Proste i dostępne testy wylęgania jaj w Caenorhabditis elegans: elastyczne formaty do przesiewowych badań nad lekami

Podsumowanie

Niniejsze badanie przedstawia elastyczną i standaryzowaną platformę do badania wylęgu jaj u Caenorhabditis elegans, która integruje wiele formatów eksperymentów. Podejście to poprawia reproduktywalność, skalowalność i dostępność, umożliwiając solidną ocenę działania leków i procesów rozwojowych, przy zachowaniu niskich kosztów i łatwej adaptacji zarówno do zastosowań badawczych, jak i edukacyjnych.

Streszczenie

Testy wylęgania jaj (EHA) są szeroko stosowane do oceny wpływu związków chemicznych na wczesne etapy rozwoju nicieni, szczególnie w badaniach nad lekami przeciwpasożytniczymi. Jednak istniejące metodologie znacznie różnią się pod względem formatu, złożoności i reprodukowalności oraz są często prezentowane jako stałe protokoły, a nie adaptowalne ramy eksperymentalne. W niniejszym badaniu ustanawiamy prostą, dostępną i elastyczną platformę dla testów wylęgania jaj u Caenorhabditis elegans poprzez integrację i bezpośrednie porównanie trzech konfiguracji eksperymentalnych: (i) kontrolowane inkubacje w mikroprobówkach z następującym wysiewem na płytki agarowe, (ii) bezpośrednie narażenie na płytkach agarowych zawierających lek, oraz (iii) testy w płytkach wielootworowych w cieczy. Dwa reprezentatywne związki zostały użyte do zilustrowania testu: jeden, który hamuje wylęganie się jaj i jeden, który nie ma wykrywalnego wpływu. Każda konfiguracja zapewnia wyraźne zalety pod względem kontroli eksperymentalnej, przepływu i dostępności. Podejście oparte na mikroprobówkach umożliwia precyzyjną kontrolę narażenia na leki i wspiera ilościowe analizy farmakologiczne. Testy na agarze oferują uproszczoną i nisko kosztową alternatywę, nadającą się do ciągłego narażenia i ustawień edukacyjnych. Formaty wielootworowe umożliwiają skalowalne, standaryzowane przesiewanie zgodne z nowoczesnymi procesami odkrywania leków. Poprzez bezpośrednie porównanie tych formatów, pokazujemy, jak wybory metodologiczne wpływają na reprodukowalność testów, dynamikę narażenia na leki i interpretację biologiczną, szczególnie w odniesieniu do czynników specyficznych dla etapów takich jak rola ochronna skorupki jaja i różnice rozwojowe w ekspresji celu molekularnego. Ogólnie, niniejsze prace ustanawiają testy wylęgania jaj u C. elegans jako wszechstronną i skalowalną platformę, przystosowaną do różnorodnych zastosowań, w tym przesiewania przeciwpasożytniczego, oceny toksykologicznej, badań rozwojowych i laboratoriów dydaktycznych, ułatwiając tym samym szersze i bardziej racjonalne wykorzystanie tej metodologii.

Wprowadzenie

Testy wylęgania jaj (EHA) od dawna są uznawane za filar metodologii w nematologii do oceny działania owicidalnego i wczesnych efektów rozwojowych związków chemicznych. Pierwotnie opracowane dla pasożytniczych nicieni, testy te ilustrują hamowanie embrionacji lub wylęgu larw w kontrolowanych warunkach in vitro, zapewniając solidne i biologicznie istotne punkty końcowe, takie jak odsetek wylęgu lub analizę koncentracji–odpowiedź (np. EC₅₀ lub IC₅₀)^{1,2,3,4,5,6,7}.

Klasyczne podejścia oparte na jajach u pasożytniczych nicieni takich jak Haemonchus contortus i Trichostrongylus colubriformis były szeroko stosowane do oceny skuteczności leków syntetycznych i produktów naturalnych, a także do monitorowania oporu na leki przeciw pasożytom^1,2,6,8,9,10. Te metodologie obejmują szeroką gamę pomiarów, od bezpośredniej oceny żywotności jaj i wylęgu po ocenę rozwoju larw po hodowli kału. Razem odegrały one kluczową rolę w powiązaniu ekspozycji na leki z wynikami rozrodczymi pasożytów i potencjalnym przenoszeniem. Jednakże, te podejścia często wymagają złożonej przygotki próbek od zakażonych gospodarzy, dłuższego okresu inkubacji i specjalistycznej infrastruktury, co może ograniczać ich dostępność, skalowalność i powtarzalność między laboratoriami.

Zastosowanie Caenorhabditis elegans jako organizmu modelowego stało się potężną strategią w celu przezwyciężenia wielu ograniczeń związanych z pasożytniczymi nicieniami. Krótki cykl życia, genetyczna łatwość manipulacji, łatwość hodowli i zachowanie kluczowych celów molekularnych wspólnych dla pasożytniczych gatunków sprawia, że jest to szczególnie odpowiednie do farmakologicznych, toksykologicznych i rozwojowych badań. Co ważne, embriogeneza w C. elegans jest szybka i bardzo powtarzalna, co pozwala na zastosowanie testów żywotności i wylęgu jaj jako ilościowych i wiarygodnych pomiarów wczesnych procesów rozwojowych i ich zakłócania przez substancje obce^{11,12,13,14,15,16,17}.

Poza tym, dostępność dobrze scharakteryzowanych szczepów mutantów umożliwiła uzyskanie mechanistycznych wglądów w działanie leków i oporność. Poprzednie badania wykazały, że oporność na związki bioaktywne może pojawić się w sposób zależny od etapu, przy czym etapy embrionalne i larwalne wykazują różne czułości. Na przykład, zmiany w przekaźnictwie glutaminianowym zostały powiązane z fenotypami oporności w larw, podczas gdy wylęg jaj pozostawał niezaburzony^14,18,19,20. Podkreśla to etapowy charakter czułości na leki i sugeruje, że etapy embrionalne mogą obejmować odrębne cele lub różne dostępności w porównaniu z późniejszymi etapami rozwoju.

Poza parazytologią, testy żywotności jaj u C. elegans stały się coraz bardziej istotne w toksykologii i wczesnym odkrywaniu leków. Testy te były stosowane nie tylko do oceny działania przeciwpasożytniczego, ale także do oceny toksyczności rozwojowej i defektów embrionalnych indukowanych lekami, z wynikami, które mogą koreluować z profilami toksyczności wyższych organizmów^15,16. Jednocześnie, obecność skorupki jaja wprowadza ważne ograniczenia biologiczne, ponieważ działa jako chroniąca i selektywnie przepuszczalna bariera otaczająca zarodek^21,22. W rezultacie, niektóre związki bioaktywne mogą nie osiągnąć zarodka mimo wykazuwania aktywności na późniejszych etapach rozwoju^14,19,23,24. Dostęp do zarodka prawdopodobnie zależy więc od fizykochemicznych właściwości każdego związku, w tym od wielkości cząsteczek i ich polarności. Może to przyczyniać się do różnic między aktywnością obserwowaną w testach wylęgu a aktywnością na późniejszych etapach rozwoju. Ta różnica podkreśla znaczenie jasnego zdefiniowania zarówno kontekstu eksperymentalnego, jak i biologicznego punktu końcowego, który jest mierzony.

Pod względem metodologicznym, testy wylęgu jaj u Caenorhabditis elegans zostały wdrożone w szerokim zakresie formatów eksperymentalnych, w tym likwidacji w płynie synchronizowanych jaj, bezpośrednim ekspozycji na płytki agar zawierające

Protokół

1. Caenorhabditis elegans szczepy i hodowla

1. Użyj szczepu dzikiego N2 (Bristol) i/lub transgenicznego szczepu PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)) do opracowania i walidacji metodologii^25,26. PD4251 ekspresuje GFP, co ułatwia wizualizację i potencjalne zastosowania w obrazowaniu, gdy jest to wymagane, podczas gdy wykazuje odpowiedzi na wykluwanie jaj i rozwój nieodróżnialne od tych obserwowanych w szczepie dzikiego N2 w warunkach eksperymentalnych stosowanych w niniejszym badaniu²⁷.
2. Uzyskaj szczepy (np. szczep dzikiego N2) z Caenorhabditis Genetic Center (CGC), wspierany przez National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
3. Utrzymuj dżdżownice w standardowych warunkach laboratoryjnych w temperaturze 18–25 °C na świeżo przygotowanych płytkach agarowych z pożywką do hodowli nematod (NGM) zasiana Escherichia coli OP50 jako źródło pokarmu. Przygotuj NGM poprzez rozpuszczenie 16 g agaru, 3 g NaCl i 2,5 g bactopeptonu w 975 mL destylowanej lub ultraczystej wody. Sterylizuj przez autoklawację. Po schłodzeniu pożywki do 55 °C dodaj sterylne roztwory buforu fosforanowego potasu (25 mL, 1 M, pH 6,0), CaCl₂ (1 mL, 1 M), MgSO₄ (1 mL, 1 M) i cholesterolu (1 mL, 5 mg/mL w czystym etanolu). Dokładnie wymieszaj i wylej płytki w warunkach sterylnych.
4. Wykonuj rutynowe manipulacje, rozmnażanie i utrzymywanie zgodnie z ustalonymi procedurami, jak opisano w WormBook i powiązanych badaniach^24,26,28,29. Utrzymuj dżdżownice w warunkach niecałkowitego głodu, zapewniając ciągłą dostępność pokarmu bakteryjnego i unikając przeludnionych płytek. Trzymaj kultury w zalecanym zakresie temperatur (18–25 °C) i unikaj zbyt suchych warunków, ponieważ mogą one przyspieszyć odwadnianie agaru.
5. Ogólne zasady przed rozpoczęciem testu
   1. Wyznacz wszystkie parametry eksperymentalne z wyprzedzeniem, w tym temperaturę (18–25 °C), czas inkubacji (4–8 h), wilgotność  (50–70%) i procedury obsługi.
   2. Przygotuj wszystkie materiały przed rozpoczęciem testu, aby zapewnić odpowiednie czasowanie i koordynację przepływu pracy.
   3. Utrzymuj jednolite warunki eksperymentalne we wszystkich repetycjach, aby zminimalizować zmienność.

2. Przygotowanie związków testowych i kontroli

1. Świeżo przygotuj wszystkie związki w dniu eksperymentu. Rozpuść zapasy w buforze M9 (22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO₄) lub w sterylnej destylowanej wodzie, w zależności od kompatybilności związku i warunków testu^30,31.
   UWAGA: Wybór wodnego medium może wpływać na aktywność związku w testach na C. elegans. Na przykład, związki takie jak serotonina mogą wykazywać różne stężenia skuteczne, jeśli są przygotowane w sterylnej destylowanej wodzie w porównaniu z buforem M9. Dlatego zarówno kompatybilność pojazdu, jak i odpowiedź biologiczna powinny być empirycznie oceniane podczas optymalizacji testu. Ponadto dla związków o niskiej rozpuszczalności wodnej, można stosować odpowiednie nośniki, takie jak dimetylosulfon (DMSO) lub etanol. Ostateczne stężenia rozpuszczalników powinny pozostać niskie (zazwyczaj poniżej 0,2% v/v), aby uniknąć toksyczności. Poprzednie badania na C. elegans wykazały, że stężenia DMSO do 0,5% wywołują minimalne efekty w standardowych warunkach laboratoryjnych¹⁷.
2. Przygotuj co najmniej pięć stężeń na związek, aby umożliwić konstrukcję krzywych stężeniowo-odpowiedziowych i oszacowanie wartości IC₅₀ lub IC₉₀ . Użyj serialnego rozcieńczenia z 2- do 3-krotnymi krokami stężeniowymi jako punktu wyjścia i dostosuj końcowy zakres stężeń zgodnie z oczekiwaną potencją, rozpuszczalnością i odpowiedzią eksperymentalną każdego związku.
   UWAGA: Jeśli testowane związki są wrażliwe na światło, wszystkie kroki przygotowawcze powinny być wykonywane w słabym oświetleniu, aby zapobiec degradacji. Obejmuje to przygotowywanie roztworów macierzystych, rozcieńczeń i płytek agarowych zawierających leki. W miarę możliwości płytki powinny być przykryte folią aluminiową i przechowywane w ciemności. Podobnie płytki wielorzędowe powinny być utrzymywane w zakryciu (np. folią lub nieprzezroczystymi pokrywkami) podczas inkubacji. Zaleca się stosowanie zamkniętych pojemników lub komór wilgotnych, które ograniczają ekspozycję na światło, aby zachować

Wyniki

TCA wykazało wyraźną zależną od stężenia inhibicję wylęgu jaj we wszystkich formatach eksperymentów, jak pokazano na Rysunku 1. Prezentowane są reprezentatywne krzywe stężenie–odpowiedzi dla każdej konfiguracji testu: probówki mikrowirówkowych (Rysunek 1A), bezpośrednie narażenie na płytkach agarowych (Rysunek 1B) i płytki wielodołkowe (Rysunek 1C).

Szacunkowe wartości IC

Dyskusja

Niniejsze badanie prezentuje prostą i elastyczną platformę do przeprowadzania testów wylęgania jaj u Caenorhabditis elegans, skonstruowaną wokół trzech uzupełniających się formatów eksperymentów, które różnią się kontrolą, dynamika ekspozycji oraz skalowalnością. Zamiast definiować jeden optymalny protokół, nasze wyniki wspierają pogląd, że testy wylęgania jaj powinny być uważane za elastyczną metodologiczną ramę przystosowaną do konkretnych celów eksperymentalnych.

Format oparty na p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bacteriological Agar	Britania	B0101406	powinno być przygotowane świeże (1.7 gr na 100 mL H2O)
Roztwór wybielacza	N/A	N/A	1.2 % (v/v) NaOH i 0.5 M NaOH
Wirówka	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
Wirówka	BiofugePICO do ependorf tube	Heraeus 75003235
Aparat cyfrowy	ToupCam	TP605100A	Przemysłowa kamera cyfrowa. Regulowana długość ogniskowa USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	MW: 78,13
Linalil Acetate	SIGMA	No.CAS: 115-95-7	powinno być przygotowane świeże
Podłoże Lysogeny broth (LB)	N/A	N/A	10 g Bacto-tryptone, 5 g wyciągu drożdżowego, 10 g NaCl na 1 L destylowanej wody
Bufor M9	N/A	N/A	3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g  NaCl, 0,25 g MgSO4 na 1 L destylowanej wody
Mini Rotator	BioSan	Bio RS-24
Podłoże do hodowli nicieni (NGM)	N/A	N/A	3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g  Bacto-Peptone na 1 L destylowanej wody. Sterylizować przez autoklawację. Uzupełnione 1 mL cholesterolu (5 mg/mL),  1 mL CaCl2 (1 M), 25 mL buforu fosforanowego potasu (1 M, pH 6.0) i 1 mL  MgSO4 (1 M)
Petri Dish (3 - 5 mm)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
Petri Dish (90 mm x 15 mm)	ExtraGene	1026160305	Tylko do użytku laboratoryjnego, Polistyren.
Pipeta	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	Wersja 12.0
Stereomikroskop	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	Trynokularny stereomikroskop (10x–40x całkowite powiększenie; oświetlenie LED przypadkowe i przepuszczające)
Sakcharoza	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (v/v) sakcharozy
Płytka do hodowli tkankowej 96-dołkowa	Biofil	TCP 012096	Polistyren, Pokrywka o niskim odparowaniu.
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
Transcinnamaldehyd (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	Powinno być przygotowane świeże