwzgórza szczurów była zmniejszona w porównaniu z grupą modelową. Wynik punktacji intensywności barwienia wynosił 3 punkty (ciemnobrązowy), odsetek dodatnich komórek wynosił 75% (w zakresie 51%–75%, oceniana na 3 punkty), a wynik łączny wynosił 9 punktów, co mieści się w zakresie wysokiej ekspresji. (D) Liczba neuronów Orexin-A dodatnich w tkance podwzgórza szczurów była również zmniejszona w porównaniu z grupą modelową. Wynik punktacji intensywności barwienia wynosił 3 punkty (ciemnobrązowy), odsetek dodatnich komórek wynosił 60% (w zakresie 51%–75%, oceniana na 3 punkty), a wynik łączny wynosił 9 punktów, co mieści się w zakresie wysokiej ekspresji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Grupa	Czas snu / min	Czas trwania snu / min
A	4,13 ± 1,80	49,75 ± 38,46
B	6,31 ± 2,80*	22,13 ± 11,41*
C	6,33 ± 2,60*	24,93 ± 14,43*
D	6,53 ± 1,90*	24,73 ± 17,59*

Tabela 1: Porównanie testów snu wywołanego sodem pentobarbitalu wśród grup po modelowaniu. * oznacza P < 0,05 w porównaniu z grupą kontrolną.

Grupa

Częstotliwość wstawania

Czas unieruchomienia (s)

Czas poruszania się (s)

Odległość poruszania się (m)

Czas w strefie środkowej (s)

Odległość w strefie środkowej (m)

Czas w strefie narożnej (s)

Dyskusja

Niniejsze badanie miało na celu ocenę skuteczności Tuina w modelu pierwotnego bezsenności u szczurów oraz zbadanie jego potencjalnego mechanizmu związanego z podwzgórzowym układem oreksyny. Obecne wyniki pokazują, że standaryzowany protokół Tuina znacząco poprawił opóźnienie snu i jego czas trwania, złagodził zachowania przypominające lęk i skutecznie zredukował przeregulowany poziom Oreksyny-A zarówno na poziomie mRNA, jak i białka w podwzgórzu. Warto zauważyć, że efekt Tuina był porównywalny z efektem antagonisty receptora oreksyny MK-4305, co sugeruje, że modulacja układu oreksyny może być kluczowy mechanizmem, poprzez który Tuina łagodzi bezsenność.

W porównaniu z interwencjami farmakologicznymi, Tuina, jako nieinwazyjna terapia zewnętrzna, oferuje zalety w zakresie bezpieczeństwa, minimalnych efektów ubocznych i przestrzegania przez pacjenta^12,18. Jej terapeutyczne zalety w bezsenności są poparte dowodami klinicznymi, które pokazują poprawę jakości snu i stanu psychicznego^18,19. Mechanizm działania jest wielowymiarowy, obejmujący regulację osi podwzgórze-przysadka-nadnercza, homeostazy układu nerwowego i kluczowe neuroprzekaźniki, takie jak 5-HT^18,20. Wyniki te rozwijają to rozumienie, wskazując na układ oreksyny jako specyficzne miejsce działania. Neurony oreksyny są głównymi czynnikami budzącymi, a ich nadpobudliwość jest związana z niestabilnością snu^21,22,23. Zredukowanie poziomów oreksyny-A obserwowane po zastosowaniu Tuina wydaje się być spójne z działaniem nowego leku przeciwbezsennego, antagonisty dwóch receptorów oreksyny, co wskazuje na możliwą skonwergencję ścieżek między interwencjami farmakologicznymi i niefarmakologicznymi^24,25.

Podczas gdy to badanie buduje na naszych wcześniejszych pracach dotyczących brzusznego Tuina i regulacji oreksyny-A²⁵, obecny rękopis reprezentuje znaczące rozszerzenie i udoskonalenie metodologiczne w porównaniu z oryginalnym raportem. Konkretnie, to badanie powiększa liczbę szczurów do 64, aby zwiększyć moc statystyczną i wprowadza kompleksową baterię ocen behawioralnych, w tym test otwartego pola i testy snu wywołanego pentobarbitalem, aby systematycznie ocenić strukturę snu i zachowania przypominające lęk, które nie zostały omówione we wcześniejszym badaniu. W przeciwieństwie do poprzednich prac, które koncentrowały się na stresie oksydacyjnym i klasycznych neuroprzekaźnikach, ten artykuł priorytetowo zwraca uwagę na funkcjonalną walidację układu oreksyny poprzez zintegrowane wyniki behawioralne i analizy molekularne, służąc jako samodzielne badanie mechanistyczne, które uzupełnia, a nie powtarza, wcześniejsze wyniki.

Projekt eksperymentu przestrzegał teorii TCM, koncentrując się na brzuchu i określonych punktach akupunkturowych, takich jak Guanyuan (CV 4), które są uważane za tonizujące pierwotne Qi i regulujące funkcje narządów wewnętrznych, w ramach zamkniętej ścieżki manipulacji^26,27. Parametry (częstotliwość, czas trwania, przebieg) zostały ustalone na podstawie wstępnych prac, aby zapewnić spójność i powtarzalność, co jest kluczowe dla mechanistycznych badań na zwierzętach¹².

Jednakże ten protokół ma ograniczenia. Po pierwsze, interwencja była przeprowadzana w jednym punkcie czasowym po utworzeniu modelu. Przyszłe badania powinny zbadać różne czasy trwania i częstotliwości interwencji, aby ustalić optymalny związek “dawka-odpowiedź” dla Tuina. Po drugie, to badanie jest projektem badania obserwacyjnego. Chociaż stwierdzono korelacje między Tuina a zmniejszoną ekspresją Oreksyny-A i poprawą behawioralną, nadal niejasne jest, czy ta asocjacja jest bezpośrednim czy pośrednim efektem Tuina lub innych czynników. Przyszłe badania mogą zastosować eksperymentalne strategie, takie jak nokaut genu, chemiczna inhibicja chemogenetyczna czy blokada antagonisty, aby dalsze zweryfikować, czy Tuina poprawia zachowanie bezsenności poprzez regulację ekspresji Oreksyny-A, co pozwoliłoby na wyjaśnienie jej mechanizmu przyczynowego. Wreszcie, to badanie nie ustanowiło grupy kontrolnej z operacją szamową ani kontrolą placebo. Jednakże, to badanie wzięło to pod uwagę podczas projektowania, a wszystkie grupy zwierząt otrzymały ten sam poziom chwytania i utrwalania operacji, co do pewnego stopnia kontrolowało wpływ niespecyficznych czynników stresu. Ponadto, częstotliwość, intensywność i ścieżka działania programu Tuina w tym badaniu zostały ustalone na podstawie wstępnych eksperymentów, aby zapewnić spójność i powtarzalność interwencji. Przyszłe badania powinny skupić się na opracowaniu bardziej rygorystycznych metod kontrolnych, takich jak zastosowanie symulacji bez kontaktu lub minimalnej stymulacji dotykowej, aby wyjaśnić konkretne efekty operacji Tuina.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	Sinteza cDNA
Acetylcholine (Ach)	Nanjing Jiancheng	A105-1	Elisa reagent
Adhesion microscope slides	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Montaż przekrojów tkankowych
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A811BA0014	Elektroforeza żelowa
Anhydrous ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Odwodnienie tkanki
Antibody diluent	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9029	Rozcieńczanie przeciwciała pierwotnego
Basket	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	N/A	Uchwyt do szkieł
Citrate powder	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	MVS-0066	Przygotowanie bufora do regeneracji antygenu
Coverslip	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Mikroskopia
DAB chromogen kit	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	DAB-1031	Wykrywanie chromogenne
DEPC	Sangon Biotech (Shanghai)	B417BA0001	Oczyszczanie RNA
Dopamine (DA)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08660r	Elisa reagent
Electrophoresis cell	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYCZ-21	Elektroforeza żelowa
Electrophoresis power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C	Elektroforeza żelowa
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	Elisa reagent
Gamma-aminobutyric acid (γ-GABA)	AMOKE	AE91068Ra	Elisa reagent
Gel imaging system	Shanghai Tanon	2500	Dokumentacja żelów
H2O2 (30%)	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Blokowanie endogennej peroksydazy
Hematoxylin staining solution	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	CTS-1097	Kontrolowanie barwienia
High-speed refrigerated centrifuge	Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.	Nefuqe 15R	Wirowanie próbek
Histamine (HIS)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	EH171-1	Elisa reagent
Hot air drying oven	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DHG series	Suszenie próbek
IHC staining humidity chamber	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	BOX-1001	Izba inkubacyjna z wilgotnością
Immunohistochemistry staining kit	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	SP9000	IHC barwienie
Incubator	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DNP-9272	Inkubacja z kontrolą temperatury
Induction cooker	Guangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.	C21-RK2101	Źródło ciepła
Microplate reader	Bio-Rad, China	xMark	Pomiar absorbancji
Microscope	Nikon	E200	Mikroskopowe przetwarzanie obrazów
MK-4305	Meilun Bio	MB3773	Reagent eksperymentalny
Neutral balsam	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9555	Środek montażowy
Norepinephrine (NA)	Nanjing Jiancheng	H096	Elisa reagent
Nucleic acid and protein quantifier	Beijing Kaiao	K5500	Ilościowe określanie kwasów nukleinowych
Orexin A	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08860r	Elisa reagent
PCR thermal cycler	Bio-Rad, USA	MyCycler Thermal Cycler	Amplifikacja PCR
Phosphate-buffered saline (PBS)	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PBS-0060/0061	Bufor myjący
Pipette	Eppendorf, Germany	Dragon lab	Obsługa płynów
Pressure cooker	Zhejiang Supor Co., Ltd.	YW20F1	Regeneracja antygenu
Protein quantification kit	TransGen Biotech	DQ111-01	Zestaw do ilościowego oznaczania białka BCA
Rabbit anti-HCRT (Orexin-A) polyclonal antibody	Sangon Biotech (Shanghai)	D163595	Przeciwciało pierwotne
Real-time PCR instrument	ABI (Thermo Fisher)	QuantStudio 6 Flex	Analiza qPCR
Refrigerator	Hefei Meiling Co., Ltd.	BCD-249LCK	Przechowywanie próbek
Serotonin (5-HT)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08364r	Elisa reagent
Staining jar	Generic	N/A	Pojemnik do barwienia szkieł
Super immunohistochemistry pen	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PEN-0002	Hydrofobowy marker
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101	Dyd żelowy
TRIzol Reagent	Ambion	15596026	Ekstrakcja RNA
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	GL-88B	Mieszarka laboratoryjna
Xylene	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Odparafinizacja