Protokoły efektywnego hodowania i analizy funkcjonalnej endoparazytoidalnej osy Asobara japonica oraz jej gospodarza Drosophila melanogaster

Summary

Celem tego protokołu jest ułatwienie analizy funkcjonalnej interakcji parazytoid-gospodarz w Asobara japonica i Drosophila melanogaster poprzez zoptymalizowane metody hodowli, pojedynczy test infekcji jajorodzenia i wyciszenia genów metodą RNAi.

Abstract

Pasożytnictwo to interakcja biologiczna, w której jeden organizm wykorzystuje ciało lub zasoby innego (żywiciela), powodując znaczne uszkodzenie lub śmierć żywiciela. Wśród pasożytniczych zwierząt, ose pasożytnicze są jedną z najbogatszych gatunkowo linii, stanowiąc prawie 20% wszystkich gatunków owadów. W szczególności, pasożytnicze wewnątrzkomórkowe ose składają jaja bezpośrednio w ciałach żywicieli i uwalniają zróżnicowaną gamę czynników jadu, aby manipulować rozwojem, odpornością i fizjologią żywiciela. W odpowiedzi na atak osy, żywiciele próbują eliminować jaja pasożytnicze za pomocą wrodzonych mechanizmów odpornościowych. Jednak mechanizmy molekularne i komórkowe, za pomocą których pojedyncze składniki jadu modulują biologię żywiciela i sprzyjają pomyślnemu pasożytnictwu, pozostają słabo poznane. Przedstawiamy tutaj standaryzowany protokół laboratoryjny do hodowania pasożytniczej wewnątrzkomórkowej osy Asobara japonica oraz jej żywiciela Drosophila melanogaster. Dostępne są zarówno partenogenetyczne, jak i płciowe szczepy A. japonica oraz partenogenetyczny szczep wykazuje wysoką skuteczność pasożytnictwa, pozwalając na stabilne utrzymanie szczepów laboratoryjnych do analizy genomu i badań pasożytnictwa. Test infekcji pojedynczego złożenia jaj oraz metoda tłumienia genów oparta na dwuniciowym RNA zostały zoptymalizowane do funkcjonalnej analizy genów jadu. Razem, te protokoły zapewniają praktyczną ramę eksperymentalną do sekcjonowania mechanizmów molekularnych leżących u podstawy interakcji żywiciel-pasożytnik i ułatwią przyszłe badania w dziedzinie biologii rozwojowej, immunologii i fizjologii.

Introduction

Pasożytnictwo to sposób życia, w którym jeden organizm wykorzystuje zasoby pokarmowe innego i jest szeroko rozpowszechnione wśród taksonów. Szacuje się, że aż połowa znanych organizmów wykazuje pasożytnictwo w swoim cyklu życia¹. Wśród pasożytów, osy pasożytoidy są szczególnie zróżnicowaną grupą, stanowiącą około 20% wszystkich owadów². Eksploatują one szeroki zakres gatunków stawonogów, takich jak owady, pająki i roztocza, i wykazują niezwykłą różnorodność w swoich historiach życia i strategiach pasożytniczych³. Te cechy sprawiają, że osy pasożytoidy są jedną z najbardziej ewolucyjnie i ekologicznie udanych grup owadów.

Interakcje między pasożytoidami a ich żywicielami były szeroko badane jako modelowe systemy ewolucyjnych "wyścigów zbrojeń". W szczególności osy endoparazytoidy wykorzystują zróżnicowaną gamę czynników, w tym jady, wirusy symbiotyczne i teratocyte^4,5. Te czynniki manipulują fizjologią i rozwojem żywiciela, zapewniając w ten sposób pomyślny rozwój wewnątrz żywiciela. Pomimo tych postępów mechanizmy molekularne leżące u podstaw pasożytnictwa są słabo rozumiane w przypadku większości gatunków pasożytoidów. Jedną z głównych ograniczeń jest ich mała wielkość ciała, co utrudnia biochemiczną identyfikację składników jadu. Ponadto, utrzymanie pasożytoidów i ich żywicieli z zsynchronizowanymi etapami rozwojowymi w warunkach laboratoryjnych jest technicznie trudne.

Ostatnie osiągnięcia w sekwencjonowaniu nowej generacji i innych technologiach omicznych umożliwiają teraz analizy genomowe nawet u bardzo małych gatunków pasożytoidów. Takie podejście otworzyło nowe drogi badania niedostępnych wcześniej mechanizmów molekularnych, pozwalając na badanie interakcji pasożyt-żywiciel z niesłychaną rozdzielczością. W tym kontekście nasze laboratorium koncentruje się na Asobara japonica Belokobylskij (Hymenoptera: Braconidae), gatunku pierwotnie zidentyfikowanym w Japonii^6,7,8. A. japonica obejmuje partenogenetyczną odmianę telytokous, w której samice rodzą potomstwo bez kopulacji. Ta cecha pozwala nam na zbieranie znacznych ilości genetycznie jednorodnego DNA genomowego do sekwencji całego genomu⁹. Ponadto, ten gatunek pasożytuje na szerokim zakresie gatunków Drosophila, w tym na organizmie modelowym D. melanogaster, który oferuje duże zalety eksperymentalne ze względu na dobrze ustalone warunki hodowli i precyzyjnie określone etapy rozwoju, umożliwiające powtarzalne testy infekcji i dokładną kontrolę rozwoju pasożytoidów¹⁰.

Podczas pasożytnictwa A. japonica, samica osa wstrzykuje jad wraz z pojedynczym jajem do larwy muchy, w której larwa osa rośnie obok jej żywiciela. Warto zauważyć, że A. japonica wykazuje wysoką skuteczność pasożytnictwa na żywicielu D. melanogaster, co sprawia, że ta para pasożytoid-żywiciel jest potężnym modelem eksperymentalnym. W tym miejscu opisujemy protokoły stabilnego hodowania, testu infekcji z pojedynczym złożeniem jaja oraz metody wyciszenia genów opartych na podwójnie niciowym RNA (dsRNA) w A. japonica. Te protokoły zapewniają niezawodną ramę do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji pasożyt-żywiciel.

Protocol

Schematyczne przedstawienie zsynchronizowanej metody hodowania D. melanogaster i A. japonica przedstawiono na Rycinie 1.

1. Hodowla muchy owocowej Drosophila melanogaster w laboratorium

1. Utrzymuj wszystkie zwierzęta doświadczalne w temperaturze 25 °C oraz 50-60% wilgotności względnej w cyklu 12:12 h światło/ciemność. Użyj szczepu dzikiego Oregon-R (OR) jako gospodarza dla A. japonica (Rycina 2A).
2. Przenieś dorosłe muchy do nowego pojemnika z pokarmem zawierającego standardowy medium z mąki kukurydzianej, drożdży i agaru (0,55% agar, Tabela 1). Oznakuję pojemnik datą transferu i nazwą szczepu "OR".
3. Wyczyść te dorosłe muchy jeden dzień po przeniesieniu, aby zapobiec nadmiernej liczbie jaj w pokarmie. Upewnij się, że larwom potomstwa żywią się na powierzchni pokarmu.
   UWAGA: Jako wytyczną, utrzymuj około 200-250 jaj na pojemnik z pokarmem (φ30×100 mm). Wyższe gęstości jaj mogą zmniejszać sukces parazytozy i zwiększać zróżnicowanie w rozwoju gospodarza i os.
4. Cztery dni po Kroku 1.2, przenieś łyżkę larw muchy do nowego pojemnika z pokarmem. Trzymaj te larwy nienarażone na działanie parazytoidów na następne pokolenie. Ta procedura pomaga również kontrolować gęstość larw gospodarza w pojemniku.

2. Hodowla endoparazytoidycznej osy Asobara japonicaw laboratorium

1. Użyj partenogenetycznego szczepu Tokyo (TK) i seksualnego szczepu Iriomote-jima (IR) (Rycina 2B). Pierwszy składa się z samic, podczas gdy drugi składa się z samic i samców. Samce wykluwają się dwa-cztery dni wcześniej niż samice. Dlatego przed przeniesieniem potwierdź obecność samic poprzez ich owłosienie.
   
2. Przenieś 10-20 dorosłych os bezpośrednio z pojemnika magazynowego do pojemnika zawierającego larwy muchy w 4 dAEL. Oznakuję pojemnik datą przeniesienia i nazwą szczepu "TK" lub "IR". Utrzymuj osy w tych samych warunkach jak w Kroku 1.1.
3. Pozwól dorosłym osom składać jaja w larwach muchy. Wyczyść te osy jeden do dwóch dni później, aby zapobiec nadmiernej parazytozie, która może prowadzić do śmierci gospodarza. Usuń dorosłe muchy, które uciekły przed parazytozą 10 lub więcej dni po Kroku 2.2.
4. Dwa tygodnie po Kroku 2.2, dorosłe osy zaczynają wykluwać się z poczwarki muchy gospodarza. Przenieś te nowo wyklęte dorosłe osy do nowego pojemnika z pokarmem zawierającego papier filtra z 25% glukozą i 50 mM roztworem witaminy C. Kawałki papieru filtra powinny być sterylizowane w temperaturze 130 °C przez 2 h. Zapewnienie roztworu na papierze filtra wspomaga zachowania składania jaj i wydłuża żywotność dorosłych os. Nasze podejście do użycia witaminy C w celu zwiększenia składania jaj zostało zainspirowane obserwacjami w badaniach nad Drosophila¹¹.

3. Test infekcji z pojedynczym składaniem jaj

1. Synchronizuj etap rozwojowy larw muchy użytych do eksperymentu infekcyjnego.
   1. Umieść dorosłe muchy w 50-mL probówce zawierającej płytkę agar z sokiem winogronowym (3% agar) rozmazanym świeżą pastą drożdżową i pozwól im składać jaja przez 24 h.
   2. Zbierz nowo wyklute larwy pierwszego stadium na płytce agar z sokiem winogronowym i przenieś je do małej probówki (12 mL) zawierającej 2-3 g pasty pokarmu dla muchy (pokarm dla muchy zmieszany z odpowiednią ilością wody). Do probówki umieszcza się 20-30 larw. Larwy muchy rosną w temperaturze 25 °C.
2. W odpowiednim momencie, przygotuj 4 cm płytkę Petriego zawierającą cienką, równomiernie rozprowadzoną warstwę pasty pokarmu dla muchy, pokrywającą obszar o średnicy około 1,5-2,0 cm (dalej nazywaną areną testu infekcji). Oprócz areny testu infekcji, przygotuj nową małą probówkę (12 mL) zawierającą odpowiednią ilość pasty pokarmu dla muchy. Ta probówka jest używana do hodowli larw gospodarza po teście infekcji.
3. Zbierz uporządkowane larwy i przenieś je do naczynia zawierającego odjonizowaną wodę (rezystywność = 15 MΩ·cm, 25 °C). Płucz larwy w naczyniu delikatnymi ruchami, aby usunąć resztki pokarmu z ich ciał.
4. Po płukaniu delikatnie usuń nadmiar wilgoci z larw za pomocą bezstrzępowych ściereczek, ponieważ nadmiar wody zakłóca zachowanie składania jaj os na arenie testu infekcji. Następnie przenieś larwy do areny. Ten krok zwiększa aktywność larw podczas ekspery

Results

Aseksualne i seksualne szczepy Asobara japonica
A. japonica jest szeroko rozpowszechniona na terenie Japonii. Szczepy częściowo genetyczne są dominujące na głównych wyspach, podczas gdy szczepy seksualne występują na subtropikalnych wyspach, w tym na wyspach Amami-Oshima i Iriomote-jima^8,12. W szczepach seksualnych samce pojawiają się wcześniej niż samice o kilka dni, co powoduje, że czas transferu dorosłych osobników jest różny w tych szczepach. Częściowe dzieworodztwo u A. japonica jest indukowane przez infekcję Wolbachia, czyli matczynie przenoszonego endosymbionta bakterii¹³. Eliminacja Wolbachia przez leczenie antybiotykami prowadzi do produkcji samców^9,14, a przeszczepienie Wolbachia do szczepów seksualnych indukuje częściowe dzieworodztwo¹⁵. Zarówno aseksualne, jak i seksualne szczepy A. japonica wykazują wysoki sukces pasożytnictwa na wielu gatunkach Drosophila. Na przykład mogą pasożytować na D. suzukii, czyli ekonomicznie ważnym szkodniku owoców i są uważane za potencjalne czynniki kontroli biologicznej w rolnictwie¹⁶. Wśród dostępnych szczepów, do naszych eksperymentów użyliśmy głównie szczepu TK zakażonego Wolbachia. Szczep TK wykazuje wyższą aktywność pasożytniczą w stosunku do larw żywiciela w porównaniu ze szczepem IR¹⁴, co czyni go odpowiednim do analiz.

Sukces pasożytnictwa zależy od warunków hodowli
Sukces pasożytnictwa A. japonica jest ogólnie wysoki, ale jest mocno wpływ na warunki hodowli much. W warunkach ubogich w składniki odżywcze, okres wzrostu larw much jest wydłużony, a czas puparyzacji jest opóźniony¹⁷. W tych warunkach osy mogą nie być w stanie odpowiednio wykorzystać zasobów żywiciela i zsynchronizować swojego rozwoju z rozwojem gospodarzy. Aby sprawdzić tę możliwość, wyhodowaliśmy muszki i osy w normalnych warunkach drożdżowych (1×) i warunkach ubogich w drożdże (0,1×). Następnie oceniliśmy sukces pasożytnictwa i czas rozwoju (Figury 2C, 2D). Sukces pasożytnictwa został obliczony jako stosunek wylęgu dorosłych os do larw żywiciela.

W normalnych warunkach drożdżowych, sukces pasożytnictwa wynosił 81,7% w pojedynczym badaniu infekcyjnym (Rycina 2C, lewa; Tabela 2). Kiedy zawartość drożdży została zmniejszona do 10% (warunki ubogich w drożdże), sukces pasożytnictwa spadł do 35,0% (Rycina 2C, prawa; Tabela 2). Ten spadek może być wyjaśniony faktem, że około 50% larw żywiciela zmarło po infekcji. Wyniki te sugerują, że alokowanie zasobów między żywicielem a pasożytem jest zakłócane w warunkach ubogich w składniki odżywcze.

Warto zauważyć, że czas ukończenia przez osy stadium imagines nie był opóźniony w takim samym stopniu w warunkach ubogich w drożdże jak w normalnych warunkach drożdżowych. Podczas gdy czas ukończenia przez muszki stadium imagines był opóźniony o maksymalnie 9 dni, czas ukończenia przez osy stadium imagines był opóźniony tylko o maksymalnie 4-5 dni. Ten wynik sugeruje, że dostępność składników odżywczych ma przede wszystkim wpływ na rozwój żywiciela. Czas ukończenia stadium imagines jest zgodny zarówno u much, jak i u os w normalnych warunkach drożdżowych, ale nie w warunkach ubogich w drożdże, co sugeruje, że zsynchronizowany rozwój między pasożytami a żywicielami zależy od dostępności składników odżywczych.

Podejście oparte na RNAi do analizy funkcjonalnej genów jadu
Chociaż analizy transkryptomowe i proteomiczne gruczołów jadowy zidentyfikowały liczne kandydackie cząsteczki, nie jest jeszcze jasne, które z nich są niezbędne do udanego pasożytnictwa. Aby określić fizjologiczne role tych kandydackich cząsteczek, wymagana jest analiza funkcjonalna in vivo z wykorzystaniem podejścia do knockdownu genów.

Niedawnym raportem doniesliśmy, że pasożytnictwo A. japonica indukuje apoptozę, autofagię i wstrzymanie podziału mitotycznego w tkankach wyobraźni larw D. melanogaster, co prowadzi do poważnego zdegradowania tkanek, zjawisko określane jako degradacja tkanek wyobraźni (IDD)¹⁰. Aby zidentyfikować cząsteczki odpowiedzialne za IDD, przeprowadziliśmy badania RNAi kandydatów zidentyfikowanych z analiz transkryptomowych, proteomicznych i porównawczych analiz genomowych. W wyniku tego zidentyfikowano dwa geny, imaginal disc degradation factor (IDDF)-1 i IDDF-2. Zarówno IDDF-1 jak i ID

Discussion

W niniejszym badaniu stworzyliśmy wszechstronny platformę eksperymentalną do badania interakcji żywiciel-pasożytnik na poziomie molekularnym. Poprzez optymalizację warunków chowu, pojedynczego testu infekcji z jednym złożeniem jaja oraz protokołu RNAi, zapewniamy solidny system do funkcjonalnych badań czynników pochodzących od pasożytoidów. Ta platforma ułatwi przyszłe badania mające na celu odkrycie mechanizmów, za pomocą których osy pasożytoidy manipulują rozwojem żywiciela, a także może przyczynić się do rozwoju biologicznych strategii zwalczania szkodników.

Zarażona Wolbachia szczep TK A. japonica zapewnia wysoce powtarzalny system eksperymentalny do analizy pasożytnictwa. W wielu badaniach żywiciel-pasożytnik wyniki eksperymentów są często zmienne, a przeżywalność żywiciela i sukces pasożytoidów są wrażliwie uzależnione od warunków środowiskowych i fizjologicznych. W przeciwieństwie do tego, szczep TK wykazuje spójnie wysoki sukces pasożytnictwa, skutecznie tworząc warunek “dominującego pasożytoidu”, w którym wynik infekcji jest w dużej mierze jednolity. Co więcej, jako szczep partenogenetyczny, zmniejsza on zmienność eksperymentalną między osobnikami dzięki jednolitemu tłu dziedzicznemu. Ta powtarzalność umożliwia niezawodne śledzenie procesu pasożytnictwa i ułatwia ilościowe analizy reakcji żywiciela i czynników pochodzących od pasożytoidów.

Dodatkowo, partenogenetyczne rozmnażanie znacznie ułatwia analizy genomowe poprzez umożliwienie generowania wysoce jednorodnego DNA genomowego, co jest krytyczne dla wysokiej jakości montażu genomu⁹. Chociaż takie partenogenetyczne szczepy nie są dostępne we wszystkich gatunkach pasożytoidów, nasze wyniki podkreślają potencjał partenogenezy indukowanej przez Wolbachia jako strategię poprawy zasobów genomowych. Ustanowienie linii zakażonych Wolbachia w innych gatunkach pasożytoidów może więc być potężnym podejściem do poszerzenia zasobów genomowych i przyspieszenia porównawczych badań molekularnych wśród pasożytoidów.

Wyniki pasożytnictwa są mocno wpłynięte przez warunki żywieniowe żywiciela, co wskazuje, że warunki chowu są krytycznym determinantem sukcesu pasożytoidów. Ponieważ skuteczne pasożytnictwo zależy od precyzyjnej koordynacji czasowej z rozwojem żywiciela i osy, niekontrolowane warunki żywieniowe prawdopodobnie zakłócą ten proces i zmniejszą powtarzalność. Dlatego staranna standaryzacja warunków chowu żywiciela jest niezbędna do ustanowienia niezawodnego systemu eksperymentalnego do badania interakcji żywiciel-pasożytnik. Ponadto, flakony ze stado much należy trzymać oddzielnie od flakonów ze stado os, ponieważ obecność os zmniejsza zachowania składania jaj u much^20,21.

Aby umożliwić ilościową ocenę interakcji żywiciel-pasożytnik, opracowaliśmy test infekcji z pojedynczym złożeniem jaja, w którym jedno jajo jest złożone do każdego żywiciela. Ten test kontrastuje z konwencjonalnymi testami infekcji masowych, które często obejmują wiele zdarzeń składania jaj, prowadzących do nadmiernego uszkodzenia i śmiertelności żywiciela. Aby promować efektywne składanie jaj w ograniczonym czasie (~15 min.), nowo wylęgłe dorosłe osy były przygotowywane za pomocą roztworu glukozy i witaminy C, poprawiając w ten sposób efektywność składania jaj i ogólną powtarzalność.

Ponadto zoptymalizowaliśmy protokół RNAi do analizy funkcji genów u pasożytoidów. Za pomocą systemu mikrowstrzykiwania osiągnęliśmy precyzyjną kontrolę objętości wstrzyknięcia i poprawiliśmy spójność efektywności wyłączania genu. Walidacja funkcjonalna za pomocą IDDF-1 potwierdziła, że ta metoda skutecznie tłumi ekspresję genów i daje powtarzalne wyniki fenotypowe. Biorąc pod uwagę, że badania transkryptomowe i proteomiczne nadal identyfikują duże liczby kandydatów do czynników jadowy, dostępność funkcjonalnej platformy do przesiewowych badań będzie niezbędna do określenia ich roli biologicznej.

Ograniczeniem tego protokołu RNAi jest to, że nie jest on odpowiedni do analizowania genów, które funkcjonują na wczesnych etapach rozwoju osy, ponieważ technicznie jest trudno wstrzyknąć dsRNA do jaj osy, które znajdują się wewnątrz ciała żywiciela. Aby temu zaradzić, ustanowienie systemu chowu ex vivo może zapewnić przydatne podejście²². Alternatywnie, podejścia do wyłączania genów za pomocą Direct Parental (DIPA)-CRISPR mogą zapewnić uzupełniającą strategię, w której reagenty są wstrzykiwane do dorosłych samic, aby wygenerować potomstwo z edytowaną genomową²³. Rzeczywiście, to podejście z powodzeniem wygenerowało osobniki z wyłączonymi genami u ektopasożytniczej osy Nasonia vitripennis wstrzykując reagenty do dorosłych samic lub osobników na późnym etapie poczwarki²⁴. Wraz z naszą metodą wyłączania genów opartą

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Badanie infekcji
1 mL strzykawka	TERUMO	SS-01T	Wstrzyknięcie dsRNA
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Hodowla
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Badanie infekcji
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	Wstrzyknięcie dsRNA
Niebieski barwnik (disodium salt Erioglaucine)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	Wstrzyknięcie dsRNA
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Hodowla
Regulator ciśnienia CO2	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Badanie infekcji
Mikroskop konfokalny z skanującym laserem	Zeiss	LSM700	Analiza obrazu
Mąka kukurydziana	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Hodowla
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Barwienie jąder, 1:10000
Woda dejonizowana	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Badanie infekcji
Dwustopniowy ściągacz mikropipet szklanych	Narishige	PC-10	Wstrzyknięcie dsRNA
Fiji	NA	https://fiji.sc	Analiza obrazu
Papier filtracyjny	Advantec	ITEM 526	Hodowla
Flaszka z pokarmem dla much	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Hodowla
Zatyczka do flaszki z pokarmem dla much	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Hodowla
Pęseta	Dumont Biologie	11252-20	Sekcja
Zamrażarka, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Przechowywanie próbek
Zamrażarka, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Przechowywanie próbek
Szklane szklanki laboratoryjne	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Badanie infekcji
Glukoza	Showa Sangyo Co., Ltd.	Nie dostępna	Hodowla
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	Synteza dsRNA
Inkubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Hodowla
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	Synteza dsRNA
Młynek mikropipet	Narishige	EG-401	Wstrzyknięcie dsRNA
Olej mineralny	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	Wstrzyknięcie dsRNA
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	Wstrzyknięcie dsRNA
Nanoject szklanymi kapilarami	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Wstrzyknięcie dsRNA
pBluescript KS (+) plasmid	Nie dostępna	Nie dostępna	Synteza dsRNA
pBluescript SK (-) plasmid	Nie dostępna	Nie dostępna	Synteza dsRNA
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	Synteza dsRNA
Propionian	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Hodowla
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Badanie infekcji, wstrzyknięcie dsRNA.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Mała flaszka (Probówka 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Badanie infekcji
Zatyczka do małej flaszki	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Badanie infekcji
Szpatułka	As One Corporation	6-522-02	Hodowla
Kwadratowa miska Petri	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	Wstrzyknięcie dsRNA
Stereomikroskop	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Badanie infekcji
Stereomikroskop	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	Wstrzyknięcie dsRNA
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	Synteza dsRNA
Termocykler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Termocykler GeneAtlas	Astel	G02	Synteza dsRNA, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Nie dostępna	qRT-PCR
Vitamin C, L-kwas askorbowy	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Hodowla
Sok z winogron Welch's grape 100	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Badanie infekcji
Drożdże	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Hodowla