Wiarygodne stworzenie modelu tętniaka tętnicy brzusznej u myszy przy użyciu uczulenia na elastynę i peryvaskularnej elastazy

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia powtarzalną i niezawodną metodę wywoływania tętniaków tętnicy brzusznej (TTB) u myszy C57BL/6 przy użyciu uczulenia elastyny i przynaczynowego stosowania elastazy, jako model TTB, który obejmuje komponent uczulenia immunologicznego.

Streszczenie

Degradacja matrycy laminarnej sprężystej w ścianie tętniaka tętnicy brzusznej jest cechą histopatologiczną tętniaków tętnicy brzusznej (TTB). Rosnące dowody implikują degradację elastyny i powiązane reakcje odpornościowe gospodarza w patogenezie TTB. Skuteczne modelowanie tych procesów jest ważne dla poprawy rozumienia i leczenia tej powszechnej choroby. Podczas gdy poprzednie modele TTB stosowały techniki zakłócające elastynę do indukcji tętniaków, pojedyncze użycie elastazy w wielu z tych modeli nie uwzględnia trwającej reakcji odpornościowej przeciwko elastynie i jej produktom degradacji (PED). Aby zamodelować tę trwającą reakcję odpornościową, opracowałeśśmy model, który uczulał myszy C57BL/6 na PED poprzez podanie podskórne PED 7 dni przed zabiegiem indukcji tętniaka. Zabieg indukcji tętniaka przebiega z ekspozycją tętnicy brzusznej i nałożeniem miejscowego elastazy w przestrzeni okołoaortalnej, w celu ekspozycji elastyny i PED na tętnicy myszy. Przy tych eksponowanych mojetach, zwierzę powinno wywołać reakcję odpornościową przeciwko tym antygenom, na które zostało wcześniej uczulone. Powtórzone “boosterowe” wstrzyknięcie PED 7 dni później służy propagacji tej reakcji odpornościowej. W niniejszym opracowaniu opisano protokół niezawodnego tworzenia TTB u myszy C57BL/6 poprzez wielokrotne uczulenia na PED, poprzedzone zabiegiem indukcji TTB z miejscowym stosowaniem elastazy. Ten model można stworzyć szybko i po umiarkowanych kosztach, indukując jednocześnie >30% rozszerzenie aorty u 82% myszy według pomiaru wideo i 73% według pomiaru ultradźwiękowego, oraz >50% rozszerzenie u 64% według pomiaru wideo i 27% według pomiaru ultradźwiękowego, zmierzonego w 21. dniu po zabiegu indukcji. Ta technika wiąże się również z 95% wskaźnikiem przeżycia w trakcie zabiegu.

Wprowadzenie

Tętniak tętnicy brzusznej (AAA) dotyczy >35 milionów ludzi na całym świecie i 4–8% mężczyzn w wieku 65-80^1,2. Pęknięcie, najbardziej niszczycielska komplikacja AAA, zazwyczaj występuje, gdy naprężenie mechaniczne ściany tętniaka przekracza wytrzymałość tkanki aorty, prowadząc do masywnego krwotoku i ogólnej śmiertelności wynoszącej 80−90%^3,4. Obecne leczenie ma na celu zapobieganie, z wykorzystaniem badań ultrasonograficznych osób z wysokim ryzykiem i naprawa chirurgiczna, gdy ryzyko pęknięcia przekracza ryzyko naprawy, zazwyczaj przy 5.5 cm średnicy⁵. Jednak większość AAA jest beobjawowa, a wiele jest diagnozowanych przypadkowo⁶. W związku z tym, należy podjąć wysiłki w celu zidentyfikowania pacjentów z wysokim ryzykiem i opracowania niechirurgicznych metod leczenia, aby zmniejszyć wzrost AAA, a zatem ryzyko pęknięcia.

Aby opracować leczenie medyczne dla AAA, patogeneza musi być lepiej zrozumiana. Obecnie stosuje się kilka modeli eksperymentalnych, w tym modele małych zwierząt wykorzystujące infuzję angiotensyny II⁷, ksenotransplantację⁸, aplikację chlorku wapnia⁹, oraz infuzję¹⁰ i/lub miejscowe stosowanie elastazy¹¹. Każdy z tych modeli opiera się na innym rozumieniu patologicznej podstawy AAA i większość z nich została zmodyfikowana, ulepszona lub połączona z innymi metodami od początku.

Ważne jest, że histologia AAA pokazuje utratę normalnej blaszkowej matrycy elastynowej, co jest również obserwowane w tkankach płuc w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc^12,13. Degradacja elastyny poprzez aktywność metaloproteazy macierzy pozaukładowej stanowi ważne połączenie między patogenezą AAA a paleniem, najważniejszym modyfikowalnym czynnikiem ryzyka powstawania AAA^12,14. Należy zauważyć, że zmniejszona elastynowość aorty, rozerwanie włókien elastynowych i zwiększenie krążących peptydów elastynowych są obserwowane w ludzkim AAA i są związane ze zwiększoną rozciągliwością ściany AAA^15,16. Dlatego stymulacja degradacji elastyny jest kluczowa w tworzeniu modelu AAA przekładalnego na praktykę. Istniejące modele AAA, które polegają na degradacji elastyny, choć skuteczne, mogą być komplikowane przez wysokie wskaźniki śmiertelności zwierząt, szczególnie w modelach, które wykorzystują kanulację aorty¹⁷, oraz niekonsekwentne tworzenie się tętniaków, szczególnie w modelach, które polegają wyłącznie na miejscowym stosowaniu elastazy¹⁸. Co więcej, wszystkie modele polegające na indukcji chirurgicznej są podatne na krzywą uczenia się operatora i różnice techniczne.

Aby rozwiązać te problemy, wykorzystujemy odpowiedź immunologiczną żywiciela do uczulania zwierząt na elastynę poprzez wstrzyknięcie produktów degradacji elastyny (EDP). Tydzień później, indukcja tętniaka odbywa się w zstandaryzowany sposób krokowy, z wykorzystaniem miejscowego stosowania elastazy wokół aorty, aby stworzyć frakcje EDP dla uczulonego organizmu, który aktywuje odpowiedź immunologiczną przeciwko nim. Następnie, "doładowanie" uczulenia na EDP, tydzień po indukcji chirurgii, zapewnia, że odpowiedź immunologiczna organizmu trwa. Powtarzające się uczulenie immunologiczne umożliwia niezawodne rozszerzenie aorty. Wykorzystujemy model AAA u myszy ze względu na niższy koszt, łatwość utrzymania, szybki rozwój choroby i spójność techniczną.

Ten model nie prowadzi niezawodnie do pęknięcia aorty i dlatego nie jest przeznaczony do badania czynników związanych z pęknięciem AAA. Jednak ten model niezawodnie powoduje postępujące rozszerzenie aorty do 21 dni po indukcji chirurgii. Jako taki, model ten jest najlepiej przystosowany do badania metod terapeutycznych, które mogą zmniejszyć lub odwrócić rozszerzenie aorty w trakcie tworzenia się tętniaka.

Protokół

1. Obrazowanie ultrasonograficzne

1. Przygotuj mysz
   1. Umieść mysz w komorze indukcji znieczulenia.
   2. Podawaj znieczulenie wdechowe izofluranem w stężeniu 1,8−2% i tlen, aż mysz zostanie znieczuliona. Upewnij się, że butle z gazem anestetycznym są podłączone do urządzenia do znieczulenia, aby zmniejszyć narażenie operatora na lotny środek znieczulający podczas stosowania izofluranu.
   3. Umieść mysz w pozycji na plecach na podłokietniku podgrzanym do 37 °C z nosem myszy umieszczonym w rurce znieczulającej.
   4. Przymocuj tylne kończyny do podłokietnika za pomocą taśmy z etykietą.
   5. Nalotuj środek do usuwania włosów za pomocą wacika na brzuch i poczekaj 30 sekund.
   6. Usuń włosy brzuszne za pomocą 5 cm x 5 cm wacika gazowego.
   7. Nalotuj podgrzane żel do przesyłania ultradźwięków na brzuch myszy.
2. Umieść 38 MHz sondę ultrasonograficzną na brzuchu i zidentyfikuj miednicę.
3. Zidentyfikuj aortę jako strukturę śródliniową w kształcie rury, która jest nieściśliwa pod umiarkowanym ciśnieniem skierowanym do tyłu, wywieranym przez sondę ultrasonograficzną.
   UWAGA: Żyła główna dolna (IVC) będzie wyglądać jak struktura świetlna po prawej stronie myszy od aorty i jest ściśliwa pod umiarkowanym ciśnieniem skierowanym do tyłu, wywieranym przez sondę ultrasonograficzną.
4. Zmierzyć przedniolityczny średnicę brzusznej aorty tuż powyżej punktu rozdwojenia.
5. Przesuń sondę wzdłuż aorty w kierunku proksymalnym i zidentyfikuj lewą żyłę nerkową przecinającą przed aortą i wchodzącą do IVC.
6. Zmierzyć przedniolityniczny średnicę brzusznej aorty tuż poniżej punktu, w którym lewa żyła nerkowa przecina przedniolitynio aortę brzuszną.
7. Przesuń sondę w kierunku proksymalnym i zidentyfikuj przeponę.
   UWAGA: Przeponę można zidentyfikować jako hiperechogeniczny pasek tuż powyżej wątroby.
8. Zmierzyć przedniolityniczny średnicę brzusznej aorty tuż poniżej punktu, w którym wchodzi ona do jamy brzusznej.
9. Umieść mysz w klatce lub w koszyku do regeneracji, który jest wyłożony ręcznikami i umieszczony na podłokietniku podgrzanym do 37 °C.
10. Monitoruj mysz do momentu wyjścia z znieczulenia.

2. Wstępna wrażliwość na elastynę

1. Przygotuj produkty rozpadu elastyny (EDP) przy użyciu sprzętu ochronnego, w tym rękawic, ochrony oczu i masek na twarz.
   1. Uzyskaj preparat elastazy trzustkowej myszy w zawiesinie PBS o stężeniu 0,475 jednostek/ml (4,75 jednostki/mg białka).
   2. Weź 168 µL elastaz i dodaj ją do 5 mg elastyny myszej. Dodaj kolejne 200 µL 1X buforu fosforanowego (PBS) do tej mieszanki, a następnie pipetuję, aby wymieszać.
   3. Inkubauj mieszankę elastaz i elastyny w 37 °C przez 20 minut z okresowym delikatnym wstrząsaniem.
   4. Dodaj 632 µL zimnego 1X PBS do mieszanki elastaz i elastyny.
   5. Dodaj 1 ml pełnego adjuvantu Freunda.
2. Umieść mysz w komorze indukcji znieczulenia.
3. Podawaj znieczulenie wdechowe izofluranem w stężeniu 1,8−2% i tlen, aż mysz zostanie znieczuliona.
4. Umieść mysz w pozycji brzusznej na podłokietniku podgrzanym do 37 °C z nosem myszy umieszczonym w rurce znieczulającej.
5. Wstrzyknij 50 µL EDP podskórnie na każdą flankę, łącznie 100 µL EDP na każdą mysz.
6. Umieść mysz w koszyku do regeneracji, który jest wyłożony ręcznikami i umieszczony na podłokietniku podgrzanym do 37 °C.
7. Monitoruj mysz do momentu wyjścia z znieczulenia.

3. Przygotowanie do zabiegu

1. Przygotuj narzędzia chirurgiczne.
   1. Zbierz zestaw chirurgiczny z 2 szczypcami zębatymi, 1 ostrymi szczypcami prostymi, 1 ostrymi szczypcami kątowymi, 1 uchwytem do igieł, nożycami, co najmniej 3 samozaciskującymi się magnesowymi retraktorami, 1 zszywaczem do skóry i 1 kołkiem z polipropylenowej nakrętki.
   2. Dodaj 4-0 szydełkową szufladkę z kwasem poliglykolowym do zestawu w sterylny sposób bezpośrednio przed operacją.
   3. UWAGA: Rozmiary szwów 3-0 lub 5-0 również wystarczą.
   4. Wypełnij polipropylenowy korek butelkowy sterylnym, podgrzanym 1X PBS.
      UWAGA: Butelka ze sterylnym 1X PBS jest przechowywana w podgrzewaczach do 37 °C w celu uzupełniania.
2. Przygotuj elastazę.
   1. R

Wyniki

Łącznie 28 samców myszy C57BL/6J przeszło ten protokół chirurgiczny, z jedną śmiercią okołooperacyjną z powodu uszkodzenia żyły głównej dolnej (3,6%). Były też trzy opóźnione zgony, jeden z nich spowodowany był przepukliną pooperacyjną, a dwa pozostałe z nieznanych przyczyn, co dało 21-dniową przeżywalność 85,7%. Średni czas od rozpoczęcia znieczulenia do zakończenia podawania znieczulenia wynosił 46,4 ± 8,0 minut. Myszy, u których przeprowadzono zabieg szamowy, przeszły prawie identyczny protokół co grupa z tętniakami, ...

Dyskusja

Od czasu pierwszego opisania go u szczurów w 1990 roku, model AAA oparty na elastazie został zmodyfikowany kilkakrotnie i zastosowany u różnych zwierząt^{10,19,20,21,22,23}. Niektóre z modyfikacji obejmują kanulację aorty, która prawdopodobnie zwiększa śmiertelność i wprowadza traumatyczny element do patologii aorty

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 mL Tuberculin Syringes	Becton Dickinson	309628
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Chemical	SF100-4
70% Isopropyl Alcohol Swabs	Cardinal Health	S-16183
Angled sharp forceps	Dumont	I I25 I-35
AutoClip 9mm (Skin stapler)	MikRon	427630
Betadine	Atlantis Consumer Healthcare	67618-155-16
Cotton gauze pad	Dynarex Corporation	3223
Cotton tipped applicator	Puritan Medical Products	25-806 2WC
Elastase from porcine pancreas (≥4.0 units/mg protein)	Sigma-Aldrich	E1250	Stored in aqueous solution at 4 °C
Elastase from mouse pancreas (4.75 units/mg protein)	Elastin Products Co., Inc.	MS838	Stored in aqueous solution (0.1 mg in 1 mL PBS)at 4 °C
Elastin	MP Biomedicals	101636	Stored in aqueous solution at 4 °C
Enersight Desktop Software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/enersight/
Ethiqa XR (extended release buprenorphine)	Fidelis	NDC 86084-100-30
Eye lubricant	OptixCare	Opx-4242
Flexacam i5 (Stereo)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-cameras/p/12730536-leica/
Freund’s complete adjuvant	MP Biomedicals	642851	Stored in aqueous solution at 4 °C
Freund’s incomplete adjuvant	MP Biomedicals	642861	Stored in aqueous solution at 4 °C
Gloves (Sterile)	Encore	7824PF
Hypodermic Needles (23 G)	Becton Dickinson	305145
Hypodermic Needles (27 G)	Becton Dickinson	305109
Isospire (Isoflurane)	Dechra Veterinary	07-894-8943
Labeling Tape	Fisher Scientific	15959
Masks	Dukal Corp.	1540
Needle driver	Scanlan	6006-36
Omnicon F/air Anesthetic Gas Canister	A.M. Bickford Inc.	80120
Press'N Seal	Glad	12587704417
RC2 Rodent Circuit Controller	VetEquip Incorporated	922100
RNAlater Stabilization solution	ThermoFisher Scientific	AM7021
Scissors	Fine Science Tools	14005-12
Skin staples (clips)	MikRon	205016
Small Rodent Warmer Heater	Stoelting	53851
Small Rodent Warmer Stage	Stoelting	53812
Stereo Microscope M60	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m80/
Straight sharp forceps	Dumont	I I 25 I-30
SurgiSuite self-retaining magnetic retractor set and stage	Kent Scientific	13-005-180
Tahoe Portable Oxygen Concentrator	Vetland Medical	595-2300A
Toothed forceps	Fine Science Tools	11043-08, 11042-08
Vevo 2100 Ultrasound	FUJIFILM Visualsonics	EDU00496
Visorb polyglycolic acid suture	CP Medical	397A
VWR Absorbents	VWR	95057-860