Protokoły efektywnego hodowania i analizy funkcjonalnej endoparazitoida Asobara japonica oraz jego żywiciela Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest ułatwienie analizy funkcjonalnej interakcji parazytoid-gospodarz w Asobara japonica i Drosophila melanogaster poprzez zoptymalizowane metody chowu, pojedynczy test infekcji jajorodności i wyciszenia genu z wykorzystaniem RNAi.

Streszczenie

Pasożytnictwo to interakcja biologiczna, w której jeden organizm wykorzystuje ciało lub zasoby innego (żywiciela), powodując znaczne uszkodzenia lub śmierć żywiciela. Wśród pasożytniczych zwierząt, błonkoskrzydłe pasożytoidy są jednym z najbogatszych gatunkowo kladów, stanowiąc prawie 20% wszystkich gatunków owadów. W szczególności, błonkoskrzydłe pasożytoidy endoparazytyczne składają jaja bezpośrednio w ciałach żywicieli i uwalniają zróżnicowaną gamę czynników jadu w celu manipulacji rozwojem, odpornością i fizjologią żywiciela. W odpowiedzi na atak osy, żywiciele próbują eliminować jaja pasożytoidów poprzez wrodzone mechanizmy odpornościowe. Jednak mechanizmy molekularne i komórkowe, za pomocą których poszczególne składniki jadu modulują biologię żywiciela i sprzyjają pomyślnemu pasożytnictwu, pozostają słabo poznane. Przedstawiamy tu standaryzowany protokół laboratoryjny do hodowli pasożytoidowej osy Asobara japonica oraz jej żywiciela Drosophila melanogaster. Dostępne są zarówno szczepy partenogenetyczne, jak i płciowe A. japonica, a szczep partenogenetyczny wykazuje wysoką skuteczność pasożytnictwa, umożliwiając stabilne utrzymanie szczepów laboratoryjnych do analizy genomu i badań pasożytnictwa. Dla analizy funkcjonalnej genów jadu zoptymalizowano pojedynczy test infekcji składaniem jaj oraz metodę wyciszenia genu opartą na podwójnie łańcuchowej RNK. Razem, te protokoły zapewniają praktyczną ramę eksperymentalną do analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji pasożyt-żywiciel i ułatwią przyszłe badania w dziedzinie biologii rozwoju, immunologii i fizjologii.

Wprowadzenie

Pasożytnictwo to sposób życia, w którym jeden organizm wykorzystuje zasoby pokarmowe innego i jest szeroko rozpowszechnione wśród różnych taksonów. Szacuje się, że aż do połowy wszystkich znanych organizmów wykazuje pasożytnictwo w swoim cyklu życia¹. Wśród pasożytów, błonkoskrzydłe pasożytoidy są szczególnie zróżnicowaną grupą, stanowiącą około 20% wszystkich owadów². Eksploatują one szeroki zakres gatunków stawonogów, takich jak owady, pająki i roztocza, i wykazują niezwykłą różnorodność w swoich historiach życia i strategiach pasożytniczych³. Te cechy sprawiają, że błonkoskrzydłe pasożytoidy są jedną z najbardziej ewolucyjnie i ekologicznie udanych grup owadów.

Interakcje między pasożytoidami a ich gospodarzami były szeroko badane jako modele ewolucyjnych "wyścigów zbrojeń". W szczególności błonkoskrzydłe pasożytoidy endoparazytoidalne wykorzystują zróżnicowaną gamę czynników, w tym jady, wirusy symbiotyczne i teracyty^4,5. Czynniki te manipulują fizjologią i rozwojem gospodarza, zapewniając tym samym pomyślny rozwój wewnątrz gospodarza. Pomimo tych postępów, mechanizmy molekularne leżące u podstaw pasożytnictwa są słabo poznane w przypadku większości gatunków pasożytoidów. Jedną z głównych ograniczeń jest ich niewielki rozmiar ciała, co utrudnia biochemiczne identyfikowanie składników jadu. Ponadto, utrzymanie pasożytoidów i ich gospodarzy z zsynchronizowanymi etapami rozwojowymi w warunkach laboratoryjnych jest technicznie trudne.

Ostatnie postęp w sekwencjonowaniu nowej generacji i innych technologiach omicznych umożliwiają teraz analizy genomowe nawet u bardzo małych gatunków pasożytoidów. Podejścia te otworzyły nowe drogi do badania uprzednio niedostępnych mechanizmów molekularnych, pozwalając na badania interakcji pasożyt-gospodarz na bezprecedensowym poziomie rozdzielczości. W tym kontekście, nasze laboratorium koncentruje się na Asobara japonica Belokobylskij (Hymenoptera: Braconidae), gatunku pierwotnie zidentyfikowanym w Japonii^6,7,8. A. japonica obejmuje partenogenetyczną odmianę telytokous, w której samice produkują potomstwo bez kopulacji. Ta cecha pozwala nam na zbieranie znacznych ilości genetycznie jednorodnego DNA genomowego do sekwencjonowania całego genomu⁹. Ponadto, ten gatunek pasożytuje na szerokim zakresie gatunków Drosophila, w tym na modelowym organizmie D. melanogaster, który oferuje duże zalety eksperymentalne ze względu na dobrze ustalone warunki hodowli i precyzyjnie określone etapy rozwoju, umożliwiające powtarzalne testy zakażeń i dokładną kontrolę rozwoju pasożytoidów¹⁰.

Podczas pasożytnictwa A. japonica, samica osy wstrzykuje jad wraz z pojedynczym jajem do larwy muchy, w której larwa osy rośnie obok swojego gospodarza. Warto zauważyć, że A. japonica wykazuje wysoką skuteczność pasożytnictwa na gospodarzu D. melanogaster, co sprawia, że ta para pasożytoid-gospodarz jest potężnym modelem eksperymentalnym. W tym artykule opisujemy protokoły dotyczące stabilnego hodowania, testu infekcji z pojedynczym złożeniem jaj i metody tłumienia genów opartej na podwójnie łańcuchowej RNA (dsRNA) w A. japonica. Te protokoły zapewniają niezawodną ramę do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji pasożyt-gospodarz.

Protokół

Schematyczne przedstawienie synchronizowanej metody hodowli D. melanogaster i A. japonica przedstawiono na Rysunku 1.

1. Hodowla gospodarza muszki owocowej Drosophila melanogaster w laboratorium

1. Utrzymuj wszystkie zwierzęta eksperymentalne w temperaturze 25 °C i 50-60% wilgotności względnej w cyklu 12:12 h światło/ciemność. Użyj szczepu typu dzikiego Oregon-R (OR) jako gospodarza dla A. japonica (Rysunek 2A).
2. Przenieś dorosłe muchy do nowego pojemnika z pokarmem zawierającego standardowy agar z mąki kukurydzianej i drożdży (0,55% agar, Tabela 1). Oznakuj pojemnik datą przeniesienia i nazwą szczepu „OR”.
3. Wyczyść te dorosłe muszki jeden dzień po przeniesieniu, aby zapobiec nadmiernej liczbie jaj w pokarmie. Upewnij się, że larwy potomstwa żerują na powierzchni pokarmu.
   UWAGA: Jako wskazówka, utrzymuj około 200-250 jaj na pojemnik z pokarmem (φ30×100 mm). Wyższa gęstość jaj może zmniejszać sukces pasożytowania i zwiększać zmienność w rozwoju gospodarza i os.
4. Cztery dni po Kroku 1.2 przenieś łyżkę larw muszek (4 dni po złożeniu jaj, dAEL) do nowego pojemnika z pokarmem. Trzymaj te larwy bez narażenia na pasożytników na następne pokolenie. Ta procedura pomaga również kontrolować gęstość larw gospodarza w pojemniku.

2. Hodowla wewnątrzorganizmowego owada pasożytniczego Asobara japonicaw laboratorium

1. Użyj partenogenetycznego szczepu Tokyo (TK) i szczepu płciowego Iriomote-jima (IR) (Rysunek 2B). Pierwszy składa się z samic, podczas gdy drugi składa się z samic i samców. Samce lądują dwa-cztery dni wcześniej niż samice. Dlatego przed przeniesieniem potwierdź obecność samic za pomocą owłosienia.
2. Przenieś 10-20 dorosłych os bezpośrednio z pojemnika zapasowego do pojemnika zawierającego larwy muszek w 4 dAEL. Oznakuj pojemnik datą przeniesienia i nazwą szczepu „TK” lub „IR”. Utrzymuj osy w tych samych warunkach jak w Kroku 1.1.
3. Pozwól dorosłym osom składać jaja w larwach muszek. Wyczyść te osy jeden do dwóch dni później, aby zapobiec nadmiernej pasożytności, która może prowadzić do śmierci gospodarza. Usuń dorosłe muszki, które uciekły z pasożytnictwa 10 lub więcej dni po Kroku 2.2.
4. Dwa tygodnie po Kroku 2.2 dorosłe osy zaczynają lądować z poczwarki muszki gospodarza. Przenieś te nowo wylądowanych dorosłych os do nowego pojemnika z pokarmem z filtrem papierowym zawierającym 25% glukozę i 50 mM roztwór witaminy C. Kawałki filtra papierowego powinny być sterylizowane w 130 °C przez 2 godziny. Dostarczenie roztworu na filtrze papierowym wspomaga zachowania składania jaj i wydłuża żywotność dorosłych os. Nasze podejście do użycia witaminy C w celu zwiększenia składania jaj zostało zainspirowane obserwacjami w badaniach nad Drosophila ¹¹.

3. Test infekcji pojedynczego składania jaj

1. Synchronizuj etapy rozwojowe larw muszek używanych do eksperymentu infekcyjnego.
   1. Umieść dorosłe muszki w 50-ml probówce zawierającej płytkę agarową z sokiem winogronowym (3% agar) nasmarowaną świeżym pastą drożdżową i pozwól im składać jaja przez 24 godziny.
   2. Zbierz nowo wylęgające się larwy pierwszego stadium na płytce agarowej z sokiem winogronowym i przenieś je do małej probówki (12 ml) zawierającej 2-3 g pasty z pokarmem dla muszek (pokarm dla muszek zmieszanych z odpowiednią ilością wody). Do probówki umieszcza się 20-30 larw. Larwy muszek są dopuszczone do wzrostu w temperaturze 25 °C.
2. W odpowiednim momencie przygotuj 4 cm płytkę Petriego zawierającą cienką, równomiernie rozprowadzoną warstwę pasty z pokarmem dla muszek, pokrywającą obszar o średnicy około 1,5-2,0 cm (dalej nazywaną areną testu infekcji). Oprócz areny testu infekcji, przygotuj nową małą probówkę (12 ml) zawierającą odpowiednią ilość pasty z pokarmem dla muszek. Ta probówka jest używana do hodowli larw gospodarza po teście infekcji.
3. Zbierz larwy w odpowiedniej fazie i przenieś je do naczynia zawierającego wodę dejonizowaną (rezystywność = 15 MΩ·cm, 25 °C). Płucz larwy w naczyniu z łagodnym mieszaniem, aby usunąć resztki pokarmu z ich ciała.
4. Po przepłukaniu delikatnie usuń nadmiar wilgoci z larw za pomocą bezstrzępowych chusteczek papierowych, ponieważ nadmiar wody zakłóca zachowania składania jaj os na

Wyniki

Szczepy bezpłciowe i płciowe Asobara japonica
A. japonica jest szeroko rozpowszechniona na terenie Japonii. Szczepy partenogenetyczne telytokalne przeważają na głównych wyspach, natomiast szczepy płciowe arrenotokalne występują na wyspach subtropikalnych, w tym na wyspach Amami-Oshima i Iriomote-jima^8,12. W szczepach płciowych samce wykluwają się o kilka dni wcześniej niż samice, przez co czas przenoszenia osobników dorosłych różni się między tymi szczepami. Partenogeneza telytokalna u A. japonica jest indukowana infekcją Wolbachia, endosymbiotyczną bakterią przenoszoną matczynie¹³. Eliminacja Wolbachia za pomocą antybiotykoterapii prowadzi do produkcji samców^9,14, a transplantacja Wolbachia do szczepów płciowych indukuje partenogenezę¹⁵. Zarówno szczepy bezpłciowe, jak i płciowe A. japonica wykazują wysoką skuteczność pasożytowania u wielu gatunków Drosophila. Na przykład mogą one pasożytować na D. suzukii, szkodniku owoców o dużym znaczeniu gospodarczym, i są uważane za potencjalne środki biologicznej kontroli w rolnictwie¹⁶. Spośród dostępnych szczepów, w naszych eksperymentach wykorzystaliśmy głównie szczep TK zainfekowany Wolbachia. Szczep TK wykazuje wyższą aktywność pasożytniczą wobec larw gospodarza w porównaniu ze szczepem IR¹⁴, co czyni go odpowiednim do analiz.

Sukces pasożytowania zależy od warunków hodowli
Wskaźnik sukcesu pasożytowania  A. japonica jest zazwyczaj wysoki, lecz jest on silnie zależny od warunków hodowli much gospodarzy. W warunkach ubogich w składniki odżywcze okres wzrostu larw much jest wydłużony, a moment pupariacji opóźniony¹⁷. W takich warunkach osy mogą nie być w stanie prawidłowo wykorzystać zasobów gospodarza i zsynchronizować swój rozwój z rozwojem gospodarzy. Aby zbadać tę możliwość, hodowano muchy i osy w warunkach z normalną zawartością drożdży (1×) oraz z niską zawartością drożdży (0,1×). Następnie oceniono sukces pasożytowania oraz czas rozwoju (Ryc. 2C, 2D). Sukces pasożytowania obliczono jako stosunek liczby wyklutych dorosłych os do liczby larw gospodarzy.

W warunkach normalnej zawartości drożdży wskaźnik sukcesu pasożytowania wynosił 81,7% w teście infekcji z pojedynczą ovipozycją (Rycina 2C, lewa strona; Tabela 2). Gdy zawartość drożdży została zredukowana do 10% (warunki ubogie w drożdże), wskaźnik sukcesu pasożytowania spadł do 35,0% (Rycina 2C, prawa strona; Tabela 2). Redukcję tę można wyjaśnić faktem, że po infekcji obumarło około 50% larw gospodarza. Wyniki te sugerują, że w warunkach niedoboru składników odżywczych dochodzi do zaburzenia alokacji zasobów pomiędzy gospodarzem a parasytoidem.

Warto zauważyć, że czas wylochania os był opóźniony w mniejszym stopniu w warunkach ubogich w drożdże niż w warunkach z normalną ilością drożdży. Podczas gdy czas wylochania much został opóźniony nawet o 9 dni, czas wylochania os opóźnił się jedynie o 4-5 dni. Wynik ten sugeruje, że dostępność składników odżywczych wpływa przede wszystkim na rozwój gospodarza. Czas wylochania jest zbieżny zarówno u much, jak i os w warunkach z normalną ilością drożdży, ale nie w warunkach ubogich w drożdże, co sugeruje, że zsynchronizowany rozwój parazytoidów i gospodarzy zależy od dostępności składników odżywczych.

Podejście oparte na RNAi w analizie funkcjonalnej genów jadu
Mimo że analizy transkrypcyjne i proteomiczne gruczołów jadowych pozwalają zidentyfikować liczne cząsteczki kandydackie, nadal nie jest jasne, które z nich są niezbędne do skutecznego pasożytnictwa. W celu określenia ról fizjologicznych tych cząsteczek kandydackich wymagane są analizy funkcjonalne in vivo z wykorzystaniem metod wyciszania genów.

Niedawno donieśliśmy, że pasożytnictwo A. japonica indukuje apoptozę, autofagię i zatrzymanie mitozy w dyskach imaginalnych larw D. melanogaster, co prowadzi do rozległej degradacji tkanek – zjawisko to nazwano degradacją dysków imaginalnych (IDD)¹⁰. Aby zidentyfikować cząsteczki odpowiedzialne za IDD, przeprowadziliśmy screening RNAi genów kandydackich wytypowanych na podstawie analiz transkryktomicznych, proteomicznych i porównawczych analiz genomicznych. W wyniku tych prac zidentyfikowano dwa geny: imaginal disc degradation factor (IDDF)-1 oraz IDDF-2. Zarówno IDDF-1, jak i IDDF-2 zawierają domenę o nieznanej funkcji 4803 (DUF4803). Co istotne, po naszej pierwszej publikacji w niezależnym badaniu zidentyfikowano wiele białek jadu A. japonica  (nazwanych białkami degradacji indukowanej jadem, VID) powiązanych z IDD, z których wszystkie również posiadają domenę DUF4803¹⁸.

Na podstawie tych wyników dalej optymalizowaliśmy protokół RNAi w celu poprawy powtarzalności i wydajności. W szczególności zastosowanie Nanoject III umożliwiło precyzyjną kontrolę objętości i prędkości wstrzykiwania, co przełożyło się na bardziej spójne wyniki knockdownu.

Aby ocenić wydajność zoptymalizowanego protokołu RNAi, przeprowadziliśmy wyciszenie genu IDDF-1. U dorosłych os wylęgłych poziom ekspresji IDDF-1 był istotnie obniżony w porównaniu z grupą kontrolną (Rycina 3D). W celu walidacji funkcjonalnej przeprowadziliśmy testy infekcyjne z pojedynczą owipozycją, wykorzystując te osy poddane RNAi oraz larwy much gospodarzy wykazujące ekspresję reportera apoptozy GC3Ai w obszarze pęcherzyka skrzydła¹⁹. Sygnał GC3Ai wykryto w pęcherzyku skrzydła po infekcji osami kontrolnymi (GFP RNAi). W przeciwieństwie do nich, sygnał GC3Ai był znacznie zredukowany po infekcji osami IDDF-1 RNAi (Rycina 3E, 3F). Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami, potwierdzając, że funkcja IDDF-1 zostaje skutecznie stłumiona przez RNAi.

Rysunek 1. Schematyczny przegląd procedur hodowli D. melanogaster i A. japonica. 
Krokowe procedury przedstawiono zgodnie z etapami rozwojowymi D. melanogaster. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Pasożytnictwo Asobara japonica. (A) Schemat zależności rozwojowej między D. melanogaster a jej pasożytem A. japonica. Samica osy wprowadza jad oraz jedno jajo do larwy muchy. Po wykluciu się larwa osy rozwija się równolegle z larwą gospodarza, która następnie przechodzi w stadium poczwarki. Po przepoczwarczeniu osa pochłania całe ciało muchy i ostatecznie wyłania się z poczwarki muchy. (B) Dorosłe osy bezpłciowego szczepu (lewo) i płciowego szczepu (prawo) A. japonica. Pasek skali, 1 mm. (C) Wskaźnik wykluwania się much lub os w warunkach normalnych (1×) i w warunkach z niską zawartością drożdży (0.1×). Testy infekcji pojedynczą owipozycją przeprowadzono z użyciem larw much gospodarzy w 4 dni po złożeniu jaj (dAEL). n = odpowiednio 267 (1×, muchy), 120 (0.1×, muchy), 85 (1×, osy) i 80 (0.1×, osy). (D) Czas wyklucia się much i os w dwóch warunkach żywieniowych przedstawionych w (C). Wskazano stosunek osobników dorosłych do poczwarek. n = odpowiednio 250, 107, 61 i 41. Czarna strzałka wskazuje moment infekcji osą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Zoptymalizowana procedura RNAi z użyciem Nanoject III. (A) Ustawienie aparatury do mikroiniekcji pod stereomikroskopem. Szklana igła kapilarna została ustawiona pod kątem 30-45° względem płytki agarowej. (B) Końcówka szklanej igły kapilarnej została zaostrzona za pomocą szlifierki do igieł. (C) Roztwór zabarwiony na niebiesko został wstrzyknięty metodą mikroiniekcji do ciała osy za pomocą szklanej igły kapilarnej. Strona przednia osy jest zaznaczona na obrazie literą A. P – strona tylna. Pasek skali, 1 mm. (D) Poziomy ekspresji IDDF-1 w osach poddanych RNAi przeciwko GFP oraz IDDF-1 zostały określone ilościowo metodą delta-delta C_t. Poziomy ekspresji znormalizowano do RpL32-Aj. Dane przedstawiają średnią ± SD z poszczególnymi punktami danych (n = 5). ***P < 0.005 (test t Studenta). (E i F) Sygnały GC3Ai w dyskach skrzydłowych niezinfekowanych larw oraz larw gospodarzy 6 h po infekcji (hpi) po zakażeniu osami kontrolnymi (GFP RNAi) lub osami z RNAi przeciwko IDDF-1. Dyski skrzydłowe zostały obrysowane białymi przerywanymi liniami na podstawie barwienia jąder DAPI (1:10000, 62247; Thermo Fisher Scientific). Ilościowo określono stosunek obszaru pozytywnego dla GC3Ai do obszaru worka skrzydłowego. ***P < 0.005 (jednoczynnikowa analiza ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Tukeya). n = 11 powtórzeń biologicznych w grupie. Pasek skali, 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Komponenty	Ilość
Woda	1 L
Agar	5,5 g
Drożdże	40 g
Mąka kukurydziana	90 g
Glukoza	100 g
Kwas propionowy	3 ml
10% butyloparaben w 70% EtOH	3,5 ml

Tabela 1: Składniki standardowej pożywki agarowej z mąką kukurydzianą i drożdżami (Fly food).

Typ pożywienia	Warunki	Całkowita liczba osobników	Liczba osobników po eklozji lub martwych				Wskaźnik wyjścia much lub os
			Mucha	Osa	Śmiertelność poczwarki	Śmiertelność larwy
1×	Niezainfekowane	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica zainfekowane	120	0	98	9	13	81.66666667
0.1×	Niezainfekowane	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica zainfekowane	80	0	28	13	39	35

Tabela 2: Liczba osobników i wskaźniki wyklucia w warunkach normalnych (1x) oraz z ubogą zawartością drożdży (0.1x).

Nazwa startera	Sekwencja (5'>3')	Przeznaczenie
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTTCCTACT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	Klonowanie CDS
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	Klonowanie CDS, matryca dsRNA
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	GAGGAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Matryca dsRNA
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	Matryca dsRNA
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG GAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Matryca dsRNA
※ Powyższe startery i matryce dsRNA zostały opisane w pracy Kamiyama et al. 2022.
※ gene007424 oznacza IDDF-1.

Tabela 3: Sekwencje starterów i matryc dsRNA użytych w niniejszym badaniu.

Dyskusja

W niniejszym badaniu stworzyliśmy wszechstronny eksperymentalny system do badania interakcji pasożytoid-gospodarz na poziomie molekularnym. Poprzez optymalizację warunków chowu, pojedynczego testu infekcji jajorodowej oraz protokołu RNAi, zapewniliśmy solidny system do funkcjonalnych badań czynników pochodzących od pasożytoidów. Platforma ta ułatwi przyszłe badania mające na celu poznanie mechanizmów, za pomocą których osy pasożytoidy manipulują rozwojem gospodarza, a także może przyczynić się do rozwoju biologicznych strategii zwalczania szkodników.

Zarażona Wolbachia szczep TK A. japonica zapewnia wysoce powtarzalny system eksperymentalny do analizy pasożytnictwa. W wielu badaniach pasożytoid-gospodarz wyniki eksperymentów są często zmienne, przy czym przeżywalność gospodarza i sukces pasożytoidów zależą wrażliwie od warunków środowiskowych i fizjologicznych. W przeciwieństwie do tego, szczep TK wykazuje konsekwentnie wysoki sukces pasożytnictwa, efektywnie tworząc warunki "dominujące pasożytoidy", w których wynik infekcji jest w dużej mierze jednolity. Co więcej, jako szczep partenogenetyczny, zmniejsza on wariację eksperymentalną między osobnikami ze względu na jednolite tło genetyczne. Ta powtarzalność umożliwia niezawodne śledzenie procesu pasożytnictwa i ułatwia ilościową analizę reakcji gospodarza i czynników pochodzących od pasożytoidów.

Dodatkowo, telitokojna reprodukcja znacznie ułatwia analizy genomowe, umożliwiając wytwarzanie wysoce jednorodnego DNA genomowego, co jest krytyczne dla wysokiej jakości montażu genomu⁹. Chociaż takie partenogenetyczne szczepy nie są dostępne we wszystkich gatunkach pasożytoidów, nasze wyniki podkreślają potencjał telitokii indukowanej przez Wolbachia jako strategię poprawy zasobów genomowych. Ustanowienie linii zakażonych Wolbachia w innych gatunkach pasożytoidów może zatem być potężnym podejściem do poszerzania zasobów genomowych i przyspieszania porównawczych badań molekularnych wśród pasożytoidów.

Wyniki pasożytnictwa są mocno wpłynięte przez warunki żywieniowe gospodarza, co wskazuje, że warunki chowu są krytycznym czynnikiem sukcesu pasożytoidów. Ponieważ skuteczne pasożytnictwo zależy od precyzyjnej koordynacji czasowej z rozwojem gospodarza i osy, niekontrolowane warunki żywieniowe prawdopodobnie zakłócą ten proces i zmniejszą powtarzalność. Dlatego staranna standaryzacja warunków chowu gospodarza jest istotna dla ustanowienia niezawodnego systemu eksperymentalnego do badania interakcji pasożytoid-gospodarz. Co więcej, probówki z zasobami much powinny być przechowywane osobno od probówek z zasobami os, ponieważ obecność os zmniejsza zachowania jajorodowe much^20,21.

Aby umożliwić ilościową ocenę interakcji pasożytoid-gospodarz, opracowałeśmy test infekcji z pojedynczym jajorodem, w którym do każdego gospodarza złożone jest jedno jajo. Ten test kontrastuje z konwencjonalnymi masowymi testami infekcji, które często wiążą się z wieloma jajorodami prowadzącymi do nadmiernego uszkodzenia i śmiertelności gospodarza. Aby promować wydajne jajorodzenie w ograniczonym oknie czasowym (~15 min.), dorosłe osobniki os nowo wylęgłe były przygotowane poprzez podawanie roztworu glukozy i witaminy C, poprawiając w ten sposób wydajność jajorodzenia i ogólną powtarzalność.

Ponadto zoptymalizowaliśmy protokół RNAi do analizy funkcji genów u pasożytoidów. Dzięki zastosowaniu systemu mikrowstrzykiwania osiągnęliśmy precyzyjną kontrolę objętości wstrzyknięcia i poprawiliśmy spójność efektywności wyłączania genów. Walidacja funkcjonalna za pomocą IDDF-1 potwierdziła, że ta metoda efektywnie hamuje ekspresję genów i wytwarza powtarzalne wyniki fenotypowe. Biorąc pod uwagę, że badania transkryptomowe i proteomiczne nadal identyfikują duże liczby kandydatów do czynników jadowych, dostępność funkcjonalnej platformy przesiewowej będzie niezbędna do określenia ich roli biologicznej.

Ograniczeniem tego protokołu RNAi jest to, że nie nadaje się on do analizowania genów, które funkcjonują we wczesnych etapach rozwoju os, ponieważ technicznie trudno jest wstrzyknąć dsRNA do jaj os, które znajdują się wewnątrz ciała gospodarza. Aby temu zaradzić, utworzenie systemu chowu ex vivo może zapewnić przydatne podejście²². Alternatywnie, podejścia do knockoutu genów z wykorzystaniem Direct Parental (DIPA)-CRISPR mogą zapewnić uzupełniającą strategię, w której reagenty są wstrzykiwane do dorosłych samic w celu wygenerowania potomstwa z edytowanym genomem²³. Rzeczywiście, to podejście z powodzeniem wygenerowało osobniki z knockoutem genu w przypadku ektopasożytniczej osy Nasonia vitripennis  poprzez wstrzyknięcie reagentów do dorosłych samic lub osobników na późnym etapie poczwarki²⁴. Wraz z naszą metodą knockdownu genów opartą na RNAi, podejścia te ułatwią bardziej kompleksowe analizy funkcji genów zaangażowanych w

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Ocena zakażenia
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	Wstrzyknięcie dsRNA
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Hodowla
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Ocena zakażenia
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	Wstrzyknięcie dsRNA
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	Wstrzyknięcie dsRNA
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Hodowla
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Ocena zakażenia
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	Analiza obrazów
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Hodowla
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Barwienie jąder, 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Ocena zakażenia
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	Wstrzyknięcie dsRNA
Fiji	NA	https://fiji.sc	Analiza obrazów
Filter paper	Advantec	ITEM 526	Hodowla
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Hodowla
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Hodowla
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	Sekcja
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Przechowywanie próbek
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Przechowywanie próbek
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Ocena zakażenia
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Not availavle	Hodowla
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	Synteza dsRNA
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Hodowla
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	Synteza dsRNA
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	Wstrzyknięcie dsRNA
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	Wstrzyknięcie dsRNA
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	Wstrzyknięcie dsRNA
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Wstrzyknięcie dsRNA
pBluescript KS (+) plasmid	Not availavle	Not availavle	Synteza dsRNA
pBluescript SK (-) plasmid	Not availavle	Not availavle	Synteza dsRNA
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	Synteza dsRNA
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Hodowla
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Ocena zakażenia, wstrzyknięcie dsRNA.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Ocena zakażenia
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Ocena zakażenia
Spatula	As One Corporation	6-522-02	Hodowla
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	Wstrzyknięcie dsRNA
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Ocena zakażenia
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	Wstrzyknięcie dsRNA
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	Synteza dsRNA
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	Synteza dsRNA, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Not availavle	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Hodowla
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Ocena zakażenia
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Hodowla