Zachowanie złożoności tkankowej in vivo w modelu układu nerwowego węchowego myszy z wykorzystaniem analizy całych preparatów (whole-mount) do badania regeneracji neuronów

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia kompletny schemat postępowania w celu zachowania złożoności anatomicznej węchowego układu nerwowego myszy. Szczegółowo opisano tutaj cały przebieg prac, obejmujący sekcję, przygotowanie tkanek oraz obrazowanie. Protokół ten może być wykorzystany do badania układu węchowego w warunkach prawidłowych lub patologicznych, w tym w warunkach jego naturalnej regeneracji.

Streszczenie

W erze obrazowania trójwymiarowego (3D) standardowa immunohistochemia jest uznawana za wysoce ograniczoną w badaniach nad patologią i złożoną anatomią człowieka. Analiza jedynie wąskich plastrów może prowadzić do utraty krytycznych szczegółów kontekstowych w przypadku większych struktur i istotnych aspektów architektury tkankowej, co skutkuje niepełnymi lub błędnymi interpretacjami. Choć przekroje dwuwymiarowe (2D) pozwoliły na podstawowe zrozumienie histoarchitektury, są one niewystarczające do uchwycenia rzeczywistej trójwymiarowej natury tkanek biologicznych.

Coraz więcej badań prowadzonych w wielu regionach anatomicznych wykorzystuje obecnie techniki izolujące nienaruszone jednostki anatomiczne – preparaty typu flat mount, whole-mount lub en face – w połączeniu z fluorescencyjną mikroskopią o wysokiej rozdzielczości. Podejścia te oferują bardziej kompleksową wizualizację i interpretację organizacji strukturalnej. Ma to szczególne znaczenie w obrębie węchowego układu nerwowego, gdzie zdefiniowanie złożonych mechanizmów komórkowych leżących u podstaw jego niezwykłej zdolności regeneracyjnej wymaga kontekstu pełnej grubości tkanki. W przypadku cienkich przekrojów istnieje ryzyko pominięcia kluczowych cech patofizjologicznych, które pozostają słabo zdefiniowane.

Biorąc pod uwagę te ograniczenia oraz lukę w wiedzy dotyczącą oddziaływań komórkowych napędzających regenerację węchową, niezbędne stało się opracowanie udoskonalonej techniki preparatyki całego narządu (whole-mount), zdolnej do zachowania złożoności tkanek o pełnej grubości. Całe błony śluzowe nosa wyizolowano jako próbki o pełnej grubości, stosując zoptymalizowany protokół penetracji przeciwciał. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości (EVIDENT SpinSR) oraz rekonstrukcja 3D umożliwiły dokładną wizualizację oddziaływań komórkowych in vivo.

Wprowadzenie

Węchowy układ nerwowy (WUN) stanowi unikalny i dobrze ugruntowany model badania mechanizmów regeneracji nerwowej, ponieważ zachowuje on wyjątkową zdolność do wymiany neuronów przez całe życie¹. Jednak potencjał klinicznego zastosowania tej zdolności neuroreparacyjnej pozostaje ograniczony ze względu na znaczące luki w naszej wiedzy na temat zachowania komórek w układzie węchowym^2,3,4. Odpowiedzi komórkowe i organizacja anatomiczna WUN, w tym pierwotne neurony węchowe, komórki osłonkowe nerwu węchowego (OECs) oraz fibroblasty okołonerwowe, zostały opisane w kilku badaniach na zwierzętach, opierających się na wykonywaniu ultracienkich (<2 µm) przekrojów tkankowych w połączeniu z modelami ciężkich urazów fizycznych zastosowanych w WUN gryzoni^1,2. Zwierzęta w tych badaniach były zazwyczaj uśmiercane 10 dni po urazie, co dawało wgląd jedynie w jeden konkretny moment rozległego i bardziej złożonego przebudowywania takiej tkanki podczas urazu nerwowego². W badaniach tych wykazano, że po obumarciu aksonów komórki OECs i fibroblasty utrzymują się w formie ciągłych kanałów po urazie.

Mimo że podejście to dostarczyło cennych informacji, ze względu na liczne opisane powyżej ograniczenia, pozwoliło ono jedynie na uzyskanie koncepcyjnego przeglądu ONS o niskiej rozdzielczości i na powierzchownym poziomie, co w konsekwencji uniemożliwiło kompleksową ocenę rzeczywistej organizacji komórkowej w nienaruszonym ONS³. W rezultacie mogło dojść do pominięcia kluczowych zależności przestrzennych.

Zachowanie trójwymiarowej struktury tkanki jest niezbędne do dokładnej analizy anatomicznej i komórkowej i zostało z powodzeniem zastosowane w wielu narządach i jednostkach chorobowych^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Podejścia z wykorzystaniem preparatów całych organów (whole-mount) stosowano do mapowania organizacji neuronów w błonie śluzowej węchu^13,14, jednak wizualizacja interakcji komórkowych w pełnej strukturze ONS, w tym z zachowaną warstwą właściwą (lamina propria), nie została jeszcze przeprowadzona.

W niniejszym badaniu opracowaliśmy schemat pracy z wykorzystaniem modelu mysiego, obejmujący przetwarzanie tkanek w całości, immunobarwienie, obrazowanie o wysokiej rozdzielczości oraz rekonstrukcję trójwymiarową, co umożliwia szczegółową analizę architektury ONS. Protokół ten został opracowany w celu uzupełnienia luki w istniejących opublikowanych metodach; pozwala on na konserwację i zachowanie pełnej grubości błony śluzowej węchowej, w tym blaszki właściwej, co umożliwia badanie oddziaływań międzykomórkowych. Co istotne, ta udoskonalona metodologia pobierania i przetwarzania tkanek może być stosowana i łączona z różnymi modelami układu węchowego.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt i komórek zmodyfikowanych transgenicznie zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Griffith (NLRD/003/2020_var3) oraz Komisji Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu Griffith (MHIQ/04/23/AEC), zgodnie z wytycznymi australijskiego regulatora technologii genowych Office of Gene Technology regulator (OGTR).

UWAGA: W badaniu wykorzystano łącznie 15 dorosłych myszy laboratoryjnych (8–9 tygodni) obu płci. Konkretnie zastosowano myszy transgeniczne S100β-DsRed, w których wszystkie OEC wykazują ekspresję jaskrawoczerwonego białka DsRed pod kontrolą promotora S100β. S100β należy do szerszej rodziny białek wiążących wapń i jest powszechnie eksponowane w komórkach glejowych ośrodkowego układu nerwowego, takich jak OEC. Model ten był optymalny dla celów niniejszych eksperymentów, ponieważ umożliwiał łatwą lokalizację docelowych populacji komórek przy użyciu endogennych sygnałów fluorescencyjnych. Myszy transgeniczne S100β-DsRed zostały wygenerowane wcześniej i wykazano, że ich zastosowanie zapewnia lepszą detekcję OEC w porównaniu z immunohistochemią w analizach tkanek utrwalonych^15,16,17,18.

1. Pobieranie głów i utrwalanie tkanek

1. Uśmierć zwierzęta poprzez inhalację rosnącego stężenia CO₂ w wyznaczonych punktach czasowych eksperymentu.
2. Potwierdź zgon poprzez brak odruchów rogówkowych i wycofywania kończyny, a następnie przeprowadź zwichnięcie szyi lub postąp zgodnie z zatwierdzoną procedurą SOP.
3. Za pomocą nożyczek usuń całą głowę wraz z żuchwami.
4. Usuń skórę z czaszki oraz chrząstkę z koniuszka nosa, aby odsłonić jamę nosową i zapewnić efektywną penetrację utrwalacza.
   UWAGA: Zaobserwowano, że ten etap wycięcia najbardziej przedniej części chrząstki nosowej zwierzęcia jest kluczowy dla prawidłowego utrwalenia tkanki wewnątrz jamy nosowej.
5. Szybko wypłucz głowy w PBS 1×, aby usunąć nadmiar krwi.
6. Utrwal tkankę poprzez zanurzenie na noc (12–18 h) w 4% paraformaldehydzie, przez co najmniej 6 h (czas wystarczający do utrwalenia badanej tkanki) w temperaturze 4 °C na rotatorze.
   OSTROŻNIE: Paraformaldehyd jest niebezpieczną substancją chemiczną, która uwalnia opary formaldehydu. Jest toksyczny przy wdychaniu, kontakcie ze skórą i połknięciu; powoduje podrażnienie oczu, skóry i dróg oddechowych oraz jest podejrzewany o działanie rakotwórcze. Należy z nim pracować wyłącznie w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu. Bezpieczna utylizacja niebezpiecznych substancji chemicznych i odpadów biologicznych powstałych podczas protokołu musi odbywać się zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi.
   ​UWAGA: Podczas optymalizacji zaobserwowano, że 6 h było wystarczające do utrwalenia badanej tkanki; jednak czas powyżej 12 h mógł prowadzić do nadmiernego utrwalenia i degradacji struktur śluzówki.
7. Wyjmij głowy z utrwalacza i płucz je przez 3 h w PBS 1× w temperaturze pokojowej (20–25 °C) na rotatorze.
8. Przechowuj głowy w świeżym PBS w temperaturze 4 °C i pobierz tkankę śluzówki w całości (whole-mount) w ciągu 48 h.

2. Pobieranie całych próbek tkanek

1. Przeprowadź izolację tkanki pod mikroskopem.
2. Przeciąć głowy na pół za pomocą skalpela, prowadząc cięcie wzdłuż linii pośrodkowej sagi.
3. Odsłonić wnętrze jamy nosowej (Rysunek 1). Zidentyfikować obszary anatomiczne i pobrać tkankę śluzówkową wyścielającą cały przekrój anatomiczny (Rysunek 1B).
4. Używając przecinaka do kości, ostrożnie przełam i usuń kość przegrody pokrywającą część jamy śluzówkowej.
   UWAGA: Zob. Rysunek 2AKrok ten jest kluczowy dla odsłonięcia wklęsłej jamy pod kością, gdzie pęczki aksonów przebiegają przez ścianę grzbietową (Rysunek 1B).
5. Po odsłonięciu tego obszaru należy użyć zakrzywionej pęsety, aby delikatnie oddzielić i wybrać tkankę z wklęsłej ściany grzbietowej. Należy unieść tkankę znad leżącej pod nią kości i ostrożnie odwarstwić pozostałą błonę śluzową węchową, aby pobrać nienaruszoną preparację w całości (whole-mount).
   UWAGA: Na tym etapie wymagana była szczególna ostrożność, aby uniknąć przerwania tkanki.
6. Pobrać interesującą tkankę z obu nozdrzy: błonę śluzową pokrywającą przegrodę, grzbietowe ściany lewą i prawą oraz blaszkę sitową jamy nosowej (Rysunek 1A, B)Pobierz tkankę z obu nozdrzy, w tym z przegrody nosowej, ścian grzbietowych oraz blaszki sitowej, aby wyizolować obszar anatomiczny zawierający główne struktury węchowe (Rysunek 2C).
7. Zebrane tkanki przemyć w 1× PBS i usunąć wszelkie niepożądane fragmenty, w tym fragmenty kości. Tkanki przechowywać w 1× PBS w temperaturze 4 °C do późniejszej analizy immunohistochemicznej.
   UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania tkanki zaleca się przechowywanie jej w roztworze PBS 1× z dodatkiem 0,001% (w/v) azotku sodu w temperaturze 4 °C.

3. Zoptymalizowany protokół barwienia

UWAGA: Powszechnie stosowane protokoły barwienia są zazwyczaj optymalizowane dla skrawków o małej lub średniej grubości (np. do 50 µm). W związku z tym protokół musiał zostać dostosowany do znacznie grubszej tkanki.
​Zauważono, że kluczowym krokiem jest utrzymywanie tkanki w stanie zawieszenia w probówkach Eppendorf przez cały proces barwienia oraz umieszczanie probówek na walcarku podczas penetracji odczynników. Dlatego etapy barwienia nie były przeprowadzane z tkanką na szkiełku do obrazowania. Tkankę barwiono najpierw w zawieszeniu, a następnie montowano na szkiełkach do obrazowania. Takie rozwiązanie zapobiegło zwijaniu się tkanki i zapewniło penetrację całego obszaru przez odczynniki i przeciwciała.

1. Wyjąć tkanki z przechowywania i umieścić je w probówce Eppendorfa z roztworem blokującym (dobór roztworu zależy od specyfiki barwienia).
   ​UWAGA: Roztwór blokujący: 3% BSA, 0,3% Triton X-100 w PBS. Inną istotną korektą był czas ekspozycji tkanki na każdy odczyn i koktajl przeciwciał.
2. Przechowywać tkankę w roztworze blokującym przez 3 h w temperaturze pokojowej na walcarku.
   UWAGA: Zaobserwowano, że zwiększenie czasu ekspozycji w porównaniu do standardowego podejścia do immunohistochemii cienkich skrawków pozwala uniknąć zwiększania stężenia wybranych przeciwciał i odczynników barwiących (Tabela 1). Pozwoliło to również zminimalizować zużycie kosztownych przeciwciał. Inkubacje przeprowadza się w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 mL z odciętym zatrzaskiem pokrywki, aby probówka mogła obracać się na walcarku. Objętość odczynnika wynosiła 500 µL.
3. Inkubować przez 72 h w 4°C z przeciwciałami pierwotnymi na walcarku.
4. Przemyć tkankę dwukrotnie (każde płukanie trwa 1,5 h) za pomocą PBS 1× w temperaturze pokojowej na walcarku.
5. Inkubować tkankę z przeciwciałem wtórnym (zawiniętą w folię aluminiową) i barwnikiem do jąder przez minimum 4 h w temperaturze pokojowej na walcarku, a następnie przenieść na noc (12–18 h) do 4°C na walcarku.
6. Przemyć tkankę dwukrotnie (po 1,5 h każde płukanie) za pomocą PBS 1× w temperaturze pokojowej na walcarku.

4. Przygotowanie preparatów

1. Ostrożnie przenieś tkankę z probówki Eppendorf
2. Pod mikroskopem umieść tkankę na szkiełku przedmiotowym, upewniając się, że nie występują w niej żadne zagięcia.
   UWAGA: Orientację tkanki można określić pod mikroskopem bez użycia fluorescencji. Stronę błony właściwej tkanki śluzowej należy umieścić na szkiełku tak, aby nabłonek przylegał do szkła przedmiotowego, a błona właściwa była skierowana w stronę szkiełka nakrywkowe. Błonę właściwą można zidentyfikować po obecności grubych pęczków nerwowych, które są widoczne bez barwienia. Ustawienie tkanki tak, aby błona właściwa była skierowana ku nakrywce, a nabłonek spoczywał na szkiełku przedmiotowym, ułatwi proces barwienia oraz obrazowania.
3. Przykryj preparaty szkiełkami nakrywkowymi, używając fluorescencyjnego medium montującego, a następnie zabezpiecz szkiełka.
4. Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C po wysuszeniu przez noc (12–18 h) w ciemności w temperaturze pokojowej

5. Pozyskiwanie obrazów i postprocessing

1. Pozyskiwanie obrazów immunofluorescencyjnych przy niskim powiększeniu
   1. Wykonaj automatyczne łączenie obrazów (stitching) podczas akwizycji, stosując liniowe blendowanie alfa.
      ​UWAGA: Liczbę klatek w stosie z (z-stack) należy dostosować do grubości preparatu, aby zapewnić pełne pokrycie objętości tkanki.
   2. Przejmij sąsiednie pola widzenia z 15% zakładką. Pozyskaj obrazy kafelkowe, stosując meandrowy wzór akwizycji.
   3. Dostosuj całkowitą liczbę przekrojów optycznych do grubości tkanki.
   4. Ustaw kalibrację obrazu na 215.594 nm/pixel w obu osiach, X i Y. Pozyskaj obrazy w formie stosów z, stosując krok z wynoszący 0.8 µm.
   5. Umieść zamontowaną tkankę w całości (whole-mount) na stoliku mikroskopu konfokalnego. Pozyskaj obrazy przeglądowe, używając obiektywu 30x (NA 1.04).
2. Pozyskiwanie obrazów immunofluorescencyjnych przy wysokim powiększeniu.
   1. Pozyskaj szczegółowe obrazy, używając obiektywu 60× (NA 1.5). Ustaw kalibrację obrazu na 107.923 nm/pixel w obu osiach, X i Y. Pozyskaj obrazy w formie stosów z, stosując krok z wynoszący 0.41 µm.
   2. Dostosuj całkowitą liczbę przekrojów optycznych do grubości tkanki i wykonaj zdjęcia z jednego pola widzenia.
      ​UWAGA: W przypadku akwizycji 60× łączenie obrazów nie jest wymagane, ponieważ każdy zestaw danych składa się z pojedynczego pola widzenia.
3. Pozyskiwanie referencyjnych obrazów histologicznych
   1. Wykonaj obrazy barwionych HE przekrojów środkowych strzałkowych głowy myszy, używając mikroskopu skanującego preparaty w oświetleniu w jasnym polu.
   2. Pozyskaj obrazy, używając obiektywu 40× (NA 0.95) oraz powiększenia kamery 0.63x, co daje efektywne powiększenie 25.2×.
   3. Potwierdź kalibrację pikseli na poziomie 136.905 nm/pixel w obu osiach, X i Y, a następnie pozyskaj obraz w jednej płaszczyźnie ogniskowej.
   4. Połącz obrazy kafelkowe automatycznie, stosując meandrowy wzór akwizycji i liniowe blendowanie alfa.
4. Pozyskiwanie referencyjnych immunofluorescencyjnych obrazów przeglądowych
   1. Pozyskaj uzupełniające immunofluorescencyjne obrazy przeglądowe, używając obiektywu 10x.
   2. Przejmij preparat jako pojedynczy przekrój z, stosując 0% zakładki kafelków podczas akwizycji obrazu.
   3. Ustaw kalibrację obrazu na 647.249 nm/pixel w obu osiach, X i Y, a następnie wygeneruj obraz przeglądowy obejmujący cały anatomiczny obszar zainteresowania.
5. Przetwarzanie obrazów i generowanie końcowych rycin.
   1. Wyeksportuj pozyskane zestawy danych obrazowych do oprogramowania do analizy obrazu. Wygeneruj projekcje maksymalnej intensywności (MIPs) z zestawów danych z-stack.
   2. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) do późniejszej analizy i przygotowania rycin.
   3. Połącz immunofluorescencyjne obrazy przeglądowe z odpowiadającymi im obrazami HE, aby stworzyć anatomiczne ryciny referencyjne. Następnie zweryfikuj wyrównanie i odpowiedniość anatomiczną między zestawami danych fluorescencyjnych a histologicznymi przed przygotowaniem rycin.
      UWAGA: Wszystkie operacje łączenia obrazów powinny być wykonywane automatycznie podczas akwizycji, przy użyciu predefiniowanych ustawień mikroskopu i nie powinny wymagać dodatkowego postprocesingu. W naszym przypadku renderowanie 3D zostało wygenerowane przy użyciu oprogramowania Imaris: do stworzenia rekonstrukcji 3D wykorzystano wtyczkę do renderowania powierzchni (surface rendering), opartą na progowej intensywności dla każdego pozyskanego kanału. Ostatecznie obrazy końcowe zostały zestawione w programie Adobe Illustrator.

Wyniki

Przedstawione tutaj podejście do przygotowania całego preparatu umożliwiło izolację i zachowanie błony śluzowej węchowej w całości. W naszym przypadku skupiliśmy się na zrozumieniu zmian komórkowych i anatomicznych zarówno w skali makro (pełny widok anatomiczny), jak i mikro (poziom komórkowy).

Podejście z wykorzystaniem preparatów całych (whole-mount) pozwala na pobranie zarówno komponentów nabłonkowych, jak i blony właściwej oraz zachowanie relacji przestrzennych między pęczkami aksonów, komórkami osłaniającymi nerw węchowy (OECs) i fibroblastami – naszymi komórkami zainteresowania. Podejście to umożliwiło pozyskanie dużych, ciągłych zbiorów danych obejmujących pełną grubość i szeroki obszar powierzchni tkanki śluzówkowej (Rycina 3) oraz pozwoliło nam uchwycić szczegóły złożonej struktury i oddziaływań komórkowych (Rycina 3), a także sposób, w jaki zmieniają się one pomiędzy stanem nienaruszonym (n = 3) (Rycina 3A, B) a stanem uszkodzonym (n = 12) (Rycina 3C, D).

Dzięki połączeniu tej zoptymalizowanej procedury przygotowania i barwienia tkanek z konfokalną mikroskopią o wysokiej rozdzielczości, udało nam się uzyskać obrazy szerszych obszarów błony śluzowej z bardzo precyzyjnymi szczegółami na poziomie komórkowym w całej grubości tkanki. Akwizycja stosów Z (Z-stack) z wielu sąsiednich obszarów pozwoliła na rekonstrukcję rozległych domen anatomicznych bez utraty rozdzielczości lub integralności sygnału (Rysunek 4A–F). Dzięki wysokiej rozdzielczości detali komórkowych mogliśmy również wykorzystać pozyskane stosy Z obejmujące pełną grubość tkanki (Rysunek 4G) do stworzenia renderowanych obrazów (Rysunek 4H), co pozwoliło na lepsze zrozumienie mikroarchitektury tkanki.

Niezawodnego określenia orientacji tkanki przed montażem i obrazowaniem konsekwentnie osiągano bez konieczności stosowania znakowania fluorescencyjnego. Stronę błony własnej łatwo było zidentyfikować w mikroskopii w świetle przechodzącym dzięki obecności grubych pęczków nerwowych, wyraźnie odróżnialnych od warstwy nabłonkowej. Standaryzacja orientacji próbek poprzez umieszczenie błony własnej sąsiadującej z szkiełkiem nakrywką, a powierzchni nabłonkowej przylegającej do szkiełka przedmiotowego, poprawiła spójność obrazowania między próbkami i ułatwiła późniejszą rekonstrukcję trójwymiarową. Stopień penetracji przeciwciał można określić poprzez analizę powiązanego sygnału obserwowanego w całej grubości tkanki. Jest on zazwyczaj widoczny jako brak sygnału lub sygnał, który stopniowo maleje wraz z zapuszczaniem się głębiej w tkankę.

Renderowanie trójwymiarowe wykonane w programie Imaris umożliwiło wyraźną wizualizację złożonych sieci komórkowych i organizacji aksonalnej w obrębie nienaruszonej błony śluzowej. Renderowanie powierzchniowe, zastosowane poprzez progowanie intensywności dla poszczególnych kanałów, pozwoliło na wygenerowanie dokładnych reprezentacji 3D architektury tkanki przy jednoczesnym zachowaniu drobnych szczegółów strukturalnych.

W przypadku barwienia i wizualizacji oczekiwanymi rezultatami powinna być wyraźna wizualizacja sygnału barwienia celu, bez żadnej nieprawidłowej utraty sygnału lub jego pogorszenia w całej grubości tkanek. Brak możliwości wizualizacji znanego zabarwionego celu pod mikroskopem należy uznać za wynik niepowodzenia.

Rysunek 1. Przedstawienie obszaru anatomicznego z nałożonym obrazem preparatu całego fragmentu błony śluzowej. (A–C). Widok strzałkowy wnętrza lewej nozdrzy (barwienie hematoksyliną i eozyną, HE) myszy (A) z nałożonym barwieniem całego fragmentu błony śluzowej z tego samego obszaru (w celu orientacji anatomicznej) (B), prezentujący orientację i położenie pęczków aksonów w kolorze zielonym oraz jąder komórkowych w kolorze niebieskim. Technika ta umożliwiła zachowanie całej struktury anatomicznej: możliwe jest wyraźne rozróżnienie pęczków aksonów nerwu węchowego głównego (ON) i dodatkowych (nerwy jamno-nosowe, VNN), a także śledzenie ich przebiegu od przegrody do opuszki węchowej (OB), przez blaszkę sitową (B, C). Przedstawiona tkanka została zabarwiona Hoechstem na jądra (niebieski) oraz β-III-Tubuliną na pęczki aksonów (zielony). Obrazy reprezentatywne z n = 15 niezależnych preparatów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Widoki makroskopowe i schematyczne układu węchowego. (A) Przy użyciu kleszczyków do kości, prowadząc cięcie wzdłuż czerwonej przerywanej linii, usuwa się kość przegrody (obszar żółty). (B) Po odsłonięciu leżącej poniżej wklęsłej jamy nozdrza (kolor brązowy), można zebrać całą tkankę śluzową rozciągającą się z tego obszaru do błony śluzowej dróg oddechowych i węchowej. (C) Przedstawienie graficzne ilustrujące ciągłość tych struktur, rozciągających się od nabłonka węchowego aż po opuszki węchowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3. Powiększony widok obszaru anatomicznego uzyskanego dzięki protokołowi pobierania i barwienia całego preparatu (whole-mount). (A–D). Przedstawiono reprezentatywne obrazy ze zdrowej i uszkodzonej błony śluzowej. Od góry do dołu: nienaruszona błona śluzowa z tkanki zdrowej (n = 3) oraz uszkodzona błona śluzowa (n = 12). W tkance zdrowej (A) komórki OEC o wydłużonej morfologii bipolarnej (A, lewo) otaczają pęczki aksonów (A, środek), a fibroblasty tworzą zewnętrzną warstwę tych struktur tunelopodobnych (A, prawo, biała strzałka). Trzy wybrane obszary ROI odzwierciedlają te szczegóły (B). W uszkodzonej błonie śluzowej komórki OEC wykazują zarówno morfologię bipolarną, jak i okrągłą (C, D, lewo, białe strzałki). Pęczki aksonów wydają się mniej jednolite i zwarte (C, D, środek, białe strzałki). Fibroblasty występują szeroko w całym regionie (C, D, prawo, białe strzałki). Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4. Trójwymiarowe obrazowanie fluorescencyjne preparatów całych z błony śluzowej. (A–H). Obrazy komórek przy małym powiększeniu (A–F) oraz obraz przy dużym powiększeniu (G) zostały uzyskane ze stosów obrazów wielu kolejnych obszarów przy użyciu mikroskopu SpinSR. Komórki osłonkowe nerwu węchowego (OECs) zaznaczono kolorem czerwonym, fibroblasty kolorem magenta, aksony kolorem zielonym, a jądra kolorem niebieskim. Strzałki wskazują różne morfologie OEC (A) oraz zewnętrzną warstwę fibroblastów wokół pęczków aksonów (B i C). Na panelach D–F strzałki podkreślają podobieństwa w prawidłowych strukturach fibroblastów. Obrazy te uwidoczniły organizację przestrzenną komponentów komórkowych, które następnie zostały odwzorowane przy użyciu oprogramowania Imaris (H). Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Odczynnik	Cel	Rozcieńczanie	Warunki inkubacji	Uzasadnienie
Przeciwciało pierwszorzędowe
β$\beta$-tubulina (królik)	Aksony	1:300	przez 72 h w temperaturze 4 °Cna wałku rotacyjnym	aby umożliwić przeniknięcie przez pełną grubość
PDGFR-β (Szczur)	Fibroblasty	1:100
Przeciwciało wtórne
Alexa 488	Królicze przeciwciała pierwotne	1:250	Zawinięte w folię aluminiową, przez minimum 4 h w temperaturze pokojowej na rolce, a następnie przez noc w 4 °C na rotatorze.	Folia aluminiowa zapobiega fotoblaknięciu. Czas trwania, temperatura i mieszanie za pomocą wałka zapewniają dobrą penetrację.
Alexa 647	Pierwotne przeciwciała szczurze	1:500
Jądra komórkowe
Hoechst	Jądra komórkowe	1:2500

Tabela 1: Lista przeciwciał z rozcieńczeniami zoptymalizowanymi dla tego protokołu.W tabeli wymieniono odczynniki do barwienia wraz z ich celami, rozcieńczeniami oraz uzasadnieniem warunków inkubacji.

Dyskusja

Ostatnie kilka dekad stało się świadkiem stopniowego nadejścia ery trójwymiarowości, w której w dziedzinie nauki rozwinęło się wiele innowacyjnych podejść. Na przykład metody rekonstrukcji trójwymiarowej, możliwe dzięki opracowaniu złożonych technik obrazowania całych preparatów (whole-mount imaging) w połączeniu z wysokorozdzielczymi mikroskopami fluorescencyjnymi, ułatwiły lepsze zrozumienie histoarchitektury wielu tkanek o pełnej grubości. Podejścia te, oparte na renderowaniu trójwymiarowym, zostały wykorzystane do zdefiniowania wielu struktur ludzkiego organizmu, takich jak naczynia, gruczoły i powszechne nowotwory^4,5,6,7,8,9. Ponadto zgromadzono informacje na temat różnic między strukturami patologicznymi a prawidłowymi, na przykład w całych mózgach myszy^10,11,12. Podejście to zostało uznane za kluczowy krok w stronę lepszego zrozumienia różnych systemów biologicznych, ułatwiający głębsze pojęcie obwodów komórkowych, ich strukturalnej i funkcjonalnej organizacji przestrzennej oraz ich potencjalnego udziału w patologiach ludzkich.

Wadą różnych kombinacji trójwymiarowej rekonstrukcji i obrazowania tkanek jest fakt, że większość podejść obejmuje etapy utrwalania i przejrzystości tkanek (tissue clearing). Choć metoda ta jest użyteczna dla wielu tkanek, nie jest ona odpowiednia dla wszystkich ich rodzajów^8,9,19. W rzeczywistości procedury przejrzystości obejmują kilka etapów płukania, co może potencjalnie uszkodzić docelowe epitopy i wpłynąć na sygnały endogenne²⁰.

Opisane powyżej podejścia zostały wykorzystane do zdefiniowania wielu ważnych struktur komórkowych w różnych układach. Jednak w układzie węchowym i jego istotnych strukturach występuje minimalna ilość komponentów kostnych, które umożliwiłyby ich łatwą izolację; dlatego w ostatnich latach testowano podejścia z wykorzystaniem preparatów całych, które nie obejmują etapów klarowania^13,14.

Badania te potwierdziły znaczenie dokładniejszego zdefiniowania organizacji struktur neuronalnych w układzie węchowym. W związku z tym ich głównym celem było opracowanie przejrzystej mapy topograficznej rozmieszczenia neuronów sensorycznych węchu w oparciu o ekspresję różnych markerów¹⁴, a także uzyskanie nowych informacji na temat ich specyficznych rzęsek¹³.

Opracowana i zaprezentowana tutaj technika preparatyki całego preparatu (whole-mount) umożliwia pobranie i utrwalenie tkanki błony śluzowej w całości, otwierając możliwość uzyskania kluczowych informacji na temat struktury anatomicznej i fizjologicznej tego środowiska, ze szczególnym uwzględnieniem, w naszym przypadku, relacji między OEC, fibroblastami a pęczkami aksonów. Połączenie tej udoskonalonej techniki izolacji i barwienia z obrazowaniem konfokalnym o wysokiej rozdzielczości pozwoliło na zgromadzenie dużych obrazów odzwierciedlających strukturę całego docelowego obszaru oraz zamieszkujących go komórek. W szczególności nasza udoskonalona technika oferuje dwie istotne zalety: pobierana i przetwarzana jest cała błona śluzowa, w tym architektura blaszki właściwej¹³, a łagodniejsza metoda przygotowania tkanki pomaga zachować anatomię w skali makro, jak i oddziaływania międzykomórkowe (takie jak między komórkami glejowymi opuszkowymi, aksonami i fibroblastami) w porównaniu z innymi protokołami preparatyki płaskiej (flat-mount)¹⁴. To również powód, dla którego niniejszy protokół nie obejmuje walidacji w odniesieniu do barwienia cienkich przekrojów.

Jak wspomniano powyżej, techniki preparatyki całych organów zazwyczaj wiążą się z długimi okresami przetwarzania tkanek oraz stosowaniem specyficznych, kosztownych odczynników. Niniejsza metoda została opracowana z naciskiem na minimalne przetwarzanie tkanek, aby skrócić czas trwania procesu oraz zredukować ryzyko uszkodzenia istotnych struktur komórkowych. Zoptymalizowana metoda stanowi zatem szybki proces, który można przeprowadzić przy użyciu odczynników powszechnie stosowanych w immunohistochemii cienkich skrawków, stanowiąc trafną alternatywę dla podejść wymagających dłuższego czasu przetwarzania, które nie są odpowiednie dla struktur pozbawionych kości, takich jak tkanka śluzowa.

Pozyskiwanie obrazów oraz postprzetwarzanie można przeprowadzić przy użyciu dowolnej platformy mikroskopii konfokalnej zdolnej do akwizycji wysokorozdzielczych stosów z (z-stacks) z grubych próbek tkanek, z wystarczającą penetracją lasera umożliwiającą obrazowanie interesujących nas błon śluzowych (szczegółowe informacje na temat naszych ustawień akwizycji i przetwarzania obrazów znajdują się w sekcji metod).

Wierzymy, że po wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji protokół ten można przenieść i zastosować w innych powszechnych modelach gryzoni. Dzięki pewnym modyfikacjom specyficznym dla danej tkanki, metodę tę można zastosować w kilku różnych kontekstach, w tym do badania tkanek śluzowych i podśluzowych z układu oddechowego oraz przewodu pokarmowego (GIT); badania organizacji tkanek i interakcji wieloukładowych w obrębie układu nerwowego; analizy procesów zapalnych i tkanki limfatycznej związanej ze śluzówką (MALTs); a także do eksploracji różnych osi wieloukładowych, takich jak oś jelitowo-mózgowa.

Główną zaletą niniejszego protokołu są ulepszenia metodologiczne, które umożliwiają uzyskanie wysokiej jakości obrazowania trójwymiarowego przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanki oraz zapewnieniu stosunkowo szybkiego przebiegu procedury w porównaniu z innymi metodami preparatyki całych organów (whole-mount) testowanymi wcześniej w tej dziedzinie.

Pomyślna implementacja tego podejścia była w dużym stopniu zależna od głębokiej wiedzy anatomicznej na temat analizowanej tkanki. W naszym przypadku znajomość przewidywanej lokalizacji pęczków aksonów była niezbędna, aby zminimalizować inwazyjność procedury pobierania po odsłonięciu wnętrza czaszki. Wiedza anatomiczna ta okazała się kluczowa dla szybkiej lokalizacji interesującego regionu i tkanki oraz zachowania ogólnej struktury błony śluzowej, co podkreśla, że sukces w przetwarzaniu tkanek jest nierozerwalnie związany z przemyślaną strategią ich pobierania, a nie tylko z etapami obróbki następczej.

Jak wspomniano w kilku uwagach w sekcji metod, kluczowe dla opracowania i optymalizacji tej metody były liczne korekty techniczne. Utrzymywanie tkanki w stanie swobodnego unoszenia się w probówkach Eppendorf przez cały proces barwienia, w połączeniu z ciągłą rotacją podczas inkubacji z odczynnikami i przeciwciałami, stanowiło kluczową modyfikację w stosunku do bardziej statycznych protokołów preparatyki całych organów i cienkich przekrojów. Udoskonalenie to zapobiegło składaniu się tkanki, zapewniając jednocześnie jednorodne przenikanie odczynników przez całą próbkę, co poprawiło spójność barwienia bez konieczności stosowania zbędnych etapów przejaśniania. Ponadto niezbędna okazała się staranna optymalizacja czasu inkubacji dla każdego odczynnika i koktajlu przeciwciał. Ten ostatni krok może wymagać dalszych korekt w zależności od wybranego rodzaju przeciwciała.

Wspólnie czynniki te doprowadziły do zwiększenia powtarzalności przy jednoczesnym skróceniu całkowitego czasu przetwarzania oraz ograniczeniu agresywnego obchodzenia się z próbkami.

Kolejnym ważnym krokiem metodologicznym była możliwość niezawodnego określenia orientacji tkanki przed montażem i obrazowaniem, bez konieczności stosowania znakowania fluorescencyjnego. Stronę błony właściwej tkanki śluzowej można było łatwo zidentyfikować w mikroskopii w świetle przechodzącym dzięki obecności grubych pęczków nerwowych, wyraźnie odróżnialnych od otaczającej tkanki nabłonkowej. Stwierdzono, że standaryzacja orientacji próbek poprzez umieszczenie błony właściwej stroną do szkiełka nakrywnego, a warstwy nabłonkowej na szkiełku przedmiotowym, ułatwia uzyskanie wysokiej jakości obrazów. To proste, lecz skuteczne usprawnienie poprawiło spójność obrazowania między próbkami i przyczyniło się do jakości uzyskanych rekonstrukcji trójwymiarowych.

Należy jednak wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Niniejszy protokół nie został przetestowany na wielu powszechnych szczepach myszy ani innych gatunkach gryzoni. Podobnie, optymalizacje przeprowadzono w konkretnych warunkach eksperymentalnych opisanych powyżej i wyłącznie z zastosowaniem wymienionych paneli przeciwciał. Choć protokół powinien działać w przypadku większości szczepów myszy i szczurów, wielu różnych przeciwciał oraz wszelkich modeli eksperymentalnych umożliwiających pobranie błony śluzowej w pełnej grubości, może być wymagana dalsza, staranna optymalizacja. Innym istotnym ograniczeniem jest fakt, że pojedynczy preparat całego organu (whole-mount) można barwić tylko jednym panelem przeciwciał, w przeciwieństwie do tkanek ciętych w cienkie skrawki, gdzie każdy skrawek może zostać zabarwiony oddzielnym panelem przeciwciał, co pozwala na przetestowanie wielu różnych paneli przeciwciał na tkance ciętej.

Podsumowując, wprowadzone innowacje metodologiczne pokazują, w jaki sposób stosunkowo proste modyfikacje w przygotowaniu tkanek, warunkach barwienia i orientacji próbek mogą znacząco poprawić wyniki obrazowania całych preparatów (whole-mount). Dzięki unikaniu rozbudowanych etapów przetwarzania i klarowania tkanek, podejście to stanowi praktyczną i elastyczną alternatywę do badania delikatnych tkanek pozbawionych kości, umożliwiając jednocześnie pozyskanie szczegółowych, wielkoskalowych danych trójwymiarowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Seryjna albumina wołowa (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	Immunohistochemia
Adobe Illustrator		wersja 28.5
Przeciwciało anty-beta III tubulinie - marker neuronalny	Abcam	ab18207
Przeciwciało anty-PDGFR beta [APB5]	Abcam	ab91066
Trichlorowodorek bis-benzimidu H 33342	Sigma Aldrich	14533
LAMPKOWA OSŁONA 24X50MM NR 1.5 100SZT.	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	Immunohistochemia
Wtórne przeciwciało osiołkowe anty-królicze IgG (H+L), silnie adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Kombinerki do kości Dumont #15A - powlekane epoksydowo	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	Disekcja tkanek
Pęseta Dumont #7 - Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	Disekcja tkanek
Wtórne przeciwciało kozie anty-szczurze IgG (H+L), adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Oprogramowanie Imaris	Imaris	wersja 9.5.0	Obrazowanie
Nożyczki do dyssekcji Mayo	ProSciTech	420SS	Disekcja tkanek
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Obróbka tkanek
Fosforan buforowany roztwór soli, sterylne tabletki PBS (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	Obróbka tkanek
Medium montażowe ProLong Glass Antifade	Thermo Fisher Scientific	P36980	Immunohistochemia
Ostrze skalpela #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	Disekcja tkanek
Rękojeść skalpela #4	ProSciTech	T134	Disekcja tkanek
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Obróbka tkanek
Sacharoza	Chem-Supply	57-50-1	Obróbka tkanek
Preparatoryjne szkiełka mikroskopowe TOMO Adhesion	ProSciTech	GEMS63705-09	Immunohistochemia
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	Immunohistochemia