Artykuł metodologiczny

Wiarygodne stworzenie modelu tętniaka tętnicy brzusznej u myszy przy użyciu uczulenia na elastynę i peryvaskularnej elastazy

115 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72015

⸱

26 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, Indiana University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia powtarzalną i niezawodną metodę wywoływania tętniaków tętnicy brzusznej (TTB) u myszy C57BL/6 przy użyciu uczulenia elastyny i przynaczynowego stosowania elastazy, jako model TTB, który obejmuje komponent uczulenia immunologicznego.

Streszczenie

Degradacja matrycy laminarnej sprężystej w ścianie tętniaka tętnicy brzusznej jest cechą histopatologiczną tętniaków tętnicy brzusznej (TTB). Rosnące dowody implikują degradację elastyny i powiązane reakcje odpornościowe gospodarza w patogenezie TTB. Skuteczne modelowanie tych procesów jest ważne dla poprawy rozumienia i leczenia tej powszechnej choroby. Podczas gdy poprzednie modele TTB stosowały techniki zakłócające elastynę do indukcji tętniaków, pojedyncze użycie elastazy w wielu z tych modeli nie uwzględnia trwającej reakcji odpornościowej przeciwko elastynie i jej produktom degradacji (PED). Aby zamodelować tę trwającą reakcję odpornościową, opracowałeśśmy model, który uczulał myszy C57BL/6 na PED poprzez podanie podskórne PED 7 dni przed zabiegiem indukcji tętniaka. Zabieg indukcji tętniaka przebiega z ekspozycją tętnicy brzusznej i nałożeniem miejscowego elastazy w przestrzeni okołoaortalnej, w celu ekspozycji elastyny i PED na tętnicy myszy. Przy tych eksponowanych mojetach, zwierzę powinno wywołać reakcję odpornościową przeciwko tym antygenom, na które zostało wcześniej uczulone. Powtórzone “boosterowe” wstrzyknięcie PED 7 dni później służy propagacji tej reakcji odpornościowej. W niniejszym opracowaniu opisano protokół niezawodnego tworzenia TTB u myszy C57BL/6 poprzez wielokrotne uczulenia na PED, poprzedzone zabiegiem indukcji TTB z miejscowym stosowaniem elastazy. Ten model można stworzyć szybko i po umiarkowanych kosztach, indukując jednocześnie >30% rozszerzenie aorty u 82% myszy według pomiaru wideo i 73% według pomiaru ultradźwiękowego, oraz >50% rozszerzenie u 64% według pomiaru wideo i 27% według pomiaru ultradźwiękowego, zmierzonego w 21. dniu po zabiegu indukcji. Ta technika wiąże się również z 95% wskaźnikiem przeżycia w trakcie zabiegu.

Wprowadzenie

Tętniak tętnicy brzusznej (AAA) dotyczy >35 milionów ludzi na całym świecie i 4–8% mężczyzn w wieku 65-801,2. Pęknięcie, najbardziej niszczycielska komplikacja AAA, zazwyczaj występuje, gdy naprężenie mechaniczne ściany tętniaka przekracza wytrzymałość tkanki aorty, prowadząc do masywnego krwotoku i ogólnej śmiertelności wynoszącej 80−90%3,4. Obecne leczenie ma na celu zapobieganie, z wykorzystaniem badań ultrasonograficznych osób z wysokim ryzykiem i naprawa chirurgiczna, gdy ryzyko pęknięcia przekracza ryzyko naprawy, zazwyczaj przy 5.5 cm średnicy5. Jednak większość AAA jest beobjawowa, a wiele jest diagnozowanych przypadkowo6. W związku z tym, należy podjąć wysiłki w celu zidentyfikowania pacjentów z wysokim ryzykiem i opracowania niechirurgicznych metod leczenia, aby zmniejszyć wzrost AAA, a zatem ryzyko pęknięcia.

Aby opracować leczenie medyczne dla AAA, patogeneza musi być lepiej zrozumiana. Obecnie stosuje się kilka modeli eksperymentalnych, w tym modele małych zwierząt wykorzystujące infuzję angiotensyny II7, ksenotransplantację8, aplikację chlorku wapnia9, oraz infuzję10 i/lub miejscowe stosowanie elastazy11. Każdy z tych modeli opiera się na innym rozumieniu patologicznej podstawy AAA i większość z nich została zmodyfikowana, ulepszona lub połączona z innymi metodami od początku.

Ważne jest, że histologia AAA pokazuje utratę normalnej blaszkowej matrycy elastynowej, co jest również obserwowane w tkankach płuc w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc12,13. Degradacja elastyny poprzez aktywność metaloproteazy macierzy pozaukładowej stanowi ważne połączenie między patogenezą AAA a paleniem, najważniejszym modyfikowalnym czynnikiem ryzyka powstawania AAA12,14. Należy zauważyć, że zmniejszona elastynowość aorty, rozerwanie włókien elastynowych i zwiększenie krążących peptydów elastynowych są obserwowane w ludzkim AAA i są związane ze zwiększoną rozciągliwością ściany AAA15,16. Dlatego stymulacja degradacji elastyny jest kluczowa w tworzeniu modelu AAA przekładalnego na praktykę. Istniejące modele AAA, które polegają na degradacji elastyny, choć skuteczne, mogą być komplikowane przez wysokie wskaźniki śmiertelności zwierząt, szczególnie w modelach, które wykorzystują kanulację aorty17, oraz niekonsekwentne tworzenie się tętniaków, szczególnie w modelach, które polegają wyłącznie na miejscowym stosowaniu elastazy18. Co więcej, wszystkie modele polegające na indukcji chirurgicznej są podatne na krzywą uczenia się operatora i różnice techniczne.

Aby rozwiązać te problemy, wykorzystujemy odpowiedź immunologiczną żywiciela do uczulania zwierząt na elastynę poprzez wstrzyknięcie produktów degradacji elastyny (EDP). Tydzień później, indukcja tętniaka odbywa się w zstandaryzowany sposób krokowy, z wykorzystaniem miejscowego stosowania elastazy wokół aorty, aby stworzyć frakcje EDP dla uczulonego organizmu, który aktywuje odpowiedź immunologiczną przeciwko nim. Następnie, "doładowanie" uczulenia na EDP, tydzień po indukcji chirurgii, zapewnia, że odpowiedź immunologiczna organizmu trwa. Powtarzające się uczulenie immunologiczne umożliwia niezawodne rozszerzenie aorty. Wykorzystujemy model AAA u myszy ze względu na niższy koszt, łatwość utrzymania, szybki rozwój choroby i spójność techniczną.

Ten model nie prowadzi niezawodnie do pęknięcia aorty i dlatego nie jest przeznaczony do badania czynników związanych z pęknięciem AAA. Jednak ten model niezawodnie powoduje postępujące rozszerzenie aorty do 21 dni po indukcji chirurgii. Jako taki, model ten jest najlepiej przystosowany do badania metod terapeutycznych, które mogą zmniejszyć lub odwrócić rozszerzenie aorty w trakcie tworzenia się tętniaka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu w Indianie (numer protokołu 24027). Wszystkie badania były prowadzone zgodnie z wytycznymi National Research Council’s Guide for the Care and Use of Laboratory Animals oraz były zgodne z wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE). Do protokołu eksperymentalnego wykorzystano samce myszy szczepu C57BL/6J typu dzikiego w wieku 12 tygodni. Zwierzęta poddano aklimatyzacji przez 7 dni przed rozpoczęciem protokołu. Operacje indukcyjne przeprowadzono 14 dni po otrzymaniu zwierząt. Komercyjną karmę dla gryzoni laboratoryjnych oraz wodę podawano ad libitum; myszy przetrzymywano w pomieszczeniach z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności, w temperaturze 21 ± 3 °C i wilgotności względnej 30−80%, przy co najmniej 10 wymianach świeżego powietrza warunkowanego na godzinę. Wszystkie czynności związane z obsługą zwierząt wykonywano w środkach ochrony osobistej, w tym w maskach ochronnych i rękawiczkach.

1. Obrazowanie ultradźwiękowe

  1. Przygotowanie myszy
    1. Umieść mysz w komorze do indukcji znieczulenia.
    2. Podawaj wziewnie izofluran w stężeniu 1,8−2% oraz tlen, aż mysz zostanie znieczulona. Upewnij się, że kanistry z gazem anestetycznym są podłączone do aparatury do znieczulenia, aby ograniczyć ekspozycję operatora na lotne środki znieczulające podczas stosowania izofluranu.
    3. Umieść mysz w pozycji grzbietowej na stole grzewczym ustawionym na 37 °C, z nosem myszy umieszczonym w masce do znieczulenia.
    4. Przytwierdź kończyny tylne do stołu za pomocą taśmy opisowej.
    5. Nałóż środek do usuwania włosów na brzuch za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i odczekaj 30 sekund.
    6. Usuń włosy z brzucha, używając gazy bawełnianej o wymiarach 5 cm x 5 cm.
    7. Nałóż podgrzany żel do badań ultrasonograficznych na brzuch myszy.
  2. Umieść głowicę ultrasonograficzną o częstotliwości 38 MHz na brzuchu i zidentyfikuj obręcz miedniczną.
  3. Zidentyfikuj aortę jako rurkowatą strukturę w linii środkowej, która jest nieściśliwa przy umiarkowanym nacisku skierowanym tylnie za pomocą głowicy ultrasonograficznej.
    UWAGA: Dolna żyła główna (IVC) będzie widoczna jako struktura światłowa po prawej stronie aorty i jest ściśliwa przy umiarkowanym nacisku skierowanym tylnie za pomocą głowicy ultrasonograficznej.
  4. Zmierz średnicę przednio-tylną aorty brzusznej tuż głową strony od miejsca jej rozwidlenia.
  5. Przesuń głowicę proksymalnie wzdłuż aorty i zidentyfikuj lewą żyłę nerkową, która przebiega przed aortą i wpada do IVC.
  6. Zmierz średnicę przednio-tylną aorty brzusznej tuż ogonową stronę od miejsca, w którym lewa żyła nerkowa przebiega przed aorty brzuszną.
  7. Przesuń głowicę proksymalnie i zidentyfikuj przeponę.
    UWAGA: Przeponę można zidentyfikować jako hiperechogeniczny pas tuż głową strony od wątroby.
  8. Zmierz średnicę przednio-tylną aorty brzusznej tuż ogonową stronę od miejsca, w którym wchodzi ona do jamy brzusznej.
  9. Umieść mysz w klatce lub w koszyku regeneracyjnym wyłożonym ręcznikami i ustawionym na stole grzewczym o temperaturze 37 °C.
  10. Monitoruj mysz aż do momentu wybudzenia z znieczulenia.

2. Wstępna sensybilizacja elastyną

  1. Przygotować produkty degradacji elastyny (EDP), używając środków ochrony osobistej, w tym rękawiczek, ochrony oczu oraz masek ochronnych.
    UWAGA: Mysia elastaza trzustkowa, elastyna, końcówki do pipet oraz probówki do mikrocentryfugi są dostarczane jako produkty sterylne. PBS jest autoklawowany w celu zapewnienia sterylności. EDP są przygotowywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    1. Przygotować zawiesinę mysiej elastazy trzustkowej w PBS o stężeniu 0,475 jednostek/mL (4,75 jednostek/mg białka).
    2. Odmierzyć 168 μL elastazy i dodać do 5 mg mysiej elastyny. Do mieszaniny dodać kolejne 200 μL 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), a następnie wymieszać za pomocą pipety.
    3. Inkubować mieszaninę elastazy i elastyny w temperaturze 37 °C przez 20 minut, stosując okresowe delikatne wytrząsanie.
    4. Do mieszaniny elastazy i elastyny dodać 632 μL zimnego 1X PBS.
    5. Dodać 1 mL kompletnego adjuwantu Freunda.
  2. Umieścić mysz w komorze do indukcji znieczulenia.
  3. Podawać wziewnie izofluran w stężeniu 1,8−2% wraz z tlenem do momentu znieczulenia myszy.
  4. Umieścić mysz w pozycji brzusznej na stole podgrzanym do 37 °C, z nosem myszy umieszczonym w masce do znieczulenia.
  5. Wstrzyknąć 50 μL EDP podskórnie w każdy bok, co daje łącznie 100 μL EDP w każdej myszy.
  6. Umieścić mysz w koszyku do wybudzania wyłożonym ręcznikami, który znajduje się na stole podgrzanym do 37 °C.
  7. Monitorować mysz do czasu pełnego wybudzenia z narkozy.

3. Przygotowanie do operacji

  1. Przygotuj narzędzia chirurgiczne.
    1. Zestaw narzędzi chirurgicznych przygotuj z 2 pęset ząbkowanych, 1 ostrej pęsety prostej, 1 ostrej pęsety kątowej, 1 igłotrzymacza, nożyczek, co najmniej 3 magnetycznych retraktorów samotrzymających, 1 zszywacza skórnego oraz 1 polipropylenowego kapsla od butelki.
    2. Bezpośrednio przed operacją do zestawu dodaj w sposób sterylny plecioną nici szwy z kwasu poliglikolowego 4-0.
    3. UWAGA: Wystarczające będą również nici szwy o rozmiarach 3-0 lub 5-0.
    4. Napełnij polipropylenowy kapselek sterylnym, ogrzanym 1X PBS.
      UWAGA: Butelka sterylnego 1X PBS jest przechowywana w ogrzewaczu w temperaturze 37 °C w celu uzupełniania.
  2. Przygotuj elastazę.
    1. Rozcieńcz 27 μL elastazy trzustkowej wieprzowej o stężeniu 5,1 mg/mL (≥4,0 jednostek/mg białka) w 73 μL 1X PBS, aby uzyskać końcową objętość 100 μL na operacje u 10 myszy (10 μL/mysz).
    2. Przygotuj stanowisko chirurgiczne.
    3. Zautoklawuj zlew z aplikatorami z bawełnianą końcówką, aplikatorami z bawełnianą końcówką o stożkowym kształcie oraz gazą 5 cm x 5 cm i umieść je obok tacek chirurgicznych przed operacją.
    4. Umieść magnetyczny stół chirurgiczny na podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C na stoliku mikroskopu. Przymocuj podkładkę grzewczą do stolika mikroskopu taśmą, ale pozostaw element magnetyczny wolny, aby umożliwić jego repozycjonowanie podczas operacji.
    5. Na podkładce grzewczej umieść wkład chłonny lub ręcznik papierowy. Złóż gazę 5 cm x 5 cm na pół i umieść ją pod maską anestezjologiczną.
    6. W pobliżu obszaru operacyjnego umieść kubek 30 mL z preparatem do usuwania włosów, kubek 30 mL z 5% powidon-jodem, tubkę z lubrykantem do oczu, taśmę chirurgiczną, niesterylną gazę 5 cm x 5 cm, niesterylne aplikatory z bawełnianą końcówką, zapakowane gaziki alkoholowe 5 cm x 5 cm, rolkę klejącej folii spożywczej oraz butelkę z atomizerem z 70% etanolem.
    7. Naciągnij do strzykawki 1 mL buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu o stężeniu 1,3 mg/mL w objętości 75 μL na mysz, co odpowiada dawce 3,25 mg/kg dla myszy o masie 30 g.
  3. Przygotuj mysz do operacji.
    1. Zważ mysz i zapisz jej masę w gramach.
    2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia.
    3. Podawaj wziewnie izofluran w stężeniu 1,8−2% oraz tlen, aż mysz zostanie znieczulona.
    4. Umieść mysz w pozycji na plecach na stole ogrzanym do 37 °C, z nosem myszy umieszczonym w masce anestezjologicznej.
    5. Wstrzyknij 75 μL buprenorfiny podskórnie.
    6. Przymocuj kończyny tylne do stołu taśmą opisową.
    7. Nałóż preparat do usuwania włosów za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką na brzuch i odczekaj 30 sekund.
    8. Usuń włosy z brzucha za pomocą bawełnianego gazika 5 cm x 5 cm.
    9. Nałóż lubrykant do oczu myszy.
    10. Nałóż powidon-jod na brzuch myszy za pomocą gazika 5 cm x 5 cm i poczekaj do wyschnięcia.
    11. Przetrzyj brzuch gazikami alkoholowymi 5 cm x 5 cm. Ponownie nałóż powidon-jod i poczekaj do wyschnięcia.
    12. Sprawdź znieczulenie, uszczypiając palec myszy i upewniając się, że nie występuje reakcja.
    13. Połóż arkusz klejącej folii spożywczej na stole chirurgicznym.
    14. Spryskaj stół chirurgiczny 70% etanolem i poczekaj do wyschnięcia.
    15. Umyj ręce i załóż sterylne rękawiczki chirurgiczne.

4. Procedura chirurgiczna (7 dni po wstępnej sensytyzacji elastyną)

  1. Odsłonięcie aorty brzusznej.
    1. Wykonać nacięcie skóry nożyczkami lub skalpelem wzdłuż linii środkowej brzucha na długości ~3 cm, zaczynając 0,5−1 cm cephalad od prącia i kończąc 0,5 cm caudad od wyrostka miecza.
    2. Chwycić skórę ząbkowaną pęsetą i delikatnie odciągnąć w górę, aby zidentyfikować linea alba, która pojawi się jako beznaczyniowa płaszczyzna między mięśniami prostymi.
    3. Za pomocą nożyczek naciąć linea alba, cały czas odciągając skórę w górę. Należy uważać, aby przeciąć wyłącznie linea alba, unikając uszkodzenia struktur wewnątrzbrzusznych.
    4. Umieścić magnetyczne rozwieracze samopodtrzymujące tak, aby jeden odciągał prawą stronę ściany brzucha, jeden lewą stronę ściany brzucha, a jeden struktury w części caudalnej nacięcia, takie jak pęcherz moczowy i pęcherzyki nasienne.
    5. Za pomocą zwilżonych aplikatorów z bawełnianym końcem odsunąć jelita od siebie i przykryć je wilgotną gazą 5 cm x 5 cm. Alternatywnie, zapakować jelita, używając zwiniętej i zwilżonej gazy 5 cm x 5 cm, po lewej stronie brzucha myszy.
      UWAGA: W zależności od anatomii myszy i rozmieszczenia rozwieraczy, jelita można odsunąć lub zapakować w przeciwnym kierunku w celu optymalizacji widoczności.
    6. Zidentyfikować żyłę główną dolną (IVC) oraz aortę brzuszną w linii środkowej od strony tylnej.
    7. Za pomocą aplikatorów z bawełnianym końcem wejść do przestrzeni zaotrzewnowej, delikatnie rozdzielając płaszczyznę tkankową pokrywającą tylne struktury naczyniowe.
      UWAGA: Nacisk skierowany tylnie na interesującą tkankę, a następnie rozsuwanie końcówek aplikatorów bawełnianych, pozwala na uzyskanie silniejszej trakcji. Aby uzyskać łagodniejszą trakcję, należy obracać końcówki aplikatorów bawełnianych w przeciwnych kierunkach.
    8. Umieścić rozwieracze boczne głębiej, aby uzyskać lepszą trakcję i widoczność aorty.
    9. Kontynuować delikatne rozdzielanie IVC i podnerkowej aorty brzusznej za pomocą aplikatorów z bawełnianym końcem, unikając uwalniania bocznych przyczepów aorty na tym etapie.
    10. Kontynuować wypracowywanie płaszczyzny między IVC a aortą, aż między aortą a IVC pojawi się przestrzeń trójkątna (Rysunek 1).
      UWAGA: Ten krok jest zazwyczaj najłatwiejszy do wykonania tuż caudad od lewej żyły nerkowej.
    11. Za pomocą tępej dyssekcji lub ostrej pęsety uwolnić boczne przyczepy aorty, odciągając aortę od tkanki łącznej i mięśni lędźwiowych po lewej stronie myszy.
    12. Umieścić zakrzywioną ostrą pęsetę w przestrzeni wypracowanej między aortą a IVC i delikatnie otwierać oraz zamykać pęsetę w powtarzalny sposób, aby otworzyć tylne przyczepy aorty.
    13. Stosując tę samą technikę otwierania i zamykania, wypracować płaszczyznę tylną wzdłuż aorty, przesuwając się od strony cephalad do caudal.
    14. Wykonać obraz mikrometryczny wideo całej aorty i zapisać go do analizy.
  2. Aplikacja perivaskularnej elastazy.
    1. Za pomocą pipety nanieść 10 μL roztworu elastazy wzdłuż całej długości odsłoniętej aorty.
      UWAGA: Poprzez zdyssekowanie tkanek jedynie przyśrodkowo i bocznie względem aorty, powstanie rynienka, w której zgromadzi się elastaza.
    2. Położyć zwilżone gaziki 5 cm x 5 cm na otwartym brzuchu i inkubować roztwór elastazy przez 10 minut.
    3. Zdjąć gaziki i trzykrotnie przepłukać jamę brzuchną sterylnym 1X PBS, aby usunąć resztki roztworu elastazy.
  3. Zamknięcie jamy brzusznej.
    1. Przywrócić narządy brzuszne na ich pierwotne pozycje. Sprawdzić i usunąć wszelkie skręcenia lub załamania jelit.
    2. Za pomocą ząbkowanej pęsety oddzielić mięsień prosty i powięź od skóry, tworząc płatek skórny o szerokości 0,25 cm.
    3. Zamknąć powięź brzuszną, używając szyć z plecionego kwasu poliglikolowego (lub podobnych) 4-0, wykonując prosty szew ciągły, dbając o objęcie narożników nacięcia i zachowując odstępy nie większe niż 2 mm między punktami szwu.
    4. Zatrzasnąć skórę za pomocą 3−4 zszywek.

5. Opieka pooperacyjna

  1. Zdjąć mysz ze stołu operacyjnego i umieścić ją w koszyku rekonwalescencyjnym wyłożonym ręcznikami, ustawionym na podgrzewanej platformie o temperaturze 37 °C.
  2. Monitorować mysz aż do momentu wybudzenia z narkozy.
  3. Monitorować stan myszy codziennie po operacji przez 4 dni, oceniając ogólną kondycję zdrowotną oraz stan nacięcia brzusznego.
  4. Po operacji wykonać ponowne badanie USG zgodnie z powyższym opisem, aby monitorować wzrost tętniaka.
  5. Usunąć zszywki tydzień po operacji lub podczas badania USG w pierwszym tygodniu.

6. Powtórzenie sensybilizacji elastyną (7 dni po operacji indukowania tętniaka)

  1. Wykonać te same kroki, które opisano powyżej dla początkowej sensybilizacji elastyną, przygotowując roztwór EDP w ten sam sposób, z jedną zamianą: zamiast kompletnego adjuwantu Freund’a należy zastosować niekompletny adjuwant Freund’a.

7. Procedury pobierania tkanek

  1. Pobierz tkanki w 21. dniu po operacji w celu przeprowadzenia różnorodnych analiz.
  2. Przygotuj mysz w taki sam sposób, jak podczas operacji indukcyjnej.
  3. Ponownie odsłoń aortę w ten sam sposób, w jaki zrobiono to podczas operacji indukcyjnej, dbając o to, aby nie uszkodzić próbek przeznaczonych do analiz histologicznych.
    UWAGA: Na tym etapie u myszy mogło dojść do powstania blizn zrostowych, dlatego może być koniejne częstsze stosowanie ostrej dyssekcji pęsetą zamiast dyssekcji tępej.
  4. Wykonaj obrazy mikrometryczne wideo.
  5. Wykonaj punkcję serca w celu pobrania krwi do analizy i uśmierć mysz.
  6. Przeprowadź perfuzję myszy do analizy, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawiczki, ochronę oczu i maski ochronne.
    1. Jeśli tkanki są przeznaczone do analizy cytometrii przepływowej (lub podobnej), przeprowadź perfuzję lewej komory 1X PBS bez rozszerzacza naczyniowego przy ciśnieniu 100−120 mm Hg, podając objętość 8 mL.
    2. Jeśli tkanki są przeznaczone do analiz PCR, przeprowadź perfuzję lewej komory 1X PBS z rozszerzaczem naczyniowym (0,1 mM adenozyny i 0,01 mM nitroprusyku sodu), a następnie podaj roztwór do stabilizacji RNA.
    3. Jeśli tkanki są przeznaczone do analiz histologicznych, przeprowadź perfuzję lewej komory 1X PBS z rozszerzaczem naczyniowym, a następnie 10% buforowanym fosforanem formaliną.
  7. Pobierz wymagane tkanki, dbając o to, aby nie uszkodzić strukturalnie tkanek przeznaczonych do analizy histologicznej. Oznacz orientację za pomocą szwów lub markerów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Łącznie 28 samców myszy C57BL/6J poddano temu protokołowi chirurgicznemu, przy czym odnotowano jeden zgon okołooperacyjny w wyniku uszkodzenia IVC (3,6%). Wystąpiły trzy dodatkowe zgony odroczone, z czego jeden był spowodowany przepukliną przybliznowatą, a dwa pozostałe z przyczyn nieznanych, co dało całkowity przeżywalność w ciągu 21 dni na poziomie 85,7%. Średni czas od indukcji znieczulenia do zakończenia podawania środka znieczulającego wynosił 46,4 ± 8,0 minuty. Myszy w grupie operacji pozorowanej (sham) przeszły ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Od czasu pierwszego opisania go u szczurów w 1990 roku, model AAA oparty na elastazie został zmodyfikowany kilkakrotnie i zastosowany u różnych zwierząt10,19,20,21,22,23. Niektóre z modyfikacji obejmują kanulację aorty, która prawdopodobnie zwiększa śmiertelność i wprowadza traumatyczny element do patologii aorty

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy niezgłaszają żadnych praw własnościowych ani komercyjnych interesów w żadnym produkcie wymienionym ani koncepcji omówionej w tym artykule.

Podziękowania

To dzieło było wspierane przez Cryptic Masons Medical Research Foundation (Brownsburg, IN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL Tuberculin SyringesBecton Dickinson309628
10% Buffered Formalin PhosphateFisher ChemicalSF100-4
70% Isopropyl Alcohol SwabsCardinal HealthS-16183
Angled sharp forcepsDumontI I25 I-35
AutoClip 9mm (Skin stapler)MikRon427630
BetadineAtlantis Consumer Healthcare67618-155-16
Cotton gauze padDynarex Corporation3223
Cotton tipped applicatorPuritan Medical Products25-806 2WC
Elastase from porcine pancreas (≥4.0 units/mg protein)Sigma-AldrichE1250Stored in aqueous solution at 4 °C
Elastase from mouse pancreas (4.75 units/mg protein)Elastin Products Co., Inc.MS838Stored in aqueous solution (0.1 mg in 1 mL PBS)at 4 °C
ElastinMP Biomedicals101636Stored in aqueous solution at 4 °C
Enersight Desktop SoftwareLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/enersight/
Ethiqa XR (extended release buprenorphine)FidelisNDC 86084-100-30
Eye lubricantOptixCareOpx-4242
Flexacam i5 (Stereo)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-cameras/p/12730536-leica/
Freund’s complete adjuvantMP Biomedicals642851Stored in aqueous solution at 4 °C
Freund’s incomplete adjuvantMP Biomedicals642861Stored in aqueous solution at 4 °C
Gloves (Sterile)Encore7824PF
Hypodermic Needles (23 G)Becton Dickinson305145
Hypodermic Needles (27 G)Becton Dickinson305109
Isospire (Isoflurane)Dechra Veterinary07-894-8943
Labeling TapeFisher Scientific15959
MasksDukal Corp.1540
Needle driverScanlan6006-36
Omnicon F/air Anesthetic Gas CanisterA.M. Bickford Inc.80120
Press'N SealGlad12587704417
RC2 Rodent Circuit ControllerVetEquip Incorporated922100
RNAlater Stabilization solutionThermoFisher ScientificAM7021
ScissorsFine Science Tools14005-12
Skin staples (clips)MikRon205016
Small Rodent Warmer HeaterStoelting53851
Small Rodent Warmer StageStoelting53812
Stereo Microscope M60Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m80/
Straight sharp forcepsDumontI I 25 I-30
SurgiSuite self-retaining magnetic retractor set and stageKent Scientific13-005-180
Tahoe Portable Oxygen ConcentratorVetland Medical595-2300A
Toothed forcepsFine Science Tools11043-08, 11042-08
Vevo 2100 UltrasoundFUJIFILM VisualsonicsEDU00496
Visorb polyglycolic acid sutureCP Medical397A
VWR AbsorbentsVWR95057-860

Bibliografia

  1. Song P, He Y, Adeloye D, Zhu Y, Ye X, Yi Q, et al. The Global and Regional Prevalence of Abdominal Aortic Aneurysms: A Systematic Review and Modeling Analysis. Ann Surg. 2023;277(6):912-9.
  2. Kent KC. Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms. N Engl J Med. 2014;371(22):2101-8.
  3. Macura KJ, Corl FM, Fishman EK, Bluemke DA. Pathogenesis in acute aortic syndromes: aortic aneurysm leak and rupture and traumatic aortic transection. AJR Am J Roentgenol. 2003;181(2):303-7.
  4. Hoornweg LL, Storm-Versloot MN, Ubbink DT, Koelemay MJ, Legemate DA, Balm R. Meta analysis on mortality of ruptured abdominal aortic aneurysms. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2008;35(5):558-70.
  5. Beckman JA, Isselbacher EM, Preventza O, Hamilton Black Iii J, Augoustides JG, Beck AW, et al. 2022 ACC/AHA Guideline for the Diagnosis and Management of Aortic Disease: A Report of the American Heart Association/American College of Cardiology Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. J Am Coll Cardiol. 2022;80(24):e223-e393.
  6. Claridge R, Arnold S, Morrison N, van Rij AM. Measuring abdominal aortic diameters in routine abdominal computed tomography scans and implications for abdominal aortic aneurysm screening. J Vasc Surg. 2017;65(6):1637-42.
  7. Senemaud J, Caligiuri G, Etienne H, Delbosc S, Michel JB, Coscas R. Translational Relevance and Recent Advances of Animal Models of Abdominal Aortic Aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2017;37(3):401-10.
  8. Allaire E, Guettier C, Bruneval P, Plissonnier D, Michel JB. Cell-free arterial grafts: morphologic characteristics of aortic isografts, allografts, and xenografts in rats. J Vasc Surg. 1994;19(3):446-56.
  9. Wang Y, Krishna S, Golledge J. The calcium chloride-induced rodent model of abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis. 2013;226(1):29-39.
  10. Anidjar S, Salzmann JL, Gentric D, Lagneau P, Camilleri JP, Michel JB. Elastase-induced experimental aneurysms in rats. Circulation. 1990;82(3):973-81.
  11. Nabseth DC, Martin DE, Rowe MI, Gotlieb LS, Deterling RA, Jr. Enzymatic destruction of aortic elastic tissue and possible relationship to experimental atherosclerosis. J Cardiovasc Surg (Torino). 1963;4:11-7.
  12. Norman PE, Curci JA. Understanding the effects of tobacco smoke on the pathogenesis of aortic aneurysm. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013;33(7):1473-7.
  13. Snider GL. Distinguishing among asthma, chronic bronchitis, and emphysema. Chest. 1985;87(1 Suppl):35S-9S.
  14. Aune D, Schlesinger S, Norat T, Riboli E. Tobacco smoking and the risk of abdominal aortic aneurysm: a systematic review and meta-analysis of prospective studies. Sci Rep. 2018;8(1):14786.
  15. Campa JS, Greenhalgh RM, Powell JT. Elastin degradation in abdominal aortic aneurysms. Atherosclerosis. 1987;65(1-2):13-21.
  16. Wilson KA, Lindholt JS, Hoskins PR, Heickendorff L, Vammen S, Bradbury AW. The relationship between abdominal aortic aneurysm distensibility and serum markers of elastin and collagen metabolism. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2001;21(2):175-8.
  17. Hu G, Dong Z, Fu W. A Novel Modification of the Murine Elastase Infusion Model of Abdominal Aortic Aneurysm Formation. Ann Vasc Surg. 2017;42:246-53.
  18. Lu G, Su G, Davis JP, Schaheen B, Downs E, Roy RJ, et al. A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model. J Vasc Surg. 2017;66(1):232-42 e4.
  19. Xue C, Zhao G, Zhao Y, Chen YE, Zhang J. Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model Induced by Perivascular Application of Elastase. J Vis Exp. 2022(180).
  20. Nie M, Yan Y, Li X, Feng T, Zhao X, Zhang M, et al. Effect of Low-Pressurized Perfusion with Different Concentration of Elastase on the Aneurysm Formation Rate in the Abdominal Aortic Aneurysm Model in Rabbits. Biomed Res Int. 2016;2016:6875731.
  21. Bi Y, Zhong H, Xu K, Zhang Z, Qi X, Xia Y, et al. Development of a novel rabbit model of abdominal aortic aneurysm via a combination of periaortic calcium chloride and elastase incubation. PLoS One. 2013;8(7):e68476.
  22. Shannon AH, Cullen JM, Dahl JJ, Scott EJ, Tyerman Z, Spinosa MD, et al. Porcine Model of Infrarenal Abdominal Aortic Aneurysm. J Vis Exp. 2019(153).
  23. Cullen JM, Lu G, Shannon AH, Su G, Sharma A, Salmon M, et al. A novel swine model of abdominal aortic aneurysm. J Vasc Surg. 2019;70(1):252-60 e2.
  24. Ingram MD, Leckie K, King JR, Doiron T, Moldovan L, Zhang L, et al. An Elastin Sensitized Murine Model of Abdominal Aortic Aneurysm. JVS-Vascular Science. 2021;2:285.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

BiologiaWydanie 232Wydanie 232Warto pustaWydaniedegradacja elastynymodel zwierz cymyszyindukowany chemicznieindukowany immunologicznie
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły