Obrazowanie żywych komórek i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania dynamiki klonalnej i przejść losu w ludzkich i mysich organoidach jelitowych

Podsumowanie

Opisujemy mikroskopię konfokalną i metody śledzenia zastosowane do dwóch strategii reporterowych: mozaikowych organoidali do rozdzielania zachowania i losu poszczególnych komórek oraz organoidali reporterowych typu komórkowego do monitorowania przemian typów komórek w ludzkich i mysich organoidach jelitowych.

Streszczenie

Nabłonek jelitowy podlega szybkiej samo-odnowie poprzez dzielenie komórek macierzystych, różnicowanie komórek i migrację. Zrozumienie, jak pojedyncze komórki decydują się na określone losy i jak powstają dynamiki klonalne w tym tkankach, wymaga metod, które uchwycą zachowanie komórki w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczej komórki. Organoidy jelitowe odtwarzają kluczowe cechy samoorganizacji nabłonka i różnorodności typów komórek, czyniąc je potężnym systemem do badania tych procesów w kontrolowanym otoczeniu. Przedstawiamy tu protokół długotrwałego konfokalnego obrazowania na żywo (do 72 h) i śledzenia pojedynczych komórek w ludzkich i mysich organoidach jelitowych, oparty na dwóch uzupełniających się strategiach raportowania. Po pierwsze, opisujemy generowa­nie organoidów mozaikowych poprzez łączenie różnicująco ozna­czonych populacji komórek, umożliwiające rozdzielczość na poziomie pojedynczej komórki dla raporterów zlokalizo­wanych w błonach i cytoszkielecie, które inaczej nie mogłyby być przypisane do pojedynczych komórek w gęstym nabłonku. Po drugie, stosujemy raportery losów specyficz­nych dla typu komórki (MUC2 dla komórek kryptowych i DEFA5 dla komórek Panetha), aby monitorować przemiany typów komórek wydzielniczych w czasie rzeczywistym. Protokół obejmuje hodowlę organoidów, formowanie mozaikowych organoidów, przygotowanie próbek z strategiami minimalizującymi fototoksyczność, zdobywanie obrazów przez kilka dni i półautomatyczne śledzenie pojedynczych komórek za pomocą OrganoidTracker, który rekonstruuje trajektorie i linie komórkowe w czasie. Chociaż zademonstrowano go na organoidach jelitowych, ten szkic jest łatwo przystosowywalny do innych systemów organoidów nabłonkowych, w tym żołądkowych, trzustkowych i jelitowych, poszerzając jego przydatność do badań nad biologią nabłonka, homeostazą i chorobami.

Wprowadzenie

Nabłonek jelitowy jest jednym z najszybciej się odnawiających tkanek w organizmie, przy czym większość komórek zostaje zastąpiona w ciągu trzech do pięciu dni. Ta ciągła wymiana jest utrzymywana przez pozytywne na receptor sprzężony z białkiem G, zawierające powtórzenia bogate w leucynę (Lgr5) komórki macierzyste, znajdujące się u podstawy krypt jelitowych, które dają początek komórkom przodującym w przemieszczaniu, które różnicują się na specjalistyczne typy komórek wyściółki jelita podczas migracji w kierunku końcówki kosmówki¹. Główne zróżnicowane linie obejmują absorpcyjne enterocyty, komórki wydzielnicze śluzu, komórki enteroendokrynne wytwarzające hormony oraz przeciwdrobnoustrojowe komórki Panetha². Jak pojedyncze komórki decydują się na określone losy, jak zbiorcze zachowanie komórek powstaje z dynamiki pojedynczych komórek oraz jak osiągana jest koordynacja na poziomie tkanki, to nadal fundamentalne pytania w biologii jelita. Odpowiedź na te pytania wymaga podejść eksperymentalnych, które rejestrują zachowanie komórek z rozdzielczością pojedynczych komórek, w czasie rzeczywistym oraz na skalach czasowych odpowiednich dla różnicowania i migracji³.

Organoidy jelitowe, trójwymiarowe (3D) struktury samoorganizujące się, rosnące z pojedynczych komórek macierzystych lub fragmentów tkankowych, powtarzają kluczowe aspekty architektury nabłonkowej, samoorganizacji i różnorodności typów komórek^4,5,6. Od czasu ich opracowania organoidy stały się niezastąpionym narzędziem do badań nad biologią jelita, modelowaniem chorób i odpowiedzi na leki. Zarówno mysie, jak i ludzkie organoidy jelitowe mogą być utrzymywane długoterminowo w hodowli, genetycznie modyfikowane za pomocą podejść opartych na klastrowanych regularnie rozmieszczanych krótkich palindromowych powtórzeniach (CRISPR) oraz łączone w mozaikowe struktury poprzez miksowanie dissociowanych pojedynczych komórek o różnych genotypach lub raportujących tłach przed ponownym zatopieniem w ekstraktach błony podstawnej^7,8,9. Mozaikowe organoidy łączą komórki o odrębnych tłach genetycznych lub fluorescencyjnych w jednej strukturze, tak że populacje doświadczają identycznych sygnałów niszowych i kontekstu mechanicznego oraz mogą być porównywane z wbudowanymi wewnętrznymi kontrolami. Ta genetyczna łatwość użycia sprawia, że są szczególnie odpowiednie do badań live-imaging, które wymagają precyzyjnego znaczenia określonych populacji komórek^6,10,11,12. Reportery, które znaczą komórki sporadycznie, takie jak znaczniki losów specyficznych dla typu komórki, produkują izolowanych fluorescencyjnych komórek, które mogą być śledzone i analizowane indywidualnie poprzez metody śledzenia pojedynczych komórek. Jednakże, stałe wyzwanie powstaje, gdy białka zlokalizowane w błonie i cytoszkielecie, takie jak złącza komórkowe lub kortykalna Myozyna-II, są znaczone jednolicie w całym nabłonku. Ich sygnały nie mogą być przypisane do pojedynczych komórek, ponieważ sąsiednie komórki dzielą ich granice na poziomie mikroskopii konfokalnej. Mozaikowe organoidy pokonują tę ograniczność: gdy komórka ekspresująca fluorescencyjnego reportera jest otoczona przez nieznaczone sąsiadów, jej złącza i cytoszkieleczne sygnały mogą być jednoznacznie przypisane do tej pojedynczej komórki, ujawniając jak remodeluje ona swój cytoszkielet podczas migracji, podziału lub ekstruzji^9,13. Regulacja proporcji znaczenia odwraca ten widok, pozwalając na przechwycenie odpowiedzi sąsiedztwa wokół nieznaczonej komórki. Reportery jądrowe histonu H2B takie jak H2B-mCherry czy H2B-iRFP służą jako narzędzia do identyfikacji wzorca mozaikowego i lokalizacji pouczających konstelacji komórek dla analizy. Poza rozdzielczością pojedynczych komórek, mozaikowe organoidy również umożliwiają bezpośrednie porównania dostosowania między genotypami: ponieważ obie populacje dzielą tę samą niszę, różnice w czasie życia komórki lub współczynniku ekstruzji dostarczają wewnętrznie kontrolowanego odczytu konkurencyjnego dostosowania^9,14,15.

Live-cell imaging organoidów, jednakże, prezentuje specyficzne wyzwania techniczne. Ich 3D geometria wymaga mikroskopii konfokalnej lub warstwy świetlnej dla sekcjonowania optycznego^16,17,18,19. Rejestrowanie powolnych procesów takich jak różnicowanie i migracja wymaga czasu trwania obrazu od 24 godzin lub więcej, z staranną optymalizacją mocy lasera, czasu ekspozycji i interwałów obrazu, aby ograniczyć fototoksyczność^16,18. Macierz osadzająca i medium kulturowe muszą wspierać zdrowie organoidów, pozostając kompatybilnymi z optiką mikroskopu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi zatwierdzonymi przez Centralny Komitet ds. Eksperymentów na Zwierzętach (CCD) holenderskiego rządu oraz Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami KNAW/Hubrecht Institute (IvD). Organoidy jelitowe człowieka wyhodowano z tkanki pacjenta uzyskanej w University Medical Center Utrecht (UMCU) za pisemną zgodą pacjenta. Badanie zatwierdził komitet etyczny UMCU (Utrecht, Holandia) i przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińskiej i holenderskim prawem.

1. Hodowla i utrzymanie organoidów

1. Przygotuj medium do wzrostu Epidermal growth factor, Noggin i R-spondin (ENR) na jelitowe organoidy mysie (Tabela 1).
2. Przygotuj Medium do ekspansji (Tabela 2), Medium do paternizacji (Tabela 3) i Medium do dojrzewania (Tabela 4) na jelitowe organoidy człowieka.
3. Roztapiaj strzykawkę z redukowanego czynnika wzrostu wyciągu z błony podstawnej (BME) na lodzie przez noc przed użyciem. 
4. Zawsze trzymaj BME na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu.
5. Hoduj jelitowe organoidy mysie w medium ENR osadzone w BME, przesadzając co 7 dni w proporcji 1:4 do 1:8 poprzez mechaniczne dysocjację⁴.
6. Hoduj jelitowe organoidy człowieka w Medium do ekspansji osadzone w BME, przesadzając co 7-10 dni⁵.
   UWAGA: W celu ekspansji lub odzyskiwania organoidów mysich po pojedynczej dysocjacji komórkowej, hoduję w medium ENR uzupełnionym o medium warunkujące Wnt (uzupełnione o 10 mM nikotynamidu i 10 µM Y-27632 dihydrochlorku) przez pierwsze 2-3 dni, aby promować wzrost i żywotność organoidów.
7. Aby wywołać różnicowanie jelitowych organoidów człowieka, sekwencyjnie hoduję organoidy w Medium do paternizacji przez 14 dni, a następnie w Medium do dojrzewania przez 7-10 dni⁶.
   UWAGA: Szczegółowe protokoły dotyczące tworzenia i hodowli organoidów, patrz Sato et al.4 dla jelitowych organoidów mysich, Sato et al.⁵ i He et al⁶ dla jelitowych organoidów człowieka. 

2. Tworzenie transgennych organoidów jelitowych

1. Przesadzej organoidy, aby zapewnić aktywnie proliferujące kultury w momencie elektroporacji: trzy dni przed elektroporacją w przypadku organoidów mysich i pięć do siedmiu dni w przypadku organoidów człowieka. Na każdą reakcję elektroporacyjną używaj organoidów z 4-8 dołków płytki 24-dołkowej (około 200-400 μL BME zawierającego organoidy, dając około 500-1000 organoidów). Dysocjuj organoidy na pojedyncze komórki za pomocą rekombinowanego reagentu dysocjującego podobnego do trypsyny przez 5-10 min w 37 °C. 
2. Uzyskaj linie reporterów jądrowych organoidów poprzez współelektroporację konstruktu ekspresyjnego opartego na transpozonach (p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR lub p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR; po 5 μg każdy) razem z wektorem transpozycyjnym (p2T-CAG-mT2TP; 5 μg) do dysocjowanych komórek przy użyciu systemu elektroporacyjnego zgodnie z ustalonymi protokołami²⁴. 
   UWAGA: Ilości DNA plazmidowego określone w kroku 2.2 (5 μg na konstrukcję) są zoptymalizowane dla około 500-1000 organoidów na reakcję elektroporacji. Podczas elektroporacji zweryfikuj, czy impedancja zmierena przez elektroporator mieści się w zakresie 25-55 Ω. Impedancja poniżej 25 Ω wskazuje na nadmierną gęstość komórek lub problemy z przewodnością buforu; impedancja powyżej 55 Ω wskazuje na niedostateczną liczbę komórek lub złą żywotność komórek. Dostosuj stężenie komórek lub wymień bufor elektroporacji, jeśli impedancja wypada poza ten zakres.
3. Po elektroporacjach hoduj komórki w warunkowym medium Wnt uzupełnionym o 10 μM Y-27632 dihydrochlorku przez 3 dni, aby wspomóc odzyskanie komórek i reformację organoidów. 
4. Rozpocznij selekcję antybiotyczną dla konstrukcji nadekspresji (puromycyna (2 μg/mL) dla linii H2B-iRFP lub blastycydyna (10 μg/mL) dla linii H2B-mCherry) tydzień po elektroporacjach, aby zapewnić wystarczające odzyskanie przed naciskiem selekcyjnym. 
5. Kontynuuj selekcję przez dwa tygodnie. 
6. Wybierz fluorescencyjne klony organoidów pod stereomikroskopem wyposażonym w epifluorescencyjne światło za pomocą odpowiednich zestawów filtrów. 
7. Dysocjuj wybrane klony na pojedyncze komórki za pomocą rekombinowanego reagentu dysocjującego podobnego do trypsyny i rozwijaj w warunkowym medium Wnt przez dwa tygodnie przed przejściem do medium ENR.
8. Zwaliduj linie reporterów, potwierdzając jednorodne lokalizowanie nuklearne fluorescencyjnego sygnału i stabilną ekspresję przez przebieg przekazów. 
9. Weryfikuj, czy introdukcja reporter

Wyniki

Zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 4, w ciągu 48 h od zasiewu tworzą się mozaiki organoidów zawierające populacje komórek oznakowane H2B-mCherry i H2B-iRFP. Sukces mozaiki charakteryzuje się albo rozproszeniem typu sól-i-pieprz albo zdefiniowanymi granicami między dwiema populacjami, w zależności od stopnia dysocjacji. Rozproszenie typu sól-i-pieprz odnosi się do losowego, jednokomórkowego wymieszania dwóch populacji, w którym komórki każdej populacji są rozrzucone na poziomie pojedynczych komórek, bez dużych klonalnych domen. Z kolei zdefiniowane granice prowadzą do spójnych plam każdej populacji komórek w obrębie tego samego organoidu. Stopień rozproszenia komórek jest kontrolowany przez czas trwania etapu dysocjacji i siłę pipetowania: dokładna dysocjacja jednokomórkowa prowadzi do mozaik typu sól-i-pieprz, podczas gdy delikatne fragmentowanie zachowuje małe klastery klonalne (Rysunek 3A).

Mozaikowe znaczenie umożliwia analizę pojedynczych komórek procesów, które nie mogą być rozdzielonych w tkankach jednorodnie oznakowane. Gdy komórka wyrażająca dane znaczniki (np. fluorescencyjny znacznik Myozyny-II) jest otoczona przez nieoznakowane sąsiedztwo, jej dynamika cytoszkieletu podczas migracji, podziału lub ekstremacji może być jednoznacznie przypisana do tej komórki (Rysunek 3B). Znaczniki H2B w jądrach ułatwiają identyfikację pouczających konstelacji komórek w mozaice, a pomiary na komórkę, takie jak czas życia, szybkość podziału i dynamika intensywności znacznika, mogą być wyodrębnione z danych śledzenia (Rysunek 3C). Gdy dwa genotypy są mieszane, te metryki na komórkę mogą być porównywane między populacjami, aby ocenić różnice w konkurencyjności.

W ludzkich organoidach jelitowych zawierających reportery losu MUC2-mNeonGreen i DEFA5-dsRed, zobowiązanie losu komórek wydzielniczych jest widoczne jako stopniowe zwiększenie fluorescencji reportera przez kilka dni. Organoidy hodowane w Maturującym Medium zostały przeniesione do dna szklanych płytek w dniu 7 i zobrazowane za pomocą konfokalnej mikroskopii komórek żywych (Rysunek 4A). Obrazy przekroju czasowego ujawniają dwie różne dynamiki reporterów: komórki kielichowe aktywują i utrzymują wysokie poziomy ekspresji MUC2-mNeonGreen przez cały okres zobrazowania, podczas gdy komórki Panetha wykazują początkową aktywację MUC2-mNeonGreen, po której następuje postępujące zmniejszenie sygnału i kolejna aktywację DEFA5-dsRed⁶ (Rysunek 4A). Ilościowe zliczanie pojedynczych komórek potwierdza tę sekwencyjną przemianę na poziomie pojedynczych komórek (Rysunek 4B), sugerując, że przejście komórek Panetha przebiega przez przejściowy stan ekspresji MUC2, a nie bezpośrednio z nieoznakowanej komórki przodującej. Uśrednione krzywe intensywności dla wielu śledzonych komórek potwierdzają, że ten wzorzec jest spójny na poziomie populacji, z komórkami przodującymi Panetha wykazującymi charakterystyczną odwrotną zależność między sygnałami MUC2-mNeonGreen i DEFA5-dsRed (Rysunek 4C). Razem, te dane pokazują, że dwukolorowy system reporterów rozdziela odrębne trajektorie losu wydzielniczych komórek na poziomie jednej komórki.

Rysunek 1: Przepływ pracy, który integruje konfokalne zobrazowanie komórek żywych i śledzenie jednej komórki z dwiema uzupełniającymi strategiami reporterów w ludzkich i myszych organoidach jelitowych. (A) Schematyczne przedstawienie przepływu pracy dotyczącego generowania organoidów mozaikowych. Mysze organoidy jelitowe wyrażające H2B-mCherry (magenta) lub H2B-iRFP (zielone) są dysoczyowane na pojedyncze komórki, mieszane w określonych proporcjach i zasadowane na płytce pokrytej BME na 24-godzinną agregowanie przed ponownym osadzeniem w BME. (B) Schematyczne przedstawienie różnicowania ludzkich organoidów jelitowych. Ludzie organoidy wyrażające MUC2-mNeonGreen (komórki kielichowe, zielone) i DEFA5-dsRed (komórki Panetha, magenta) endogenne reportery knock-in są różnicowane za pomocą dwuetapowowego protokołu. Organoidy są najpierw hodowane w Maturującym Medium przez 14 dni, a następnie w Medium Różnicującym przez 7-10 dni. Podczas różnicowania, organoidy przechodzą z cystycznej, sferycznej morfologii do rozbudowanej struktury, która zawiera główne typy komórek jelitowych, w tym MUC2-mNeonGreen dodatnie komórki kielichowe i DEFA5-dsRed dodatnie komórki Panetha. (C) 3D przekrojowym obrazie konfokalnym myszy mozaikowego organoidu jelitowego wyrażającego jądrowe reportery. (D) Śledzenie pojedynczych komórek i rekonstrukcja linii rodowych za pomocą półautomatycznego narzędzia do śledzenia komórek organoidów. Wykryte jądra są połączone w punktach czasowych, aby zrekonstruować trajektorie komórek i drzewa lini

Dyskusja

Ten protokół zapewnia krok po kroku przepływ pracy dla konfokalnego obrazowania na żywo i śledzenia pojedynczych komórek w ludzkich i mysich organoidach jelitowych, zbudowany wokół dwóch uzupełniających się systemów eksperymentalnych: mozaikowych organoidów, które rozdzielają zachowanie pojedynczych komórek w gęstym nabłonku oraz organoidów reporterów losu wyrażających MUC2-mNeonGreen i DEFA5-dsRed do monitorowania przejść typu komórek wydzielniczych w czasie rzeczywistym.

W porównaniu z metodami o ustalonym czasie, takimi jak immunofluorescencja czy sekwencjonowanie RNA jednokomórkowego, obrazowanie na żywo rejestruje dynamikę przejść, a nie chwilowe ujęcia. W porównaniu z śledzeniem linii opartym na Cre, zapewnia ono rozdzielczość czasową do identyfikacji indywidualnych decyzji losowych. Podejście mozaikowe dodaje wewnętrznie kontrolowane porównania w tym samym kontekście tkankowym, unikając zakłócającej zmienności między organoidami.

Kilka kroków w protokole jest kluczowych dla sukcesu. W przypadku mozaiki o rozkładzie typu sól i pieprz dysocjacja organoidów do pojedynczych komórek musi być dokładna, ale delikatna: niekompletna dysocjacja powoduje duże klonalne plamy, podczas gdy nadmierna dysocjacja zmniejsza żywotność (Sekcja 4.3). 24-godzinny krok agregacji na płaskiej powierzchni przed ponownym zatopieniem w BME jest niezbędny do prawidłowego mieszania dwóch populacji; pominięcie go prowadzi do słabo zintegrowanych mozaik (Sekcja 4.6–4.8). Zarządzanie fototoksycznością podczas obrazowania wymaga starannej kalibracji, zaczynając od konserwatywnych ustawień lasera i zwiększając ich intensywność tylko jeśli oprogramowanie do śledzenia generuje zbyt wiele fałszywych negatywów (Sekcja 6.8).

Główne ograniczenia dotyczą zarówno wbudowanych ograniczeń systemów organoidowych, jak i obrazowania na żywo. Organoidy nie mają składników stromalnych, wydzielniczych i immunologicznych, które mogą wpływać na zachowanie komórek in vivo. W przypadku mikroskopii konfokalnej głębokość obrazowania jest ograniczona do około 100 μm od szkła pokrywowego, powyżej której rozpraszanie światła pogarsza jakość sygnału i dokładność śledzenia. Mikroskopia wielofotonowa i przestrzenna może znacznie zwiększyć ten zakres głębokości, jednak za wyceny dodatkowego sprzętu i adaptacji protokołu. Półautomatyczne podejście do śledzenia, choć znacznie wydajniejsze niż ręczne oznaczanie, nadal wymaga znacznego czasu korekcji, szczególnie w gęstych tkankach (Sekcja 7.4).

Obie strategie są łatwo rozszerzalne. Poprzez zmienianie reportera współwyrażanego z markerem jądra, można badać różne aspekty zachowania jednokomórkowego, od miozyny-II kortykalnej dla dynamiki mechanicznej po E-kaderyna stykowa dla remodelacji adhezyjnej, biosensorów wapnia takich jak tq-Ca-FLITS i ColBD-Twitch, lub biosensorów metabolicznych takich jak SoNar dla komórkowego stanu redoks NAD+/NADH, umożliwiając jednoczesne odczytywanie tożsamości komórki, linii i stanu fizjologicznego w obrębie tego samego organoidu^9,25,26,27. Dostosowanie stosunku mieszania dostosowuje analizę: rzadko oznaczone komórki umożliwiają przypisanie membranowych sygnałów do pojedynczych komórek, podczas gdy rzadko nieoznakowane komórki ujawniają reakcje sąsiedztwa. Strategia reporterów losu jest rozszerzalna na dowolne endogenne lokusy dostosowanych do znaczników CRISPR-HOT lub HDR. Połączenie obu podejść w obrębie tego samego organoidu pozwoliłoby na jednoczesne śledzenie zobowiązań linii i dynamiki jednokomórkowej.

Szerzej rzecz biorąc, potok obrazowania i analizy może być stosowany do organoidów pochodzących z innych tkanek nabłonkowych, w tym modeli żołądkowych, jelitowych, wątrobowych i trzustkowych. Pochodzące z komórek pluripotentnych indukowanych (iPSC) organoidy są obiecującym rozszerzeniem, ponieważ etykieta jądra oparta na H2B i generowanie mozaiki przez mieszanie komórek są bezpośrednio przenoszone, a potok może umożliwić pacjenckie badania losu komórek i dynamiki konkurencyjnej. Syntetyczne modele zarodka, takie jak gastruloidy i pochodzące z komórek macierzystych embrioidy, są również nadające się do śledzenia jednokomórkowego, choć ich bardziej złożona geometria i wyższa gęstość jąder mogą wymagać ponownego trenowania modelu sieci neuronowej narzędzia do półautomatycznego śledzenia komórek organoidów i dostosowania parametrów obrazowania. Organoidy mózgowe stanowią dodatkowe wyzwania ze względu na ich dużą wielkość i gęstość optyczną, które ogranicza głębokość obrazowania konfokalnego. Co więcej, organoidy mózgowe wymagają tygodni do miesięcy na różnicowanie przed wykonaniem znaczących eksperymentów obrazowania, co znacznie zwiększa czas eksperymentu w porównaniu z organoidami jelitowymi. Niektóre protokoły organoidów mózgowych polegają na hodowli w zawiesinie zamiast na osadzaniu w BME, co jest niekompatybilne z opisanym tu podejściem do przygotowania próbki i wymagałoby adaptacji do formatów osadzanych w matrycy lub przymocowanych do powierzchni przed obrazowaniem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A83-01	Tocris	2939
Accutase Cell Detachment Solution	Innovative Cell Technologies	AT104-500
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (Advanced DMEM/F12)	Invitrogen	12634-010
B27 supplement	Thermo Fisher	17504044
Blasticidin	InvivoGen	ant-bl-05
Cell strainer (40um)	Greiner Bio-one	542140
CHIR99021	Stemgent	04-0004-base
Confocal microscope	Leica	SP8	z kontrolą klimatu dla temperatury i CO2
Cultrex Basement Membrane Extract (BME)	R&D Systems, Bio-Techne	3533-001-02
Fiji	open source		open source https://imagej.net/software/fiji/
Glass bottom plates	CellVis	P24-1.5H-N
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
NEPA electroporation system	NEPAGENE	NEPA21
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
NucSpot Live			far-red live-cell nuclear dye
Noggin conditioned medium (U-Protein Express)	IPA Therapeutics	N002
OrganoidTracker	open source		open source https://organoidtracker.org/
p2T-CAG-mT2TP	homemade		protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753
p2T-H2B-iRFP-IRES-PuroR	homemade		protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753
p2T-H2B-mCherry-IRES-BlastR	homemade		protocol to generate the plasmid DOI: 10.1126/science.adr8753
Penicillin/Streptomycin	Gibco	11548876
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05
Prostaglandin E2	Tocris	2296
puromycin	InvivoGen	ant-pr
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant Human IL-22	Peprotech	200-22
Recombinant human R-spondin 1	Thermo Fisher	120-38-5UG
Recombinant murine EGF	Thermo Fisher	315-09-500UG
Recombinant murine Noggin	Thermo Fisher	250-38-100UG
R-spondin conditioned medium (U-Protein Express)	IPA Therapeutics	R001
SiR-DNA			far-red live-cell DNA dye
SB202190 (p38 inhibitor)	Sigma-Aldrich	S7076
Suspension plate for organoid culture	Greiner	665102
Trypan blue	Gibco	15250061
TrypLE	Gibco	12605-010
Wnt surrogate	U-Protein Express	custom order
Wnt3A conditioned medium	homemade		The production of Wnt3A conditioned medium can be found here:  https://doi.org/10.1002/cpim.106
Y-27632 dihydrochloride	Abmole Bioscience	M1817