Celem tego protokołu jest ułatwienie analizy funkcjonalnej interakcji parazytoid-gospodarz w Asobara japonica i Drosophila melanogaster poprzez zoptymalizowane metody chowu, pojedynczy test infekcji jajorodności i wyciszenia genu z wykorzystaniem RNAi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Protokoły efektywnego hodowania i analizy funkcjonalnej endoparazitoida Asobara japonica oraz jego żywiciela Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pasożytnictwo to interakcja biologiczna, w której jeden organizm wykorzystuje ciało lub zasoby innego (żywiciela), powodując znaczne uszkodzenia lub śmierć żywiciela. Wśród pasożytniczych zwierząt, błonkoskrzydłe pasożytoidy są jednym z najbogatszych gatunkowo kladów, stanowiąc prawie 20% wszystkich gatunków owadów. W szczególności, błonkoskrzydłe pasożytoidy endoparazytyczne składają jaja bezpośrednio w ciałach żywicieli i uwalniają zróżnicowaną gamę czynników jadu w celu manipulacji rozwojem, odpornością i fizjologią żywiciela. W odpowiedzi na atak osy, żywiciele próbują eliminować jaja pasożytoidów poprzez wrodzone mechanizmy odpornościowe. Jednak mechanizmy molekularne i komórkowe, za pomocą których poszczególne składniki jadu modulują biologię żywiciela i sprzyjają pomyślnemu pasożytnictwu, pozostają słabo poznane. Przedstawiamy tu standaryzowany protokół laboratoryjny do hodowli pasożytoidowej osy Asobara japonica oraz jej żywiciela Drosophila melanogaster. Dostępne są zarówno szczepy partenogenetyczne, jak i płciowe A. japonica, a szczep partenogenetyczny wykazuje wysoką skuteczność pasożytnictwa, umożliwiając stabilne utrzymanie szczepów laboratoryjnych do analizy genomu i badań pasożytnictwa. Dla analizy funkcjonalnej genów jadu zoptymalizowano pojedynczy test infekcji składaniem jaj oraz metodę wyciszenia genu opartą na podwójnie łańcuchowej RNK. Razem, te protokoły zapewniają praktyczną ramę eksperymentalną do analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji pasożyt-żywiciel i ułatwią przyszłe badania w dziedzinie biologii rozwoju, immunologii i fizjologii.
Wprowadzenie
Pasożytnictwo to sposób życia, w którym jeden organizm wykorzystuje zasoby pokarmowe innego i jest szeroko rozpowszechnione wśród różnych taksonów. Szacuje się, że aż do połowy wszystkich znanych organizmów wykazuje pasożytnictwo w swoim cyklu życia1. Wśród pasożytów, błonkoskrzydłe pasożytoidy są szczególnie zróżnicowaną grupą, stanowiącą około 20% wszystkich owadów2. Eksploatują one szeroki zakres gatunków stawonogów, takich jak owady, pająki i roztocza, i wykazują niezwykłą różnorodność w swoich historiach życia i strategiach pasożytniczych3. Te cechy sprawiają, że błonkoskrzydłe pasożytoidy są....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Schematyczne przedstawienie synchronizowanej metody hodowli D. melanogaster i A. japonica przedstawiono na Rysunku 1.
1. Hodowla gospodarza muszki owocowej Drosophila melanogaster w laboratorium
- Utrzymuj wszystkie zwierzęta eksperymentalne w temperaturze 25 °C i 50-60% wilgotności względnej w cyklu 12:12 h światło/ciemność. Użyj szczepu typu dzikiego Oregon-R (OR) jako gospodarza dla A. japonica (Rysunek 2A).
- Przenieś dorosłe muchy do nowego pojemnika z pokarmem zawierającego standardowy agar z mąki kukurydz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Szczepy bezpłciowe i płciowe Asobara japonica
A. japonica występuje powszechnie w całej Japonii. Szczepy partenogenetyczne telitokowe dominują na głównych wyspach, natomiast szczepy płciowe arrenotokowe występują na wyspach subtropikalnych, w tym na wyspach Amami-Oshima i Iriomote-jima8,12. W szczepach płciowych samce wykluwają się o kilka dni wcześniej niż samice, przez co czas przenoszenia osobników dorosłych różni się pom.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym badaniu stworzyliśmy wszechstronny eksperymentalny system do badania interakcji pasożytoid-gospodarz na poziomie molekularnym. Poprzez optymalizację warunków chowu, pojedynczego testu infekcji jajorodowej oraz protokołu RNAi, zapewniliśmy solidny system do funkcjonalnych badań czynników pochodzących od pasożytoidów. Platforma ta ułatwi przyszłe badania mające na celu poznanie mechanizmów, za pomocą których osy pasożytoidy manipulują rozwojem gospodarza, a także może przyczynić się do rozwoju biologicznych st.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy żadnego konfliktu interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcą podziękować Kanata Tachibana, Shion Kudo, Toshiya Makino, Shunta Yorimoto, Shuji Shigenobu, Akiko Kawamura, Ari Fujinoki i Masako Iida za pomoc techniczną. Dziękujemy również wszystkim pozostałym członkom naszego laboratorium.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 50 mL tube | Greiner Bio-One | 210261 | Ocena zakażenia |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | Wstrzyknięcie dsRNA |
| Agar | Daisin, Ltd. | P-700 | Hodowla |
| Asnol Petri Dish φ40×13.5mm | As One Corporation | 1-8549-01 | Ocena zakażenia |
| Asnol Petri Dish φ55×17mm | As One Corporation | 1-8549-02 | Wstrzyknięcie dsRNA |
| Blue dye (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich Co. Llc. | 861146-25G | Wstrzyknięcie dsRNA |
| Butyl p-Hydroxybenzoate | Nacalai Tesque, Inc. | 06327-15 | Hodowla |
| CO2 pressure regulator | YAMATOSANGYO | YR-507F-2 | Ocena zakażenia |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM700 | Analiza obrazów |
| Corn meal | Sunny Maize Co., Ltd. | No.4M | Hodowla |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | PI62247 | Barwienie jąder, 1:10000 |
| Deionized water | Millipore Inc. | ZLXEV030WW | Ocena zakażenia |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | Wstrzyknięcie dsRNA |
| Fiji | NA | https://fiji.sc | Analiza obrazów |
| Filter paper | Advantec | ITEM 526 | Hodowla |
| Fly food vial | Chiyoda Science Co., Ltd. | KFB-3M | Hodowla |
| Fly food vial plug | Chiyoda Science Co., Ltd. | AS-275 | Hodowla |
| Forceps | Dumont Biologie | 11252-20 | Sekcja |
| Freezer, -20 °C | Nihon Freezer | GS-3120HC | Przechowywanie próbek |
| Freezer, -80 °C | Nihon Freezer | CLN-52UD2 | Przechowywanie próbek |
| Glass slides | Matsunami Glass Ind., Ltd | S7213 | Ocena zakażenia |
| Glucose | Showa Sangyo Co., Ltd. | Not availavle | Hodowla |
| KOD Plus Neo | Toyobo | KOD-401 | Synteza dsRNA |
| Incubator | Panasonic | MIR-254-PJ | Hodowla |
| Ligation high Ver.2 | Toyobo | LGK-201 | Synteza dsRNA |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-401 | Wstrzyknięcie dsRNA |
| Mineral oil | Nacalai Tesque, Inc. | 23306-84 | Wstrzyknięcie dsRNA |
| Nanoject III | Drummond Scientific Company | 3-000-207 | Wstrzyknięcie dsRNA |
| Nanoject Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Wstrzyknięcie dsRNA |
| pBluescript KS (+) plasmid | Not availavle | Not availavle | Synteza dsRNA |
| pBluescript SK (-) plasmid | Not availavle | Not availavle | Synteza dsRNA |
| PrimeScript reverse Transcriptase | Takara | 2680A | Synteza dsRNA |
| Propionic acid | Nacalai Tesque, Inc. | 29018-55 | Hodowla |
| PROWIPE | Daio Paper Corporation | 2-2624-02 | Ocena zakażenia, wstrzyknięcie dsRNA. |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover | Toyobo | FSQ-301 | qRT-PCR |
| RNAiso Plus reagent | Takara | 9108 | qRT-PCR |
| Small vial (Test tube 12 mL) | Sarstedt | REF 58.487 | Ocena zakażenia |
| Small vial plug | Chiyoda Science Co., ltd. | QD-S4 | Ocena zakażenia |
| Spatula | As One Corporation | 6-522-02 | Hodowla |
| Square petri dish | Eiken Chemical Co., Ltd. | 64-2192-55, AW2000 | Wstrzyknięcie dsRNA |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | lvesta3 (C-Mount) | Ocena zakażenia |
| Stereomicroscope | Nikon Solutions Co., Ltd. | SMZ1000 | Wstrzyknięcie dsRNA |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | Synteza dsRNA |
| Thermal Cycler Dice Real Time System | Takara | TP815 | qRT-PCR |
| Thermal Cycler GeneAtlas | Astel | G02 | Synteza dsRNA, qRT-PCR |
| THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix | Toyobo | QPS-201 | qRT-PCR |
| TissueLyser II | Qiagen | Not availavle | qRT-PCR |
| Vitamin C, L-Ascorbic Acid | Nacalai Tesque, Inc. | 03420-65 | Hodowla |
| Welch's grape 100 juice | Asahi Soft drinks Co., Ltd. | 32390 | Ocena zakażenia |
| Yeast | Asahi Group Foods, Ltd. | HB-P02 | Hodowla |
Bibliografia
- Hasik AZ, et al. Parasitism as a driver of host diversification. Nat Rev Biodivers. 2025;1(6):401-410.
- Pennacchio F, Strand MR. Evolution of developmental strategies in parasitic Hymenoptera. Annu Rev Entomol. 2006;51:233-258.
- Quicke DL. Parasitic Wasps. 1997:221-255.
- Moreau S, Asgari S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological functions. Toxins. 2015;7(7):2385-2412.
- Huang J, Chen XX, Zhan S. Molecular mechanisms underlying parasitoid-derived host manipulation strategies. Annu Rev Entomol. 2026;71:51-68.
- Belokobylskij SA. Key to the Insects of Russian Far East. Tribe Alysiini. In: Ler PA, ed. 1998;4(3):163-....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
