Farmakologia sieciowa i badania eksperymentalne dotyczące β-Sitosterolu w leczeniu przewlekłej obturacyjnej choroby płuc poprzez receptor glukokortykoidowy

Podsumowanie

α-sitosterol łagodziło POChP i zwiększyło skuteczność deksametazonu, przy czym receptor kortykosteroidowy pośredniczył w tym działaniu. Ponadto, α-sitosterol zmniejszał stan zapalny, stres oksydacyjny i starzenie się komórek zarówno w komórkach nabłonka oskrzeli stymulowanych CSE, jak i u myszy z POChP wywołanej dymem tytoniowym.

Streszczenie

Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) to rozpowszechnione zaburzenie układu oddechowego charakteryzujące się przetrwałą stanem zapalnym, stresem oksydacyjnym i progresywnym spadkiem czynności płuc. Potencjał terapeutyczny β-sitosterolu w POChP pozostaje niejasny. Celem tego badania było zbadanie efektów ochronnych β-sitosterolu przeciwko POChP i wyjaśnienie jego podstawowego mechanizmu. Przeszukiwanie baz danych wykryło receptor glikokortykosteroidowy (GR) jako potencjalne miejsce działania β-sitosterolu. Utworzono model POChP u myszy indukowanej dymem papierosowym oraz model komórek BEAS-2B stymulowanych ekstraktem dymu papierosowego (CSE). Oceniano czynności płuc, markery uszkodzenia płuc, stan zapalny, stres oksydacyjny i starzenie się komórek za pomocą (RT-qPCR), badań sond fluorescencyjnych DCFH-DA oraz zestawów wykrywania starzenia. Oceniano również działanie β-sitosterolu samodzielnie lub w połączeniu z deksametazonem (DEX). β-sitosterol znacząco poprawił czynności płuc, normalizował markery uszkodzenia płuc oraz łagodził stan zapalny, stres oksydacyjny i starzenie się komórek zarówno w stymulowanych CSE komórkach BEAS-2B jak i u myszy eksponowanych na dym papierosowy. Te efekty ochronne były towarzyszone przez zwiększoną ekspresję GR. Ponadto, β-sitosterol zwiększył odpowiedź na DEX, a leczenie łączone β-sitosterolem i DEX dało większe poprawy w czynnościach płuc, markerach uszkodzenia płuc, stanie zapalnym, poziomach reaktywnych form tlenu i starzeniu się komórek niż leczenie tylko DEX. Łącznie, te wyniki sugerują, że β-sitosterol łagodzi zmiany patologiczne związane z POChP, przynajmniej częściowo, poprzez wzrost ekspresji GR i poprawę skuteczności terapii DEX, podkreślając jego potencjał jako uzupełniającej strategii leczenia POChP.

Wprowadzenie

Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) to postępująca choroba układu oddechowego charakteryzująca się przetrwającym zapaleniem dróg oddechowych, uszkodzeniem pęcherzyków płucnych i nieodwracalnym ograniczeniem przepływu powietrza, które upośledza czynność oddechową i obniża jakość życia¹. Częstość występowania tej choroby znacznie wzrasta wraz z wiekiem, a ryzyko dla osób w wieku sześćdziesięciu pięciu lat i starszych jest około pięciokrotnie większe niż dla osób poniżej czterdziestki². Ten trend demograficzny wiąże się ze wzrostem zachorowalności, śmiertelności i niepełnosprawności³. Prognozy epidemiologiczne wskazują, że do 2030 roku POChP może stać się czwartą przyczyną zgonów na świecie, odpowiadając za około 5% wszystkich zgonów^4,5,6. Obecnie, zidentyfikowane czynniki ryzyka obejmują podatność genetyczną, dysplazję płuc, narażenie na cząstki kroplowe, przewlekłe zapalenie oskrzeli i infekcje dróg oddechowych⁷.

Wśród czynników ryzyka, dym tytoniowy jest najważniejszym patogennym czynnikiem POChP⁸. Zawiera on tysiące chemikaliów, które mogą powodować uszkodzenie nabłonka oskrzeli, sprzyjać infiltracji komórek zapalnych i prowadzić do przebudowy tkanki płucnej⁹. Długotrwała ekspozycja może powodować trwałe i nieodwracalne uszkodzenie nabłonka, sprzyjać uwalnianiu dużej liczby prozapalnych chemokin, znacząco zwiększać (ROS) produkcję i indukować apoptozę komórek¹⁰. Wiele badań wykazało, że zwiększone poziomy prozapalnych chemokin, takich jak interleukina‑8 (IL-8) i czynnik nekrozy nowotworu‑α (TNF‑α), wraz z nadmierną produkcją ROS i starzeniem się komórek, są ściśle związane z ciężkością POChP^11,12. Podkreśla to potrzebę środków, które mogą skutecznie i bezpiecznie modulować te kluczowe patogenne czynniki, aby wywierać działanie ochronne i terapeutyczne w POChP.

Fitosterole są naturalnymi związkami bioaktywnymi powszechnie obecnymi w błonach komórkowych roślin. Wśród nich, β-sitosterol jest najbardziej obfitym i szeroko rozpowszechnionym w bogatym w lipidy pokarmach pochodzenia roślinnego, takich jak warzywa, orzechy, nasiona i oliwa z oliwek^13,14,15,16. Badania potwierdziły, że podawanie β-sitosterolu w dawkach do 1000 mg/kg u szczurów i myszy nie wiąże się z cytotoksycznością ani genotoksycznością¹⁷. Ponadto, badania wykazały, że β-sitosterol wykazuje właściwości przeciwutleniające poprzez jego wpływ na enzymy przeciwutleniające i ludzkie receptory estrogenowe¹⁸.

β-sitosterol wykazuje szerokie spektrum działań farmakologicznych, w tym przeciwzapalne¹⁹, przeciwgorączkowe²⁰, przeciwbólowe²¹ i przeciwcukrzycowe¹³. Wykazał również potencjał terapeutyczny w różnych modelach chorobowych, takich jak zapalenie okrężnicy i jelita²², oraz posiada właściwości przeciwmiażdżycowe²³ i immunomodulujące²⁴. Ponadto, ma korzystny profil bezpieczeństwa. Biorąc pod uwagę te cechy, β-sitosterol przyciągnął znaczne zainteresowanie jako potencjalny kandydat do leku. Jednak jego dokładna rola i mechanizmy leżące u podstaw POChP pozostają w dużej mierze niejasne.

Dlatego niniejsze badanie miało na celu zbadanie potencjalnych działań terapeutycznych i mechanizmów leżących u podstaw działania β-sitosterolu w POChP. W szczególności, zastosowano model uszkodzenia komórek BEAS‑2B indukowany ekstraktem dymu papierosowego (CSE), aby ocenić, czy β-sitosterol może skutecznie złagodzić uszkodzenie komórkowe wywołane przez CSE, identyfikując tym samym nową kandydatkę do molekuły dla strategii terapeutycznych w POChP.

Protokół

Badanie przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology dotyczącymi badań eksperymentalnych i klinicznych²⁵. Wszystkie protokoły dotyczące eksperymentów na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Zwierząt Drugiego Szpitala Afiliacyjnego Zhejiang University School of Medicine (Numer zgody 20230102), a wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki ds. Zwierząt. Badanie przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE.

Wyszukiwanie kluczowych składników i celów za pomocą farmakologii sieciowej

Aktywne składniki Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. i Adenophora stricta Miq. zostały pobrane z bazy danych farmakologii systemowej medycyny tradycyjnej chińskiej (TCMSP; dostęp 12 marca 2024). Kandydatów do związków wyszukano zgodnie z następującymi kryteriami ADME: dostępność biologiczna (OB) ≥ 30%, podobieństwo do leków (DL) ≥ 0,18 i przepuszczalność Caco-2 ≥ −0,4²⁵. Związki spełniające wszystkie trzy kryteria zostały zachowane jako kandydatki na aktywne składniki do dalszej analizy.

Skomplikowana struktura linii wejściowych molekularnych (SMILES) β-sitosterolu została uzyskana z bazy danych PubChem (dostęp 18 marca 2024) i zaimportowana do SwissTargetPrediction (dostęp 21 marca 2024) w celu przewidywania celów. Homo sapiens został wybrany jako gatunki docelowe. Potencjalne cele przewidywano na podstawie podobieństwa strukturalnego 2D i 3D między β-sitosterolem a znanymi ligandami w bazie danych. Przewidywane cele z prawdopodobieństwem większym niż 0 zostały zachowane, a zduplikowane wpisy usunięto.

Geny związane z POChP zostały pobrane z bazy danych dotyczącej celów terapeutycznych (TTD; dostęp 25 marca 2024) i bazy danych porównawczej toksykogenomik (CTD; dostęp 28 marca 2024) za pomocą słowa kluczowego „chronic obstructive pulmonary disease”. Po usunięciu zduplikowanych genów geny związane z POChP zostały przecięte z przewidywanymi celami β-sitosterolu, aby zidentyfikować kandydatów do celów potencjalnie zaangażowanych w efekty terapeutyczne β-sitosterolu przeciwko POChP.

Dokowanie molekularne β-sitosterolu i GR

Trójwymiarowa struktura β-sitosterolu w formacie SDF została pobrana z bazy danych PubChem (dostęp 2 czerwca 2026), podczas gdy struktura krystaliczna receptora glikokortykoidowego (GR) została uzyskana z Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB; dostęp 3 czerwca 2026). Po standardowej przygotowce struktury ligandu i receptora przeprowadzono dokowanie molekularne za pomocą platformy online CB-Dock2 (dostęp 3 czerwca 2026). Przygotowane pliki ligandu i receptora zostały przekazane na platformę, a obliczenia dokowania przeprowadzono przy użyciu domyślnych parametrów.

Analiza wzbogacenia funkcjonalnego Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)

Wszystkie przewidywane geny docelowe β-sitosterolu poddano analizie wzbogacenia funkcjonalnego GO i analizie wzbogacenia ścieżek KEGG. Wyniki wzbogacenia, w tym znacząco wzbogacone procesy biologiczne, komponenty komórkowe, funkcje molekularne i ścieżki sygnałowe, zostały posortowanie i przechowane w Pliku uzupełniającym 1 na potrzeby dalszej analizy bioinformatycznej.

Modelowanie zwierząt i grupowanie

Liczba prób została ustalona na sześć zwierząt na grupę na podstawie poprzedniego badania, które przeprowadziło analizę mocy a priori przy użyciu oprogramowania G*Power (α = 0,05, moc = 0,80) i wykazało, że n = 6 wystarczyło do wykrycia biologicznie istotnych różnic w porównywalnych warunkach eksperymentalnych²⁶. Samce myszy C57BL/6 w wieku 6–8 tygodni (20 ± 2 g) zostały losowo przydzielone do pięciu grup: grupa kontrolna, grupa modelu POChP, grupa POChP + deksametazon (DEX), grupa POChP + β-sitosterol i grupa POChP + DEX + β-sitosterol. Myszy były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych (25 °C, 12-godzinny cykl światło/ciemność) z wolnym dostępem do standardowej karmy i wody i były pozwolone na aklimatyzację przez 1 tydzień przed eksperymentami.

Aby utworzyć model POChP, myszy umieszczono w komorze do całkowitego ekspozycji na dym papierosowy (63 cm × 55 cm × 45 cm) i eksponowano na główny dym papierosowy przez 12 tygodni. Każdy papieros zawierał 10 mg smoły, 0,9 mg nikotyny i 10 mg tlenku węgla. Ekspozycja na dym odbywała się dwa razy dziennie (5 dni/tydzień) o godzinie 9:30 i 15:00, z dymem generowanego z 18 papierosów wprowadzanym do komory przez 90 min na sesję²⁷.

Aby ocenić efekty terapeutyczne interwencji, podawanie leków rozpoczęto po 8 tygodniach ekspozycji na dym papierosowy i kontynuowane przez

Wyniki

β-sitosterol był potencjalnym produktem naturalnym w leczeniu POChP

Ze względu na zgłaszane działanie lecznicze Fritillaria cirrhosa D. Don, suszonych kwiatów Lonicera japonica Thunb., suszonych korzeni Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. i Adenophora stricta Miq. w leczeniu chorób płuc^35,36,37,38, w badaniu tym wykorzystano bazę TCMSP do systematycznego identyfikowania aktywnych składników tych zielnych leków z medycyny tradycyjnej chińskiej (TCM) β-sitosterol został zidentyfikowany jako ważny aktywny składnik wspólny dla tych zielnych leków z TCM ( Rysunek 1A). Aby systematycznie zbadać podstawowy mechanizm molekularny β-sitosterolu, jego informacje o strukturze SMILES zostały pobrane z bazy PubChem i zaimportowane do bazy danych SwissTargetPrediction w celu przewidywania docelowego; wszystkie przewidywane cele o prawdopodobieństwie przewidywania powyżej 0 zostały zachowane do dalszej analizy. Powstały sieciowy układ interakcji składnik-cel między β-sitosterolem a jego kandydatowskimi celami został zwizualizowany i przedstawiony na Rysunku 1B. Łącznie przewidziano 43 domniemane geny-cele β-sitosterolu za pomocą bazy danych SwissTargetPrediction. Następnie przeprowadzono analizy wzbogacenia funkcjonalnego GO i wzbogacenia ścieżek KEGG dla genów-celów β-sitosterolu, a wszystkie pełne zestawy danych wzbogacenia zostały zarchiwizowane w Pliku uzupełniającym 1. Należy zauważyć, że procesy metaboliczne steroidów zostały zidentyfikowane jako jedna z najważniejszych ścieżek wzbogacenia. Zgromadzona literatura wykazała ścisłą korelację między nieprawidłowym metabolizmem steroidów a opornością na glikokortykoidy w POChP³⁹. Co więcej, GR był wyraźnie wzbogacony w klastrowych funkcjonalnych klastrach związanych z metabolizmem steroidów. To odkrycie dostarcza kluczowego wsparcia bioinformatycznego dla naszych kolejnych eksperymentów komórkowych badających mechanizm, w jaki β-sitosterol poprawia wrażliwość na DEX i zmienia poziomy ekspresji GR.

Geny związane z POChP zostały pobrane z baz danych TTD i CTD. Następnie analizę przecięcia Venna (Rysunek 1C) ujawniono dwa nakładające się geny między celami β-sitosterolu a genami związanymi z POChP pochodzącymi z TTD, kolejne dwa nakładające się geny między celami β-sitosterolu a genami związanymi z POChP pochodzącymi z CTD oraz pięć wspólnych genów POChP między zestawami danych TTD i CTD. Ostatecznie GR był jedynym genem wspólnym dla wszystkich trzech zestawów danych i został zdefiniowany jako główny cel β-sitosterolu przeciw POChP. Szczegółowe dane numeryczne analizy Venna są wymienione w Pliku uzupełniającym 2. Aby dalsze potwierdzić powinowactwo wiązania, przeprowadzono dokowanie molekularne β-sitosterolu z GR (Rysunek 1D). Kieszenie wiązania o wynikach Vina niższych niż -7,0 kcal/mol uważano za wykazujące korzystne powinowactwo wiązania. Wyniki Vina dla kieszeni C1 i C5 wyniosły odpowiednio -8,8 i -7,2 kcal/mol, co wskazuje na silną przewidywaną interakcję między β-sitosterolem a GR.

β-sitosterol chronił komórki BEAS-2B przed uszkodzeniem wywołanym CSE, co może być związane z podwyższoną ekspresją GR

β-sitosterol wykazał znaczące działanie ochronne w modelu uszkodzenia komórek BEAS-2B wywołanego przez CSE. Grupa CSE + 0 została zaprojektowana jako kontrola pojazdu otrzymująca CSE plus równą objętość rozpuszczalnika leku bez β-sitosterolu. Jak się spodziewano, nie znaleziono istotnej różnicy między grupami CSE i CSE + 0. Związek hamował wytwarzanie TNF-α i IL-6 indukowany przez CSE w sposób zależny od stężenia (Rysunek 2A). Zmniejszał również poziomy ROS wewnątrzkomórkowych (Rysunek 2B). β-sitosterol również znacząco obniżył zawartość MDA (Rysunek 2C), hamował starzenie się komórek indukowane przez CSE (Rysunek 2D) i obniżył markery związane ze starzeniem p53 i p21 (Rysunek 2E). Efekty te były towarzyszone przez zwiększoną ekspresję GR mRNA (Rysunek 2F), sugerując, że jego funkcja ochronna może być ściśle związana z transkrypcyjną regulacją GR. W przetestowanym zakresie stężeń β-sitosterol nie wywierał oczywistego cytotoksycznego wpływu na żywotność komórek BEAS-2B (Rysunek 2G), co wskazuje na korzystną tolerancję komórkową dla tego związku. Ponieważ 20 μg/mL (około 48,2 μM) wykazało najsilniejsze efekty hamujące, ta dawka została wybrana do dalszych eksperymentów. Chociaż nie zaobserwowano istotnej różnicy statystycznej między grupami 10 μg/mL i 20 μg/mL w odniesieniu do hamowania cytokin prozapalnych, 20 μg/mL β-sitosterol wykazało

Dyskusja

COPD nakłada znaczny ciężar chorobowy na świecie i pozostaje dużym wyzwaniem dla zdrowia na całym świecie¹. Obecne leczenie POChP obejmuje zarówno interwencje farmakologiczne, jak i niefarmakologiczne⁴². Wśród farmakologicznych terapii glikokortykosteroidy (GC) są szeroko stosowane w przewlekłych chorobach zapalnych. Działają one poprzez wiązanie się z GR i rekrutowanie deacetylazy histonów 2 do kompleksów transkrypcyjnych w celu odwrócenia acetylacji histonów⁴³. Jednak wiele badań wykazało zmniejszoną wrażliwość na GC u pacjentów z POChP^44,45, a badania dostarczyły dowodów na oporność na GC w tej chorobie⁴⁶. Te ustalenia wskazują, że przezwyciężenie oporu na GC jest znaczącym wyzwaniem klinicznym, podkreślając potrzebę nowych środków terapeutycznych. Dlatego identyfikowanie bardziej skutecznych opcji terapeutycznych dla POChP ma ogromne znaczenie.

Poprzednie badania wykazały, że β-sitosterol wywiera działanie przeciwproliferacyjne na komórki nabłonka oskrzeli w POChP⁴⁷. Ponieważ β-sitosterol i δ-sitosterol są zarówno częstymi składnikami bioaktywnymi fitosteroli, niniejsze badanie rozszerza obecną wiedzę na temat działania fitosteroli w POChP i podkreśla potencjalną wartość ochronną δ-sitosterolu w patogenezie choroby. Nasze ustalenia wykazały, że δ-sitosterol znacząco hamował uwalnianie czynników zapalnych, zmniejszał stres oksydacyjny i tłumił starzenie komórek. Jest to zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, które pokazują, że δ-sitosterol skutecznie hamuje wzmożone wytwarzanie czynników zapalnych indukowanych lipopolisacharydem, takich jak IL-6, indukcyjna syntaza tlenu azotowego i TNF-α⁴⁸. Te ustalenia potwierdzają jego działanie przeciwzapalne i wspierają jego spójność w różnych modelach zapalnych.

Inhalowane GC są skutecznymi środkami przeciwzapalnymi w kontrolowaniu zapalenia dróg oddechowych. Działają one głównie poprzez wiązanie się i aktywację GR⁴⁹. Jednak kluczową cechą patologiczną POChP jest zmniejszona wrażliwość komórek na przeciwzapalne działania GC⁴⁴. Zmniejszenie ekspresji lub upośledzenie funkcji GR jest uważane za główny mechanizm leżący u podstawy rozwoju oporu na GC u pacjentów z POChP⁵⁰. Poprzednie badania wykazały, że niektóre leki mogą zwiększać wrażliwość na GC. Na przykład, połączenie azytromycyny i budezonidu wywiera znacznie większe hamujące działanie na produkcję IL-4 i CXCL8 niż którykolwiek z tych składników stosowany samodzielnie⁵¹.

Warto zauważyć, że niniejsze badanie wykazało, że zarówno w modelach mysich z POChP narażonych na dym papierosowy, jak i w modelach komórek BEAS-2B indukowanych CSE, połączenie δ-sitosterolu z DEX wywierało znacznie silniejsze działanie hamujące na czynniki zapalne, stres oksydacyjny i starzenie komórek niż DEX samodzielnie. Ta kombinacja znacząco poprawiała także efektywność ochronną DEX przeciwko zmianom patologicznym związanym z POChP i uszkodzeniom nabłonka oskrzeli u myszy. Ten wynik sugeruje, że δ-sitosterol może poprawić wrażliwość komórek nabłonka oskrzeli na DEX, co stanowi nowatorskie podejście do rozwiązania problemu niewrażliwości lub oporu na GC u niektórych pacjentów z POChP. Zgodnie z wynikami ilościowych badań PCR in vitro, δ-sitosterol podnosi poziom mRNA GR w sposób zależny od stężenia, zamiast bezpośrednio działać jako agonista lub antagonista GR. Zweryfikowana efektywność wyciszenia si-GR i kolejne badania funkcjonalne uzupełniające dalsze potwierdzają, że δ-sitosterol poprawia reaktywność komórkową na GC poprzez zwiększenie całkowitego poziomu GR wewnątrzkomórkowego, a nie poprzez bezpośrednie aktywowanie GR, co prowadzi do zwiększenia efektów terapeutycznych w połączeniu z DEX, kanonicznym agonistą GR. W związku z tym zmiany w ekspresji GR mogą być związane z działaniem δ-sitosterolu, co jest zgodne z wcześniejszymi obserwacjami znacząco zmniejszonej GR i jej aktywnej izoformy GRα w komórkach gładkomięśniowych dróg oddechowych u pacjentów z POChP⁵². Co ważne, eksperymenty wyciszenia GR dalsze ujawniły kluczową rolę tego receptora w cytoprotekcji pośredniczonej przez δ-sitosterol, co wskazuje, że niektóre funkcje biologiczne δ-sitosterolu zależą od integralności szlaku GR.

W związku z powyższym, niniejsze badanie nie tylko ujawnia, że GR może służyć jako kluczowy mediator δ-sitosterolu w interwencji w POChP, ale także zapewnia potencjalne nowe podejście do przezwyciężenia wyzwania klinicznego oporności na DEX, stając się podstawą eksperymentalną dla opracowania naturalnych terapii uzupełniających ukierunkowanych na szlak GR.

Jednakże, niniejsze badanie miało kilka ograniczeń. Po pierwsze, funkcja płuc została oceniona tylko w celu potwierdzenia pomyślnego ustanowienia mysie

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BEAS-2B human bronchial epithelial cells	SunnCell, China	SC-0218	Human bronchial epithelial cell line for in vitro study
C57BL/6 mice	Vital River Laboratories, China	213	Animal model for COPD in vivo experiment
CB-DOCK2	China	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	for molecular docking simulation between ligand and receptor protein
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	C0038	Detection of cell viability and proliferation
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, USA	C10851	Detection of cellular senescence
Cigarettes	Hongta, China	Not provided	Cigarette used for smoke exposure and CSE preparation
CTD	USA	https://ctdbase.org/	for retrieving COPD-related genes
DCFH-DA fluorescent probe	Sigma-Aldrich, USA	D6883-50MG	Detection of intracellular ROS level
Dexamethasone (DEX)	Yeasen, China	40323ES03	Glucocorticoid for combined intervention
DMEM/F12 medium	Gibco, USA	11330032	Basal medium for BEAS-2B cell culture
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10270106	Supplement for cell culture medium
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	9.3.1	Data statistical analysis and graph drawing
Isoflurane	RWD Life Science, China	R510-22-10	Inhaled anesthetic for animal euthanasia
Lipid Peroxidation MDA Assay Kit	Beyotime Biotechnology, China	S0131S	Detection of intracellular malondialdehyde (MDA) content
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, USA	11668030	Transfection reagent for siRNA delivery
Multimode microplate reader	Thermo Fisher, USA	VL0000D0	Detection of absorbance and fluorescence value
Navios EX Flow Cytometer	Beckman Coulter, USA	B80912	Analysis of ROS and senescent cells
Penicillin/streptomycin	HyClone, USA	SV30010	Antibiotics to prevent bacterial contamination
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, USA	4367659	Fluorescent quantitative PCR amplification
PrimeScript™ RT reagent Kit	Takara, Japan	RR037Q	Reverse transcription for cDNA synthesis
PubChem database	USA	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	for acquiring canonical SMILES sequence and downloading 3D SDF structural information of beta-sitosterol
QuantStudio Dx PCR Instrument	Thermo Fisher, USA	4479889	Real-time RT-qPCR detection
RCSB PDB	USA	https://www.rcsb.org/	to obtain GR crystal 3D structure file
RNA/Protein Isolation Kit	Beyotime Biotechnology, China	R0018S	Total RNA extraction from cell and lung tissue
si-GR	Designed in silico via siDirect 2.1	Custom synthesis	Guide: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Passenger: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, knockdown for GR
si-NC	Thermo Fisher, USA	4390843	used as negative transfection control for cellular and in vivo assays
SwissTargetPrediction database	Switzerland	http://swisstargetprediction.ch/	for in silico prediction of potential drug-related protein targets
TCMSP database	China	https://www.tcmsp-e.com/	for herbal ingredient screening and target prediction
TTD	Singapore	https://db.idrblab.net/ttd/	for collection of validated COPD-associated disease genes
Whole-body smoke exposure chamber	Teague Enterprise, USA	TE-2	Establishment of cigarette smoke-induced COPD model
β-sitosterol	ChemicalBook, China	83-46-5	Active phytosterol for drug treatment