Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zachowanie złożoności tkankowej in vivo w modelu układu nerwowego węchowego myszy z wykorzystaniem analizy całych preparatów (whole-mount) do badania regeneracji neuronów

117 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72036

⸱

18 sierpnia 2026

 ,  ,  , 
1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia kompletny schemat postępowania w celu zachowania złożoności anatomicznej węchowego układu nerwowego myszy. Szczegółowo opisano tutaj cały przebieg prac, obejmujący sekcję, przygotowanie tkanek oraz obrazowanie. Protokół ten może być wykorzystany do badania układu węchowego w warunkach prawidłowych lub patologicznych, w tym w warunkach jego naturalnej regeneracji.

Streszczenie

W erze obrazowania trójwymiarowego (3D) standardowa immunohistochemia jest uznawana za wysoce ograniczoną w badaniach nad patologią i złożoną anatomią człowieka. Analiza jedynie wąskich plastrów może prowadzić do utraty krytycznych szczegółów kontekstowych w przypadku większych struktur i istotnych aspektów architektury tkankowej, co skutkuje niepełnymi lub błędnymi interpretacjami. Choć przekroje dwuwymiarowe (2D) pozwoliły na podstawowe zrozumienie histoarchitektury, są one niewystarczające do uchwycenia rzeczywistej trójwymiarowej natury tkanek biologicznych.

Coraz więcej badań prowadzonych w wielu regionach anatomicznych wykorzystuje obecnie techniki izolujące nienaruszone jednostki anatomiczne – preparaty typu flat mount, whole-mount lub en face – w połączeniu z fluorescencyjną mikroskopią o wysokiej rozdzielczości. Podejścia te oferują bardziej kompleksową wizualizację i interpretację organizacji strukturalnej. Ma to szczególne znaczenie w obrębie węchowego układu nerwowego, gdzie zdefiniowanie złożonych mechanizmów komórkowych leżących u podstaw jego niezwykłej zdolności regeneracyjnej wymaga kontekstu pełnej grubości tkanki. W przypadku cienkich przekrojów istnieje ryzyko pominięcia kluczowych cech patofizjologicznych, które pozostają słabo zdefiniowane.

Biorąc pod uwagę te ograniczenia oraz lukę w wiedzy dotyczącą oddziaływań komórkowych napędzających regenerację węchową, niezbędne stało się opracowanie udoskonalonej techniki preparatyki całego narządu (whole-mount), zdolnej do zachowania złożoności tkanek o pełnej grubości. Całe błony śluzowe nosa wyizolowano jako próbki o pełnej grubości, stosując zoptymalizowany protokół penetracji przeciwciał. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości (EVIDENT SpinSR) oraz rekonstrukcja 3D umożliwiły dokładną wizualizację oddziaływań komórkowych in vivo.

Wprowadzenie

Węchowy układ nerwowy (WUN) stanowi unikalny i dobrze ugruntowany model badania mechanizmów regeneracji nerwowej, ponieważ zachowuje on wyjątkową zdolność do wymiany neuronów przez całe życie1. Jednak potencjał klinicznego zastosowania tej zdolności neuroreparacyjnej pozostaje ograniczony ze względu na znaczące luki w naszej wiedzy na temat zachowania komórek w układzie węchowym2,3,4. Odpowiedzi komórkowe i organizacja anatomiczna WUN, w tym pierwotne neurony węchowe, komórki osłonkowe nerwu węchowego (OECs) oraz fibroblasty okołonerwowe, zostały opisane w kilku badaniach na zwierzętach, opierających się na wykonywaniu ultracienkich (<2 µm) przekrojów tkankowych w połączeniu z modelami ciężkich urazów fizycznych zastosowanych w WUN gryzoni1,2. Zwierzęta w tych badaniach były zazwyczaj uśmiercane 10 dni po urazie, co dawało wgląd jedynie w jeden konkretny moment rozległego i bardziej złożonego przebudowywania takiej tkanki podczas urazu nerwowego2. W badaniach tych wykazano, że po obumarciu aksonów komórki OECs i fibroblasty utrzymują się w formie ciągłych kanałów po urazie.

Mimo że podejście to dostarczyło cennych informacji, ze względu na liczne opisane powyżej ograniczenia, pozwoliło ono jedynie na uzyskanie koncepcyjnego przeglądu ONS o niskiej rozdzielczości i na powierzchownym poziomie, co w konsekwencji uniemożliwiło kompleksową ocenę rzeczywistej organizacji komórkowej w nienaruszonym ONS3. W rezultacie mogło dojść do pominięcia kluczowych zależności przestrzennych.

Zachowanie trójwymiarowej struktury tkanki jest niezbędne do dokładnej analizy anatomicznej i komórkowej i zostało z powodzeniem zastosowane w wielu narządach i jednostkach chorobowych4,5,6,7,8,9,10,11,12. Podejścia z wykorzystaniem preparatów całych organów (whole-mount) stosowano do mapowania organizacji neuronów w błonie śluzowej węchu13,14, jednak wizualizacja interakcji komórkowych w pełnej strukturze ONS, w tym z zachowaną warstwą właściwą (lamina propria), nie została jeszcze przeprowadzona.

W niniejszym badaniu opracowaliśmy schemat pracy z wykorzystaniem modelu mysiego, obejmujący przetwarzanie tkanek w całości, immunobarwienie, obrazowanie o wysokiej rozdzielczości oraz rekonstrukcję trójwymiarową, co umożliwia szczegółową analizę architektury ONS. Protokół ten został opracowany w celu uzupełnienia luki w istniejących opublikowanych metodach; pozwala on na konserwację i zachowanie pełnej grubości błony śluzowej węchowej, w tym blaszki właściwej, co umożliwia badanie oddziaływań międzykomórkowych. Co istotne, ta udoskonalona metodologia pobierania i przetwarzania tkanek może być stosowana i łączona z różnymi modelami układu węchowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt i komórek zmodyfikowanych transgenicznie zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Griffith (NLRD/003/2020_var3) oraz Komisji Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu Griffith (MHIQ/04/23/AEC), zgodnie z wytycznymi australijskiego regulatora technologii genowych Office of Gene Technology regulator (OGTR).

UWAGA: W badaniu wykorzystano łącznie 15 dorosłych myszy laboratoryjnych (8–9 tygodni) obu płci. Konkretnie zastosowano myszy transgeniczne S100β-DsRed, w których wszystkie OEC wykazują ekspresję jaskrawoczerwonego białka DsRed pod kontrolą promotora S100β. S100β należy do szerszej rodziny białek wiążących wapń i jest powszechnie eksponowane w komórkach glejowych ośrodkowego układu nerwowego, takich jak OEC. Model ten był optymalny dla celów niniejszych eksperymentów, ponieważ umożliwiał łatwą lokalizację docelowych populacji komórek przy użyciu endogennych sygnałów fluorescencyjnych. Myszy transgeniczne S100β-DsRed zostały wygenerowane wcześniej i wykazano, że ich zastosowanie zapewnia lepszą detekcję OEC w porównaniu z immunohistochemią w analizach tkanek utrwalonych15,16,17,18.

1. Pobieranie głów i utrwalanie tkanek

  1. Uśmierć zwierzęta poprzez inhalację rosnącego stężenia CO2 w wyznaczonych punktach czasowych eksperymentu.
  2. Potwierdź zgon poprzez brak odruchów rogówkowych i wycofywania kończyny, a następnie przeprowadź zwichnięcie szyi lub postąp zgodnie z zatwierdzoną procedurą SOP.
  3. Za pomocą nożyczek usuń całą głowę wraz z żuchwami.
  4. Usuń skórę z czaszki oraz chrząstkę z koniuszka nosa, aby odsłonić jamę nosową i zapewnić efektywną penetrację utrwalacza.
    UWAGA: Zaobserwowano, że ten etap wycięcia najbardziej przedniej części chrząstki nosowej zwierzęcia jest kluczowy dla prawidłowego utrwalenia tkanki wewnątrz jamy nosowej.
  5. Szybko wypłucz głowy w PBS 1×, aby usunąć nadmiar krwi.
  6. Utrwal tkankę poprzez zanurzenie na noc (12–18 h) w 4% paraformaldehydzie, przez co najmniej 6 h (czas wystarczający do utrwalenia badanej tkanki) w temperaturze 4 °C na rotatorze.
    OSTROŻNIE: Paraformaldehyd jest niebezpieczną substancją chemiczną, która uwalnia opary formaldehydu. Jest toksyczny przy wdychaniu, kontakcie ze skórą i połknięciu; powoduje podrażnienie oczu, skóry i dróg oddechowych oraz jest podejrzewany o działanie rakotwórcze. Należy z nim pracować wyłącznie w dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu. Bezpieczna utylizacja niebezpiecznych substancji chemicznych i odpadów biologicznych powstałych podczas protokołu musi odbywać się zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi.
    ​UWAGA: Podczas optymalizacji zaobserwowano, że 6 h było wystarczające do utrwalenia badanej tkanki; jednak czas powyżej 12 h mógł prowadzić do nadmiernego utrwalenia i degradacji struktur śluzówki.
  7. Wyjmij głowy z utrwalacza i płucz je przez 3 h w PBS 1× w temperaturze pokojowej (20–25 °C) na rotatorze.
  8. Przechowuj głowy w świeżym PBS w temperaturze 4 °C i pobierz tkankę śluzówki w całości (whole-mount) w ciągu 48 h.

2. Pobieranie całych próbek tkanek

  1. Przeprowadź izolację tkanki pod mikroskopem.
  2. Przeciąć głowy na pół za pomocą skalpela, prowadząc cięcie wzdłuż linii pośrodkowej sagi.
  3. Odsłonić wnętrze jamy nosowej (Rysunek 1). Zidentyfikować obszary anatomiczne i pobrać tkankę śluzówkową wyścielającą cały przekrój anatomiczny (Rysunek 1B).
  4. Używając przecinaka do kości, ostrożnie przełam i usuń kość przegrody pokrywającą część jamy śluzówkowej.
    UWAGA: Zob. Rysunek 2AKrok ten jest kluczowy dla odsłonięcia wklęsłej jamy pod kością, gdzie pęczki aksonów przebiegają przez ścianę grzbietową (Rysunek 1B).
  5. Po odsłonięciu tego obszaru należy użyć zakrzywionej pęsety, aby delikatnie oddzielić i wybrać tkankę z wklęsłej ściany grzbietowej. Należy unieść tkankę znad leżącej pod nią kości i ostrożnie odwarstwić pozostałą błonę śluzową węchową, aby pobrać nienaruszoną preparację w całości (whole-mount).
    UWAGA: Na tym etapie wymagana była szczególna ostrożność, aby uniknąć przerwania tkanki.
  6. Pobrać interesującą tkankę z obu nozdrzy: błonę śluzową pokrywającą przegrodę, grzbietowe ściany lewą i prawą oraz blaszkę sitową jamy nosowej (Rysunek 1A, B)Pobierz tkankę z obu nozdrzy, w tym z przegrody nosowej, ścian grzbietowych oraz blaszki sitowej, aby wyizolować obszar anatomiczny zawierający główne struktury węchowe (Rysunek 2C).
  7. Zebrane tkanki przemyć w 1× PBS i usunąć wszelkie niepożądane fragmenty, w tym fragmenty kości. Tkanki przechowywać w 1× PBS w temperaturze 4 °C do późniejszej analizy immunohistochemicznej.
    UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania tkanki zaleca się przechowywanie jej w roztworze PBS 1× z dodatkiem 0,001% (w/v) azotku sodu w temperaturze 4 °C.

3. Zoptymalizowany protokół barwienia

UWAGA: Powszechnie stosowane protokoły barwienia są zazwyczaj optymalizowane dla skrawków o małej lub średniej grubości (np. do 50 µm). W związku z tym protokół musiał zostać dostosowany do znacznie grubszej tkanki.
​Zauważono, że kluczowym krokiem jest utrzymywanie tkanki w stanie zawieszenia w probówkach Eppendorf przez cały proces barwienia oraz umieszczanie probówek na walcarku podczas penetracji odczynników. Dlatego etapy barwienia nie były przeprowadzane z tkanką na szkiełku do obrazowania. Tkankę barwiono najpierw w zawieszeniu, a następnie montowano na szkiełkach do obrazowania. Takie rozwiązanie zapobiegło zwijaniu się tkanki i zapewniło penetrację całego obszaru przez odczynniki i przeciwciała.

  1. Wyjąć tkanki z przechowywania i umieścić je w probówce Eppendorfa z roztworem blokującym (dobór roztworu zależy od specyfiki barwienia).
    ​UWAGA: Roztwór blokujący: 3% BSA, 0,3% Triton X-100 w PBS. Inną istotną korektą był czas ekspozycji tkanki na każdy odczyn i koktajl przeciwciał.
  2. Przechowywać tkankę w roztworze blokującym przez 3 h w temperaturze pokojowej na walcarku.
    UWAGA: Zaobserwowano, że zwiększenie czasu ekspozycji w porównaniu do standardowego podejścia do immunohistochemii cienkich skrawków pozwala uniknąć zwiększania stężenia wybranych przeciwciał i odczynników barwiących (Tabela 1). Pozwoliło to również zminimalizować zużycie kosztownych przeciwciał. Inkubacje przeprowadza się w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 mL z odciętym zatrzaskiem pokrywki, aby probówka mogła obracać się na walcarku. Objętość odczynnika wynosiła 500 µL.
  3. Inkubować przez 72 h w 4°C z przeciwciałami pierwotnymi na walcarku.
  4. Przemyć tkankę dwukrotnie (każde płukanie trwa 1,5 h) za pomocą PBS 1× w temperaturze pokojowej na walcarku.
  5. Inkubować tkankę z przeciwciałem wtórnym (zawiniętą w folię aluminiową) i barwnikiem do jąder przez minimum 4 h w temperaturze pokojowej na walcarku, a następnie przenieść na noc (12–18 h) do 4°C na walcarku.
  6. Przemyć tkankę dwukrotnie (po 1,5 h każde płukanie) za pomocą PBS 1× w temperaturze pokojowej na walcarku.

4. Przygotowanie preparatów

  1. Ostrożnie przenieś tkankę z probówki Eppendorf
  2. Pod mikroskopem umieść tkankę na szkiełku przedmiotowym, upewniając się, że nie występują w niej żadne zagięcia.
    UWAGA: Orientację tkanki można określić pod mikroskopem bez użycia fluorescencji. Stronę błony właściwej tkanki śluzowej należy umieścić na szkiełku tak, aby nabłonek przylegał do szkła przedmiotowego, a błona właściwa była skierowana w stronę szkiełka nakrywkowe. Błonę właściwą można zidentyfikować po obecności grubych pęczków nerwowych, które są widoczne bez barwienia. Ustawienie tkanki tak, aby błona właściwa była skierowana ku nakrywce, a nabłonek spoczywał na szkiełku przedmiotowym, ułatwi proces barwienia oraz obrazowania.
  3. Przykryj preparaty szkiełkami nakrywkowymi, używając fluorescencyjnego medium montującego, a następnie zabezpiecz szkiełka.
  4. Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4 °C po wysuszeniu przez noc (12–18 h) w ciemności w temperaturze pokojowej

5. Pozyskiwanie obrazów i postprocessing

  1. Pozyskiwanie obrazów immunofluorescencyjnych przy niskim powiększeniu
    1. Wykonaj automatyczne łączenie obrazów (stitching) podczas akwizycji, stosując liniowe blendowanie alfa.
      ​UWAGA: Liczbę klatek w stosie z (z-stack) należy dostosować do grubości preparatu, aby zapewnić pełne pokrycie objętości tkanki.
    2. Przejmij sąsiednie pola widzenia z 15% zakładką. Pozyskaj obrazy kafelkowe, stosując meandrowy wzór akwizycji.
    3. Dostosuj całkowitą liczbę przekrojów optycznych do grubości tkanki.
    4. Ustaw kalibrację obrazu na 215.594 nm/pixel w obu osiach, X i Y. Pozyskaj obrazy w formie stosów z, stosując krok z wynoszący 0.8 µm.
    5. Umieść zamontowaną tkankę w całości (whole-mount) na stoliku mikroskopu konfokalnego. Pozyskaj obrazy przeglądowe, używając obiektywu 30x (NA 1.04).
  2. Pozyskiwanie obrazów immunofluorescencyjnych przy wysokim powiększeniu.
    1. Pozyskaj szczegółowe obrazy, używając obiektywu 60× (NA 1.5). Ustaw kalibrację obrazu na 107.923 nm/pixel w obu osiach, X i Y. Pozyskaj obrazy w formie stosów z, stosując krok z wynoszący 0.41 µm.
    2. Dostosuj całkowitą liczbę przekrojów optycznych do grubości tkanki i wykonaj zdjęcia z jednego pola widzenia.
      ​UWAGA: W przypadku akwizycji 60× łączenie obrazów nie jest wymagane, ponieważ każdy zestaw danych składa się z pojedynczego pola widzenia.
  3. Pozyskiwanie referencyjnych obrazów histologicznych
    1. Wykonaj obrazy barwionych HE przekrojów środkowych strzałkowych głowy myszy, używając mikroskopu skanującego preparaty w oświetleniu w jasnym polu.
    2. Pozyskaj obrazy, używając obiektywu 40× (NA 0.95) oraz powiększenia kamery 0.63x, co daje efektywne powiększenie 25.2×.
    3. Potwierdź kalibrację pikseli na poziomie 136.905 nm/pixel w obu osiach, X i Y, a następnie pozyskaj obraz w jednej płaszczyźnie ogniskowej.
    4. Połącz obrazy kafelkowe automatycznie, stosując meandrowy wzór akwizycji i liniowe blendowanie alfa.
  4. Pozyskiwanie referencyjnych immunofluorescencyjnych obrazów przeglądowych
    1. Pozyskaj uzupełniające immunofluorescencyjne obrazy przeglądowe, używając obiektywu 10x.
    2. Przejmij preparat jako pojedynczy przekrój z, stosując 0% zakładki kafelków podczas akwizycji obrazu.
    3. Ustaw kalibrację obrazu na 647.249 nm/pixel w obu osiach, X i Y, a następnie wygeneruj obraz przeglądowy obejmujący cały anatomiczny obszar zainteresowania.
  5. Przetwarzanie obrazów i generowanie końcowych rycin.
    1. Wyeksportuj pozyskane zestawy danych obrazowych do oprogramowania do analizy obrazu. Wygeneruj projekcje maksymalnej intensywności (MIPs) z zestawów danych z-stack.
    2. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) do późniejszej analizy i przygotowania rycin.
    3. Połącz immunofluorescencyjne obrazy przeglądowe z odpowiadającymi im obrazami HE, aby stworzyć anatomiczne ryciny referencyjne. Następnie zweryfikuj wyrównanie i odpowiedniość anatomiczną między zestawami danych fluorescencyjnych a histologicznymi przed przygotowaniem rycin.
      UWAGA: Wszystkie operacje łączenia obrazów powinny być wykonywane automatycznie podczas akwizycji, przy użyciu predefiniowanych ustawień mikroskopu i nie powinny wymagać dodatkowego postprocesingu. W naszym przypadku renderowanie 3D zostało wygenerowane przy użyciu oprogramowania Imaris: do stworzenia rekonstrukcji 3D wykorzystano wtyczkę do renderowania powierzchni (surface rendering), opartą na progowej intensywności dla każdego pozyskanego kanału. Ostatecznie obrazy końcowe zostały zestawione w programie Adobe Illustrator.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zaprezentowane tutaj podejście do preparatyki całego narządu umożliwiło izolację i utrwalenie błony śluzowej węchowej w całości. W naszym przypadku skupiliśmy się na zrozumieniu zmian komórkowych i anatomicznych zarówno w skali makro (pełny widok anatomiczny), jak i mikro (poziom komórkowy).

Metoda analizy preparatów całych (whole-mount) pozwala na pobranie zarówno nabłonka, jak i warstwy właściwej błony śluzowej oraz zachowanie zależności przestrzennych między pęczkami aksonów, komórkami otac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ostatnie kilka dekad stało się świadkiem stopniowego nadejścia ery trójwymiarowości, w której w dziedzinie nauki rozwinęło się wiele innowacyjnych podejść. Na przykład metody rekonstrukcji trójwymiarowej, możliwe dzięki opracowaniu złożonych technik obrazowania całych preparatów (whole-mount imaging) w połączeniu z wysokorozdzielczymi mikroskopami fluorescencyjnymi, ułatwiły lepsze zrozumienie histoarchitektury wielu tkanek o pełnej grubości. Podejścia te, oparte na renderowaniu trójwymiarowym, zostały wykorzystane do zd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana finansowo przez Clem Jones Foundation, Perry Cross Spinal Research Foundation oraz Motor Accident Insurance Commission dla JSTJ i RR, a także przez stypendium National Injury Insurance Scheme Queensland dla RR oraz stypendium Perry Cross Spinal Research Foundation dla FO. Część tego projektu była wspierana przez „Griffith University Post-Graduate Research Scholarship (GUPRS)” oraz „Griffith University International Postgraduate Research Scholarship (GUIPRS)” dla FO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Seryjna albumina wołowa (BSA)Sigma-AldrichA3294-50GImmunohistochemia
Adobe Illustratorwersja 28.5
Przeciwciało anty-beta III tubulinie - marker neuronalnyAbcamab18207
Przeciwciało anty-PDGFR beta [APB5]Abcamab91066
Trichlorowodorek bis-benzimidu H 33342Sigma Aldrich14533
LAMPKOWA OSŁONA 24X50MM NR 1.5 100SZT.Bio-strategyEPBRCS245015GPImmunohistochemia
Wtórne przeciwciało osiołkowe anty-królicze IgG (H+L), silnie adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
Kombinerki do kości Dumont #15A - powlekane epoksydowoDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02Disekcja tkanek
Pęseta Dumont #7 - Biologie/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10Disekcja tkanek
Wtórne przeciwciało kozie anty-szczurze IgG (H+L), adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
Oprogramowanie ImarisImariswersja 9.5.0Obrazowanie
Nożyczki do dyssekcji MayoProSciTech420SSDisekcja tkanek
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148-500GObróbka tkanek
Fosforan buforowany roztwór soli, sterylne tabletki PBS (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014Obróbka tkanek
Medium montażowe ProLong Glass AntifadeThermo Fisher ScientificP36980Immunohistochemia
Ostrze skalpela #23Scalpel Blades Swann MortonCOS240BDisekcja tkanek
Rękojeść skalpela #4ProSciTechT134Disekcja tkanek
Azydek soduSigma-AldrichS2002-25GObróbka tkanek
SacharozaChem-Supply57-50-1Obróbka tkanek
Preparatoryjne szkiełka mikroskopowe TOMO AdhesionProSciTechGEMS63705-09Immunohistochemia
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100mLImmunohistochemia

Bibliografia

  1. Li Y, Field P M, Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 1997;277 (5334),2000–2002.
  2. Li Y, Field P M, Raisman G. Olfactory ensheathing cells and olfactory nerve fibroblasts maintain continuous open channels for regrowth of olfactory nerve fibres. Glia. 2005;52(3):245–251.
  3. Yamaguchi M, et al. The New Era of Three-Dimensional Histoarchitecture of the Human Endometrium. J Pers Med. 2021;11(8).
  4. Falk M, Ynnerman A, Treanor D, Lundström C. Interactive visualization of 3D histopathology in native resolution. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 2018;25(1):1008–1017.
  5. Kiemen A, et al. In situ characterization of the 3D microanatomy of the pancreas and pancreatic cancer at single-cell resolution. BioRxiv. 2020.2012. 2008.416909, (2020).
  6. Tian J, et al. Three-dimensional reconstruction of laryngeal cancer with whole organ serial immunohistochemical sections. Sci Rep. 2020;10(1):18962.
  7. Lotz JM, et al. Integration of 3D multimodal imaging data of a head and neck cancer and advanced feature recognition. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2017;1865(7):946–956.
  8. Nojima S, et al. CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis. Sci Rep. 2017;7(1):9269.
  9. Tainaka K, et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell reports. 2018;24(8):2196–2210.e2199.
  10. Onozato ML, Klepeis VE, Yagi Y, Mino-Kenudson M. A role of three-dimensional (3D)-reconstruction in the classification of lung adenocarcinoma. Stud Health Technol Inform. 2012;35(2):79–84.
  11. Hama H, et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of the transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 2011;14(11):1481–1488.
  12. Tainaka K, et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 2014;159(4):911–924.
  13. Oberland S, Neuhaus EM. Whole mount labeling of cilia in the main olfactory system of mice. J Vis Exp. 2014;10.3791/52299(94).
  14. Gavid M, et al. Technique of flat-mount immunostaining for mapping the olfactory epithelium and counting the olfactory sensory neurons. PLoS One. 2023;18(1):e0280497.
  15. Windus LC, et al. Stimulation of olfactory ensheathing cell motility enhances olfactory axon growth. Cell Mol Life Sci. 2011;68(19):3233–3247.
  16. Windus LC, Claxton C, Allen CL, Key B, St John JA. Motile membrane protrusions regulate cell-cell adhesion and migration of olfactory ensheathing glia. Glia. 2007;55(16):1708–1719.
  17. Windus LC, et al. Lamellipodia mediate the heterogeneity of central olfactory ensheathing cell interactions. Cell Mol Life Sci. 2010;67(10):1735–1750.
  18. Chehrehasa F, et al. Olfactory glia enhance neonatal axon regeneration. Mol Cell Neurosci. 2010;45(3):277–288.
  19. Ueda HR, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 2020;21(2):61–79.
  20. Jing D, et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Res. 2018;28(8):803–818.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie trójwymiarowetkanka o pełnej grubościmikroskopia o wysokiej rozdzielczościpenetracja przeciwciałrekonstrukcja 3Dbłona śluzowa węchowa

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.