Ekspresja białka czytającego m6A YTHDC2 w niedrobnokomórkowym raku płuca w chińskiej kohorcie klinicznej

Podsumowanie

W niniejszym badaniu oceniono ekspresję YTHDC2 w niedrobnokomórkowym raku płuca z wykorzystaniem bioinformatyki i qRT-PCR. Podczas gdy analizy baz danych sugerują obniżenie poziomu ekspresji oraz istotność prognostyczną, walidacja kliniczna nie wykazała znaczących różnic. Wyniki podkreślają niespójności, co wskazuje na ograniczoną dokładność diagnostyczną i potrzebę dalszej walidacji przed zastosowaniem w praktyce klinicznej.

Streszczenie

Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) pozostaje główną przyczyną śmiertelności z powodu nowotworów na całym świecie, przy ograniczonej liczbie dostępnych biomarkerów do wczesnej diagnostyki i prognozowania. Modyfikacja RNA N6-metyloadenozyna (m6A) oraz jej białka odczytujące, takie jak YTHDC2, odgrywają kluczową rolę w regulacji genów i tumorigenizie. Celem niniejszego badania było ocena profilu ekspresji YTHDC2 w tkankach NSCLC z wykorzystaniem bioinformatyki i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), ocena związku między YTHDC2 a cechami kliniczno-patologicznymi oraz zbadanie jego potencjalnego znaczenia klinicznego i biologicznego dla przyszłych badań. W celu oceny dokładności prognostycznej przeanalizowano dane dotyczące ekspresji genów i przeżywalności pochodzące z baz danych. Ekspresję YTHDC2 ilościowo określono w tkankach NSCLC w chińskiej kohorcie klinicznej, a następnie przeanalizowano cechy kliniczno-patologiczne. Analizy publicznych baz danych wykazały, że YTHDC2 był obniżony w tkankach NSCLC (p < 0,05) i był powiązany z przeżywalnością pacjentów, choć jego wartość prognostyczna była niska (AUC ≈ 0,5). Analiza qRT-PCR 19 par tkanek nowotworowych i sąsiednich tkanek prawidłowych nie wykazała statystycznie istotnej różnicy (p = 0,537) w ekspresji YTHDC2 między tkankami rakowymi a sąsiednimi. Podsumowując, analizy publicznych baz danych sugerują, że ekspresja YTHDC2 może być obniżona i może mieć potencjalne znaczenie prognostyczne w NSCLC, jednak niezależna walidacja kliniczna w naszej kohorcie nie potwierdziła istotnej różnicowej ekspresji. Wyniki te wskazują na znaczną heterogenność między wielkoskalowymi zbiorami danych a kohortami rzeczywistymi, co sugeruje, że YTHDC2 prawdopodobnie nie będzie wiarygodnym, samodzielnym biomarkerem diagnostycznym lub prognostycznym i może wymagać integracji z dodatkowymi markerami molekularnymi w celu zastosowania klinicznego.

Wprowadzenie

Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC), obejmujący raka плоскоepithelialnego i gruczołowego, jest najczęściej diagnozowanym nowotworem płuca i główną przyczyną śmiertelności z powodu raka na świecie¹. Globalne statystyki onkologiczne wskazują, że rak płuca jest jedną z głównych przyczyn zgonów z powodu nowotworów². Niedawne postępy w diagnostyce, chirurgii, radioterapii i terapii celowanej molekularnie nie poprawiły znacząco rokowania w przypadku NSCLC, ponieważ pierwotna diagnoza jest stawiana w późnym stadium, a choroba we wczesnych fazach często przebiega bezobjawowo³. Podkreśla to potrzebę opracowania nowych biomarkerów do identyfikacji, prognozowania i oceny skuteczności leczenia u pacjentów z NSCLC.

m6A jest pierwszą zidentyfikowaną i najliczniejszą modyfikacją RNA u eukariontów i bierze udział w stabilności, translacji oraz transkrypcji RNA⁴. Modyfikacje m6A są dynamiczne i odwracalne, a proces ten jest wspomagany przez metylotransferazy (pisarze), demetylazy (kaszerzy) oraz specyficzne białka wiążące (czytelnicy)⁵. Spośród nich YTHDC2, główne białko czytelnika m6A, moduluje stabilność RNA i tempo translacji⁶. Niedawne badania wskazują, że YTHDC2 bierze udział w regulacji wielu typów nowotworów, albo poprzez hamowanie wzrostu i inwazji komórek, albo poprzez indukowanie śmierci komórkowej⁷. Badania podkreśliły również kliniczne znaczenie innych białek czytelników m6A, w tym YTHDF1, YTHDF2 i YTHDC1, w progresji raka płuca, regulacji odpornościowej i prognozie, co podkreśla wagę systematycznej oceny poszczególnych czytelników m6A w niezależnych kohortach pacjentów^8,9,10. W NSCLC stwierdzono znacznie niskie poziomy YTHDC2, co wiązało się z zaawansowanymi stadiami guza, przerzutami do węzłów chłonnych i złym rokowaniem pacjentów, co wskazuje, że może on być czynnikiem przeciwnowotworowym¹¹. Eksperymenty in vitro i in vivo ujawniły również, że wysoka ekspresja YTHDC2 hamuje proliferację i przerzutniczość komórek w raku płuca⁷.

W niniejszym badaniu analizowano regulację YTHDC2 w NSCLC za pomocą zintegrowanych analiz obliczeniowych oraz walidacji eksperymentalnej metodą qRT-PCR. Zbadano również zależność między ekspresją YTHDC2 a charakterystyką kliniczno-patologiczną i rokowaniami pacjentów. Mimo rosnącej liczby dowodów z publicznych baz danych sugerujących dysregulację YTHDC2 w NSCLC, opublikowane badania wykazały niespójne wyniki w odniesieniu do skali i znaczenia klinicznego tej dysregulacji, a niezależna walidacja w dobrze scharakteryzowanych, rzeczywistych kohortach klinicznych, szczególnie w populacjach azjatyckich, pozostaje ograniczona. Co więcej, większość poprzednich badań opierała się głównie na publicznych zbiorach danych transkrypcyjnych lub modelach eksperymentalnych, a stosunkowo niewiele z nich łączyło wyniki bioinformatyczne z niezależną walidacją kliniczną. Poprzez połączenie wielkoskalowych publicznych analiz transkrypcyjnych z niezależną walidacją qRT-PCR w chińskiej kohorcie klinicznej, badanie to miało na celu ocenę powtarzalności wcześniejszych ustaleń oraz wypełnienie luki translacyjnej między analizami publicznych baz danych a rzeczywistymi próbkami klinicznymi. W związku z tym celem badania była systematyczna ocena ekspresji YTHDC2 z wykorzystaniem zintegrowanych podejść bioinformatycznych i walidacji klinicznej oraz ocena jej potencjalnego znaczenia biologicznego i klinicznego w NSCLC. Postawiono hipotezę, że ekspresja YTHDC2 jest dysregulowana w NSCLC, a połączenie analiz bioinformatycznych z niezależną walidacją kliniczną zapewni bardziej wiarygodną ocenę jej znaczenia diagnostycznego i prognostycznego niż każde z tych podejść stosowane osobno.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu Medycznego w Hainan (numer zatwierdzenia HMC1984.24) i przeprowadzono je zgodnie z Deklaracją Helsińską (w wersji zrewidowanej w 2013 roku).

Badani

Badanie przeprowadzone u 50 pacjentów z rakiem płuca, zdiagnozowanych w latach 2017–2024 w Sanya Central Hospital w prowincji Hainan, zostało wykonane zgodnie z wytycznymi klinicznymi Chińskiego Stowarzyszenia Medycznego dotyczącymi diagnostyki i leczenia raka płuca (wydanie z 2024 r.). W celu zapewnienia porównywalności między badaniami zastosowano stopniowanie CSCO (2024), zgodne z 8. wydaniem AJCC, co zostało zwalidowane w kohortach chińskich¹²; w celu zapewnienia spójności przeprowadzono dwie niezależne oceny onkologiczne. Proces wyboru pacjentów, dostępność tkanek, ocena jakości RNA oraz ostateczna liczba próbek włączonych do analizy qRT-PCR zostały podsumowane na Rysunku 1.

Dane badania

W niniejszym badaniu wykorzystano bioinformatykę do analizy poziomów ekspresji YTHDC2 w NSCLC oraz ich związku z cechami kliniczno-patologicznymi, co pozwoliło na uzyskanie wglądu w potencjalne mechanizmy. Analizy bioinformatyczne przeprowadzono wyłącznie z wykorzystaniem publicznie dostępnych danych z sekwencjonowania RNA z The Cancer Genome Atlas (TCGA), obejmujących gruczolakoraka płuca (LUAD), raka płaskonabłonkowego płuca (LUSC) oraz odpowiadające im próbki normalnej tkanki płucnej pobrane za pośrednictwem GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). Pobranym zestaw danych towarzyszyły dane o ekspresji z sekwencjonowania RNA wraz z dostępnymi zmiennymi klinicznymi (identyfikator pacjenta, identyfikator próbki, wiek, płeć, stopień zaawansowania patologicznego, status przeżycia oraz całkowity czas przeżycia) dla kwalifikujących się przypadków TCGA-LUAD i TCGA-LUSC. Próbki pozbawione informacji o ekspresji genów lub przeżywalności zostały wykluczone z dalszych analiz przeżycia i analiz ROC. Zestaw danych wykorzystany w tym badaniu znajduje się w Pliku uzupełniającym 1. Do analiz bioinformatycznych nie wykorzystano materiału klinicznego pobranego w Sanya Central Hospital. Szczegółowe procedury analiz GEPIA, Kaplan–Meier Plotter oraz survivalROC przedstawiono w poniższej sekcji Analiza bioinformatyczna. Kompletny schemat analizy bioinformatycznej, obejmujący pozyskiwanie danych, przetwarzanie wstępne, analizę ekspresji genów, analizę przeżywalności oraz analizę ROC, podsumowano na Rysunku 2.

Kryteria włączenia i wyłączenia

Kryteria włączenia i wyłączenia pacjentów przedstawiono w Tabeli 1. Analiza mocy przeprowadzona za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej wykazała, że co najmniej 26 przypadków w grupie zapewni 80% mocy do wykrycia umiarkowanej wielkości efektu (d = 0,8, α = 0,05, test obustronny). Choć pierwotnie planowano włączenie 50 par w grupie raka płuca, końcowa analiza qRT-PCR objęła 30 próbek guza i 19 próbek prawidłowej tkanki sąsiedniej po wykluczeniu próbek ze względu na jakość tkanki lub RNA. Redukcja liczby próbek odzwierciedla rzeczywiste ograniczenia kliniczne i podkreśla znaczenie integralności RNA oraz dostępności tkanki w badaniach translacyjnych. Przy n = 19 dla porównań minimalna wykrywalna wielkość efektu wynosi d = 1,0 (moc 80%, α = 0,05). Zatem badanie posiadało wystarczającą moc, aby wykryć duże, ale nie małe lub umiarkowane różnice w ekspresji YTHDC2.

Próbki tkanek i ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Diagnozy patomorfologiczne zostały określone w sposób podwójnie ślepy przez dwóch różnych patomorfologów. Czystość guza została oceniona przez patomorfologów (>70% komórek złośliwych) i potwierdzona za pomocą metody ESTIMATE (TCGA). Sąsiadujące tkanki prawidłowe zostały poddane makrodissekcji w celu zminimalizowania zanieczyszczenia stromy. Typy histologiczne raka płuca obejmowały gruczolakoraka płuca oraz raka плоскоkomórkowego, w tym 26 przypadków gruczolakoraka płuca i 4 przypadki raka плоскоkomórkowego. Stadiowanie kliniczne 50 pacjentów z rakiem płuca przeprowadzono zgodnie z kryteriami stadiowania opisanymi w „Chinese Medical Association Clinical Guidelines for Lung Cancer (2024 Edition)”. Patologicznie potwierdzone preparaty NSCLC (n = 50) reprezentowały typowy rozkład kliniczny (patrz Tabela 2). Z 50 początkowo zakwalifikowanych pacjentów, 30 próbek tkanki nowotworowej i 19 dopasowanych próbek sąsiadującej tkanki prawidłowej spełniło kryteria jakości RNA. Ponieważ sparowana analiza statystyczna wymaga dopasowanych preparatów od tego samego pacjenta, porównanie ekspresji w guzie i sąsiadującej tkance prawidłowej wykonano z wykorzystaniem 19 dostępnych dopasowanych par. Te preparaty kliniczne zostały użyte wyłącznie do walidacji eksperymentalnej metodą qRT-PCR i analizowano je niezależnie od publicznych zbiorów danych TCGA wykorzystanych do analizy bioinformatycznej. Wybrane preparaty przetworzono natychmiast po potwierdzeniu patologicznym i obsługiwano w warunkach wolnych od RNaz przed ekstrakcją RNA. Podzbiór ten odzwierciedla przypadki, w których uzyskano zarówno odpowiednią ilość tkanki, jak i wysokiej jakości całkowite RNA (liczba integralności RNA, RIN >7.0). Stężenie i czystość całkowitego RNA zmierzono przed odwrotną transkrypcją, a do dalszych analiz włączono tylko próbki o odpowiedniej jakości RNA (RIN >7.0). Równe ilości całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji do komplementarnego DNA (cDNA) zgodnie z protokołem producenta przed ilościowym PCR. Proces ten zapewnił poprawność analizowanych danych ekspresji genów. Eksperymenty qRT-PCR przeprowadzono na termocyklerze PCR czasu rzeczywistego przy użyciu testu ilościowego PCR opartego na sondach. Wszystkie reakcje przeprowadzono w trzech powtórzeniach, wraz z kontrolami bez matrycy, aby zapewnić powtarzalność analityczną. Amplifikację PCR przeprowadzono w następujących warunkach cyklicznych: początkowy etap aktywacji enzymu/denaturacji w 95°C przez 10 min, a następnie 40 cykli denaturacji w 95°C przez 15 s i przyłączania/elongacji w 60°C przez 60 s. Sygnały fluorescencyjne rejestrowano na koniec każdego cyklu amplifikacji. Wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne pozyskano od komercyjnych dostawców (patrz Tabela Materiałów). Sekwencje starterów i sond użytych w qRT-PCR znajdują się w Tabeli 3.

Analiza bioinformatyczna

Analiza ekspresji genu YTHDC2 w bazie danych GEPIA

Bazę danych GEPIA wykorzystano do analizy ekspresji YTHDC2 w NSCLC. Dostęp do serwera GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) uzyskano za pomocą przeglądarki internetowej. Wybrano moduł Expression DIY, wprowadzono symbol genu "YTHDC2", wybrano zbiory danych LUAD oraz LUSC, zachowano domyślne parametry normalizacji, a następnie bezpośrednio w interfejsie GEPIA wygenerowano wykresy pudełkowe ekspresji różnicowej. Istotność statystyczną określono jako p < 0.05.

Baza danych Kaplan-Meier plotter do analizy przeżywalności pacjentów z rakiem płuca

W badaniu przeanalizowano związek między ekspresją YTHDC2 a rokowaniem u pacjentów z rakiem płuca przy użyciu bazy danych Kaplan-Meier Plotter. Wybrano zbiór danych dotyczących raka płuca, wprowadzono symbol genu "YTHDC2", zastosowano opcję automatycznego wyboru najlepszego punktu odcięcia (cutoff), a następnie wygenerowano krzywe Kaplana-Meiera dla przeżycia całkowitego oraz przeżycia po progresji, korzystając z domyślnych ustawień analizy. Pacjentów automatycznie podzielono na grupy o wysokiej i niskiej ekspresji, stosując optymalny punkt odcięcia określony przez platformę Kaplan-Meier Plotter; wartości hazard ratio wraz z odpowiadającymi im 95% przedziałami ufności wygenerowano przy użyciu domyślnych ustawień platformy.

Uruchamianie pakietów R w oprogramowaniu R do wykreślania krzywych ROC

Dane z sekwencjonowania RNA oraz odpowiadające im metadane kliniczne dla kwalifikujących się przypadków TCGA-LUAD i TCGA-LUSC pobrano z portalu GDC Data Portal. Pobrane zestawy danych scalono według identyfikatora pacjenta i zaimportowano do programu R w celu przeprowadzenia dalszych analiz. Pakiet survivalROC wykorzystano do wygenerowania zależnych od czasu krzywych ROC dla punktów czasowych prognozy wynoszących 1, 3 i 5 lat, a odpowiadające im wartości powierzchni pod krzywą (AUC) obliczono w celu oceny wydajności prognostycznej ekspresji YTHDC2. W analizie ROC przeżycia uwzględniono wyłącznie pacjentów TCGA-LUAD i TCGA-LUSC, dla których dostępne były dane o ekspresji RNA-seq oraz informacje o przeżyciu. Lokalna kohorta kliniczna nie została wykorzystana do prognozowania przeżycia ze względu na brak danych z długoterminowej obserwacji.

Ekspresja YTHDC2 w tkankach za pomocą qRT-PCR

W celu analizy poziomów ekspresji genów przeprowadzono qRT-PCR. Do każdej reakcji dodano równe objętości cDNA, zgodnie z zalecanymi przez producenta warunkami reakcji. Amplifikację przeprowadzono za pomocą ilościowego testu PCR opartego na sondach, a dane fluorescencji zbierano automatycznie po każdym cyklu amplifikacji. W skrócie proces ekstrakcji RNA obejmował kilka etapów, w tym przygotowanie próbek, deparafinizację, usunięcie pozostałych cieczy, trawienie proteinazą K, inkubację, wirowanie, traktowanie DNazą, dodanie DNazy I oraz wytrącanie etanolem. Następnie próbkę związano z kolumną do oczyszczania RNA opartą na krzemionce i odwirowano przy 8,000 × g przez 30 s. Kolumnę przemyto buforem do przemywania 1, buforem do przemywania 2 oraz buforem do przemywania 2 rozcieńczonym etanolem, a następnie osuszono przy 13,000 × g przez 2 min. RNA eluwano poprzez dodanie 70 µL wody wolnej od RNaz do centrum membrany kolumny, a następnie odwirowano przy 13,000 × g przez 1 min. Każda para starterów wykazała pojedynczy produkt amplifikacji, co potwierdzono analizą krzywych topnienia przed obliczeniem względnej ekspresji genów. Wydajność starterów (90–110%) zwalidowano za pomocą krzywych standardowych przed analizą próbek. Analizy krzywych topnienia potwierdziły obecność pojedynczych amplikonów oraz brak dimerów starterów. Względną ekspresję YTHDC2 obliczono metodą 2^-ΔCt, w której wartości Ct znormalizowano względem endogennego genu referencyjnego GAPDH. Ponieważ wartości ekspresji przedstawiono jako znormalizowane poziomy ekspresji, a nie jako krotność zmiany względem próbki kalibratora, wyniki podano jako wartości 2^−ΔCt. GAPDH wybrano jako gen housekeepingowy, ponieważ jego ekspresja wykazywała minimalną zmienność (CV < 5%) w porównaniu z testowanymi alternatywami (ACTB, CV = 12%; 18S rRNA, CV = 18%), co jest zgodne z kryteriami wyboru genów referencyjnych w badaniach m6A.

Analiza statystyczna

Analizy statystyczne, w tym tworzenie grafik i wykresów, wykonano przy użyciu oprogramowania statystycznego. Do analizy danych ilościowych i kategorycznych dotyczących ekspresji genu YTHDC2 u pacjentów z NSCLC wykorzystano oprogramowanie R do analiz bioinformatycznych i generowania krzywych ROC. Krzywe ROC oraz AUC posłużyły do oceny wydajności diagnostycznej ekspresji YTHDC2 w przewidywaniu przeżywalności. W przypadku analiz opartych na regresji podano szacunki efektu (ilorazy szans) wraz z odpowiadającymi im 95% przedziałami ufności, tam gdzie było to właściwe. Testy Wilcoxona dla par wykorzystano do porównania ekspresji YTHDC2 pomiędzy parami próbek guza i sąsiadującej tkanki prawidłowej, natomiast analizę korelacji Pearsona zastosowano do oceny związku między ekspresją YTHDC2 a cechami kliniczno-patologicznymi. Podano współczynniki korelacji (r) oraz odpowiadające im wartości p. Ponieważ dane qRT-PCR składały się z par próbek guza i sąsiadującej tkanki prawidłowej od tych samych pacjentów, a dane o ekspresji genów nie miały rozkładu normalnego, do porównania poziomów ekspresji YTHDC2 między parami tkanek zastosowano test Wilcoxona dla par. Test ten nie zakłada normalności danych i jest powszechnie stosowany w przypadku skośnych danych biologicznych. Wszystkie testy statystyczne były dwustronne, a wartość p <0,05 uznano za istotną statystycznie. Przed analizą sprawdzono normalność rozkładu zmiennych ciągłych. Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe lub mediana (rozstęp międzykwartylowy), w zależności od potrzeby.

Wyniki

Ekspresja genu YTHDC2 w nowotworach na podstawie bazy danych TCGA

Rysunek 3 ilustruje powiązanie między NSCLC a YTHDC2 poprzez analizę poziomów ekspresji YTHDC2 w różnych nowotworach z wykorzystaniem narzędzia GDC w bazie danych TCGA.

Ekspresja genu YTHDC2 w NSCLC w bazie danych GEPIA

W wyniku dodatkowego przesiewu poziomów ekspresji YTHDC2 w gruczolczym raku płuca (LUAD) ora...

Dyskusja

YTHDC2, największe białko wiążące N6-metyloadenozynę (m6A) z rodziny YTH, wyróżnia się zależną od ATP aktywnością helikazy RNA, co czyni go kluczowym regulatorem metabolizmu RNA¹³. W przeciwieństwie do innych członków rodziny YTH, YTHDC2 występuje zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie, gdzie reguluje translację mRNA oraz stabilność RNA¹⁴. Wcześniejsze badania eksperymentalne wykazały, że YTHDC2 hamuje progresję gruczolakowca płuca (LUAD) poprzez inhibicję ekspresji mRNA ADI...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dedykowane startery i sondy	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chiny	Synteza na zamówienie	Sekwencje starterów i sond wymienione w Tabeli 6
DNaza I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	DNase I (HiPure FFPE RNA Kit)	Usuwanie zanieczyszczeń DNA genomowym
Algorytm ESTIMATE	Yoshihara i in.	Pakiet R (Wersja 1.0.13)	Szacowanie czystości guza
Zestaw do ekstrakcji RNA z FFPE	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	Ekstrakcja RNA z tkanki FFPE
Portal danych GDC	National Cancer Institute (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	Pobieranie zbiorów danych TCGA
Serwer sieciowy GEPIA	Uniwersytet Pekiński, Chiny	http://gepia.cancer-pku.cn	Analiza ekspresji genów
Kaplan–Meier Plotter	Uniwersytet Semmelweisa, Węgry	https://kmplot.com	Analiza przeżywalności
Mikrowirówka	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy	5424 R	Procedury oczyszczania RNA
Spektrofotometr NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	NanoDrop 2000/2000c	Kwantyfikacja RNA
Master Mix do qPCR z sondami	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Amplifikacja ilościowa PCR
Oprogramowanie statystyczne R	R Foundation for Statistical Computing, Wiedeń, Austria	Wersja 4.4.1	Analizy statystyczne i analiza ROC
System PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA	CFX Opus 96	Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym
Zestaw do odwrotnej transkrypcji	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	Synteza cDNA
Kolumna do oczyszczania RNA	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	HiPure Mini Column I	Kolumna do oczyszczania RNA z membraną krzemionkową
Woda wolna od RNaz	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	RNase-Free Water	Elucja RNA
Statystyka SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics Wersja 27.0	Analizy statystyczne
Pakiet survivalROC	CRAN (R Foundation for Statistical Computing)	Wersja 1.0.3.1	Zależna od czasu analiza ROC
Baza danych TCGA	National Cancer Institute (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	Publiczna baza danych genomiki nowotworów
Bufor płuczący RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	Buffer RW1	Bufor płuczący do oczyszczania RNA
Bufor płuczący RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	Buffer RW2	Bufor płuczący do oczyszczania RNA