Artykuł metodologiczny

Model myszy endometriozy z wykorzystaniem Ex Vivo Cy5.5 barwnik dopowanej nanocząsteczki krzemionki do wizualizacji zmian

119 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72070

⸱

4 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Women’s Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Engineering, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie pokazuje indukcję endometriozy przy użyciu ex vivo oznakowania za pomocą nanocząstek krzemu zmodyfikowanych barwnikiem Cy5.5, umożliwiając fluorescencyjną wizualizacje zmian endometriotycznych bez manipulacji genetycznej.

Streszczenie

Endometrioza jest częstym zaburzeniem ginekologicznym charakteryzującym się wzrostem tkanki podobnej do endometrium poza jamą macicy, prowadzącym do przewlekłego zapalenia, bólu miednicy i niepłodności. Wiarygodne modele na myszach są niezbędne do badania mechanizmów molekularnych, hormonalnych, immunologicznych i środowiskowych leżących u podstaw rozwoju i postępu choroby. Konwencjonalne metody identyfikacji zmian endometriotycznych często opierają się na genetycznie zmodyfikowanych myszach reporterowych z fluorescencyjnymi znacznikami, które są czasochłonne i kosztowne w wytworzeniu. Przedstawiamy tu prostą, niegenetyczną metodę indukowania i wizualizowania endometriozy u myszy poprzez ex vivo oznaczenie fragmentów tkanki macicy dawcy nanocząstkami krzemu zawierającymi Cy5.5 przed przeszczepieniem. Nanocząstki wykazują korzystne właściwości fizykochemiczne, wysoką stabilność fluorescencji i minimalną cytotoksyczność, umożliwiając efektywne oznaczenie tkanki macicy bez naruszenia procedur eksperymentalnych. Po wdrożeniu do jamy otrzewnej u myszy-odbiorców, zmiany endometriotyczne oznakowane Cy5.5 można łatwo odróżnić od otaczających tkanek żywiciela za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Ten protokół zapewnia powtarzalną i wszechstronną metodę wizualizowania i śledzenia zmian, ułatwiając badania patogenezy endometriozy i przedkliniczną ocenę strategii diagnostycznych i terapeutycznych bez konieczności manipulacji genetycznych.

Wprowadzenie

Endometrioza to częsta choroba ginekologiczna, w której komórki wyściełające endometrium rosną poza macicą. Powstające stamtąd zmiany endometriotyczne prowadzą do przewlekłego stanu zapalnego1, a dotknięte kobiety często doświadczają bólu miednicy i niepłodności2. Dysfunkcja komórek stromy i nabłonka endometrium zwiększa przeżywalność i rozwój zmian endometriotycznych3,4,5,6. To powszechne zaburzenie dotyka około 11% kobiet tylko w USA. Jest to główna przyczyna niepłodności i bólu miednicy7, a jego częstość wzrasta do 50–60% u kobiet z przewlekłym bólem miednicy i niepłodnością8,9,10,11,12,13. Szacunkowe roczne koszty diagnozy i leczenia endometriozy przekraczają 22 miliardy dolarów w Stanach Zjednoczonych14,15. Obecne leczenie obejmuje chirurgiczne usuwanie zmian lub indukcję stanu hipoestrogenowego. Jednak nawroty po operacji są powszechne, a istniejące terapie są często nieskuteczne9,16. Rozpoznanie jest zwykle ustanawiane tylko poprzez chirurgiczną wizualizację i weryfikację histologiczną17,18. Co więcej, endometrioza jest często nierozpoznana lub błędnie zdiagnozowana, a opóźnienie diagnostyczne wynosi 9–11 lat19,20. To opóźnienie narzuca znaczne obciążenie emocjonalne i finansowe zarówno na pacjentów, jak i na system opieki zdrowotnej20,21. Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania nieinwazyjnych metod zarówno diagnozy, jak i leczenia endometriozy.

In vitro modele posunęły naprzód badania nad endometriozą. Jednak nadal mają ograniczoną zdolność do pełnego naśladowania złożoności choroby. Głównym wyzwaniem jest wieloczynnikowy charakter endometriozy, który obejmuje skomplikowane interakcje między hormonami, stanem zapalnym, komórkami układu odpornościowego, nerwami i różnymi typami komórek w dynamicznym trójwymiarowym środowisku. Ponadto systemy in vitro nie uwzględniają naturalnych wahań hormonów steroidowych jajników, co ogranicza możliwość badania wpływu choroby na układ rozrodczy21,22,23. Dlatego model wywołanej endometriozy u całych myszy zapewnia wszechstronną platformę do badania indywidualnych i interaktywnych ról układu odpornościowego24, hormonów25,26 i czynników środowiskowych27,28 w rozwoju endometriozy i jej wpływie na układ rozrodczy29. Ponadto stosowanie transgenicznych modeli mysich, w których określone geny są selektywnie usuwane lub nadmiernie ekspresowane w endometrium, umożliwia badaczom wyjaśnienie ról poszczególnych ścieżek molekularnych w rozwoju i postępie endometriozy. Jednakże dokładne rozróżnienie zmian endometriotycznych od otaczających tkanek żywiciela pozostaje znaczącym wyzwaniem technicznym.

Nanocząstki krzemianu z barwnikiem to wszechstronne i trwałe sondy do śledzenia komórkowego i bioobrazowania. Są one proste w syntezie, wysoce dypersyjne, fotostable, biokompatybilne i skuteczne w oznakowaniu komórek30,31. Podstawa krzemowa stabilizuje hydrofobowe fluorofory wewnątrz macierzy, czyniąc je wydajnymi, o wysokiej wydajności kwantowej (QY) fluorescencyjnymi reporterami molekularnymi. Na przestrzeni lat takie fluorescencyjne nanocząstki krzemianu były szeroko stosowane jako jasne, trwałe ex vivo znaczniki dla komórek i struktur tkankowych przed przeszczepieniem i późniejszym obrazowaniem in vivo32,33,34,35. W tym miejscu opisujemy szczegółową procedurę wywołania endometriozy u myszy z ex vivo oznakowywaniem za pomocą nanocząstek krzemianu z barwnikiem Cy5.5, jak to zostało użyte w poprzedniej publikacji35, umożliwiając ich zastosowanie jako stabilne markery obrazowania do śledzenia zmian.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Missouri (Numer protokołu 65323) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i obowiązującymi przepisami krajowymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi.

1. Przygotowanie koniugatu Cy5.5-APTES

  1. Rozpuść 1 mg estru Cy5.5-NHS w 100 µL dimetylosulfonu (DMSO) w przezroczystym 11,1 mL szklanym kołkiem. Natychmiast przykryj kołek folią aluminiową, aby chronić roztwór przed światłem.
    UWAGA: Koniugat Cy 5.5-APTES można przechowywać w temperaturze pokojowej w 4 °C przez jeden tydzień.
  2. Dodaj 1 µL (3-aminopropyl)trietoksysylan (APTES) do roztworu barwnika.
  3. Dodaj 0,5 µL trietyloaminy (TEA) i natychmiast wymieszaj, aby ułatwić reakcję.
  4. Mieszaj mieszaninę reakcyjną z prędkością 300 rpm w 30 °C w ciemności przez 24 godziny, aby umożliwić kowalencyjne wiązanie między Cy5.5 a APTES.
  5. Zamknij kołek jego pokrywką i kontynuuj ochronę przed światłem, owijając go folią aluminiową.

2. Synteza nanocząstek z nanocząstkami krzemu dopekowanymi barwnikiem Cy5.5

  1. Dodaj 1 µL stężonego roztworu amoniaku (28%) do nowego przezroczystego szklanego kołka.
  2. Dodaj 8,5 mL czystego etanolu (klasa do biologii molekularnej).
  3. Dodaj 350 µL tetraetylokrzemianu (TEOS).
  4. Dodaj 15 µL przygotowanego roztworu Cy5.5-APTES do mieszaniny reakcyjnej syntezy krzemu.
  5. Mieszaj mieszaninę reakcyjną z prędkością 500 rpm w temperaturze pokojowej w ciemności przez 24 godziny, aby umożliwić kowalencyjną inkorporację barwnika do macierzy krzemianowej.

3. Oczyszczanie i dyspersja

  1. Przenieś całą mieszaninę reakcyjną do 15 mL zentrofugi do zentrofugowania.
  2. Przygotuj zentrofugę z równą objętością wody destylowanej do zentrofugowania.
  3. Centrofuguuj obie zentrofugi przez 10 min w 4 °C z prędkością 12 074 × g. Potwierdź, że na dnie zentrofugi po zentrofugacji utworzył się widoczny pellet.
  4. Przemyj pellet 10 mL 95% etanolu, zentrofugujac przez 10 min w 4 °C z prędkością 12 074 × g. Powtórz to mycie 3x, resuspendując pellet przez sonikowanie przez około 3–5 min między myciami lub aż do pełnego uwidocznienia.
  5. Przemyj pellet 5 mL wody destylowanej i zentrofuguj przez 10 min w 4 °C z prędkością 12 074 × g. Powtórz to mycie 2x, resuspendując pellet przez sonikowanie przez około 3–5 min między myciami lub aż do pełnego uwidocznienia.
  6. Resuspenduj pellet w 5 mL wody destylowanej przez sonikowanie aż do pełnego uwidocznienia (nie obserwowano żadnych stałych fragmentów potwierdzających dyspersję). Potwierdź, że zawiesina cząstek wygląda na widocznie niebiesko po całkowitym uwidocznieniu.
  7. Przenieś zawiesinę do szklanego kołka, owiń kołek folią aluminiową, aby chronić go przed światłem i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  8. Oceń dyspersję cząstek i fluorescencje za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS). Użyj długości fali wzbudzenia 680 nm i długości fali emisji 710 nm dla Cy5.5.

4. Indukcja endometriozy za pomocą ex vivo znaczenia za pomocą nanocząstek z nanocząstkami krzemu dopekowanymi barwnikiem Cy5.5

  1. Podaj 8-tygodniowej żeńskiej myszy donorowej (szczep: C57Bl6J X129Sv) podskórnie E2 (100 µL 1 µg/mL w oleju sezamowym) raz dziennie rano przez trzy kolejne dni w celu synchronizacji hormonalnej.
  2. Uśmierć mysz donorową poprzez wyważenie szyjne 6 godzin po ostatnim wstrzyknięciu E2 i usuń macicę.
  3. Ciężko pokrój tkankę macicy na fragmenty o wymiarach około 1 mm3 na potrzeby skalpela w naczyniu Petriego30,36.
  4. Inkubuj fragmenty tkanki macicy (45 mg) z 20% (v/v) nanocząstkami z nanocząstkami krzemu dopekowanymi barwnikiem Cy5.5 w 24-dołkowej płytce zawierającej kompletne medium RPMI-1640 (10% FBS) przez 3 godziny w 37 °C w 5% CO2.
  5. Znieczulij myszę odbiorczą (szczep: C57Bl6J X129Sv) 3% izofluranem w tlenie i wykonaj 0,5 cm środkową nacięcie brzuszne.
    UWAGA: Umieść mysz w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem, aż osiągniesz znieczulenie. O

Wyniki

Nanocząsteczki krzemionki domieszkowane barwnikiem mogą być wykorzystywane jako sondy obrazujące w aplikacjach znakowania komórek. Nanocząsteczki krzemionki domieszkowane barwnikiem Cy5.5 (Cy5.5-SiNPs) zsyntetyzowano w dwóch etapach, wykorzystując proces sol-gel krzemionki i funkcjonalizując je fluorescencyjnym barwnikiem cyjaninowym Cy5.5 za pomocą chemii silanowej (Rysunek 1). Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) wykazała jednorodne sferyczne nanocząsteczki o średnicach 156,67 ± 15,23 nm (Rysunek 1A). Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) wykazało, że zsyntetyzowane nanocząsteczki (SiNPs i Cy5.5-SiNPs) były koloidalnie stabilne, z średnicami hydrodynamicznymi (Hd) odpowiednio 130,67 ± 3,20 nm (PDI = 0,152 ± 0,09) oraz 185,9 ± 5,4 nm (PDI = 0,14 ± 0,09) (Rysunek 1B). Potencjały zeta dla niezmodyfikowanych SiNPs i Cy5.5-SiNPs wynosiły odpowiednio −32,39 ± 3,5 mV oraz −50,53 ± 2,47 mV (Rysunek 1C). Spektroskopia fotoluminescencyjna (długość fali wzbudzenia = 680 nm; długość fali emisji = 710 nm) potwierdziła pomyślne włączenie Cy5.5 do nanocząsteczek krzemionki, a Cy5.5-SiNPs wykazały charakterystyczną fluorescencję (Rysunek 1D). Pomyślne sprzęganie barwnika zostało dodatkowo potwierdzone widmem fotoluminescencyjnym. Ponadto wydajność kwantowa (QY) Cy5.5-SiNPs (φ = 0,31) była porównywalna do wydajności wolnego barwnika Cy5.5 (φ = 0,23)36.

Aby ocenić biokompatybilność nanocząstek, komórki nabłonka endometrium 12Z inkubowano przez noc z Cy5.5-SiNPs w pożywce DMEM w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂. Żywotność komórek oceniono za pomocą testu MTT po zastosowaniu stężeń nanocząstek wynoszących 0, 0,5, 1, 2,5, 5 i 10 µg/mL (Rycyna 1E). Nie zaobserwowano cytotoksyczności przy stężeniach do 10 µg/mL. Komórki inkubowane z 5 µg/mL Cy5.5-SiNPs wykazały efektywne pobieranie nanocząstek, a mikroskopia fluorescencyjna wykazała lokalizację cząstek w regionie okołojądrowym (Rycina 1F). W przeciwieństwie do nich, w nieleczonych komórkach kontrolnych nie wykryto fluorescencji Cy5.5. Przygotowane Cy5.5-SiNPs wykazały również stabilność w środowisku wodnym, z średnicami hydrodynamicznymi w zakresie 170–190 nm w wodzie dejonizowanej oraz stabilną intensywnością fluorescencji przez siedem dni, co określono odpowiednio za pomocą DLS i obrazowania fluorescencyjnego (Rycina 1G, H).

Aby ocenić przydatność domieszkowanych barwnikiem Cy5.5 nanocząsteczek krzemionkowych do znakowania tkanek ex vivo, przed indukcją endometriozy zweryfikowano ich właściwości fluorescencyjne. Obrazowanie IVIS wykazało silną emisję fluorescencji z zawiesin nanocząsteczek, podczas gdy w kontroli negatywnej zawierającej samą wodę nie zaobserwowano wykrywalnego sygnału fluorescencyjnego, co potwierdziło swoistość i czułość detekcji fluorescencji Cy5.5 (Rysunek 2).

Następnie zoptymalizowano stężenie i czas inkubacji dla znakowania fragmentów tkanki macicy ex vivo. Fluorescencję wykryto w fragmentach tkanki macicy inkubowanych z 20% (v/v) nanocząsteczkami krzemionki domieszkowanymi barwnikiem Cy5.5 przez 3 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO235. Obrazowanie IVIS potwierdziło silne i spójne sygnały fluorescencyjne z oznakowanych fragmentów tkanki. Wyniki te dowodzą, że nanocząsteczki krzemionki domieszkowane barwnikiem Cy5.5 efektywnie znakują fragmenty tkanki macicy bez konieczności modyfikacji genetycznej (Rycina 3).

Następnie oceniono zdolność fragmentów tkanki macicy znakowanych nanocząsteczkami krzemionki domieszkowanymi barwnikiem Cy5.5 do indukowania endometriozy oraz ułatwiania identyfikacji zmian35. Znakowane fragmenty tkanki wstrzyknięto do jamy otrzewnej myszy biorców, a następnie przez miesiąc monitorowano postęp choroby. W punkcie końcowym eksperymentu w jamie otrzewnej łatwo zidentyfikowano zmiany endometriozowe. Zmiany wykazujące obecność Cy5.5 zostały wyraźnie odróżnione od otaczających tkanek gospodarza za pomocą obrazowania IVIS oraz mikroskopii fluorescencyjnej, co umożliwiło szybką i jednoznaczną identyfikację zmian. Fluorescencję Cy5.5 w obrębie zmian potwierdzono dodatkowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wyniki te wykazują, że znakowanie ex vivo z wykorzystaniem nanocząsteczek krzemionkowych domieszkowanych barwnikiem Cy5.5 wspomaga skuteczną indukcję endometriozy i umożliwia niezawodną wizualizację ognisk endometriozy in vivo (Rycina 4).

Charakterystyka nanocząsteczek krzemionkowych (SiNPs); schematy: wielkość, potencjał zeta, fluorescencja, testy komórkowe.
Rysunek 1Charakterystyka fizyczna nanocząsteczek krzemionkowych domieszkowanych barwnikiem Cy5.5 (Cy5.5-SiNPs). (A) Reprezentatywny obraz z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) nanocząsteczek krzemionki znakowanych Cy5.5 (Cy5.5-SiNPs). Średnica cząsteczek = 156,67 ± 15,23 nm. Pasek skali = 10 nm. (B) Pomiary dynamicznego rozpraszania światła (DLS) średnic hydrodynamicznych SiNP (130,67 ± 3,20 nm, PDI = 0,152 ± 0,09) oraz Cy5.5-SiNP (185,9 ± 5,4 nm, PDI = 0,14 ± 0,009). (C) Pomiary potencjału zeta dla SiNPs (−32,39 ± 3,5 mV) oraz Cy5.5-SiNPs (−50,53 ± 2,47 mV), wykazujące spadek potencjału zeta po koniugacji z Cy5.5. (D) Profil fluorescencji Cy5.5-SiNPs (długość fali wzbudzenia = 680 nm; długość fali emisji = 710 nm). Wstawka: obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne Cy5.5-SiNPs zdyspergowanych w wodzie. (E) test żywotności komórek MTT dla komórek 12Z traktowanych SiNPs-Cy5.5 w stężeniach 0, 0,5, 1, 2,5, 5 i 10 µg/mL. (F) Pobieranie komórkowe Cy5.5-SiNPs przez komórki 12Z. Komórki poddano działaniu PBS (kontrola) lub Cy5.5-SiNPs. Kolor niebieski = DAPI; kolor czerwony = Cy5.5-SiNPs. Pasek skali = 200 µm. (G) Stabilność rozmiaru nanocząsteczek krzemionkowych Cy5.5-SiNPs przechowywanych w wodzie przez 7 dni, wykazująca brak istotnych zmian w średnicy hydrodynamicznej. (H) Stabilność fluorescencji nanocząsteczek krzemowych Cy5.5-SiNPs przechowywanych w wodzie przez 7 dni, wykazująca brak istotnych zmian w intensywności fluorescencji. Wstawka: Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne uzyskane w dniach 1., 3. i 6. NS = brak istotności statystycznej. Wartości przedstawiono jako średnia ± SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Nanocząstki krzemionkowe domieszkowane barwnikiem w roztworze oraz odpowiadający im wykres widma fluorescencji IVIS.
Rysunek 2Potwierdzenie obecności nanocząsteczek krzemionki domieszkowanych barwnikiem Cy5.5. (A) Reprezentatywny obraz nanocząstek krzemionkowych domieszkowanych barwnikiem Cy5.5. (B) Detekcja fluorescencji Cy5.5 z nanocząsteczek krzemionkowych domieszkowanych barwnikiem Cy5.5 przy użyciu obrazowania IVIS. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Widmo IVIS dla grupy nietraktowanej w porównaniu z grupą CY5.5; porównanie obrazowania fluorescencyjnego w szalkach hodowlanych.
Rycina 3: Ex vivo znakowanie fragmentów tkanki macicy nanocząsteczkami krzemionki domieszkowanymi barwnikiem Cy5.5. Panel lewy przedstawia niepoddane działaniu preparatu fragmenty tkanki macicy grupy kontrolnej, a panel prawy przedstawia fragmenty tkanki macicy znakowane nanocząsteczkami krzemionkowymi domieszkowanymi barwnikiem Cy5.5. Fluorescencję Cy5.5 wykryto przy użyciu obrazowania IVIS. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

obrazowanie fluorescencyjne Cy5.5, widmo IVIS, mikroskop, ognisko endometriozy, histologia H&E.
Rysunek 4Wykrywanie zmian endometriozy znakowanych nanocząstkami krzemionkowymi domieszkowanymi barwnikiem Cy5.5. (A) Obraz jamny otrzewnej wykonany w systemie IVIS. (BMikroskopia fluorescencyjna zmian endometriozowych znakowanych Cy5.5 umożliwia ich wyraźną identyfikację w jamnie otrzewnej.C) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej zmian endometriozy. Żółta fluorescencja wskazuje sygnał Cy5.5, a jądra komórkowe wybarwiono DAPI. (D) Reprezentatywny obraz zmiany endometriozowej. Strzałka wskazuje nanocząsteczki krzemionkowe domieszkowane barwnikiem Cy5.5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Niniejsze badanie przedstawia podejście oparte na nanocząstkach krzemianu zbarwionych farbą Cy5.5 jako praktyczną i efektywną metodę wizualizacji zmian endometriozy u mysich modeli35. Ta strategia oferuje kilka zalet, w tym prostotę, elastyczność i niegenetyczność, eliminując konieczność generowania zwierząt reporterów transgenicznych. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami wizualizacji, takimi jak fluorescencyjne modele reporterowe myszy, ta metoda zmniejsza złożoność techniczną, zachowując jednocześnie wysoką efektywność oznaczania, dzięki czemu zwiększa jej dostępność w badaniach nad endometriozą. Ponadto, nanocząstki krzemianu zapewniają stabilną platformę do włączania fluorescencyjnych barwników i ich efektywnego zatrzymywania w tkankach, co wspomaga reproduktywalne identyfikowanie zmian.

Rozróżnienie zmian endometriozy od otaczającej tkanki gospodarza jest istotne dla badania inicjacji i progresji choroby u mysich modeli. Myszy reporterowe Rosa26mTmG eksprelują błonowo ukierunkowany tandemowy dimer fluorescencyjnego białka Tomato (mT), który jest konwertowany na błonowo ukierunkowany zielony fluorescencyjny białko (mG) po wycięciu za pośrednictwem Cre w określonych tkankach docelowych37. Chociaż dostępnych jest wiele transgennych modeli mysich do badania funkcji genów w endometriozie, generowanie zwierząt reporterowych jest pracochłonne i czasochłonne. Natomiast, ex vivo oznaczanie za pomocą nanocząstek krzemianu zbarwionych farbą Cy5.5 zapewnia szybkie, elastyczne i niegenetyczne alternatywy dla wizualizacji zmian, pozostając kompatybilnymi z szerokim zakresem istniejących modeli mysich.

Sukces wdrożenia tego protokołu zależy od starannego kontrolowania kilku kluczowych parametrów eksperymentalnych. Podczas syntezy nanocząstek, stężenie katalizatora, skład rozpuszczalnika, szybkość dodawania TEOS, warunki mieszania i efektywność płukania mają bezpośredni wpływ na wielkość cząstek, intensywność fluorescencji i powtarzalność oznaczania. Metoda Stöbera zapewnia prosty, skalowalny i powtarzalny sposób syntezy fluorescencyjnych nanocząstek krzemianu z precyzyjną kontrolą wielkości cząstek i stabilnym włączaniem barwnika38,39,40,41. W porównaniu z metodami odwrotnej mikroemulsji, podejście Stöber minimalizuje wyzwania czyszczenia związane z surfaktantami, zachowując fluorescencje Cy5.5 w łagodnych warunkach reakcji39,40,41,42. Zwiększenie stężenia katalizatora ogólnie zwiększa wielkość cząstek40, podczas gdy szybciej dodawany TEOS sprzyja nukleacji, prowadząc do mniejszych cząstek41. Dokładne płukanie jest niezbędne do usunięcia niezreagowanych reagentów i poprawy stabilności nanocząstek podczas przechowywania.

Kilka dodatkowych czynników jest istotnych dla osiągnięcia powtarzalnego ex vivo oznaczania tkanek i utworzenia zmian. Jednolita wielkość fragmentów tkanki macicy, jednorodna dyspersja nanocząstek i spójne warunki inkubacji poprawiają efektywność oznaczania i zmniejszają zmienność eksperymentalną. Równoległe przetwarzanie nieoznakowanych tkanek kontrolnych jest również istotne dla odróżnienia prawdziwej fluorescencji Cy5.5 od autofluorescencji tkanki i niespecyficznych sygnałów tła. Podczas indukcji zmian, spójne hormonowe przygotowanie myszy donorów, delikatne wszczepienie oznakowanych fragmentów tkanki i odpowiednia opieka pooperacyjna minimalizują traumę tkankową i niespecyficzną reakcję zapalną, co poprawia powtarzalność formowania zmian.

Mimo tych zalet, należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Trwałość i stabilność sygnału fluorescencyjnego in vivo mogą się różnić po implantacji z powodu remodelacji tkanki, proliferacji komórkowej i usuwania immunologicznego. Jako egzogenny fluorescencyjny marker, sygnał Cy5.5 ma maleć stopniowo w miarę podziału oznaczonych komórek, co może ograniczać wykonalność długotrwałych badań podłużnych. Dodatkowo, zmienność w przygotowywaniu tkanek i wchłanianiu nanocząstek może wpływać na efektywność oznaczania między eksperymentami, podkreślając znaczenie standaryzowanych procedur eksperymentalnych.

Mimo że niniejsze badanie koncentruje się na wykrywaniu zmian ex vivo, Cy5.5 jest czerwonym/blisko-podczerwieńnym (NIR) fluorescencyjnym barwnikiem, który minimalizuje autofluorescencję tkanek i umożliwia głębsze przenikanie fotonów. Te właściwości optyczne sprawiają, że Cy5.5 jest odpowiedni dla zastosowań in vivo w obrazowaniu. Odpowiednio, strategia oznaczania nanocząstek krzemianu z farbą Cy5.5 o wysokiej kwantowej wydajności zapewnia solidną platformę dla nieinwazyjnego, podłużnego śledzenia zmian za pomocą obrazowania fluorescencyjnego NIR i fotoakustycznego43,44.

Przyszłe badania powinny skupić się na poprawie trwałości fluorescencji i dalszej optymalizacji spójności oznaczania w różnych war

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To dzieło zostało wspierane przez Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD108895 dla T.K. i J.W.J.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)Sigma-Aldrich440140Czystość ≥99%
17β-EstradiolMilliporeSigmaE8875Czystość ≥98%
Ammonium hydroxideFisher ScientificA669S-50028% roztwór wodorotlenku amonu
BD Autoclip Wound Closing SystemBD427631Chirurgiczne zamki do ran
Clear glass threaded vialFisherbrandFS60910A-311,1 mL przezroczysta szklank
Cyanine 5.5 NHS esterSigma-AldrichGEPA15502Barwnik fluorescencyjny w podczerwieni
Ethanol, absoluteFisher ScientificBP2818Klasy molekularno-biologiczne
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000044Dodatek do hodowli komórek
High-speed centrifugeBeckman Coulter Life SciencesAvanti J-EWysokoprędkowa wirówka
In vivo imaging systemPerkinElmerIVIS SpectrumSystem obrazowania fluorescencyjnego
IsofluraneBaxterNDC1001-9-360-60Anestetyk inhalacyjny
Magnetic stir barFisherbrand14-513-648 mm
Magnetic stir plateChelmsfordSP88854200Magnetomikser o zmiennej prędkości
Refrigerated centrifugeEppendorf5427 RWyposażony w wirówkę FA-45-48-11
RPMI-1640 mediumGibco11835-030Środek do hodowli komórek
Sesame oilMilliporeSigmaS3547Nośnik dla preparatu estradiolu
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)Sigma-Aldrich86578Czystość ≥99%
Triethylamine (TEA)Sigma-AldrichT0886Czystość ≥99%
Ultrasonic bathFisherbrandCPX1800HDo dyfuzji nanocząstek przez sonicację

Bibliografia

  1. Marquardt RM, Kim TH, Shin JH, Jeong JW. Progesterone and estrogen signaling in the endometrium: What goes wrong in endometriosis? Int J Mol Sci. 2019;20(15).
  2. Yilmaz BD, Bulun SE. Endometriosis and nuclear receptors. Hum Reprod Update. 2019;25(4):473–485.
  3. Kanzaki H, Wang HS, Kariya M, Mori T. Suppression of natural killer cell activity by sera from patients with endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 1992;167(1):257–261.
  4. Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Vandeputte M, et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril. 1992;58(2):290–295.
  5. Tanaka E, Sendo F, Kawagoe S, Hiroi M. Decreased natural killer cell activity in women with endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 1992;34(1):27–30.
  6. Vigano P, Vercellini P, Di Blasio AM, Colombo A, et al. Deficient antiendometrium lymphocyte-mediated cytotoxicity in patients with endometriosis. Fertil Steril. 1991;56(5):894–899.
  7. Bulun SE. Endometriosis. N Engl J Med. 2009;360(3):268–279.
  8. Eskenazi B, Warner ML. Epidemiology of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997;24(2):235–258.
  9. Johnson NP, Hummelshoj L, World Endometriosis Society Montpellier Consortium. Consensus on current management of endometriosis. Hum Reprod. 2013;28(6):1552–1568.
  10. Kim JJ, Kurita T, Bulun SE. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocr Rev. 2013;34(1):130–162.
  11. Burney RO, Giudice LC. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis. Fertil Steril. 2012;98(3):511–519.
  12. Fadhlaoui A, Bouquet de la Joliniere J, Feki A. Endometriosis and infertility: How and when to treat? Front Surg. 2014;1:24.
  13. D'Hooghe TM, Debrock S, Hill JA, Meuleman C. Endometriosis and subfertility: Is the relationship resolved? Semin Reprod Med. 2003;21(2):243–254.
  14. Simoens S, Hummelshoj L, D'Hooghe T. Endometriosis: Cost estimates and methodological perspective. Hum Reprod Update. 2007;13(4):395–404.
  15. Gao X, Outley J, Botteman M, Spalding J, et al. Economic burden of endometriosis. Fertil Steril. 2006;86(6):1561–1572.
  16. Brown J, Farquhar C. An overview of treatments for endometriosis. JAMA. 2015;313(3):296–297.
  17. Martin DC, Hubert GD, Vander Zwaag R, el-Zeky FA. Laparoscopic appearances of peritoneal endometriosis. Fertil Steril. 1989;51(1):63–67.
  18. Quesada J, Harma K, Reid S, Rao T, et al. Endometriosis: A multimodal imaging review. Eur J Radiol. 2023;158:110610.
  19. Culley L, Law C, Hudson N, Denny E, et al. The social and psychological impact of endometriosis on women's lives: A critical narrative review. Hum Reprod Update. 2013;19(6):625–639.
  20. Nnoaham KE, Hummelshoj L, Webster P, et al. Reprint of: Impact of endometriosis on quality of life and work productivity: A multicenter study across ten countries. Fertil Steril. 2019;112(4 Suppl 1):e137–e152.
  21. Herington JL, Bruner-Tran KL, Lucas JA, Osteen KG. Immune interactions in endometriosis. Expert Rev Clin Immunol. 2011;7(5):611–626.
  22. Malvezzi H, Marengo EB, Podgaec S, Piccinato CA. Endometriosis: Current challenges in modeling a multifactorial disease of unknown etiology. J Transl Med. 2020;18(1):311.
  23. Esfandiari F, Mansouri N, Shahhoseini M, Heidari Khoei H, et al. Endometriosis organoids: Prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 2022;45(1):5–9.
  24. Lin YJ, Lai MD, Lei HY, Wing LY. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 2006;147(3):1278–1286.
  25. Fang Z, Yang S, Lydon JP, DeMayo F, et al. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil Steril. 2004;82(3):673–678.
  26. Fang Z, Yang S, Gurates B, Tamura M, et al. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87(7):3460–3466.
  27. Foster WG, Ruka MP, Gareau P, Foster RA, et al. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: Application to toxicology. Can J Physiol Pharmacol. 1997;75(10–11):1188–1196.
  28. Cummings AM, Metcalf JL, Birnbaum L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: Time-dose dependence and species comparison. Toxicol Appl Pharmacol. 1996;138(1):131–139.
  29. Yoo JY, Kim TH, Shin JH, Marquardt RM, et al. Loss of MIG-6 results in endometrial progesterone resistance via ERBB2. Nat Commun. 2022;13(1):1101.
  30. Ow H, Larson DR, Srivastava M, Baird BA, et al. Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles. Nano Lett. 2005;5(1):113–117.
  31. Chung SJ, Hadrick K, Nafiujjaman M, Apu EH, et al. Targeted biodegradable near-infrared fluorescent nanoparticles for colorectal cancer imaging. ACS Appl Bio Mater. 2024;7(12):7861–7870.
  32. Pittet MJ, Swirski FK, Reynolds F, Josephson L, et al. Labeling of immune cells for in vivo imaging using magnetofluorescent nanoparticles. Nat Protoc. 2006;1(1):73–79.
  33. Nguyen TT, Nguyen HN, Nghiem THL, Do XH, et al. High biocompatible FITC-conjugated silica nanoparticles for cell labeling in both in vitro and in vivo models. Sci Rep. 2024;14(1):6969.
  34. Marquardt RM, Nafiujjaman M, Kim TH, Chung SJ, et al. A mouse model of endometriosis with nanoparticle labeling for in vivo photoacoustic imaging. Reprod Sci. 2022;29(10):2947–2959.
  35. Kim TH, Bae N, Kim T, Hsu AL, et al. Leptin stimulates endometriosis development in mouse models. Biomedicines. 2022;10(9).
  36. Bouteiller C, Clave G, Bernardin A, Chipon B, et al. Novel water-soluble near-infrared cyanine dyes: Synthesis, spectral properties, and use in the preparation of internally quenched fluorescent probes. Bioconjug Chem. 2007;18(4):1303–1317.
  37. Muzumdar MD, Tasic B, Miyamichi K, Li L, et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 2007;45(9):593–605.
  38. Stӧber W, Fink A, Bohn E. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range. J Colloid Interface Sci. 1968;26(1):62–69.
  39. Thorat AV, Ghoshal T, Chen L, Holmes JD, et al. Synthesis and stability of IR-820 and FITC-doped silica nanoparticles. J Colloid Interface Sci. 2017;490:294–302.
  40. Silva AS, Santos JHZ. Silica particle size and polydispersity control from fundamental practical aspects of the Stöber method. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 2024;702:135190.
  41. Saha A, et al. Greening the pathways: A comprehensive review of sustainable synthesis strategies for silica nanoparticles and their diverse applications. RSC Adv. 2024;14(16):11197-11216.
  42. Lian Y, Ding LJ, Zhang W, Zhang XA, et al. Synthesis of highly stable cyanine-dye-doped silica nanoparticles for biological applications. Methods Appl Fluoresc. 2018;6(3):034002.
  43. Kumar PPP, Chung SJ, Hadrick K, Hill ML, et al. Noninvasive detection and thermal ablation therapy of endometriosis using silica-coated gold nanorods. Adv Nanobiomed Res. 2025;5(12):2500101.
  44. Rahman MS, et al. Nanoceria as a non-steroidal anti-inflammatory drug for endometriosis theranostics. J Control Release. 2025;378:1015-1029.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

MedycynaNumer 234Numer 234Warto pustaNumerNanocz steczka krzemionkowa domieszkowana barwnikiem FITC

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.