Artykuł metodologiczny

Rytmy okołodobowe w szalce Petriego: synchronizacja komórek mHypoE-42 podwzgórza myszy do analizy ekspresji genów zegara okołodobowego

159 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72039

⸱

3 września 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół przedstawia praktyczny i powtarzalny schemat synchronizacji hodowlanych komórek, przeprowadzania przesuniętego w czasie pobierania próbek w przedziale od 24 do 72 h bez konieczności nocnej zbiórki oraz analizy ekspresji genów zegara okołodobowego.

Streszczenie

Rytmy okołodobowe to endogenne oscylacje o okresie około 24 h, które regulują szeroki zakres procesów komórkowych i fizjologicznych, w tym ekspresję genów, metabolizm oraz zachowanie. Rytmy te wynikają z powiązanych ze sobą pętli sprzężenia zwrotnego transkrypcyjno-translacyjnego, które reagują na sygnały czasowe i środowiskowe. Ponieważ regulacja okołodobowa jest wysoce dynamiczna, nawet niewielkie zmienne eksperymentalne mogą wpływać na fazę, amplitudę i rytmiczność, co sprawia, że ustandaryzowane schematy eksperymentalne są niezbędne do uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie praktycznego i powtarzalnego schematu synchronizacji hodowli komórkowych, pobierania próbek w serii czasowej oraz analizy ekspresji genów zegara okołodobowego w standardowych warunkach laboratoryjnych. Protokół opisuje synchronizację opartą na szoku surowiczym, przesunięte w czasie pobieranie próbek w okresie od 24 do 72 h w celu uniknięcia pobierania próbek w nocy, ekstrakcję kwasu rybonukleinowego, syntezę komplementarnego kwasu deinoksyrybonukleinowego, ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym oraz analizę rytmu okołodobowego z wykorzystaniem odpowiednich metod statystycznych. Schemat pracy podkreśla również krytyczne aspekty eksperymentalne, w tym warunki synchronizacji, ocenę jakości próbek, wybór genów referencyjnych oraz analizę danych, aby zwiększyć powtarzalność między eksperymentami. Metoda ta stanowi dostępny sposób badania molekularnych mechanizmów okołodobowych i oceny rytmicznej ekspresji genów w hodowlach komórkowych, ułatwiając badania nad regulacją okołodobową w fizjologicznych i chorobowych modelach eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Rytmy okołodobowe to endogenne cykle o okresie około 24 h, które regulują szeroki zakres procesów fizjologicznych, metabolicznych i komórkowych1. W organizmach ssaków rytmy te są koordynowane przez zegar centralny zlokalizowany w jądrach nadskrzyżowaniowych (SCN) podwzgórza oraz przez autonomiczne zegary molekularne na poziomie komórkowym. Zegary te składają się z powiązanych pętli sprzężenia zwrotnego transkrypcyjno-translacyjnego z udziałem kluczowych genów zegarowych, w tym circadian locomotor output cycles protein kaput (Clock), basic helix-loop-helix aryl hydrocarbon receptor nuclear translocase-like 1 (Bmal1), period (Per) oraz cryptochrome (Cry)2. Ze względu na centralną rolę zegara okołodobowego w różnorodnych procesach biologicznych, modele komórkowe in vitro stały się ważnymi narzędziami do badania molekularnych mechanizmów regulacji czasowej w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych.

Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie niezawodnego, praktycznego i powtarzalnego schematu postępowania w celu synchronizacji hodowli komórkowych przy użyciu protokołu szoku surowiczego, przeprowadzenia sekwencyjnego pobierania próbek w czasie oraz analizy ekspresji genów zegara okołodobowego, przy jednoczesnym uniknięciu nocnego zbierania próbek. Poprzez zwiększenie wykonalności pobierania próbek okołodobowych bez pogorszenia jakości danych, niniejszy schemat postępowania ma na celu ułatwienie badań nad rytmicznymi procesami biologicznymi z wykorzystaniem standardowych technik laboratoryjnych.

Badania nad rytmami okołodobowymi przeprowadzono na szerokim zakresie modeli in vitro, w tym na liniach komórek nowotworowych człowieka3, fibroblastach rat-14, eksplantach  jądra nadskrzyżowaniowego (SCN)5 oraz organoidach6. Chociaż większość komórek ssaków posiada funkcjonalne zegary okołodobowe, brak sygnałów synchronizujących, takich jak światło, szybko prowadzi do desynchronizacji w hodowli, co ogranicza badanie rytmów okołodobowych in vitro7. Dlatego techniki synchronizacji są niezbędne do badania mechanizmów molekularnego zegara oraz ich znaczenia w zdrowiu i chorobach.

Opracowano kilka strategii synchronizacji dla hodowlanych komórek ssaków. Synchronizacja oparta na glikokortykosterydach z użyciem deksametazonu jest jedną z najczęściej stosowanych metod, ponieważ skutecznie resetuje rytmy okołodobowe w wielu typach komórek, jednocześnie redukując część zmienności związanej ze stymulacją surowiczą8. Podobnie, aktywacja sygnalizacji cyklicznego adenozynomonofosforanu za pośrednictwem forskoliny była z sukcesem stosowana do synchronizacji zegarów peryferyjnych w wybranych modelach komórkowych9. Inne podejścia obejmują traktowanie sygnałami przenoszonymi przez krew4, różnymi związkami chemicznymi8,10, wymianę pożywki3, szok termiczny11, cykle tlenowe12 oraz stymulację mechaniczną13. Łącznie metody te znacząco rozwinęły badania nad rytmami okołodobowymi; mogą one jednak wymagać specjalistycznego sprzętu, specyficznych warunków eksperymentalnych lub dodatkowej optymalizacji, co sprawia, że istotne jest zweryfikowanie wybranej strategii synchronizacji dla każdego modelu biologicznego i zastosowania eksperymentalnego14.

Szok surowiczy jest jedną z najszerzej stosowanych metod synchronizacji i polega na poddaniu hodowlanych komórek krótkotrwałej stymulacji wysokim stężeniem surowicy4. Ponieważ stymulacja ta jest przejściowa, zminimalizowane zostaje długotrwałe zaburzenie ścieżek sygnalizacyjnych komórek4, co ogranicza potencjalne efekty zakłócające analizy końcowe. W konsekwencji szok surowiczy jest szczególnie odpowiedni do badań ekspresji genów okołodobowych oraz funkcji molekularnego zegara. Ponadto procedura ta jest łatwa w implementacji i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, co czyni ją dostępną i łatwo powtarzalną w różnych laboratoriach. Praktycznym ograniczeniem eksperymentów z wykorzystaniem szoku surowiczego jest jednak intensywny harmonogram pobierania próbek, niezbędny do dokładnej charakterystyki rytmu okołodobowego. Niezawodna analiza rytmiki zazwyczaj wymaga gromadzenia próbek w regularnych odstępach czasu, zwykle co 2–6 h przez jeden lub więcej cykli okołodobowych (24–72 h)14, co często wiąże się z koniecznością pobierania próbek w nocy.

Opisany tutaj schemat postępowania rozwiązuje ten problem logistyczny poprzez rozłożenie w czasie rozpoczęcia synchronizacji na wielu płytkach hodowlanych, co umożliwia pełne pobieranie próbek w rytmie okołodobowym w standardowych godzinach pracy, unikając konieczności nocnej zbiórki próbek. Zamiast wprowadzać nową strategię synchronizacji, niniejszy protokół zapewnia szczegółową i powtarzalną implementację ugruntowanej metody szoku surowiczego w połączeniu z praktycznym harmonogramem pobierania próbek i późniejszą analizą ekspresji genów. Ten schemat pracy jest szczególnie odpowiedni do badań ekspresji genów okołodobowych w hodowlach komórkowych z wykorzystaniem powszechnie dostępnych technik laboratoryjnych. Przy adaptacji protokołu do dodatkowych modeli komórkowych należy zoptymalizować i zwalidować parametry eksperymentalne, w tym gęstość komórek, warunki synchronizacji, odstępy między pobraniami próbek oraz dobór genów referencyjnych dla konkretnego typu komórek przed wdrożeniem metody.

Protokół

Poniższy protokół opisuje zwalidowaną metodę synchronizacji dla linii komórkowych podwzgórza embrionalnego myszy mHypoE-42. Przed zastosowaniem tej metody w innych typach hodowlanych komórek należy niezależnie zwalidować i zoptymalizować protokół synchronizacji. Przegląd przebiegu prac przedstawiono na Rysunku 1, a tygodniowy harmonogram pobierania próbek na Rysunku uzupełniającym 1. Wszystkie odczynniki, sprzęt i urządzenia wykorzystane w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów. Wszystkie procedury hodowli komórkowej należy przeprowadzać w certyfikowanej komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając sterylnych odczynników i sprzętu.

Schemat procesu synchronizacji komórek, metoda szoku surowiczego, oś czasu, układ eksperymentalny, interwały CT.
Rysunek 1. Schematyczny przegląd protokołu przesuniętej synchronizacji szokiem surowiczym. Schemat ilustrujący przebieg pracy wykorzystywany do synchronizacji komórek mHypoE-42 za pomocą szoku surowiczego w dwóch przesuniętych zestawach eksperymentalnych. Przesunięty projekt umożliwia pobieranie próbek w rytmie okołodobowym w standardowych godzinach pracy, unikając pobierania próbek w nocy. Próbki są następnie poddawane ekstrakcji RNA, ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) oraz analizie rytmu okołodobowego. Utworzono w Biorender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

1. Hodowla komórkowa

  1. Hodować adherentne komórki mHypoE-42 w podłożu Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy (4500 mg/L), uzupełnionym o 10% (v/v) inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 3,7 g/L wodorowęglanu sodu oraz 1% roztwór antybiotyków.
  2. Utrzymywać komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem, zawierającym 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla (CO2), wykorzystując kolby hodowlane T75 z końcową objętością hodowli 10 mL.
    UWAGA: Przetestuj każdą nową partię FBS przed rozpoczęciem eksperymentów, ponieważ partie surowicy mogą się różnić.
  3. Przesiewać komórki, gdy osiągną około 80%–90% konfluencji. Przemyć komórki sterylnym 1× roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; pH 7,4), dodać 3 mL 0,5% roztworu trypsyny i inkubować przez 3–5 min w celu odklejenia komórek.
  4. Dodać co najmniej dwukrotność objętości trypsyny kompletnego podłoża hodowlanego zawierającego 10% (v/v) FBS, aby zneutralizować trypsynę.
  5. Rozcieńczyć komórki świeżym podłożem wzrostowym w stosunku do 1:2.
    UWAGA: Unikać stosowania komórek, które przeszły nadmierną liczbę pasaży (np. powyżej 40 pasaży dla komórek mHypoE-42). Wszystkie roztwory należy uprzednio podgrzać. Regularnie badać hodowle pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmami.
  6. Przystąpić do testów synchronizacji 24 h po wysianiu komórek w gęstości 2,0 × 105 komórek na dołek, zgodnie z opisem w Kroku 2. Utrzymywać rutynowe hodowle komórkowe przy konfluencji około 80%–90% przed pasażowaniem.

2. Synchronizacja linii komórkowej mHypoE-42

  1. Przygotowanie komórek
    1. Po trypsynizacji odwiruj komórki przy 700 × g przez 5 min.
    2. Odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 10 mL świeżej pożywki hodowlanej.
    3. Wymieszaj zawiesinę komórkową z barwnikiem trypan blue w stosunku 1:1 (całkowita objętość 20 μL) i określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: Roztwory zawierające trypan blue należy utylizować zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi utylizacji odpadów chemicznych. Nie wylewaj niewykorzystanego barwnika do zlewu.
  2. Wysiew komórek i kaskadowy plan eksperymentalny
    1. Wysiej 2,0 × 105 komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych lub naczyniach hodowlanych 35-mm. Inkubuj kultury w temperaturze 37°C przez 24 h.
      UWAGA: Synchronizację surowiczą rozpocznij 24 h po wysiewie komórek. W związku z tym przed synchronizacją nie jest wymagane osiągnięcie określonej konfluencji komórek. Zamiast tego zbadaj kultury mikroskopowo, aby potwierdzić, że komórki są w pełni przytwierdzone i wykazują odpowiednią morfologię przed rozpoczęciem procedury synchronizacji.
    2. Podziel płytki hodowlane losowo na dwa zestawy eksperymentalne. Pierwszego zestawu użyj do wyznaczenia punktów czasowych rytmu dobowego (CT): CT0, CT4, CT8, CT24, CT28 i CT32. Drugiego zestawu użyj do wyznaczenia CT12, CT16, CT20, CT36, CT40, CT44 i CT48 (Rysunek 1; Rysunek uzupełniający 1).
    3. Zwiększ liczbę dołków lub płytek w zależności od potrzeb, aby uwzględnić powtórzenia techniczne.
      UWAGA: Zminimalizuj zmienność, przygotowując wszystkie płytki z tej samej zawiesiny komórkowej, zachowując identyczną gęstość wysiewu i warunki hodowli oraz przeprowadzając synchronizację przy użyciu tych samych odczynników i ustawień eksperymentalnych. Dostosuj format naczynia hodowlanego i gęstość wysiewu w zależności od rodzaju komórek. W przypadku stosowania płytek 6-dołkowych łącz punkty CT zbierane jednocześnie, aby zoptymalizować wykorzystanie płytek.
  3. Synchronizacja
    1. Po 24 h odlej pożywkę z pierwszego zestawu płytek i dodaj 1 mL DMEM bez surowicy. Inkubuj przez 12 h, aby wywołać głodzenie surowicze.
    2. Bezpośrednio przed użyciem przygotuj 50% (v/v) roztwór surowicy końskiej w DMEM z wysoką zawartością glukozy.
    3. Odlej pożywkę do głodzenia z pierwszego zestawu i poddaj komórki działaniu 1 mL świeżo przygotowanego 50% roztworu surowicy końskiej przez 2 h.
    4. Jednocześnie odlej pożywkę z drugiego zestawu płytek i zastąp ją 1 mL DMEM bez surowicy. Inkubuj przez 12 h.
    5. Po 2-godzinnym szoku surowiczym odlej pożywkę i dodaj 1 mL DMEM z wysoką zawartością glukozy uzupełnionego o 10% (v/v) inaktywowaną ciepłem FBS. Wyznacz ten punkt czasowy jako CT0.
  4. Zbiór próbek
    1. Umieść płytki hodowlane na lodzie. Odlej pożywkę, przemyj komórki dwukrotnie 1 mL zimnego sterylnego 1× PBS, odlej roztwór płuczący i zlizuj komórki mechanicznie, używając do 1 mL odczynnika do lizy.
      OSTROŻNIE: Odczynnik do lizy zawiera niebezpieczne substancje chemiczne. Wszystkie etapy manipulacji wykonuj w certyfikowanej dygestorium chemicznym, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej. Odpady utylizuj zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa chemicznego.
    2. Przenieś każdy lizat do sterylnej probówki i przechowuj próbki w temperaturze −80°C do czasu ekstrakcji RNA.
    3. Powtórz kroki 2.4.1 i 2.4.2, aby zebrać próbki w punktach CT4 i CT8.
    4. W punkcie CT8 powtórz krok 2.3.2 dla drugiego zestawu eksperymentalnego, aby zsynchronizować pozostałe komórki.
    5. Po 2 h szoku surowiczego zakończ synchronizację drugiego zestawu eksperymentalnego, zastępując pożywkę 1 mL DMEM z wysoką zawartością glukozy uzupełnionego o 10% (v/v) inaktywowaną ciepłem FBS.
    6. Zbieraj próbki naprzemiennie z dwóch zestawów eksperymentalnych, aby uzyskać CT12, CT24, CT16, CT28, CT20 i CT32. Następnego dnia powtórz procedurę zbioru, aby uzyskać CT36, CT40, CT44 i CT48.
      UWAGA: Głodzenie surowicze i synchronizacja zostały rozpoczęte zgodnie z harmonogramem eksperymentalnym po wysiewie komórek, a nie po osiągnięciu określonej konfluencji komórek. Przed rozpoczęciem synchronizacji potwierdź, że komórki są w pełni przytwierdzone i wykazują odpowiednią morfologię. Chociaż kolejne punkty CT różnią się o 4 h, zbiory nie są przeprowadzane w 4-godzinnych odstępach. Pełny tygodniowy harmonogram zbiorów znajduje się na Rysunku uzupełniającym 1.

3. Przetwarzanie próbek: Ekstrakcja RNA

UWAGA: Protokoły mogą się różnić w zależności od kontekstu eksperymentalnego i zastosowania. Poniższy schemat opisuje przykład skutecznej procedury ekstrakcji RNA, syntezy komplementarnego DNA (cDNA) oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Wyekstrahuj całkowite RNA, stosując połączoną metodę lizy opartą na fenolu i separację faz, a następnie przeprowadź oczyszczanie za pomocą kolumn wirówkowych z krzemionką.

  1. Przygotowanie próbek i rozdział faz
    1. Rozmrozić próbki, ponownie zhomogenizować lizaty i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    2. Dodać 200 μL chloroformu na każdy 1 mL odczynnika do lizy.
      OSTRZEŻENIE: Chloroform jest lotny i toksyczny. Wszystkie procedury z wykorzystaniem chloroformu należy przeprowadzać w certyfikowanym dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej.
    3. Wigorystycznie wstrząsać probówkami przez 15 s i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 3 min.
    4. Wirować próbki przy 12,000 × g przez 15 min w temperaturze 4°C. Pozostawić próbki do rozdzielenia na trzy fazy: dolną fazę fenolowo-chloroformową zawierającą białka, białą interfazę zawierającą DNA oraz górną fazę wodną wzbogaconą w RNA.
    5. Ostrożnie przenieść fazę wodną do nowej sterylnej probówki, nie naruszając interfazy. Fazę organiczną przechowywać w temperaturze 4°C, jeśli planowana jest późniejsza izolacja białek lub DNA.
      UWAGA: Izolację białek lub DNA należy przeprowadzić zgodnie z odpowiednim protokołem, jeżeli biomolekuły te mają zostać odzys Regardless z fazy organicznej.
  2. Oczyszczanie RNA
    1. Dodać do fazy wodnej taką samą objętość 70% etanolu (przygotowanego w wodzie wolnej od RNaz) i wymieszać na wir器dwukrotnie przez 15 s, aby wspomóc wiązanie RNA.
    2. Nanieść próbkę na krzemionkową kolumny spinową i oczyścić RNA zgodnie z procedurą oczyszczania kolumnowego.
    3. Trawić zanieczyszczające DNA genomiczne za pomocą DNazy przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    4. Przemyć kolumnę, używając dostarczonych buforów do płukania.
    5. Przeprowadzić dodatkowe płukanie 100 μL buforu do płukania i wirować przy 11,000 × g przez 2 min w celu osuszenia membrany krzemionkowej.
    6. Przenieść kolumnę spinową do czystej probówki do mikrocentryfugi. Eluować RNA za pomocą 40–60 μL wody wolnej od RNaz, aplikując wodę bezpośrednio na środek membrany krzemionkowej i wirować przy 11,000 × g przez 1 min.
      UWAGA: Objętość elucji należy dobrać zgodnie z pożądaną wydajnością i stężeniem RNA. Objętość elucji 60 μL zazwyczaj zapewnia bardziej kompletne odzyskanie RNA z membrany krzemionkowej, ale daje bardziej rozcieńczony roztwór RNA. Z kolei objętość elucji 40 μL pozwala uzyskać bardziej skoncentrowany preparat RNA, ale może zmniejszyć całkowity odzysk RNA. Objętość elucji należy zoptymalizować zgodnie z zaleceniami producenta i wymaganiami dalszych aplikacji.
  3. Ocena jakości RNA
    1. Umieścić próbki RNA na lodzie i przenieść 5 μL każdej próbki do nowej sterylnej probówki do mikrocentryfugi w celu oceny jakości.
    2. Ocenić integralność RNA za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu agarozowym lub elektroforezy kapilarnej. Potwierdzić obecność wyraźnych pręg RNA rybosomalnego 28S i 18S.
    3. Określić stężenie i czystość RNA poprzez pomiar absorbancji spektrofotometrem.
      UWAGA: Odpady zawierające fenol należy utylizować zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi utylizacji odpadów chemicznych. Nie wolno wylewać niebezpiecznych odpadów chemicznych do zlewu. W przypadku próbek z hodowli komórkowych stężenia RNA zazwyczaj mieszczą się w zakresie od 200 do 1000 ng/μL i nadają się do syntezy cDNA oraz qRT-PCR. Należy zaakceptować próbki RNA o stosunku A260/230 między 2,0 a 2,2 oraz stosunku A260/280 wynoszącym około 2,0 (patrz Tabela uzupełniająca 1).
  4. Przechowywanie RNA
    1. Oczyszczone próbki RNA przechowywać w temperaturze −80°C do czasu syntezy cDNA.

4. Przetwarzanie próbek: synteza cDNA

UWAGA: cDNA należy zsyntetyzować z 1 μg całkowitego RNA, używając zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA. Objętości reakcji oraz warunki inkubacji należy dostosować zgodnie z instrukcją producenta.

  1. Odpisanie (transkrypcja odwrotna)
    1. Odmrozić próbki RNA na lodzie. Przygotować 20 μL reakcji odwrotnej transkrypcji zawierającej 1 μg całkowitego RNA, 10 μL 2× Master Mix (zawierającego inhibitor rybonukleazy, losowe heksamery, primery oligo(deoksytymidynowe), jony magnezu [Mg2+] oraz deoksynukleotydotrifosforany), 2 μL mieszaniny enzymów (zawierającej odwrotną transkryptazę) oraz wodę traktowaną pirokarbonianem dwuetylowym do uzyskania końcowej objętości 20 μL.
    2. Inkubować reakcję w termocyklerze przez 10 min w temperaturze 25°C w celu przyłączenia primerów, a następnie przez 30 min w 50°C w celu syntezy cDNA. Inaktywować odwrotną transkryptazę poprzez inkubację reakcji w 85°C przez 5 min.
    3. Dodać 1 μL RNazy H i inkubować reakcję przez 20 min w 37°C, aby zdegradować nić RNA hybrydy RNA–DNA.
    4. Rozcieńczyć preparat cDNA do 1:20 w sterylnej wodzie, zgodnie z wymogami optymalizacji testu, i przechowywać rozcieńczone cDNA w temperaturze −20°C do czasu przeprowadzenia ilościowej analizy polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (qRT-PCR).

5. Obróbka próbek: Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

UWAGA: Poziom ekspresji genów zegara biologicznego należy zmierzyć za pomocą qRT-PCR. Zwalidowane sekwencje starterów, temperatury przyłączania oraz stężenia starterów znajdują się w Tabeli uzupełniającej 2.

  1. Optymalizacja analizy
    1. Przed analizą próbek eksperymentalnych należy zwalidować i zoptymalizować stężenie starterów, temperaturę przyłączania oraz ilość wprowadzonego cDNA, wykorzystując połączone próbki cDNA i krzywą standardową. Optymalizację i walidację analizy należy przeprowadzić zgodnie z wcześniejszymi opisami15,16.
  2. Przygotowanie reakcji
    1. Każdą reakcję qRT-PCR o objętości 10 μL należy przygotować w płytce PCR z 96 dołkami, łącząc 5 μL master mixu 2×, po 0,4 μL startera prawego i lewego, 0,2 μL wody traktowanej piroweglanem dietylu oraz 4 μL matrycy cDNA.
    2. Płytkę należy zamknąć optycznie przezroczystą folią uszczelniającą lub matą uszczelniającą. Następnie płytkę należy odwiruwać przy 700 × g przez maksymalnie 5 min w temperaturze 4°C, aby usunąć pęcherzyki powietrza i zgromadzić mieszaninę reakcyjną na dnie każdego dołka.
    3. Należy przeanalizować wszystkie próbki cDNA w celu określenia ekspresji genów docelowych Bmal1 oraz Per2.
    4. Wybrany gen referencyjny (B2m) należy przeanalizować przy użyciu tego samego rozcieńczenia cDNA, aby znormalizować ekspresję genów w próbkach.
  3. Cykl termiczny
    1. Reakcję qRT-PCR należy przeprowadzić zgodnie z następującymi warunkami cyklu: wstępna denaturacja i aktywacja polimerazy DNA typu hot-start w temperaturze 95°C przez 2 min, a następnie 39 cykli: 95°C przez 5 s i 60°C przez 30 s.
    2. Analizę krzywej topnienia należy przeprowadzić poprzez ogrzanie reakcji do 95°C przez 5 s, a następnie stopniowe zwiększanie temperatury o 0,5°C do 95°C, z utrzymaniem każdej temperatury przez 5 s.
      UWAGA: W razie potrzeby należy dostosować czasy utrzymania oraz ustawienia krzywej topnienia zgodnie z zaleceniami producenta master mixu.
  4. Walidacja genu referencyjnego
    UWAGA: W eksperymentach z synchronizacją surowiczą należy ocenić kandydackie geny referencyjne, ponieważ traktowanie surowicą może zmienić ekspresję genów gospodarzy (housekeeping genes)17. Stabilność ekspresji należy ocenić za pomocą metod takich jak BestKeeper18, geNorm19, NormFinder20 lub metoda porównawczego ΔCt21. Do normalizacji należy wybrać najstabilniejsze geny. W niniejszym badaniu oceniały geny β-aktyna (Actb) oraz β-2-mikroglobulina (B2m) przy użyciu oprogramowania RefFinder22, które integruje wiele algorytmów walidacji genów referencyjnych. Gen B2m wykazał największą stabilność ekspresji w całym cyklu dobowym i został dlatego wybrany do normalizacji.
  5. Weryfikacja produktu
    1. Specyficzność amplifikacji należy zweryfikować poprzez analizę produktów PCR przy użyciu elektroforezy na 2% żelu agarozowym.
      UWAGA: Optymalną temperaturę przyłączania należy określić, testując kilka temperatur (np. 58 °C, 60°C i 62°C). Należy wybrać temperaturę, która daje najniższą wartość cyklu kwantyfikacji (Cq), zapewniając jednocześnie pojedynczy piki na krzywej topnienia bez oznak tworzenia dimerów starterów.
      UWAGA: Należy zaakceptować analizy z wydajnością amplifikacji między 90% a 110% oraz współczynnikiem determinacji (R2) wynoszącym 0,99 lub więcej. Należy potwierdzić, że temperatury topnienia różnią się nie więcej niż o 0,5°C między powtórzeniami technicznymi. Do analizy należy dopuścić tylko powtórzenia techniczne z różnicą Cq ≤0,5 i tych wartości użyć do obliczenia średnich poziomów ekspresji. Wszystkie reakcje należy przeprowadzić w powtórzeniach technicznych (np. w trzech powtórzeniach), uwzględniając zarówno kontrolę bez matrycy (NTC), jak i kontrolę bez odwrotnej transkrypcji (no-RT).

6. Analiza danych

  1. Analiza ekspresji genów
    1. Wyciągnij średnią z powtórzeń technicznych dla każdej próbki przed dalszą analizą.
    2. Oblicz wartość ΔCq dla każdej próbki i punktu czasowego, korzystając z następującego równania:
      ΔCq   = Cqgen docelowy  -  Cqgen housekeeping
    3. Oblicz wartość ΔΔCq dla każdej próbki i punktu czasowego, korzystając z następującego równania:
      ΔΔCq   = ΔCqpróbka  -  ΔCqkontrolna  
      UWAGA: Do obliczenia ΔΔCq wartość ΔCqkontrolna została zdefiniowana jako średnia wartość ΔCq uzyskana poprzez uśrednienie wszystkich próbek kontrolnych we wszystkich CT.
    4. Oceń parametry okołodobowe, w tym statystykę szacowania linii środkowej rytmu (MESOR), amplitudę, szczyt i fazę, używając programu CircaCompare23. Przeprowadź analizę za pomocą aplikacji online lub implementacji w pakiecie R.
  2. Analiza w aplikacji online CircaCompare
    UWAGA: Implementacja online raportuje pełne szacunki parametrów okołodobowych tylko wtedy, gdy zestaw danych spełnia statystyczne kryteria rytmiczności. Gdy rytmiczność jest słaba lub nieistotna statystycznie, należy użyć implementacji w R, aby uzyskać szacunki parametrów dla wszystkich zestawów danych.
    1. Przygotuj plik wartości rozdzielanych przecinkami (.csv).
      1. Wprowadź zmienną czasu (numeryczną; godziny) w kolumnie 1.
      2. Wprowadź zmienną grupowania (tylko dwie grupy eksperymentalne) w kolumnie 2.
      3. Wprowadź zmienną wyniku (numeryczną; ΔΔCq) w kolumnie 3.
    2. Prześlij plik .csv do aplikacji online CircaCompare.
    3. Przypisz zmienne czasu, grupy i wyniku do odpowiednich kolumn.
    4. Wybierz Run, aby przeprowadzić analizę.
  3. Analiza CircaCompare w programie R
    1. Przeprowadź analizę, korzystając z wersji R 4.5.1 oraz wersji pakietu CircaCompare 0.2.024.
    2. Zainstaluj wymagane pakiety R.
      1. Zainstaluj pakiet devtools (wersja 2.5.2).
      2. Zainstaluj pakiet circacompare (wersja 0.2.0).
      3. Zainstaluj pakiet ggplot2 (wersja 4.0.3).
      4. Zainstaluj pakiet svglite (wersja 2.2.2).
    3. Prześlij wejściowy plik .csv.
    4. Uruchom analizę CircaCompare po ustawieniu alpha_threshold = 1.
      UWAGA: Ustawienie alpha_threshold = 1 pozwala na raportowanie szacunków parametrów okołodobowych dla wszystkich dopasowanych oscylacji, niezależnie od istotności statystycznej. Jednak tylko oscylacje z wartością p-value < 0,05 powinny być interpretowane jako rytmiczne i istotne statystycznie.
    5. Dostosuj Supplementary File 1 przed uruchomieniem skryptu.
      1. Zastąp „XXX.csv” nazwą wejściowego pliku danych.
      2. Zastąp „YYY.csv” pożądaną nazwą pliku z wynikami.
      3. Zastąp „ZZZ.svg” pożądaną nazwą pliku wykresu.
      4. Dostosuj granice osi y (ylim) oraz wszelkie dodatkowe parametry wykresu zgodnie z zestawem danych.
    6. Przejrzyj Supplementary Table 3 w celu zobaczenia przykładu pliku wejściowego.

Wyniki

O pomyślnej synchronizacji świadczy statystycznie istotna rytmika okołodobowa analizowanych genów zegarowych w warunkach kontrolnych (p < 0,05). W niniejszym badaniu przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty biologiczne, w których 0,1% dimetylosulfoksyd służył jako kontrola negatywna. Bmal11 i Na każdąWybrano je jako reprezentatywne markery okołodobowe, ponieważ stanowią one kluczowe komponenty molekularnego zegara biologicznego i wykazują dobrze scharakteryzowany antyfazowy wzorzec ekspresji. Reprezentatywne profile rytmicznej ekspresji uzyskane po synchronizacji przedstawiono na Rycina 2Odpowiadające im parametry okołodobowe, w tym rytmiczność, MESOR, amplituda oraz czas szczytu, zostały zestawione w Tabela 1, podczas gdy porównania parowe pomiędzy Bmal1 i Za każdym razem2 przedstawiono w Tabela 2.

Wykres dobowej ekspresji mRNA; poziomy Per2/Bmal1 w ciągu 24–48 h; analiza rytmicznej ekspresji genów.
Rysunek 2Oscylacje okołodobowe Bmal11 i Na każdą2 po synchronizacji szokiem surowiczym. Reprezentatywne profile ekspresji okołodobowej Bmal11 (ciemnoniebieski) i Na każdą2 (jasnoniebieski) w zsynchronizowanych komórkach mHypoE-42, zmierzone za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) od 24 do 48 h po synchronizacji. Krzywe przedstawiają dopasowane modele okołodobowe wygenerowane przy użyciu programu CircaCompare.Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

GenRytmiczność
(wartość p)		MESORAmplitudaCzas szczytowy
(h)
Bmal10.0205−0.29480.464820.4239
Per20.0071−0.3180.46299.4883
Bmal1 + Związek A0.1068———

Tabela 1: Parametry rytmu okołodobowego oszacowane dla Bmal1 i Per2 w warunkach bazowych oraz dla Bmal1 po zastosowaniu związku A. Rytmiczność okołodobową oceniono za pomocą programu CircaCompare. W tabeli przedstawiono wartość p dla rytmiczności, statystykę szacującą linię środkową rytmu (MESOR), amplitudę oraz czas szczytu dla każdego stanu. Parametry okołodobowe nie zostały podane dla Bmal1 po zastosowaniu związku A, ponieważ rytmiczność nie była istotna statystycznie (p = 0,1068).

szacowanie różnicy MESOR
(p-wartość)		Szacowanie różnicy amplitud
(p-wartość)		Szacowanie różnicy faz
(pwartość p)		Wspólny okres
(h)
−0.0232 (p = 0.8904)−0.0019 (p = 0.9936)−10.9356 (p = 2.3155 × 10⁻6)24

Tabela 2: Porównanie parametrów okołodobowych dla Bmal1 i Per2. Porównanie parzyste średniej wartości rytmu (MESOR), amplitudy i fazy pomiędzy dopasowanymi profilami ekspresji okołodobowej Bmal1 i Per2, oszacowanymi przy użyciu programu CircaCompare. Wartości przedstawiono jako różnice parametrów wraz z odpowiadającymi im wartościami p. Wspólny okres ustalono na poziomie 24 h podczas dopasowywania modelu.

W warunkach bazalnych zarówno Bmal1, jak i Per2 wykazywały statystycznie istotną rytmiczność (Bmal1: p = 0,0205; Per2: p = 0,0071). Analiza CircaCompare dodatkowo wykazała, że oba geny oscylowały w przeciwnych fazach, z różnicą faz wynoszącą −10,9356 h (p = 2,3155 × 10⁻6), co jest zgodne z ich oczekiwaną antyfazową relacją w obrębie molekularnej sieci zegara okołodobowego. Wskaźniki jakości RNA stanowiące podstawę dla dalszej analizy ekspresji genów podano w Tabeli uzupełniającej 1.

Protokół ten można również zastosować do porównania rytmiki okołodobowej między różnymi warunkami eksperymentalnymi, w tym między modelami zdrowymi a chorobowymi lub grupami kontrolnymi a grupami leczonymi. Jako reprezentatywny przykład oceniono nowo pojawiający się zanieczyszczający środowisko związek i disruptor endokrynny, wykryty wcześniej w ludym podwzgórzu, określony tutaj jako Związek A. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 3, a odpowiadającą im analizę rytmiki podsumowano w Tabeli 1.

Wykres przebiegu czasowego ekspresji RNA; mRNA (ΔΔCq) w funkcji czasu; kontrola vs Związek A; analiza danych.
Rysunek 3. Wpływ Związku A na rytmikę okołodobową ekspresji Bmal1. Reprezentatywny profil ekspresji Bmal1 w zsynchronizowanych komórkach mHypoE-42 po zastosowaniu Związku A, zmierzony za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Krzywe przedstawiają dopasowane modele okołodobowe wygenerowane przy użyciu oprogramowania CircaCompare. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Po ekspozycji na Związek A, Bmal1 nie wykazał już statystycznie istotnej rytmiczności (p = 0,1068). W tych warunkach dopasowany model okołodobowy nie spełnił statystycznych kryteriów rytmiczności. W związku z tym parametry okołodobowe, takie jak MESOR, amplituda i czas szczytu, nie zostały podane, ponieważ nie uznaje się ich za biologicznie interpretowalne, gdy rytmiczność nie jest statystycznie istotna. Przykład ten ilustruje, w jaki sposób opisany schemat postępowania pozwala odróżnić rytmiczne profile ekspresji od nierytmicznych i może być wykorzystany do oceny potencjalnych zmian w okołodobowej ekspresji genów w różnych warunkach eksperymentalnych. Aby zminimalizować potencjalną zmienność techniczną związaną ze strategią próbkowania przesuniętego w czasie, wszystkie płytki hodowlane przygotowano z tej samej zawiesiny komórkowej, utrzymywano w identycznych warunkach hodowli i synchronizowano za pomocą tego samego schematu eksperymentalnego, różniącego się jedynie momentem synchronizacji.

Rycina uzupełniająca 1. Tygodniowy harmonogram protokołu synchronizacji przesuniętej. Reprezentatywna oś czasu tygodnia ilustrująca wysiew komórek, głodzenie surowicze, synchronizację szokiem surowiczym, zatrzymanie synchronizacji oraz pobieranie próbek okołodobowych dla dwóch przesuniętych zestawów eksperymentalnych (Zestaw 1, fioletowy; Zestaw 2, zielony). Projekt przesunięty umożliwia pobieranie próbek w punktach czasu okołodobowego (CT) od CT0 do CT48 w standardowych godzinach pracy, unikając konieczności pobierania próbek w nocy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1. Metryki jakości RNA dla wszystkich próbek biologicznych uwzględnionych w eksperymencie z przebiegiem czasowym rytmu okołodobowego. Czystość RNA oceniono za pomocą stosunków absorbancji A260/A280 i A260/A230, a stężenie RNA określono spektrofotometrycznie przed syntezą komplementarnego DNA (cDNA). Próbki są identyfikowane według czasu pobrania, grupy traktowanej oraz biologicznego powtórzenia. Pomiary te wykorzystano do weryfikacji jakości RNA przed dalszą analizą ilościową za pomocą reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2. Sekwencje starterów i warunki amplifikacji zastosowane w ilościowej reakcji polimerazy w łańcuchu w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Sekwencje starterów oligonukleotydowych sens i antysens przedstawiono w orientacji 5′-3′ wraz z odpowiadającymi im numerami dostępu NCBI, temperaturą przyłączania oraz stężeniem starterów zastosowanych do amplifikacji każdego genu docelowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3. Przykładowy zestaw danych wejściowych do analizy rytmu okołodobowego przy użyciu CircaCompare. Przykładowy zestaw danych w formacie wartości rozdzielanych przecinkami (CSV), sformatowany do analizy za pomocą CircaCompare. Zestaw danych zawiera trzy wymagane zmienne: Time (h), Group oraz Outcome (ΔΔCq), co odpowiada formatowi opisanemu w protokole analizy danych i służy jako przykładowy plik wejściowy do szacowania parametrów okołodobowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1. Przykładowy skrypt R do analizy rytmów okołodobowych z wykorzystaniem pakietu CircaCompare. Przykładowy skrypt R do analizy danych dotyczących ekspresji genów w rytmie okołodobowym z wykorzystaniem pakietu CircaCompare (wersja 0.2.0) w środowisku R (wersja 4.5.1). Skrypt importuje zestaw danych wejściowych, wykonuje szacowanie parametrów okołodobowych dla okresu 24 h, eksportuje podsumowanie statystyczne i generuje wykres w jakości publikacyjnej. Przed użyciem należy zastąpić przykładowe nazwy plików (XXX.csv, YYY.csv oraz ZZZ.svg) pożądanymi nazwami plików wejściowych i wyjściowych oraz odpowiednio dostosować parametry wykresu (np. ylim) do zestawu danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Rytmy okołodobowe to endogenne cykle o długości około 24 h, które regulują szeroki zakres procesów fizjologicznych, metabolicznych i komórkowych za pośrednictwem konserwatywnych mechanizmów zegara molekularnego1,2. Modele synchronizacji in vitro zapewniają kontrolowane środowisko eksperymentalne do badania tych mechanizmów i stały się cennymi narzędziami do analizy regulacji okołodobowej w warunkach prawidłowych i patologicznych, w tym podczas ekspozycji na zanieczyszczenia środowiskowe oraz inne perturbacje eksperymentalne25. Przedstawiony tutaj protokół opisuje praktyczny schemat synchronizacji hodowli komórkowych za pomocą szoku surowiczego, pobierania próbek w serii czasowej z wykorzystaniem strategii próbkowania przesuniętego oraz kwantyfikacji ekspresji genów okołodobowych metodą qRT-PCR. Schemat ten jest szczególnie odpowiedni dla badań wymagających profilowania czasowego ekspresji genów przy jednoczesnym zminimalizowaniu wyzwań logistycznych związanych z nocnym pobieraniem próbek. O sukcesie i powtarzalności tego protokołu decyduje kilka krytycznych etapów. Odpowiednia kontrola konfluencji komórek, głodzenia surowiczego, czasu trwania szoku surowiczego oraz warunków synchronizacji jest niezbędna, ponieważ niewłaściwa synchronizacja może prowadzić do słabej lub niewykrywalnej rytmiczności14. Spójna gęstość siewu komórek, przygotowanie wszystkich płytek eksperymentalnych z tej samej zawiesiny komórkowej oraz identyczne warunki hodowli w przesuniętych zestawach eksperymentalnych dodatkowo redukują zmienność techniczną. Jakość RNA, synteza cDNA, walidacja starterów oraz wybór stabilnych genów referencyjnych są również istotnymi czynnikami wpływającymi na wiarygodność wyników qRT-PCR. Podobnie jak w przypadku każdego protokołu synchronizacji okołodobowej, adaptacja schematu do różnych typów komórek lub warunków eksperymentalnych może wymagać optymalizacji tych parametrów.

Chociaż szok surowiczy jest jedną z najszerzej uznanych metod synchronizacji w biologii rytmów okołodobowych4,26, nie jest on uniwersalnie optymalny dla każdego zastosowania eksperymentalnego. Alternatywne podejścia do synchronizacji, w tym traktowanie deksametazonem, stymulacja forskoliną, synchronizacja temperaturą oraz systemy oparte na reporterach, mogą być bardziej odpowiednie w zależności od modelu biologicznego i celu badań14. Metody te należy rozpatrywać jako podejścia komplementarne, a nie konkurencyjne, ponieważ każda z nich posiada odrębne zalety i ograniczenia. Szok surowiczy zapewnia praktyczną równowagę między prostotą eksperymentalną, dostępnością a powtarzalnością, nie wymagając specjalistycznego instrumentarium ani genetycznie kodowanych systemów reporterowych. Niemniej jednak badacze powinni dokładnie rozważyć potencjalny wpływ bodźca synchronizującego na swój system biologiczny i wybrać podejście, które najlepiej odpowiada ich pytaniu badawczemu. Opisano również protokoły szoku surowiczego z pominięciem etapu głodzenia surowiczego, które mogą stanowić odpowiednie alternatywy w określonych kontekstach eksperymentalnych27. Elastyczność niniejszego protokołu pozwala na wprowadzenie kilku modyfikacji i strategii rozwiązywania problemów. Projekt przesuwanego próbkowania opiera się na równoległych płytkach hodowlanych synchronizowanych w różnych odstępach czasu, aby wygenerować komplementarne CT, unikając jednocześnie nocnego pobierania próbek. Aby zminimalizować zmienność między płytkami, należy przygotować wszystkie płytki z tej samej zawiesiny komórkowej, zasiać je z taką samą gęstością, utrzymywać identyczne warunki hodowli i przeprowadzić synchronizację według tego samego schematu eksperymentalnego, różniącego się jedynie momentem synchronizacji. Chociaż podejście to nie może całkowicie wyeliminować zmienności związanej z partią, minimalizuje ono zmienność techniczną, znacznie redukując wyzwania logistyczne związane z nocnym próbkowaniem i zachowując możliwość wykrycia biologicznie istotnych rytmów okołodobowych. Mimo że strategia przesuwanego próbkowania została zaprojektowana w celu zminimalizowania zmienności technicznej poprzez utrzymanie identycznych warunków hodowli we wszystkich zestawach eksperymentalnych, nie była ona w niniejszym badaniu bezpośrednio porównywana z konwencjonalnym projektem próbkowania ciągłego. Przyszłe badania mogą dalej oceniać równoważność tych podejść w dodatkowych modelach eksperymentalnych. Podczas adaptacji tego schematu do nowych typów komórek lub warunków eksperymentalnych należy zoptymalizować wydajność synchronizacji i ocenić potencjalne efekty serii podczas walidacji protokołu. W zależności od celu eksperymentalnego można zmodyfikować harmonogram synchronizacji, dostosowując godziny rozpoczęcia synchronizacji lub utrzymując jedną zsynchronizowaną hodowlę ze skróconym oknem próbkowania. Strategie rozwiązywania problemów obejmują optymalizację czasu trwania szoku surowiczego, weryfikację żywotności i konfluencji komórek przed synchronizacją, potwierdzenie jakości RNA przed dalszą analizą oraz dostosowanie odstępów próbkowania w celu poprawy wykrywania rytmu okołodobowego. Niniejszy protokół został zwalidowany w embrionalnej linii komórkowej podwzgórza myszy mHypoE-42, a zatem powinien zostać niezależnie zoptymalizowany i zwalidowany przed zastosowaniem w innych modelach komórkowych. Chociaż nie zostało to ocenione w niniejszym badaniu, protokół ten opracowano w oparciu o wcześniejszą optymalizację w naszym laboratorium z wykorzystaniem innych linii komórkowych (np. komórek N2a i ludzkich fibroblastów), co potwierdza jego potencjalną przydatność w różnych modelach komórkowych. Podobnie, strategia przesuwanego próbkowania znacznie poprawia wykonalność eksperymentalną, umożliwiając pełne próbkowanie okołodobowe w standardowych godzinach pracy; jednak użytkownicy powinni utrzymywać identyczne warunki eksperymentalne we wszystkich płytkach hodowlanych, aby zminimalizować potencjalne efekty serii. Po odpowiedniej optymalizacji schemat ten stanowi dostępny i powtarzalny sposób badania ekspresji genów okołodobowych oraz oceny interwencji eksperymentalnych zmieniających funkcję molekularnego zegara w szerokim zakresie zastosowań badawczych.

Pomimo praktycznych zalet, metoda ta posiada kilka ograniczeń. Strategia próbkowania skokowego dostarcza pomiarów w dyskretnych punktach czasowych zamiast ciągłego monitorowania, co obniża rozdzielczość czasową w porównaniu z testami reporterowymi opartymi na fluorescencji lub bioluminescencji7. W konsekwencji może dojść do zmniejszenia dokładności szacowania okresu oraz wykrywania subtelnych przesunięć fazowych lub oscylacji o niskiej amplitudzie. Ponadto proces próbkowania z wykorzystaniem płytek staje się coraz bardziej pracochłonny wraz ze wzrostem liczby traktowań lub warunków doświadczalnych, ponieważ dla każdego warunku wymagane są dodatkowe płytki hodowlane. Wśród istniejących metodologii, opisany schemat postępowania stanowi praktyczną alternatywę dla systemów reporterowych, w tym testów lucyferazy sterowanych przez E-box (np. Bmal1-Luc i Per2-Luc), które umożliwiają monitorowanie aktywności okołodobowej w żywych komórkach w czasie rzeczywistym28,29. Chociaż systemy reporterowe oparte na fluorescencji i bioluminescencji zapewniają wysoką rozdzielczość czasową i są szczególnie użyteczne w wysokoprzepustowym przesiewaniu potencjalnych modulatorów rytmów okołodobowych, wymagają one stabilnej modyfikacji genetycznej, specjalistycznego sprzętu detekcyjnego oraz ściśle kontrolowanych warunków środowiskowych30, które nie zawsze są dostępne we wszystkich laboratoriach. Co więcej, systemy reporterowe są zazwyczaj ograniczone do zdefiniowanych konstruktów reporterowych i mogą wymagać normalizacji do sygnałów konstytutywnych lub liczebności komórkowej, co ogranicza jednoczesną ocenę wielu genów lub późniejsze analizy molekularne. W przeciwieństwie do nich, opisany tutaj proces jest kompatybilny z wieloma zastosowaniami następczo, w tym z ilościową analizą ekspresji genów i testami białkowymi, co czyni go dostępnym i wszechstronnym podejściem dla laboratoriów badających molekularną regulację rytmów okołodobowych.

Po pobraniu próbek i przeprowadzeniu analizy końcowej niezbędna jest odpowiednia ocena statystyczna, aby ustalić, czy obserwowane oscylacje są zarówno statystycznie istotne, jak i biologicznie znaczące. W niniejszym protokole program CircaCompare zapewnia solidne ramy dla szacowania i statystycznego porównywania wartości MESOR, amplitudy oraz fazy przy użyciu modeli regresji opartych na metodzie cosinora23. W przeciwieństwie do podejść oceniających wyłącznie rytmiczność, CircaCompare umożliwia bezpośrednie porównania parowe parametrów okołodobowych pomiędzy grupami eksperymentalnymi, co ułatwia ocenę efektów leczenia, zaburzeń genetycznych lub zmian w zachowaniu okołodobowym związanych z chorobą. Ten schemat analityczny uzupełnia protokół synchronizacji, dostarczając zestandaryzowanych miar ilościowych do interpretacji zmian w okołodobowej ekspresji genów. Jak pokazano w Reprezentatywnych Wynikach, pomyślną synchronizację wskazano poprzez oczekiwane oscylacyjne wzorce ekspresji mRNA dla genów Bmal1 i Per2 po szoku surowiczym (Rysunek 2). W przeciwieństwie do tego, ekspozycja na Związek A doprowadziła do utraty statystycznie istotnej rytmiczności Bmal1 (Rysunek 3), co ilustruje użyteczność tego schematu w ocenie interwencji eksperymentalnych zmieniających okołodobową ekspresję genów. Ważnym aspektem podczas interpretacji danych o okołodobowej ekspresji genów jest zmienność biologiczna między niezależnymi eksperymentami. W niniejszym badaniu reprezentatywne wyniki uzyskano z niezależnych powtórzeń biologicznych wykonanych w różne dni i na różnych pasażach komórek. W związku z tym spodziewany jest pewien stopień zmienności, który odzwierciedla różnice biologiczne, a nie techniczne. Z tego powodu eksperymenty synchronizacyjne powinny obejmować niezależne powtórzenia biologiczne i być interpretowane w kontekście oczekiwanej zmienności biologicznej badanego modelu komórkowego. Pomimo tej zmienności, konsekwentnie obserwowano statystycznie istotną rytmiczność oraz oczekiwaną relację antyfazową między Bmal1 a Per2. Ponadto cechy okołodobowe, w tym amplituda oscylacji, faza, długość okresu i szybkość tłumienia, różnią się w zależności od modeli komórkowych. Dlatego efektywność synchronizacji powinna być oceniana w kontekście konkretnego badanego typu komórek, a nie poprzez bezpośrednie porównanie z niezwiązanymi modelami.

Niniejszy schemat postępowania jest szczególnie istotny w badaniu roli rytmów okołodobowych w mechanizmach chorobowych i odpowiedziach terapeutycznych. Zaburzenia regulacji okołodobowej są powiązane z licznymi stanami patologicznymi, w tym z nowotworami, zaburzeniami metabolicznymi oraz chorobami neurodegeneracyjnymi31,32. Zdolność do oceny rytmicznej ekspresji genów lub poziomu białek in vitro zapewnia praktyczne ramy do badania tych procesów oraz oceny wpływu interwencji farmakologicznych na molekularny zegar okołodobowy, który jest coraz częściej uznawany za potencjalny cel terapeutyczny14,33. Na przykład protokół ten można zastosować do zbadania, w jaki sposób potencjalne modulatory wpływają na okołodobową ekspresję genów w istotnych dla danej choroby modelach komórkowych, po odpowiedniej optymalizacji i walidacji. Co ważne, celem niniejszej pracy nie jest rekomendowanie szoku surowiczego jako zamiennika dla innych metod synchronizacji ani sugerowanie jego wyższości nad alternatywnymi podejściami. Zamiast tego, niniejszy protokół dostarcza szczegółowego i powtarzalnego schematu wdrażania powszechnie stosowanej strategii synchronizacji, pobierania próbek okołodobowych w standardowych godzinach pracy z wykorzystaniem kaskadowego projektu próbkowania oraz analizowania rytmicznej ekspresji genów za pomocą dostępnych metod analitycznych. Przewidujemy, że opracowane ramy będą szczególnie przydatne dla laboratoriów ustanawiających eksperymenty okołodobowe lub poszukujących praktycznego, powtarzalnego i dostępnego schematu włączania analiz czasowych do istniejących modeli komórkowych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta została współfinansowana przez Instrument na rzecz Odbudowy i odporności Unii Europejskiej (UE) oraz portugalskie fundusze krajowe za pośrednictwem FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia w ramach projektów LA/P/0058/2020 (DOI: 10.54499/LA/P/0058/2020), UID/04539/2025, UID/PRR/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR/04539/2025) oraz UID/PRR2/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR2/04539/2025); przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRR) w ramach Regionalnego Programu Operacyjnego Centro 2030 w projekcie CENTRO2030-FEDER-02360200; oraz przez portugalskie fundusze krajowe za pośrednictwem FCT w ramach grantów 2023.17896.ICDT (DOI: 10.54499/2023.17896.ICDT), 2023.12355.PEX (DOI: 10.54499/2023.12355.PEX), 2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI: 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008), 2020.04850.BD (DOI: 10.54499/2020.04850.BD) oraz 2021.05334.BD (DOI: 10.54499/2021.05334.BD).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 6-dołkowa do hodowli komórekNest Biotechnology15140122Płytka do hodowli komórek
AgarozaNZYtechMB02702Ocena jakości RNA
Mieszanina antybiotyków (penicylina/streptomycyna)Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648Suplement do hodowli komórek
Zestaw do syntezy cDNA (pierwszej nici)NZYtechMB12502Transkrypcja odwrotna
ChloroformSigma-AldrichA5256701Odczynnik do separacji faz
DMEM, wysoka zawartość glukozy (4500 mg/L glukozy, L-glutamina)Sigma-Aldrich26050088Pożywka do hodowli komórek
Probówki do mikrocentryfugi EppendorfEppendorf30120086Przechowywanie próbek
Ethanol (96%)Fisher Bioreagents15552393Oczyszczanie RNA
Płytkowa surowica bydlęca, inaktywowana ciepłemGibco, Thermo Fisher ScientificJ62692.K7Suplement do hodowli komórek
Sztywna płytka PCR 96-dołkowaBio-Rad LaboratoriesHSP9601Płytka do qRT-PCR
Surowica konia, inaktywowana ciepłemGibco, Thermo Fisher Scientific15400054Synchronizacja szokiem surowiczym
Linia komórkowa mHypoE-42 (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402Linia komórek podwzgórza myszy embrionalnej
Primery oligonukleotydoweNZYtechMB12501Primery do qRT-PCR
Bufor fosforanowy (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502Przemywanie komórek
qPCR Green Master Mix (2×)NZYtechMB22403Odczynnik do qRT-PCR
System detekcji PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad LaboratoriesEP0030108116Urządzenie do qRT-PCR
Zestaw do izolacji RNANZYtech288306Oczyszczanie metodą kolumienek krzemionkowych
Odczynnik do lizy RNANZYtechMB18502Odczynnik do ekstrakcji RNA oparty na fenolu
Wodorowęglan soduSigma-AldrichMB22401Suplement do pożywki do hodowli komórek
Sterylna płytka hodowlana 35-mmThermo Fisher Scientific121VPłytka do hodowli komórek
Termocykler T100Bio-Rad Laboratories1861096Synteza cDNA
Flask do hodowli tkanek T75Corning430641UNaczynie do hodowli komórek
Roztwór błękitu trypanu (0,4%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061Liczenie komórek
Trypsyna-EDTA (0,5%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054Dysocjacja komórek

Bibliografia

  1. Fuhr L, Abreu M, Pett P, Relógio A. Circadian systems biology: When time matters. Comput Struct Biotechnol J. 2015;13:417-426.
  2. Albrecht U. Timing to perfection: The biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 2012;74(2):246-260.
  3. Relógio A, et al. Ras-mediated deregulation of the circadian clock in cancer. PLoS Genet. 2014;10(5):e1004338.
  4. Balsalobre A, Damiola F, Schibler U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 1998;93(6):929-937.
  5. Hughes ATL, et al. Constant light enhances synchrony among circadian clock cells and promotes behavioral rhythms in VPAC2-signaling deficient mice. Sci Rep. 2015;5:12092.
  6. Fuhr L, et al. The circadian clock regulates metabolic phenotype rewiring via HKDC1 and modulates tumor progression and drug response in colorectal cancer. EBioMedicine. 2018;33:105-121.
  7. Nagoshi E, et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: Cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 2004;119(5):693-705.
  8. Balsalobre A, et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 2000;289(5488):2344-2347.
  9. Kaneko H, Kaitsuka T, Tomizawa K. Response to stimulations inducing circadian rhythm in human induced pluripotent stem cells. Cells. 2020;9(3):732.
  10. Chalmers JA, et al. Vascular circadian rhythms in a mouse vascular smooth muscle cell line (Movas-1). Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008;295:R1529-R1538.
  11. Brown SA, et al. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Curr Biol. 2002;12(18):1574-1583.
  12. Adamovich Y, et al. Rhythmic oxygen levels reset circadian clocks through HIF1α. Cell Metab. 2017;25(1):93-101.
  13. Rogers EH, et al. Comparing circadian dynamics in primary derived stem cells from different sources of human adult tissue. Stem Cells Int. 2017;2017:2057168.
  14. Gaspar LS, et al. The importance of determining circadian parameters in pharmacological studies. Br J Pharmacol. 2019;176(16):2827-2847.
  15. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 2006;1(3):1559-1582.
  16. Derveaux S, Vandesompele J, Hellemans J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 2010;50(4):227-230.
  17. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-408.
  18. Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper—Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol Lett. 2004;26(6):509-515.
  19. Vandesompele J, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002;3(7):research0034.1-research0034.11.
  20. Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization. Cancer Res. 2004;64(15):5245–5250.
  21. Silver N, Best S, Jiang J, Thein SL. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC Mol Biol. 2006;7:33.
  22. Xie F, Wang J, Zhang B. RefFinder: a web-based tool for comprehensively analyzing and identifying reference genes. Funct Integr Genomics. 2023;23:125.
  23. Parsons R, Garner N, Oster H, Rawashdeh O. CircaCompare: A method to estimate and statistically support differences in mesor, amplitude and phase between circadian rhythms. Bioinformatics. 2020;36(4):1208-1212.
  24. Parsons R. circacompare: Analyses of circadian data. R package version 0.2.0. 2021. Available at: https://CRAN.R-project.org/package=circacompare
  25. Di Nisio A, et al. Impairment of human dopaminergic neurons at different developmental stages by perfluoro-octanoic acid (PFOA) and differential human brain areas accumulation of perfluoroalkyl chemicals. Environ Int. 2022;158:106982.
  26. Xiang S, et al. Oscillation of clock and clock-controlled genes induced by serum shock in human breast epithelial and breast cancer cells: Regulation by melatonin. Breast Cancer (Auckl). 2012;6:155-168.
  27. Chang HC, Guarente L. SIRT1 mediates central circadian control in the SCN by a mechanism that decays with aging. Cell. 2013;153(7):1448-1460.
  28. Yoo SH, et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(15):5339-5346.
  29. Ueda HR, et al. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat Genet. 2005;37(2):187-192.
  30. Beaulé C, Granados-Fuentes D, Marpegan L, Herzog ED. In vitro circadian rhythms: Imaging and electrophysiology. Essays Biochem. 2011;49(1):103-117.
  31. Ribeiro RFN, et al. Circadian rhythms are disrupted in patients and preclinical models of Machado-Joseph disease. Brain. 2025;148(11):4127-4142.
  32. Masri S, Sassone-Corsi P. The emerging link between cancer, metabolism, and circadian rhythms. Nat Med. 2018;24(12):1795-1803.
  33. Ribeiro RFN, Cavadas C, Silva MMC. Small-molecule modulators of the circadian clock: Pharmacological potentials in circadian-related diseases. Drug Discov Today. 2021;26(7):1620-1641.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synchronizacja szokiem surowiczymkom rki podwzg rza myszypobieranie pr bek w czasieilo ciowe PCRekstrakcja RNAdob r gen w referencyjnychanaliza rytm w oko odobowychrytmiczno ekspresji gen w

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.