Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej do wykazania, jak inhibitor peptydylny z fluorescencyjnym znakowaniem celuje w mitochondrialne ClpXP w komórkach ssaków

Podsumowanie

Ten protokół ustanawia ilościowy przepływ pracy z obrazowaniem, który obejmuje zastosowanie mikroskopi konfokalnej do monitorowania selektywnej lokalizacji fluorescencyjnego peptydowego inhibitora ClpP FAM-FAPAL-CMK (Karboksyfluoresceina-FAPAL-chlorometyloketono) do mitochondria w celu uzyskania dostępu do ClpP oraz późniejszych zmian morfologicznych w mitochondriach w całych komórkach spowodowanych inhibicją ClpP.

Streszczenie

Mitochondrialne proteazy zależne od ATP są niezbędne do utrzymania homeostazy białkowej poprzez degradację uszkodzonych lub nieprawidłowo sfałdowanych białek. Wśród nich kompleks proteazy ClpXP znajduje się w macierzy mitochondriach i przyczynia się do kontroli jakości mitochondria w warunkach fizjologicznych i stresu. Niniejsza praca prezentuje ilościową metodę mikroskopii fluorescencyjnej do oceny mitochondrialnego ukierunkowania fluorescencyjnego inhibitora peptydowego FAM-FAPAL-CMK oraz oceny zmian morfologicznych mitochondria związanych z inhibicją ClpXP w komórkach ssaczych. Komórki HeLa były traktowane FAM-FAPAL-CMK i analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w połączeniu z barwieniem immunofluorescencyjnym markerów mitochondrialnych i ilościową analizą obrazów. Analiza kolokalizacji z wykorzystaniem prógowania Costes i współczynników nakładania się Manders’ wykazała wzbogacenie mitochondrialne sygnału inhibitora. W konsekwencji, inhibicja ClpP zmieniła morfologię mitochondrialną. Analiza immunoblotu nie wykazała znaczącej zmiany w obfitości białka ClpP po leczeniu inhibitorem. Wzięte razem, ta praca opisuje powtarzalny przepływ pracy oparty na obrazowaniu, który umożliwi badanie funkcji mitochondrialnego ClpXP w całych komórkach w odpowiedzi na zaburzenia homeostazy, takie jak stres oksydacyjny.

Wprowadzenie

Mitochondrialne ATP-zależne proteazy są kluczowe dla homeostazy białkowej, rozkładając niewłaściwie sfałdowane lub uszkodzone białka^1,2,3,4,5,6. Wśród nich, ClpXP jest heterooligomerycznym kompleksem proteaz AAA+ zlokalizowanym w macierzy mitochondrialnej. ClpX ATPaza rozpoznaje i odsłania białka, a następnie translokuje je do komory proteolitycznej ClpP^7,8,9. Wraz z innymi mitochondrialnymi proteazami, ClpXP utrzymuje kontrolę jakości białek zarówno w normalnych, jak i warunkach stresowych, w tym stresu oksydacyjnego i zaburzeń metabolicznych^1,2,4. Zakłócenie mitochondrialnej homeostazy białkowej zostało powiązane z chorobami takimi jak neurodegneracja i rak, podkreślając znaczenie zrozumienia tych aktywności proteaz w całych komórkowych systemach^3,6,10.

Głównym wyzwaniem w tej dziedzinie jest brak metod do bezpośredniego monitorowania aktywności mitochondrialnych proteaz z rozdzielczością przestrzenną w całych komórkach. Istniejące podejścia opierają się głównie na biochemicznych badaniach używających oczyszczonych białek lub lizatów komórkowych, które dostarczają szczegółowych informacji kinetycznych, ale nie zachowują kontekstu subkomórkowego^11,12,13,14. Strategie chemii biologicznej częściowo zajęły się tą ogranicznością poprzez opracowanie fluorogenicznych substratów peptydowych i inhibitorów ukierunkowanych na aktywne miejsce aktywności. Fluorescencyjne peptydowe substraty umożliwiają ilościowe pomiary aktywności peptydaz zależnych od ATP, podczas gdy peptydowe inhibitory tworzą odwracalne kowalencyjne interakcje z miejscem proteolitycznym, aby osiągnąć selektywne hamowanie^{13,15,16,17,18,19}. Wcześniej, laboratoryjnie syntetyzowany inhibitor ClpXP FAPAL-CMK został wykazany jako tworzący wiązanie kowalencyjne z ClpP²⁰. W niniejszym badaniu, FAM-FAPAL-CMK, fluorescejonowa pochodna FAPAL-CMK, została opracowana jako mechanizmowy inhibitor ClpP, umożliwiający wizualizację jego lokalizacji wewnątrzkomórkowej.

W porównaniu z badaniami biochemicznymi, konfokalna mikroskopia fluorescencyjna umożliwia przestrzennie rozdzielcze ocenę dystrybucji sond i morfologii mitochondriów w całych komórkach, dostarczając informacji, których nie można uzyskać z samych lizatów. Jednak w przeciwieństwie do badań enzymatycznych, lokalizacja fluorescencji nie mierzy bezpośrednio aktywności katalitycznej ani zdarzeń wiązania molekularnego i może być wpłynięta na efektywność poboru sondy, dynamiki mitochondriów i warunki obrazu. Ponadto, sukces implementacji zależy od adekwatnego akumulacji sond i wystarczająco rozdzielonych sieci mitochondriów, czyniąc ten przepływ pracy najbardziej odpowiednim dla adhezywnych hodowli komórkowych o wyraźnie rozróżnialnej morfologii mitochondrialnej.

Celem tego badania jest ustanowienie ilościowego przepływu pracy, który integruje mechanizmowe fluorescencyjne sondy z mikroskopią konfokalną, aby monitorować lokalizacje i funkcje mitochondrialnych proteaz w całych komórkach. Łącząc selektywne chemiczne sondy z wysokiej rozdzielczości obrazowaniem konfokalnym, ten przepływ pracy umożliwia ocenę mitochondrialnej lokalizacji, dystrybucji sond i morfologicznych odpowiedzi na zakłócenia mitochondrialnej homeostazy w całych komórkach. Może uzupełniać istniejące badania biochemiczne, które bezpośrednio mierzą aktywność proteaz, ale brakuje im rozdzielczości przestrzennej.

Protokół

Doświadczenia przeprowadzono z wykorzystaniem komórek HeLa dostępnych na rynku. Nie zastosowano ludzkich uczestników, kręgowców, ani pierwotnych materiałów biologicznych pochodzenia ludzkiego lub kręgowców. Zastosowanie reagentów i sprzętu jest wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla komórek i leczenie

1. Hoduj komórki HeLa w pożywce Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej o 10% płonnego surowicy wołowej (FBS) w temperaturze 37 °C w inkubatorze klimatyzowanym z 5% CO₂.
2. Zasiej komórki na sterylne szkiełka szklane i inkubować przez 24 h, aby umożliwić przyczepianie się komórek.
3. Rozpuść inhibitor FAM-FAPAL-CMK w DMSO, aby przygotować 50 µM stężenie początkowe i zamroź w -20 °C do przechowywania.
4. Dodaj 50 nM FAM-FAPAL-CMK do pożywki wzrostowej komórek w próbkach komórek leczonych.
5. Dodaj równą objętość DMSO do próbek kontrolnych, aby dopasować ostateczne stężenie rozpuszczalnika w próbkach leczonych inhibitorem, upewniając się, że wszelkie efekty nie wynikają z DMSO.
6. Inkubować komórki przez dodatkowe 18 h w tych samych warunkach hodowli przed dalszym przetwarzaniem.
   Uwaga: Inhibitor FAM-FAPAL-CMK jest zaprojektowany i syntetyzowany w laboratorium, a metoda syntezy została wcześniej opisana²⁰.

2. Fiksacja i permeabilizacja

1. Przepłucz komórki ciepłą buforem D-PBS przez 5 min i powtórz raz.
2. Fiksuję komórki przez 15 min w temperaturze pokojowej w buforze PHEM (68 mM PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mM MgCl₂, pH 6,9) zawierającym 2,4% (v/v) formaldehydu, 0,05% (v/v) glutaraldehydu i 0,5% (w/v) saponiny.
3. Przygotuj świeżą roztwór borowodzianu sodu (5 mg/mL w D-PBS).
4. Inkubować komórki w roztworze borowodzianu sodu przez 15 min w temperaturze pokojowej, aby zneutralizować pozostałości glutaraldehydu.
5. Przepłucz komórki trzykrotnie buforem D-PBS przez 5 min każdy przed barwieniem.
   UWAGA: Formaldehyd i glutaraldehyd są toksycznymi fiksatorami. Przeprowadzaj kroki fiksacji w wyciągu laboratoryjnym i używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (rękawiczki, fartuch laboratoryjny i środki ochrony oczu). Borowodzian sodu jest reaktywnym środkiem redukującym i należy z nim postępować ostrożnie. Bufor fiksujący na bazie PHEM zawierający formaldehyd, glutaraldehyd i saponiny został wybrany, aby zachować morfologię mitochondriów, zachowując dostępność antygenów podczas immunobarwienia. Formaldehyd i glutaraldehyd zapewniają łączenie białek w celu zachowania struktury, podczas gdy skład bufora PHEM i pH pomagają stabilizować ultrastrukturę mitochondriów²¹. Saponina ułatwia permeabilizację błony do poprawy szybkości penetracji fiksatora. Ta strategia fiksacji minimalizuje zniekształcenie sieci mitochondriów i jest szczególnie odpowiednia do ilościowej analizy morfologii mitochondriów.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Zablokuj komórki przez 1 h w temperaturze pokojowej w buforze blokującym zawierającym 3% (w/v) albuminy surowicy wołowej (BSA) w PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) z 0,1% (v/v) Triton X-100.
2. Inkubować komórki z przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w buforze blokującym przez 1 h w temperaturze pokojowej. Użyj przeciwciała mysiego przeciwko TOMM20 (1:500) i przeciwciała króliczego przeciwko ClpP (1:500).
3. Przepłucz komórki trzy razy buforem PBS przez 5 min każdy, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwotne.
4. Inkubować komórki z przeciwciałami wtórnymi rozcieńczonymi w buforze blokującym przez 1 h w temperaturze pokojowej. Użyj przeciwciała mysiego współpracującego z CF405S (1:500) i przeciwciała króliczego współpracującego z Alexa Fluor 647 (1:500).
5. Chroń próbki przed światłem podczas i po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi.
6. Powtórz krok 3.3.
7. Załóż szkiełka na szlabanki szklanych szklaneczek za pomocą środka górującego.
   UWAGA: ClpP i TOMM20 były wizualizowane pod 405 nm i 647 nm, aby uniknąć jakiegokolwiek nakładania widma z sygnałami FAM.

4. Pozyskiwanie obrazów

1. Pozyskaj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego z liniowym skanowaniem laserowym wyposażonego w obiektyw o wysokiej numerycznej aperturze w zanurzeniu olejowym.
2. Pobudzaj fluorofory przy użyciu linii laserowych o długości fali 405 nm i 633 nm. Użyj odpowiednich dwuspadowych działoczeników, aby odbijać światło pobudzające i

Wyniki

Inhibicja ClpP zmienia morfologię mitochondriów i organizację ich sieci
Aby określić, czy inhibicja ClpP zmienia organizację mitochondriów w komórkach HeLa, oceniano ich morfologię. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne wykazały wyraźne różnice w organizacji mitochondriów między komórkami kontrolnymi a tymi, w których stosowano FAM-FAPAL-CMK (Rysunek 1A). Analiza ilościowa wykazała, że pole mitochondriów zmniejszyło się z 1,15 ± 4,8 μm² (n = 8013) w komórka...

Dyskusja

Peptydylowa ketona chlorometylowa FAPAL-CMK¹⁵ została wcześniej wykazana jako potencjalny nieodwracalny inhibitor podjednostki proteazy (ClpP) mitochondrialnej ATP-zależnej proteazy ClpXP. Podczas gdy eksperymenty kinetyk wykazały skuteczność inhibitora i mechanizm działania, podejście in vitro nie mogło ocenić skuteczności FAPAL-CMK jako selektywnego mitochondrialnego inhibitora ClpP w całych komórkach. Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna potwierdziła, że FAM-FAPAL-CMK był selektywnie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3