Artykuł metodologiczny

Otwieranie bariery krew-mózg (BBB) sterowane ultradźwiękami w mikrofluidycznym chipie BBB-glioblastoma do badań nad dostarczaniem leków

112 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72041

⸱

18 sierpnia 2026

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje konstrukcję mikrofluidycznego modelu chipa BBB-glioblastoma (BBB-GBM). Model został zwalidowany pod kątem integralności BBB i umożliwia badanie przejściowego i w dużej mierze odwracalnego otwarcia BBB indukowanego ultradźwiękami o niskiej intensywności, co pozwala na ilościową ocenę transportu nanomicel za pośrednictwem ultradźwięków przez BBB oraz efektywności celowania w guz.

Streszczenie

Bariera krew-mózg (BBB) stanowi główną przeszkodę w leczeniu glejaka wielopostaciowego (GBM), ograniczając przenikanie większości cząsteczek terapeutycznych do mózgu. Różnice międzygatunkowe w strukturze i funkcji BBB komplikują translację kliniczną modeli zwierzęcych, co podkreśla potrzebę stworzenia odpowiednich dla ludzi platform BBB in vitro do oceny przepuszczalności leków w terapii GBM. W niniejszym opracowaniu opisano protokół budowy mikrofluidalnego modelu chipa BBB-GBM. Model ten ustanawia system potrójnej hodowli obejmujący ludzkie komórki śródbłonka mikrokrążenia mózgowego (HCMECs), pierwotne astrocyty (ACs) oraz komórki U87-MG w obrębie mikrofluidalnej platformy zatopionej w Matrigelu. Integralność BBB jest weryfikowana poprzez ciągłe barwienie immunocytochemiczne zonula occludens-1 (ZO-1) oraz test przepuszczalności FITC-dekstranu. Następnie zastosowano ultradźwięki (US) o niskiej intensywności (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s), aby wywołać przejściowe i w dużej mierze odwracalne otwarcie BBB, co pozwala nanomicelom ukierunkowanym na guz (SFN@RB@SPMs) efektywnie pokonać barierę i nagromadzić się w komórkach GBM. Kluczową cechą tego protokołu jest integracja pomiarów przepuszczalności BBB i dostarczania leków w czasie rzeczywistym w ramach jednego chipa reagującego na ultradźwięki, co zapewnia potężną platformę do analizy mechanizmów dostarczania leków wspomaganego ultradźwiękami w GBM.

Wprowadzenie

Leczenie glejaka wielopostaciowego (GBM) jest w znacznym stopniu ograniczone przez barierę krew-mózg (BBB), która silnie utrudnia przenikanie niemal wszystkich środków terapeutycznych do mózgu1,2. BBB jest tworzona przez niefenestrowane komórki śródbłonka połączone białkami złączy ścisłych (np. okludyną, ZO-1), przy dodatkowym wsparciu pericytów i stóp astrocytarnych3. Chociaż modele zwierzęce dostarczyły cennych informacji na temat funkcji BBB, gatunkowe różnice w fizjologii i metabolizmie ograniczają ich zdolność do dokładnego przewidywania reakcji organizmu człowieka na leki4,5. W związku z tym fizjologicznie istotne ludzkie modele BBB są niezbędne do oceny przepuszczalności leków w terapii GBM.

Tradycyjne modele BBB in vitro, takie jak system hodowlany Transwell, nie oddają w pełni złożoności bariery krew-mózg, w tym interakcji międzykomórkowych, dynamicznych zmian płynów oraz naprężeń ścinających wywołanych przepływem6. W przeciwieństwie do nich, mikrofluidalne modele BBB pojawiły się jako lepsze platformy, które ściśle naśladują te charakterystyki typu in vivo7. Takie systemy BBB-on-a-chip były szeroko stosowane do badania przerzutów nowotworów mózgu8, analizy dysfunkcji BBB w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera9, oraz oceny transportu leków przez BBB10,11. Jednak większość istniejących modeli BBB-chip jest wykorzystywana głównie do testów przepuszczalności leków i nie posiada możliwości włączania zewnętrznych bodźców fizycznych modulujących przepuszczalność BBB. Obecnie skupiony ultradźwięk (FUS) wyłonił się jako obiecująca strategia przejściowego otwierania BBB z możliwością całkowitej regeneracji, co umożliwia zwiększoną dostawę czynników terapeutycznych do mózgu12,13. Poprzednie badania mechanistyczne wykazały, że stymulacja mechaniczna indukowana ultradźwiękami może przejściowo modulować funkcję bariery poprzez przebudowę połączeń międzykomórkowych i zwiększenie przepuszczalności śródbłonka. Na przykład Silvani i wsp. wykazali, że siły mechaniczne indukowane ultradźwiękami generowały odwracalne tworzenie szczelin międzyśródbłonkowych w modelu in vitro vessel-on-a-chip14. Zgodnie z tymi ustaleniami, Beekers i wsp. udowodnili, że bioefekty mechaniczne pośredniczone przez ultradźwięki indukowały przejściowe otwarcie kontaktów międzykomórkowych komórek śródbłonka, zwiększając tym samym przepuszczalność śródbłonka15. Niedawno Qiao i wsp. zgłosili, że przepuszczalność bariery śródbłonka jest krytycznie regulowana przez parametry ekspozycji na ultradźwięki, szczególnie długość impulsu, co podkreśla znaczenie optymalizacji parametrów akustycznych w celu osiągnięcia bezpiecznej i kontrolowanej modulacji BBB16. Pomimo tego postępu, platformy in vitro, które jednocześnie pozwalają na ilościową analizę otwierania BBB za pomocą ultradźwięków oraz jego wpływu na dostarczanie nanoleków, pozostają ograniczone.

Aby uzupełnić powyższą lukę, przedstawiono protokół konstrukcji mikrofluidycznego chipa BBB-GBM. Urządzenie mikrofluidyczne umożliwia trikulturę komórek HCMEC, pierwotnych komórek AC oraz komórek GBM linii U87-MG osadzonych w Matrigelu. Zrekonstruowana bariera BBB wykazała cechy strukturalne i funkcjonalne nienaruszonej bariery, co udowodniono poprzez ciągłą lokalizację ZO-1 wzdłuż połączeń międzykomórkowych oraz ograniczoną dyfuzję FITC-dekstranu 40 kDa przez interfejs naczyniowy. Co istotne, chip ten można połączyć z kontrolowaną stymulacją ultradźwiękową w celu wywołania przejściowego otwarcia BBB, co zwiększa późniejszy transport i efektywność celowania nanomicel w nowotwór. Wykorzystując ten system, można ilościowo ocenić transport i efektywność celowania w nowotwór nanomicel SFN@RB@SPM. Podsumowując, platforma ta stanowi użyteczne narzędzie do badania zależności między parametrami ultradźwięków, modulacją BBB o charakterze odwracalnym a zwiększonym dostarczaniem nanomicel w terapii GBM.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były zgodne z wytycznymi (GB/T35892-2018) dotyczącymi etycznej oceny dobrostanu zwierząt doświadczalnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Instytutu Przemysłu Życia i Zdrowia w Ningbo, UCAS (numer zatwierdzenia GK-2023-XM-0073). Wykorzystane odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Wytworzenie i przygotowanie urządzenia organ-on-a-chip BBB-GBM

  1. Projekt chipa i układ fotomaski
    1. Zaprojektuj chipa za pomocą oprogramowania Auto CAD.
      UWAGA: Chip składa się z trzech równoległych kanałów mikroprzepływowych, w tym kanału krwi, kanału mózgu i kanału guza. Szerokość kanału krwi i kanału guza wynosi 1000 µm, natomiast szerokość kanału mózgu to 1300 µm. Wysokość trzech kanałów wynosi 150 µm, a sąsiednie kanały są oddzielone trapezowymi macierzami mikrosłupków o szerokości 200 µm, które umożliwiają międzykompartymentalną dyfuzję molekularną i komunikację komórkową. Szczegółowy układ projektu fotomaski przedstawiono na Ryc. uzupełniającej 1 oraz Ryc. uzupełniającej 2. W niniejszym badaniu zastosowano fotorezyst SU-8 3050.
  2. Wytwarzanie krzemowej formy matrycowej przy użyciu standardowej fotolitografii z fotorezystem SU-8.
    1. Umieść czysty wafel krzemowy na uchwycie próżniowym urządzenia do powlekania wirującego i uruchom próżnię, aby stabilnie unieruchomić wafel.
    2. Powoli nanieś 10 mL fotorezystu SU-8 na środek wafla.
    3. Przeprowadź dwuetapowy proces powlekania wirującego w celu uzyskania jednolitej warstwy fotorezystu: najpierw przy 500 rpm przez 10 s, następnie przy 2500 rpm przez 90 s.
    4. Przenieś powlekany wafel na płytę grzejną i wykonaj wstępne wygrzewanie (soft bake) w temperaturze 95 °C przez 30 min w celu odparowania rozpuszczalnika.
    5. Pozostaw wafel do ostygnięcia do temperatury pokojowej i zmierz grubość warstwy SU-8 za pomocą miernika grubości.
      UWAGA: Dla optymalnego tworzenia BBB zalecana wysokość kanału wynosi 110–150 µm. Pojedyncze powlekanie wirujące (krok 1.2.3) zazwyczaj daje grubość warstwy 40–50 µm; dlatego wymagane są dwa do trzech procesów powlekania wirującego, aby osiągnąć pożądaną całkowitą grubość.
  3. Wzorowanie fotolitograficzne
    1. Ustaw intensywność światła ultrafioletowego (UV) w urządzeniu do wyrównywania masek na 14–15 mW/cm2.
    2. Wyrównaj chromową fotomaskę z powlekanym SU-8 wafelem krzemowym i przeprowadź ekspozycję na UV przez 10 s.
    3. Niezwłocznie przenieś wafel krzemowy na płytę grzejną w celu wygrzewania po ekspozycji w następujących warunkach: 65 °C przez 10 s, a następnie 95 °C przez 300 s.
    4. Po ostygnięciu wafla krzemowego do temperatury pokojowej zanurz go w roztworze wywoływacza (monometryloetylopropylen glikol acetat, PGMEA) i pozostaw do wywołania przez 4–6 min.
    5. Przepłucz wafel izopropanolem, aby przerwać wywoływanie, a następnie przemyj wodą dejonizowaną.
    6. Osusz wafel gazem azotowym i obejrzyj ustrukturyzowane mikrokanały pod mikroskopem optycznym.
      UWAGA: Jeśli pozostaną niewywołane resztki fotorezystu, powtórz etap wywoływania, aż mikrostruktury będą wyraźnie zdefiniowane.
    7. Wypal gotową krzemową matrycę w piecu w temperaturze 200 °C przez 1 h, aby poprawić adhezję między fotorezystem SU-8 a powierzchnią wafla krzemowego.
  4. Wytwarzanie chipa z PDMS
    1. Przygotuj polidimetylosiloksan (PDMS), dokładnie mieszając prepolimer bazowy i czynnik sieciujący w stosunku wagowym 10:1 (w/w) przez 30 min, aby uzyskać jednorodny prepolimer PDMS.
    2. Wlej mieszaninę PDMS na wykonaną krzemową formę matrycową, upewniając się, że mikrostruktury są całkowicie przykryte.
    3. Umieść formę matrycową w desykatorze próżniowym w celu odpowietrzenia i usunięcia pęcherzyków powietrza.
    4. Przenieś formę matrycową do pieca i utwardzaj w temperaturze 65 °C przez 1,5–2 h.
    5. Po utwardzeniu ostrożnie wytnij warstwę PDMS wzdłuż granic chipa za pomocą noża modelarskiego i delikatnie oddziel ją od krzemowej formy matrycowej.
    6. Zanurz chip z PDMS w 70%–75% etanolu na 30 min w celu wstępnej sterylizacji, następnie przepłucz wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    7. Wykonaj otwory wlotowe i wylotowe za pomocą 2 mm wycinaka do biopsji.
  5. Wiązanie plazmowe i montaż urządzenia
    1. Umieść chip z PDMS i czystą szkiełko przedmiotowe w komorze oczyszczacza plazmowego, upewniając się, że strona z mikrokanałami PDMS jest skierowana do góry.
    2. Odsysaj powietrze z komory, aż ciśnienie spadnie poniżej 30 Pa, a następnie wprowadź gaz tlenowy.
    3. Utrzymuj przepływ tlenu przez 90 s, zachowując ciśnienie w komorze poniżej 40 Pa.
    4. Ustaw moc częstotliwości radiowej (RF) na 55% i przeprowadź obróbkę plazmową przez 90 s, aby aktywować powierzchnie PDMS i szkła.
    5. Niezwłocznie doprowadź aktywowany chip z PDMS do kontaktu ze szkiełkiem przedmiotowym i delikatnie dociśnij, aby uzyskać nieodwracalne wiązanie.
    6. Umieść zmontowane urządzenie w piecu w temperaturze 65 °C przez 24 h, aby ustabilizować wiązanie i przywrócić jego hydrofobowość.
    7. Przed wysianiem komórek wysterylizuj połączone urządzenie poprzez naświetlanie promieniami ultrafioletowymi przez 30 min.
      UWAGA: Zachowaj warunki sterylne, przechowując wysterylizowane chipy w szczelnych szalkach Petriego wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza do momentu użycia.

2. Wysiew komórek i ustanowienie modelu BBB-GBM

  1. Przygotować następujące odczynniki:
    1. pożywka hodowlana dla ACs (do kanału mózgowego): podstawowa pożywka DMEM/F12 zawierająca 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S).
    2. pożywka hodowlana dla HCMECs (do kanału naczyniowego): pożywka dla komórek śródbłonka (ECM) uzupełniona o 1% P/S.
    3. pożywka hodowlana dla komórek GBM (do kanału glejaka): podstawowa pożywka MEM zawierająca 10% FBS i 1% P/S.
    4. odczynnik do dysocjacji komórek: do odrywania komórek adherentnych należy użyć 0,25% roztworu trypsyny-EDTA.
      UWAGA: Przedłużona ekspozycja na trypsynę może zmniejszyć żywotność komórek. Należy monitorować odrywanie się komórek pod mikroskopem i niezwłocznie zneutralizować trypsynę za pomocą pełnej pożywki.
    5. Wszystkie komórki (ACs, HCMECs i U87-MG) należy utrzymywać w szalkach hodowlanych 100 mm przed wysianiem do urządzenia mikrofluidycznego.
  2. Izolacja pierwotnych ACs
    1. Wyizolować pierwotne ACs z kory mózgowej noworodków szczurów (1–3 dzień po urodzeniu). Po ostrożnym usunięciu opon mózgowych i naczyń krwionośnych w lodzie, posiekać tkankę korową sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi i poddać ją trawieniu enzymatycznemu.
    2. Przemyć zdysocjowaną zawiesinę komórkową lodowatym PBS, potraktować trypsyną w celu uzyskania dysocjacji do pojedynczych komórek, a następnie zebrać osad przez wirowanie (400 x g, 5 min, temperatura pokojowa).
    3. Resuspendować komórki i wysiać je do kolb hodowlanych T25 zawierających pożywkę dla ACs.
    4. Zidentyfikować ACs za pomocą GFAP poprzez barwienie immunofluorescencyjne. Obraz przedstawiono na Supplementary Figure 3.
  3. Wysiew komórek
    ​UWAGA: Dzień 1 – Wysiew ACs do kanału mózgowego.
    1. Wprowadzić 1 mL 0,25% trypsyny-EDTA do szalki hodowlanej z ACs. Delikatnie zamieszać, aby zapewnić równomierne pokrycie.
    2. Inkubować w 37 °C przez 1–2 min, aż komórki oddzielą się od szalki hodowlanej.
    3. Dodać 3 mL pożywki dla ACs (z kroku 2.1.1), aby zneutralizować trypsynę. Delikatnie pipetować, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
    4. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki do wirowania i wirować przy 300 × g przez 3 min w 4 °C.
    5. Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 200 µL pożywki dla AC.
    6. Określić stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i dostosować gęstość do 2,5 × 106 komórek/mL.
    7. Zmieszać zawiesinę komórek ACs z Matrigel w stosunku 3:5 (v/v) (komórki AC: Matrigel).
    8. Za pomocą mikropipety nanieść 10 µL mieszaniny Matrigel-ACs do kanału mózgowego.
      UWAGA: Procedurę ładowania należy przeprowadzać z chipem utrzymywanym w lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji Matrigelu.
    9. Inkubować chip w 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 30 min, aby umożliwić polimeryzację Matrigelu i stabilizację komórek.
      UWAGA: Dzień 1 – Wysiew HCMECs do kanału naczyniowego.
    10. Nanieść 1 mL 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować w 37 °C przez około 30 s, aż komórki się oddzielą.
    11. Dodać 3 mL pożywki dla HCMECs (krok 2.1.2), aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.
    12. Delikatnie pipetować w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny pojedynczych komórek.
    13. Zebrać zawiesinę i wirować przy 300 × g przez 3 min w 4 °C.
    14. Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 200 µL pożywki dla HCMECs.
    15. Policzyć komórki i dostosować stężenie do 2 × 106 komórek/mL.
    16. Ostrożnie wprowadzić 10 µL zawiesiny HCMECs do kanału naczyniowego chipu.
    17. Ustawić chip bokiem na 30 min w inkubatorze komórkowym, aby wspomóc przyleganie komórek śródbłonka wzdłuż ścianki kanału.
    18. Wysiać dodatkowe 10 µL zawiesiny HCMECs do kanału naczyniowego, aby zwiększyć gęstość śródbłonka w kanale naczyniowym.
    19. Inkubować chip przez kolejne 30–60 min, aby umożliwić adhezję HCMECs.
    20. Dodać 100 µL mieszanej pożywki hodowlanej do wlotu chipu.
      UWAGA: Mieszana pożywka składa się z pożywki dla AC i pożywki dla HCMECs w stosunku 1:1 (v/v).
      Dzień 3 – Wysiew komórek U87-MG do kanału glejaka.
    21. Dodać 1 mL 0,25% trypsyny-EDTA do szalki hodowlanej i inkubować w 37 °C przez 1–2 min.
    22. Dodać 3 mL pożywki dla U87-MG (z kroku 2.1.3), aby przerwać trawienie.
    23. Delikatnie pipetować, aby uzyskać homogeniczną zawiesinę pojedynczych komórek.
    24. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki do wirowania i wirować przy 300 × g przez 3 min.
    25. Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 200 µL pożywki dla U87-MG.
    26. Określić stężenie komórek i dostosować gęstość do 2 × 106 komórek/mL.
    27. Wprowadzić 10 µL zawiesiny komórek U87-MG do kanału glejaka chipu.
    28. Inkubować chip w 37 °C z 5% CO2 przez 30–60 min, aby umożliwić przyleganie komórek.
    29. Dodać 100 µL pożywki hodowlanej dla U87-MG do wlotu chipu.
    30. Utrzymywać urządzenie mikrofluidyczne w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejne 48 h, aby umożliwić formowanie się ścisłych połączeń śródbłonkowych.

3. Ocena szczelności BBB

  1. Analiza przepuszczalności
    1. Przygotować dekstran znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC-dextran) o masie cząsteczkowej 40 kDa w mieszanej pożywce hodowlanej (pożywka ACs: pożywka HCMEC = 1:1, v/v) do końcowego stężenia 10 µg/mL.
    2. Wprowadzić 10 µL roztworu FITC-dextranu do kanału naczyniowego.
    3. Umieścić chip mikrofluidyczny na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby rejestrować obrazy fluorescencyjne zarówno kanału naczyniowego, jak i sąsiedniego kanału mózgowego w odstępach 20 min w celu monitorowania dyfuzji dekstranu przez barierę śródbłonkową.
    4. Ilościowo określić współczynnik przepuszczalności (Papp, cm/s) korzystając z następującego wzoru:
      Papp (cm/s)= Równanie wydajności procesu, zawierające Fs, Fc, Δt; wzór matematyczny do badań naukowych.
      Gdzie Papp to pozorny współczynnik przepuszczalności (cm/s), FS to natężenie fluorescencji w czasie początkowym w kanale krwi, FC to natężenie fluorescencji w kanale mózgowym na koniec przedziału dyfuzji, Δt to czas dyfuzji (s), VT to objętość dyfuzji FITC-dextranu w kanale mózgowym (cm3), a A to powierzchnia śródbłonka (cm2).
      UWAGA: Niższy współczynnik przepuszczalności wskazuje na wyższą integralność BBB i szczelniejsze utworzenie bariery śródbłonkowej.
    5. Przeprowadzić analizę danych i definicję parametrów.
      UWAGA: Wartości natężenia fluorescencji z kanałów krwi i mózgu zostały skorygowane o tło przy użyciu pomiarów uzyskanych z obszarów chipu pozbawionych komórek. Obszary zainteresowania (ROI) zdefiniowano po obu stronach interfejsu krew-mózg na podstawie długości dyfuzji fluorescencji. Powierzchnię śródbłonka (A) obliczono z powierzchni interfejsu między kanałem naczyniowym a mózgowym (przyjmując przerwę między dwoma mikropilarami jako punkt odniesienia): 200 µm × 150 µm = 30 000 µm2 = 3 × 10-6 cm2. Objętość dyfuzji FITC-dextranu (VT) wyliczono jako iloczyn odległości penetracji dyfuzyjnej w kanale mózgowym i powierzchni A. Obrazy fluorescencyjne rejestrowano co 20 min (1200 s) przez okres 60 min; współczynnik przepuszczalności obliczono na podstawie danych z przedziału 20 min. Wartości przepuszczalności obliczono z trzech niezależnych chipów dla każdej grupy eksperymentalnej. Wszystkie konwersje jednostek wykonano przed wyrażeniem przepuszczalności w cm/s.
  2. Analiza immunofluorescencyjna ZO-1
    1. Przepłukać kanały mikrofluidyczne trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), aby usunąć pozostałości pożywki hodowlanej.
    2. Utrwalić komórki, wprowadzając 4% paraformaldehyd (PFA) do kanałów i inkubując przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    3. Permeabilizować komórki za pomocą 0,1% Triton X-100 w PBS przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    4. Zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał, inkubując kanały z 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 45 min w temperaturze pokojowej.
    5. Wprowadzić do kanałów przeciwciało pierwotne anty-ZO-1 (rozcieńczenie 1:200) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Dokładnie przepłukać kanał PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwotne.
    7. Inkubować chipy z przeciwciałem wtórnym anty-króliczym sprzężonym z Alexa Fluor 555 (rozcieńczenie 1:1000) przez 45 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    8. Przebarwić jądra komórkowe za pomocą 1 µg/mL 4’,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) przez 1 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: DAPI jest światłoczuły i podczas barwienia należy chronić go przed światłem.
    9. Przepłukać kanały trzykrotnie PBS.
    10. Wykonać obrazowanie urządzenia mikrofluidycznego przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego oraz konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego, aby zwizualizować lokalizację ZO-1 wzdłuż połączeń komórek śródbłonka.

4. Dostarczanie nanomiceli wspomagane ultradźwiękami przez BBB do komórek GBM

  1. Stymulacja ultradźwiękowa
    1. Ostrożnie wyjmij chip z naczynia hodowlanego i umieść go wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Zastosuj stymulację ultradźwiękową przy użyciu terapeutycznego systemu ultradźwiękowego wyposażonego w przetwornik 1 MHz (efektywna powierzchnia promieniowania: 5 cm²).2).
    3. Umieść podkładkę sprzęgającą akustycznie klasy medycznej o grubości 3 mm pomiędzy głowicą ultradźwiękową a powierzchnią chipa mikroprzepływowego, aby zapewnić efektywną transmisję akustyczną.
    4. Umieść głowicę ultradźwiękową bezpośrednio nad obszarem kanału naczyniowego urządzenia mikroprzepływowego.
      UWAGA: Pęcherzyki powietrza między przetwornikiem a chipem znacznie ograniczają transmisję energii akustycznej i należy ich unikać.
    5. Ustaw parametry ultradźwięków w następujący sposób: cykl pracy: 60%; częstotliwość: 1 MHz; natężenie: 1 W/cm²2; czas ekspozycji: 30 s; częstotliwość powtarzania impulsów (PRF): 100 Hz. Szczegółowe parametry ultradźwiękowe podano w Tabela uzupełniająca 1.
    6. W przypadku grupy kontrolnej niepoddanej leczeniu należy umieścić przetwornik ultradźwiękowy w tej samej pozycji, jednak pozostawić go w stanie nieaktywnym, aby służył jako kontrola pozorowana (sham control), zapewniając identyczny przebieg procedur bez ekspozycji na fale akustyczne.
    7. Po ekspozycji na ultradźwięki należy zdjąć podkład sprzęgający i natychmiast przenieść chip do sterylnego naczynia hodowlanego.
    8. Dodać świeżą pożywkę do portów wlotowych chipa.
    9. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do czasu dalszej analizy.
  2. Ocena modulacji BBB indukowanej ultradźwiękami
    1. Należy przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne białka ZO-1 bezpośrednio po zabiegu ultradźwiękowym (0 h) oraz 24 h po zabiegu, aby ocenić zmiany w integralności połączeń ścisłych.
    2. Należy postępować zgodnie z procedurą barwienia immunofluorescencyjnego opisaną w kroku 3.2.
    3. Porównaj rozkład barwienia ZO-1 wzdłuż osi z, aby ocenić wpływ stymulacji ultradźwiękowej na szczelność połączeń ścisłych bariery krew-mózg (BBB).
  3. Przygotowanie i charakterystyka nanomicel SFN@RB@SPM
    1. Przygotować nanomicele SFN@RB@SPM zgodnie z wcześniej opracowanym protokołem17Krótko mówiąc, roztwory zapasowe amfifilowego peptydu (oznaczonego jako SPM, 6 mg/mL), RB (0,6 mg/mL) oraz SFN (6 mM) zmieszano w stosunku objętościowym 1:1:1.
    2. Umieścić mieszaninę w sonikatorze i poddać sonikacji przy częstotliwości 28 kHz, 25 °C przez 30 min.
    3. Przeprowadzić dializę mieszaniny (próg odcięcia masy cząsteczkowej: 1000 Da) przez 48 h w celu usunięcia wolnego RB i SFN.
    4. Pomiar wielkości i potencjału zeta nanomiceli należy przeprowadzić za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Dane z charakterystyki znajdują się w Rysunek uzupełniający 4.
  4. Ocena dostarczania nanomiceli stymulowanych ultradźwiękami i ich akumulacji w komórkach glejaka
    1. Bezpośrednio po ekspozycji na ultradźwięki należy wprowadzić pożywkę hodowlaną zawierającą nanomicele do kanału naczyniowego urządzenia mikroprzepływowego.
    2. Aby ocenić transport nanomiceli przez barierę krew-mózg (BBB), należy umieścić chip mikroprzepływowy na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i rejestrować obrazy fluorescencyjne zarówno kanału naczyniowego, jak i sąsiadującego kanału mózgowego w odstępach 20-minutowych przez 60 min.
    3. Przeprowadź kwantyfikację obrazów fluorescencyjnych w kanale mózgu, aby ocenić przenikalność nanomicel zwiększoną przez ultradźwięki.
    4. Aby ocenić akumulację nanomicel w komórkach glejaka, należy inkubować urządzenie w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO22) przez 3 h po ekspozycji na ultradźwięki, a następnie obrazować kanał glejaka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu oceny wewnątrzkomórkowego poboru nanomiceli.
  5. Analiza statystyczna
    1. Wszystkie dane ilościowe należy przedstawić jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM).
    2. Każdy eksperyment należy przeprowadzić w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych (n = 3 chipy na warunek eksperymentalny). Dla każdego powtórzenia biologicznego zmierzono co najmniej trzy powtórzenia techniczne (ROI na kanał), aby zapewnić wiarygodność danych.
    3. Oblicz współczynnik przepuszczalności (Paplikacja, cm/s) z każdego niezależnego chipa służyły jako podstawowa jednostka analizy dla wszystkich porównań statystycznych.
      UWAGA: Porównania między dwiema grupami przeprowadzono przy użyciu nieparzystego dwustronnego testu t Studenta test t-StudentaPorównania między trzema lub większą liczbą grup analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Tukeya dla porównań wielokrotnych. W przypadku eksperymentów obejmujących dwie niezależne zmienne przeprowadzono dwuczynnikową analizę ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Tukeya. Analizy statystyczne wykonano przy użyciu oprogramowania statystycznego i graficznego. pwartość p

Wyniki

Podsumowując in vivo strukturę BBP, opracowano mikrofluidyczny chip z potrójną kulturą komórkową, zawierający HCMEC, pierwotne komórki astrocytów oraz komórki U87-MG (nazwany „modelem chipa”). Jak pokazano w Rysunek 1A,Bw urządzeniu rozmieszczono trzy równoległe kanały: naczyniowy (lewy, niebieski), wypełniony Matrigelami kanał mózgu (środkowy, różowy) oraz kanał guza (prawy, zielony), w których odpowiednio wysiano komórki HCMEC, AC oraz U87-MG. Kanały są oddzielone macierzami mikrofilarów, które zapewniają ograniczenie Matrigelu do przedziału środkowego, jednocześnie umożliwiając międzykanałową wymianę molekularną i komórkową. Po sterylizacji urządzenia komórki AC (2,5 × 106 komórek/ml) zawieszonych w Matrigelu w stosunku 3:5 (v/v) wprowadzono do kanału mózgowego. Po polimeryzacji Matrigelu komórki HCMEC (2 × 106 komórek/ml) zasiano w lewym kanale naczyniowym. Po 2-dniowej kokulturze AC i HCMEC, komórki U87-MG (2 × 106 (komórek/ml) wprowadzono do prawego kanału nowotworowego w celu utworzenia przedziału GBM. Model na chipie został w pełni ustanowiony do 5. dnia. Następnie oceniono szczelność bariery poprzez Immunobarwienie ZO-1 i pomiary przepuszczalności dla dekstranu FITC o masie 40 kDa. Jak pokazano w Rysunek 1C, ZO-1 wykazywało ciągły, liniowy rozkład wzdłuż interfejsu HCMEC-AC, co potwierdziło utworzenie połączeń ścisłych na interfejsie BBB. Rekonstrukcja 3D w mikroskopii konfokalnej dodatkowo ujawniła wyraźne sygnały ZO-1 na interfejsie kanału naczyniowo-mózgowego (płaszczyzna z-y, Rysunek 1D), co potwierdza powstanie nienaruszonej bariery endotelialnej wewnątrz chipa. Aby dalej określić funkcję bariery, oceniono przepuszczalność dla dekstranu FITC o masie 40 kDa. Przepuszczalność była kwantyfikowana w odstępach 20-minutowych przez 1 h. Jak pokazano w Rycina 1E,Fwspółczynnik przepuszczalności wynosi (3,46 ± 0,50) × 10-6 cm/s w 60. minucie, co jest porównywalne do in vivo mikrokrążenie szczura18 or zaawansowane modele oparte na indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC)19i stanowi ono znaczną poprawę w stosunku do konwencjonalnych modeli opartych wyłącznie na śródbłonku13Łącznie te dane strukturalne i funkcjonalne potwierdziły pomyślne utworzenie fizjologicznie istotnej platformy BBB-GBM.

Z uwagi na doniesienia, że ultradźwięki indukują przejściowe i w dużej mierze odwracalne otwieranie BBB, przy czym funkcja bariery jest zazwyczaj przywracana w ciągu 24 h20, w następnej kolejności zbadano bezpośredni wpływ stymulacji US na funkcję BBB w modelu na chipie w czasie 0 h lub 24 h po ekspozycji na US. Model na chipie poddano działaniu US (1 W/cm2, 1MHz, 30 s). Analiza immunofluorescencyjna ZO-1 wykazała porównywalną intensywność w 0 h i 24 h po zabiegu US (Rycyna 2A), co sugeruje zachowanie integralności połączeń ścisłych. Ilościowa analiza fluorescencji ZO-1 potwierdziła porównywalną intensywność sygnału na styku naczyniowo-mózgowym pomiędzy grupą kontrolną a grupą traktowaną US (Rycina 2B). Aby dalej ocenić, czy ekspozycja na US zwiększyła przepuszczalność BBB, jako znacznika przepuszczalności zastosowano 40 kDa FITC-dekstran. Jak pokazano na Rycynie 2C,D, ekspozycja na US szybko przyspieszyła dyfuzję znacznika przez BBB, a współczynnik przepuszczalności wzrósł z 4.20 x 10-6cm/s w grupie nieleczonej do 1.33 x 10-5cm/s. W 24 h po ekspozycji na US współczynnik przepuszczalności spadł do 8.04 x 10-6cm/s, co oznacza znaczną regenerację w porównaniu z grupą bezpośrednio po US, choć pozostał on nieco wyższy niż poziom kontrolny w grupie nieleczonej. Wyniki te demonstrują, że US o niskiej intensywności indukuje przejściowe otwieranie BBB, po którym następuje znaczna regeneracja funkcji bariery przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej w modelu na chipie.

Następnie oceniono przepuszczalność nanomiceli SFN@RB@SPM przez barierę krew-mózg (BBB) pod wpływem stymulacji ultradźwiękami (US). W naszym poprzednim badaniu wykazano, że te samoorganizujące się nanomicele skutecznie przekraczają BBB i gromadzą się w miejscu guza w mysim modelu glejaka ksenoprzeszczepionego17. Aby sprawdzić, czy modulacja US zwiększa transport SFN@RB@SPM w tym modelu na chipie, zastosowano te same parametry sonikacji, co w Rysunku 2C. Ekspozycja na US znacznie przyspieszyła transport SFN@RB@SPM przez BBB, podnosząc współczynnik przepuszczalności z (2,42 ± 0,15) × 10-5 cm/s do (4,58 ± 0,07) × 10-5 cm/s w 60 min po zabiegu, co stanowi 1,9-krotny wzrost w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 3A, B). Aby zweryfikować aktywne celowanie w guz, zmierzono sygnał czerwonej fluorescencji RB w kanale glejaka po wstrzyknięciu nanomiceli do kanału naczyniowego. Jak pokazano na Rysunku 3C, w kanale glejaka 3 h po ekspozycji na US zaobserwowano wyraźny wzrost czerwonej fluorescencji, co wskazuje na zwiększony transport nanomiceli przez BBB. W przypadku braku US wykryto jedynie pomijalną fluorescencję, co potwierdza, że przerwanie BBB jest niezbędne, aby SFN@RB@SPM dotarły do miejsca guza i uległy tam zagęszczeniu.

Schemat mikroprzepływowego chipa bariery krew-mózg oraz eksperyment przedstawiający analizę danych o przepuszczalności.
Rycina 1: Fabrykacja i charakterystyka modelu BBB-GBM on-a-chip. (A) Schemat trójkanałowego urządzenia mikroprzepływowego: kanał naczyniowy (niebieski), kanał mózgowy (różowy) oraz kanał nowotworowy (zielony). (B) Fotografia zmontowanego chipa z PDMS i szkła. (C) Immunobarwienie ZO-1 (czerwony) w połączeniach śródbłonkowych z przeciwbarwieniem jąder DAPI (niebieski). Pasek skali: 50 µm. (D) Ortogonalne widoki konfokalne (x-z i y-z) pokazujące wzbogacenie ZO-1 (czerwony) na styku naczyniowo-mózgowym. (E) Reprezentatywne obrazy time-lapse dyfuzji 40 kDa FITC-dextran z kanału naczyniowego do kanału mózgowego w ciągu 60 min (interwały 20-minutowe). Pasek skali: 200 µm. (F) Ilościowo określone współczynniki przepuszczalności, potwierdzające selektywną względem wielkości funkcję bariery. Dane reprezentują średnią ± SEM z trzech niezależnych chipów (n = 3). Istotność statystyczną określono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Tukeya dla porównań wielokrotnych. Dokładna wartość p jest przedstawiona na rycinie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna, wykres przepuszczalności, porównanie US, time-lapse, analiza przepuszczalności.
Rysunek 2: Otwarcie BBB i późniejsza regeneracja funkcji bariery indukowane ultradźwiękami. (A) Immunobarwienie ZO-1 na styku naczyniowo-mózgowym bezpośrednio (0 h) oraz 24 h po sonikacji. Przedstawiono rekonstrukcje konfokalne 3-D. (B) Znormalizowana intensywność fluorescencji ZO-1 wzdłuż osi z (głębokość) na styku naczyniowo-mózgowym w grupie kontrolnej i grupie traktowanej US. (C) Kinetyka dyfuzji FITC-dekstranu 40 kDa z przedziałów naczyniowych do mózgowych w 0 h i 24 h, z ekspozycją na US lub bez niej (obrazy pozyskiwane w odstępach 20-minutowych przez 60 min). Pasek skali: 200 µm. (D) Ilościowo określony współczynnik przepuszczalności dla znacznika 40 kDa w 0 h lub 24 h po US, z sonikacją lub bez niej. Dane przedstawiają średnią ± SEM z trzech niezależnych chipów (n = 3). Istotność statystyczną określono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Tukeya dla porównań wielokrotnych. Istotność statystyczna: p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Badanie przepuszczalności komórkowej z zastosowaniem ultradźwięków; obejmuje obrazy z odstępami czasowymi, wykres słupkowy przepuszczalności oraz mikroskopię fluorescencyjną z porównaniem barwienia DAPI.
Rysunek 3: Zwiększona pod wpływem ultradźwięków przepuszczalność i celowanie SFN@RB@SPM do komórek U87-MG. (APomiar przepuszczalności SFN@RB@SPM przez barierę naczyniowo-mózgową, z ekspozycją na US lub bez niej. Pasek skali: 200 µm. (B) Ilościowe współczynniki przepuszczalności SFN@RB@SPM w warunkach kontrolnych oraz po potraktowaniu ultradźwiękami (US). (C) Akumulacja SFN@RB@SPM w kanale guza po otwarciu BBB za pomocą ultradźwięków; fluorescencję czerwoną zarejestrowano 3 h po wstrzyknięciu. Pasek skali: 50 µmDane przedstawiają średnią ± SEM z trzech niezależnych chipów (n = 3). Istotność statystyczną określono przy użyciu nieparowego dwustronnego testu Student’a test t-StudentaIstotność statystyczna: p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Projekt CAD układu mikroprzepływowego chipa BBB-GBM.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Szczegółowy projekt chipa BBB-GBM. Konstrukcja składa się z trzech równoległych kanałów mikroprzepływowych; szerokość obu kanałów bocznych wynosi 1000 µm, natomiast szerokość kanału środkowego wynosi 1300 µm.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Charakterystyka astrocytów pierwotnych za pomocą GFAP (kolor zielony) oraz barwienie jąder komórkowych DAPI (kolor niebieski). Pasek skali: 50 µm.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 4: Charakterystyka samomontowanych nanomiceli SFN@RB@SPM. (A) Analiza dynamicznego rozpraszania światła (DLS) wykazująca rozkład wielkości SFN@RB@SPM, ze średną średnicą cząstek wynoszącą około 64 nm. (B) Pomiar potencjału zeta wskazuje na ładunek powierzchniowy wynoszący około 150,67 ± 2,85 mV. Wszystkie pomiary wykonano przy użyciu aparatury DLS.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela podsumowująca parametry ultradźwięków.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje sposób tworzenia mikroprzepływowego chipa BBB-GBM do oceny modulacji BBB za pomocą ultradźwięków oraz dostarczania nanomiceli. W porównaniu do konwencjonalnych modeli BBB in vitro (np. Transwell), platforma mikroprzepływowa ta umożliwia przestrzennie zdefiniowaną kokulturę komórek śródbłonka, astrocytów (AC) i komórek glejaka, co pozwala na badanie transportu leków przez fizjologicznie istotną barierę krew-mózg. Kilka krytycznych etapów protokołu wymaga starnej optymalizacji, aby zapewnić wiarygodne uformowanie bariery. Jednym z kluczowych parametrów jest stosunek objętości Matrigelu do medium zawiesiny komórek AC wykorzystywanego do przygotowania mieszaniny wprowadzanej do centralnego kanału mózgowego. Stosunek ten ma kluczowe znaczenie dla utrzymania odpowiedniej lepkości żelu, tak aby mieszanina AC-Matrigel pozostała w środkowym kanale podczas ładowania. Jeśli mieszanina zawiera zbyt dużą część medium zawiesiny komórek AC, zmniejszona lepkość może spowodować wyciek Matrigelu do sąsiednich mikrokanałów, co umożliwi migrację komórek AC do kanałów bocznych. I odwrotnie, zbyt skoncentrowany Matrigel może upośledzić żywotność komórek i utrudnić dyfuzję składników odżywczych. Zoptymalizowany stosunek 3:5 (v/v) zawiesiny komórek AC do Matrigelu (krok 2.2.7) zapewnia wystarczającą stabilność mechaniczną do zatrzymania żelu w kanale centralnym, wspierając jednocześnie wzrost AC w Matrigelu. Podobne kwestie podkreślono w innych mikroprzepływowych modelach BBB, gdzie właściwa lepkość hydrożelu (np. fibryny lub Matrigelu) jest krytyczna dla zapobiegania wyciekom międzykanałowym, utrzymania separacji przestrzennej przedziałów komórkowych i naśladowania właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej7,21,22.

Po drugie, natychmiast po wysianiu HCMEC do kanału naczyniowego, urządzenie mikrofluidyczne należy ustawić bokiem na około 30 min. Ten krok sprzyja przyleganiu HCMEC wzdłuż ściany bocznej pomiędzy kanałem naczyniowym a mózgowym, co jest niezbędne do utworzenia ciągłej bariery endotelialnej na styku komórki z komórką. Bez tego kroku HCMEC osadzają się głównie na dolnej powierzchni kanału, co skutkuje niepełnym pokryciem endotelialnym ściany bocznej i obniżoną szczelnością bariery. Następny krok dodatkowego wysiewania HCMEC zapewnia dalszą, wystarczającą gęstość komórek w kanale naczyniowym. Utrzymanie odpowiedniej gęstości komórek jest istotne, ponieważ niska gęstość HCMEC może prowadzić do niepełnego utworzenia monowarstwy i zwiększonej apoptozy. Wcześniejsze badania nad BBB-on-a-chip w podobny sposób podkreślały, że uzyskanie konfluencyjnej monowarstwy endotelialnej ma krytyczne znaczenie dla integralności bariery i ekspresji białek złączy szczelnych w systemach mikrofluidycznych23,24.

Rozwiązywanie typowych problemów może znacząco poprawić powtarzalność badań. Jeśli podczas ładowania kanału mózgowego (krok 2.2.8) dojdzie do wycieku Matrigelu do sąsiednich kanałów: (1) należy upewnić się, że mieszanina Matrigelu i komórek jest przechowywana w lodzie, aby zapobiec polimeryzacji Matrigelu; (2) mieszaninę komórek z Matrigelem należy wstrzykiwać powoli i jednostajnie, aby uniknąć przelania do sąsiednich kanałów; (3) należy dostosować stosunek Matrigelu do komórek do 5:4 (v/v), co pomaga utrzymać odpowiednią lepkość i ograniczenie materiału w obrębie kanału centralnego. Ponadto pomyślne uformowanie bariery śródbłonkowej zależy w dużej mierze od odpowiedniego przylegania i gęstości komórek śródbłonka. Jeśli komórki śródbłonka nie utworzą ciągłej warstwy jednowarstwowej wzdłuż interfejsu kanału naczyniowego, należy rozważyć zwiększenie gęstości wysiewu komórek śródbłonka lub wydłużenie czasu adhezji, aby poprawić pokrycie śródbłonkiem i formowanie złączy ścisłych. Jeśli po dodaniu pożywki w kanale pojawią się pęcherzyki powietrza, należy delikatnie opukać chip lub usunąć je za pomocą żółtej końcówki pipety poprzez delikatne odsysanie, ponieważ pęcherzyki uwięzione w pobliżu bariery śródbłonkowej mogą miejscowo naruszyć integralność złączy ścisłych.

Chociaż opisany tutaj model BBB-GBM on-a-chip zapewnia bardziej relewantny fizjologicznie model, kilka aspektów może zostać dodatkowo zoptymalizowanych w przyszłych badaniach w celu poprawy zgodności fizjologicznej i zrozumienia mechanistycznego. Pierwszym z nich jest zastosowany obecnie model wykorzystujący pierwotne AC pochodzenia szczurzego w kokulturze z HCMEC, co skutkuje niedopasowaniem gatunkowym. Chociaż podejście to było szeroko stosowane przy konstrukcji platform BBB-on-a-chip13,23, różnice gatunkowe mogą wpływać na właściwości bariery i odpowiedzi w zakresie przepuszczalności leków. W przyszłych badaniach zostaną zastosowane AC pochodzące z ludzkich iPSC lub pierwotne ludzkie AC w celu stworzenia w pełni zhumanizowanego modelu, co wyeliminuje to ograniczenie i dodatkowo zwiększy relewantność translacyjną platformy. Po drugie, obecny model nie zawiera komponentów jednostki naczyniowo-nerwowej, w szczególności perycytów i komórek odpornościowych, które są ważnymi regulatorami funkcji BBB i progresji guza25,26. Włączenie tych komponentów pozwoliłoby lepiej odtworzyć złożoność mikrośrodowiska guza. Po trzecie, urządzenie pracuje w warunkach statycznych, bez ciągłej perfuzji medium. Wykazano, że fizjologiczne naprężenie ścinające generowane przez przepływ krwi poprawia właściwości BBB poprzez zwiększenie ekspresji białek połączeń ścisłych, takich jak claudin-5 i occludin . Zatem brak przepływu może być przyczyną wyższego współczynnika przepuszczalności obserwowanego w chipach statycznych w porównaniu z systemami dynamicznymi27. Po czwarte, integralność BBB była oceniana głównie poprzez połączenie barwienia immunofluorescencyjnego ZO-1 z analizą przepuszczalności FITC-dekstranu. Niemniej jednak te komplementarne testy strukturalne i funkcjonalne są szeroko stosowane do walidacji BBB zarówno w konwencjonalnych modelach BBB transwell, jak i w mikrofluidycznych modelach BBB-on-a-chip6,28,29. Dodatkowa charakterystyka kluczowych regulatorów sterujących transportem parakomórkowym i transkomórkowym, w tym claudin-530, MFSD2A oraz caveolin-1, zapewniłaby bardziej kompleksową ocenę funkcji BBB30,31,32. Markery te zostaną uwzględnione w przyszłych badaniach, aby dodatkowo wzmocnić charakterystykę fizjologiczną platformy. Wreszcie, niniejszy protokół wykorzystuje terapeutyczne ultradźwięki o niskiej intensywności bez egzogennych mikropęcherzyków lub bezpośredniego pomiaru ciśnienia akustycznego. W przeciwieństwie do konwencjonalnych systemów ultradźwięków skupionych, które zazwyczaj wykorzystują wspomagane mikropęcherzykami otwieranie BBB in vivo, obecne badanie zostało zaprojektowane w celu stworzenia uproszczonej, powtarzalnej platformy in vitro do oceny indukowanej ultradźwiękami modulacji przepuszczalności BBB i transportu nanoleków. Podejście to minimalizuje dodatkowe zmienne związane z koncentracją mikropęcherzyków, ich rozkładem oraz zachowaniem kawitacyjnym w mikrofluidycznym środowisku w skali mikro. Niemniej jednak, przyszłe badania obejmujące ultradźwięki wspomagane mikropęcherzykami, monitorowanie temperatury oraz szczegółową charakterystykę pola akustycznego dodatkowo zwiększą relewantność fizjologiczną i ilościowe zrozumienie modulacji BBB za pomocą ultradźwięków.

Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół zapewnia kontrolowaną mikrofluidyczną platformę BBB-GBM, która umożliwia integrację stymulacji ultradźwiękowej z ilościową analizą dostarczania nanomiceli. System ten pozwala na bezpośrednie badanie otwierania bariery krew-mózg (BBB) za pomocą ultradźwięków oraz następującego po tym transportu nanoleków przez barierę śródbłonkową. Poza oceną dostarczania nanomiceli, platforma ta może być również wykorzystywana do przesiewu leków pod kątem ich zdolności do przenikania przez BBB, badania mechanizmów rozszczelnienia BBB oraz służyć jako zaawansowane narzędzie do przedklinicznej oceny terapii skierowanych do ośrodkowego układu nerwowego (CNS).

Oświadczenia

Podczas przygotowywania niniejszego manuskryptu autorzy korzystali z ChatGPT (OpenAI) wyłącznie w celu redakcji i poprawy języka. Autorzy sprawdzili i zredagowali wszystkie treści przygotowane przy wsparciu AI i biorą pełną odpowiedzialność za dokładność i rzetelność manuskryptu. Narzędzia AI nie były wykorzystywane do generowania danych, analizy ani przygotowywania rycin.

Podziękowania

Z wdzięcznością potwierdzamy otrzymanie finansowania z Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (LQ24H160003), Medical Scientific Research Foundation of Zhejiang Province (2024KY351), Ningbo Natural Science Foundation (2023J365), Yongjiang Talent Introduction Programme (Young Innovative Talent Project, 2021A-012-G) oraz Bei’An Talent Programme of Jiangbei District, Ningbo (2023RC004).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało wtórne anty-królicze koniugowane z Alexa Fluor 555Cell Signaling Technology, Inc.4413
Przeciwciało anty-ZO-1Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
Wycinak do biopsjiZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
Seryjna albumina wołowaAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
Licznik komórekThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
Szalka do hodowli komórek (100 mm)Corning Inc.430167
WirówkaBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
Maska chromowaSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
Konfokalny skaningowy mikroskop laserowyCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
WywoływaczSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
ECMScienCell Research Laboratories1001
EtanolNingbo Zhenhai Yongfeng Chemical Plant6923193900015
Płodowa surowica wołowaScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)Projekt open-sourceN/A
FITC-Dekstran (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
Lamelki szklaneCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
Graphpad prism 9.5GraphPad Software, Inc.N/A
Ludzkie komórki śródbłonka mikrokrążenia mózgowego (HCMECs)BeNa Culture CollectionBNCC337717
InkubatorEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyNikon Instruments Inc.TS2-FL
IzopropanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEMPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
AzotNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
TlenNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
Paraformaldehyd (PFA, 4%)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
PBSScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
PDMSCorning Inc.220777
Penicylina/streptomycynaPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
FotolitografiaInstytut Optyki i Elektroniki Chińskiej Akademii NaukURE-2000\AL
Płyta grzejna do fotolitografiiSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
Urządzenie do usuwania pozostałości (Plasma Asher)TIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
Pierwotne astrocytyN/AN/AWyizolowane z mózgu noworodka szczura (dzień 1-3)
Wafle krzemoweZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
Powlekarka wirująca (Spin Coater)Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
TrypsynaScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
Komórki U87-MGPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
Urządzenie ultradźwiękowe Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4(blue edition)Carl Zeiss AGN/A

Bibliografia

  1. Narsinh KH, Perez E, Haddad AF, Young JS, Savastano L, Villanueva-Meyer JE, et al. Strategies to improve drug delivery across the blood-brain barrier for glioblastoma. Curr Neurol Neurosci Rep. 2024;24(5):123-139.
  2. Xie Y, Yang F, He L, Huang H, Chao M, Cao H, et al. Single-cell dissection of the human blood-brain barrier and glioma blood-tumor barrier. Neuron. 2024;112(18):3089-105 e7.
  3. Scalise AA, Kakogiannos N, Zanardi F, Iannelli F, Giannotta M. The blood-brain and gut-vascular barriers: from the perspective of claudins. Tissue Barriers. 2021;9(3):1926190.
  4. Sivandzade F, Cucullo L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(10):1667-1681.
  5. Shawahna R, Decleves X, Scherrmann JM. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 2013;14(1):120-136.
  6. Oddo A, Peng B, Tong Z, Wei Y, Tong WY, Thissen H, et al. Advances in Microfluidic Blood-Brain Barrier (BBB) Models. Trends Biotechnol. 2019;37(12):1295-1314.
  7. Hajal C, Offeddu GS, Shin Y, Zhang S, Morozova O, Hickman D, et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nat Protoc. 2022;17(1):95-128.
  8. Xu H, Li Z, Yu Y, Sizdahkhani S, Ho WS, Yin F, et al. A dynamic in vivo-like organotypic blood-brain barrier model to probe metastatic brain tumors. Sci Rep. 2016;6:36670.
  9. Park J, Wetzel I, Marriott I, Dreau D, D'Avanzo C, Kim DY, et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 2018;21(7):941-951.
  10. Park TE, Mustafaoglu N, Herland A, Hasselkus R, Mannix R, FitzGerald EA, et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nat Commun. 2019;10(1):2621.
  11. Peng B, Tong Z, Tong WY, Pasic PJ, Oddo A, Dai Y, et al. In situ surface modification of microfluidic blood-brain-barriers for improved screening of small molecules and nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(51):56753-56766.
  12. Mainprize T, Lipsman N, Huang Y, Meng Y, Bethune A, Ironside S, et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: a clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 2019;9(1):321.
  13. Adriani G, Ma D, Pavesi A, Kamm RD, Goh EL. A 3D neurovascular microfluidic model consisting of neurons, astrocytes and cerebral endothelial cells as a blood-brain barrier. Lab Chip. 2017;17(3):448-459.
  14. Silvani G, Scognamiglio C, Caprini D, Marino L, Chinappi M, Sinibaldi G, et al. Reversible cavitation-induced junctional opening in an artificial endothelial layer. Small. 2019;15(51):e1905375.
  15. Beekers I, Vegter M, Lattwein KR, Mastik F, Beurskens R, van der Steen AFW, et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 2020;322:426-438.
  16. Qiao C, Luo S, Liu Z, Bu Y, Cai Y, Liu Z, et al. Tuning endothelial barrier permeability with ultrasound: a pulse-length-dependent interplay between bubble dynamics and cellular bioeffects. Ultrason Sonochem. 2026;129:107851.
  17. Li Y, Yang X, Wei Z, Niu H, Wu L, Chen C, et al. Sulforaphane wrapped in self-assembled nanomicelle enhances the effect of sonodynamic therapy on glioma. Pharmaceutics. 2024;17(1):34.
  18. Yuan W, Lv Y, Zeng M, Fu BM. Non-invasive measurement of solute permeability in cerebral microvessels of the rat. Microvasc Res. 2009;77(2):166-173.
  19. Lee SWL, Campisi M, Osaki T, Possenti L, Mattu C, Adriani G, et al. Modeling nanocarrier transport across a 3D in vitro human blood-brain-barrier microvasculature. Adv Healthc Mater. 2020;9(7):e1901486.
  20. Mehta RI, Carpenter JS, Mehta RI, Haut MW, Ranjan M, Najib U, et al. Blood-brain barrier opening with MRI-guided focused ultrasound elicits meningeal venous permeability in humans with early Alzheimer disease. Radiology. 2021;298(3):654-662.
  21. Cho H, Seo JH, Wong KH, Terasaki Y, Park J, Bong K, et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 2015;5:15222.
  22. Campisi M, Shin Y, Osaki T, Hajal C, Chiono V, Kamm RD. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  23. Wang YI, Abaci HE, Shuler ML. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. 2017;114(1):184-194.
  24. Jiang L, Li S, Zheng J, Li Y, Huang H. Recent progress in microfluidic models of the blood-brain barrier. Micromachines (Basel). 2019;10(6):375.
  25. Bonkowski D, Katyshev V, Balabanov RD, Borisov A, Dore-Duffy P. The CNS microvascular pericyte: pericyte-astrocyte crosstalk in the regulation of tissue survival. Fluids Barriers CNS. 2011;8(1):8.
  26. Hurtado-Alvarado G, Cabanas-Morales AM, Gomez-Gonzalez B. Pericytes: brain-immune interface modulators. Front Integr Neurosci. 2014;7:80.
  27. Santa-Maria AR, Walter FR, Figueiredo R, Kincses A, Vigh JP, Heymans M, et al. Flow induces barrier and glycocalyx-related genes and negative surface charge in a lab-on-a-chip human blood-brain barrier model. J Cereb Blood Flow Metab. 2021;41(9):2201-2215.
  28. van der Helm MW, van der Meer AD, Eijkel JC, van den Berg A, Segerink LI. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 2016;4(1):e1142493.
  29. Alluri H, Peddaboina CS, Tharakan B. Evaluation of tight junction integrity in brain endothelial cells using confocal microscopy. Methods Mol Biol. 2024;2711:257-262.
  30. Nitta T, Hata M, Gotoh S, Seo Y, Sasaki H, Hashimoto N, et al. Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice. J Cell Biol. 2003;161(3):653-660.
  31. Ben-Zvi A, Lacoste B, Kur E, Andreone BJ, Mayshar Y, Yan H, et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 2014;509(7501):507-511.
  32. Andreone BJ, Chow BW, Tata A, Lacoste B, Ben-Zvi A, Bullock K, et al. Blood-brain barrier permeability is regulated by lipid transport-dependent suppression of caveolae-mediated transcytosis. Neuron. 2017;94(3):581-594 e5.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model glejaka wielopostaciowegoultrasoniczne otwieranie BBPprzepuszczalno BBPkom rki r db onkakokultura astrocyt wtest z FITC dekstrantransport nanomiceli
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.