Analiza włókien elastycznych w tkankach płuc za pomocą ilościowych analiz obrazów

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół szczegółowo opisujący przygotowanie tkanki do wizualizacji włókien elastycznych i ilościowego profilowania w tkankach płuc mysich. Ta metoda umożliwia solidną ocenę architektury tkanki, przestrzennej organizacji włókien oraz remodelacji macierzy pozakomórkowej w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Streszczenie

Remodeling macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) płuc jest kluczową cechą uszkodzenia i choroby płuc. Włókna elastyczne są centralnym składnikiem ECM płuc, zapewniając odporność i odrzut niezbędne do normalnego funkcjonowania układu oddechowego, a ich uszkodzenie przyczynia się do upośledzenia mechaniki tkanki. Protokół ten opisuje solidny, powtarzalny proces przygotowania i analizy tkanki płucnej myszy, ze szczególnym uwzględnieniem wizualizowania i ilościowego profilowania włókien elastycznych. Zawiera zoptymalizowane metody przetwarzania tkanki i barwienia histologicznego w celu zachowania i wykrycia struktur elastyny. Ponadto protokół szczegółowo opisuje przepływ analizy obrazów umożliwiającej ilościową ocenę obfitości, organizacji i rozmieszczenia przestrzennego włókien elastycznych w płucach. Przepływ pracy obejmuje także estymację wektora barwnika w QuPath, dekonwolucję kolorów w Fiji/ImageJ oraz analizę obrazów opartą na TWOMBLI, umożliwiającą ilościową ocenę obfitości, rozgałęziania i złożoności sieci włókien elastycznych. W protokole zawarte są strategie pozyskiwania obrazów, wybierania obszarów zainteresowania, optymalizacji parametrów i kontroli jakości, aby zapewnić powtarzalność i zminimalizować uzależnienie od użytkownika. Korzystając z tego procesu, z powodzeniem zidentyfikowaliśmy zmiany w organizacji i architekturze sieci włókien elastycznych w płucach myszy z otyłością, co wykazuje, że metoda ta nadaje się do wykrywania przemian związanych z chorobą w macierzy zewnątrzkomórkowej. Razem, te podejścia zapewniają kompleksową ramę do badania przemian włókien elastycznych i ich wkładu w architekturę tkanki w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Metoda ta ułatwia badanie zmian strukturalnych wywołanych przez fibroblasty i wspiera mechanizmy związane z przemianami w macierzy zewnątrzkomórkowej leżącymi u podstaw choroby płuc.

Wprowadzenie

Włókna elastyczne są podstawowymi składnikami zewnątrzkomórkowej matrycy płuc (ECM), składającymi się głównie z elastyny i powiązanych białek mikrofibrylarnych, które łączą się w wysoce zorganizowane, odporne sieci¹. W płucach włókna elastyczne są ułożone wzdłuż przegród pęcherzyków i struktur okołooskrzelowych, gdzie zapewniają elastyczność i odprężanie wymagane do normalnej mechaniki oddychania^1,2. Jako jeden z najbardziej obficie występujących składników strukturalnych ECM w tkankach takich jak płuca, aorta i macica, ich integralność jest krytyczna dla utrzymania elastyczności tkanek^1,2. Zakłócenie organizacji włókien elastycznych obserwowano w różnych chorobach płuc, w tym w fibrozie, rozedmie i przewlekłych schorzeniach zapalnych, gdzie zmieniona architektura włókien przyczynia się do upośledzenia funkcji płuc i ich właściwości mechanicznych^2,3.

Matrisome płuc został niedawno scharakteryzowany, ujawniając podstawowe białka ECM, takie jak kolageny i lamininy, wraz ze składnikami związanymi z matrisomem, w tym cytokinami, regulatorami ECM i związanymi z ECM białkami (np. ligandy integrin, galektyny)^4,5. Poza zapewnieniem wsparcia strukturalnego, te składniki aktywnie regulują funkcję tkanki i tworzą specjalistyczne nisze, które wspierają komórki rezydentne i migrujące^6,7. Warto zauważyć, że ostatnie badania wykazały, że warunki metaboliczne, takie jak otyłość, są związane ze znaczącymi zmianami w organizacji włókien elastycznych, łącząc ogólnoustrojowe zaburzenia metaboliczne ze zmianami w architekturę ECM płuc i funkcją fibroblastów³. Te odkrycia podkreślają znaczenie rozumienia remodelacji włókien elastycznych jako dynamicznego i istotnego z punktu widzenia choroby procesu.

Konwencjonalna ocena włókien elastycznych często opiera się na jakościowej ewaluacji histologicznej, półilościowych systemach punktacji lub pomiarach obfitości elastyny, które dostarczają ograniczonej informacji dotyczącej organizacji włókien, łączności i złożoności sieci^8,9. Podczas gdy te podejścia są użyteczne do wykrywania ogólnych zmian w zawartości elastyny, mogą nie uchwycić subtelnych zmian architektonicznych związanych z remodelacją tkanki. Ilościowe analizy obrazu mają potencjał do pokonania tych ograniczeń poprzez umożliwienie obiektywnej i możliwej do powtórzenia charakteryzacji sieci włókien elastycznych i ułatwienie porównań między warunkami eksperymentalnymi i badaniami. W celu zajęcia się tym, opisany tutaj protokół umożliwia zintegrowaną analizę organizacji ECM płuc ze szczególnym skupieniem na architekturze włókien elastycznych. Oprócz uznanych podejść do charakteryzacji ECM^4,5, ten przepływ pracy obejmuje barwienie Elasticą i optimizowaną dla architektury tkanki płuc linię analizy obrazów opartą na TWOMBLI¹⁰. Łącząc barwienie Elasticą z ilościową analizą sieci, ten przepływ pracy wykracza poza konwencjonalną ocenę histologiczną i umożliwia szczegółową charakteryzację obfitości włókien, fragmentacji, organizacji przestrzennej i złożoności strukturalnej. Protokół jest szczególnie dobrze przystosowany do badań dotyczących fibrozy, rozedmy, remodelacji płuc związanej z otyłością, zapalnych chorób płuc, starzenia się i innych stanów charakteryzujących się remodelacją matrycy pozakomórkowej w płucach.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach opisane tutaj zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzeniem Komitetu Etykiety Zwierząt w Nadrenii Północnej-Westfalii, Niemcy (AZ: 81-02.04.2021.A221).

UWAGA: Podczas całej procedury należy nosić odpowiednią odzież ochronną (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, okulary ochronne).

1. Pobieranie próbek i przygotowanie tkanki płucnej myszy

UWAGA: Myszy zostały uśpione przedawkowaniem izofluranu zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi przed pobraniem tkanki.

1. Ostrożnie otworzyć jamę piersiową za pomocą nacięcia środkowego, następnie przeciąć przeponę wzdłuż jej przyczepu i delikatnie ujawnić płuca.
2. Usunąć całe płuco przez przecięcie płatów prawego i lewego razem, dbając o zachowanie całokształtu wszystkich płatów.
3. Umieścić płaty płuc pojedynczo w 5 mL probówce zawierającej 2 mL 10% neutralnego buforowanego formalinu i inkubować przez 15–20 h w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Fiksacja zachowuje architekturę tkanki dla kolejnych analiz histologicznych i włókien elastycznych. Ponieważ głównym celem tego procesu było wizualizowanie i ilościowa ocena organizacji włókien elastycznych, a nie morfometryczna analiza pęcherzyków, płuca nie zostały inflacji-fiksowane przed przetwarzaniem tkanki.
   OSTRZEŻENIE: Neutralny buforowany formalin zawiera formaldehyd, który jest toksyczny, rakotwórczy i może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. Obsługiwać formalin w certyfikowanym koczu chemicznym i nosić odpowiednią odzież ochronną, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.
4. Zatopić fiksowane tkanki płuc w parafinie zgodnie ze standardowym protokołem osadzania histologicznego¹¹.
   UWAGA: Upewnić się, że doszło do całkowitego odwodnienia i infiltrowaniu parafiny, aby zachować morfologię tkanki dla kolejnych barwień. Aby zminimalizować różnorodność między próbkami i zapewnić kompatybilność w warunkach eksperymentalnych, zawsze należy używać tych samych płatów płuc dla każdej analizy. Zaleca się używanie lewego płata do histologii.
5. Wyciąć tkankę płucną FFEP na 5–7 μm cienkie sekcje za pomocą mikrotonu i nałożyć je na standardowe szkielety szklane. Piec szkielety w temperaturze 60 °C przez 1 h przed przejściem do dalszych zastosowań. Szkielety można przechowywać w temperaturze pokojowej w wolnym od kurzu środowisku przez kilka tygodni lub w temperaturze 4 °C na dłużej.
   UWAGA: Unikać narażenia na wilgoć podczas przechowywania, ponieważ wilgotność może powodować utlenianie się parafiny i kompromitację jakości barwienia. Przechowywać szkielety w szczelnym plastikowym pudełku ze szkłami z suszarką, jeśli wymagane jest długotrwałe przechowywanie.
   Punkt przerwy: Przechowywać szkielety w temperaturze pokojowej lub 4 °C do barwienia.

2. Barwienie włókien elastycznych

1. Wykonać barwienie Elastica (rezorcyno-fuchsynowe) na 5–7 μm osadzonych w parafinie sekcjach tkanki płucnej, aby uwidocznić włókna elastyczne wewnątrz struktur pęcherzykowych i naczyniowych.
   UWAGA: Barwić tylko tyle szkieletów, ile można obsłużyć jednocześnie, aby zapewnić spójną intensywność barwienia i powtarzalność wśród próbek.
   1. Odparafinować szkielety poprzez zanurzenie szkieletów w xylinie (zmieszane izomery) dwa razy po 5 min każdy.
      OSTRZEŻENIE: Xylin jest toksyczny i łatwopalny. Obsługiwać w kocu chemicznym i nosić odpowiednią odzież ochronną.
   2. Rehydratować szkielety w malejącej serii etanolu aż do 80% etanolu.
      1. Inkubować szkielet przez 3 min w temperaturze pokojowej w komorze barwnikowej wypełnionej 100% etanolem.
      2. Przenieść szkielet do świeżego 100% etanolu i inkubować 3 min w temperaturze pokojowej.
      3. Przenieść szkielet do 95% etanolu i inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej.
      4. Przenieść szkielet do 80% etanolu i inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej.
   3. Przenieść szkielet do nowej komory barwnikowej zawierającej roztwór resorcyn-fuchsynowy i inkubować przez 20–30 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Roztwór barwnika resorcyn-fuchsynowego można wielokrotnie wykorzystywać i jest stabilny w temperaturze pokojowej.
      OSTRZEŻENIE: Roztwór barwnika resorcyn-fuchsynowego zawiera potencjalnie niebezpieczne chemikalia, w tym stężone kwasy i barwniki, które mogą powodować podrażnienie skóry i oczu. Obsługiwać roztwór w dobrze wentylowanym obszarze lub kocu chemicznym i nosić odpowiednią odzież ochronną zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego.
   4. Umieścić szkielet w komorze barwnikowej pod bieżącą wodą destylowaną i myć przez 1 min.
   5. Różnicować w 95–96% etanolu:

Wyniki

Niniejszy protokół dostarcza parametrów ilościowych sieci włókien elastynowych w różnych obszarach płuc i warunkach eksperymentalnych. Analiza TWOMBLI, opisana wcześniej, pozwala na wyznaczenie takich parametrów jak długość włókien, gęstość rozgałęzień, lakunarność oraz wymiar fraktalny w celu oceny macierzy pozakomórkowej¹⁰. Opierając się na tym modelu, nasze podejście umożliwia kompleksową charakterystykę organizacji włókien elastynowych, pozwalając na ocenę zmian w liczebności, łączności, jedno...

Dyskusja

To protokoll zapewnia solidny, powtarzalny proces badania architektury pozakomórkowej matrycy płucnej (ECM) u myszy, ze szczególnym skupieniem na remodelacji włókien elastycznych wywołanej przez fibroblasty. Włókna elastyczne są niezbędne dla utrzymania rozciągliwości i sprężystości płuc, a ich uszkodzenie jest charakterystyczne dla wielu chorób płuc, w tym dla zwłóknienia, uszkodzenia płuc, starzenia się i zaburzeń metabolicznych². Pomimo ich centralnej roli funkcjonalnej, ilościowa ocena organiz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	wersja 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	wersja 11
Qupath		https://qupath.github.io	wersja 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172