Analiza włókien elastycznych w tkankach płuc za pomocą ilościowych analiz obrazów

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół szczegółowo opisujący przygotowanie tkanki do wizualizacji włókien elastycznych i ilościowego profilowania w tkankach płuc mysich. Ta metoda umożliwia solidną ocenę architektury tkanki, przestrzennej organizacji włókien oraz remodelacji macierzy pozakomórkowej w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Streszczenie

Remodeling macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) płuc jest kluczową cechą uszkodzenia i choroby płuc. Włókna elastyczne są centralnym składnikiem ECM płuc, zapewniając odporność i odrzut niezbędne do normalnego funkcjonowania układu oddechowego, a ich uszkodzenie przyczynia się do upośledzenia mechaniki tkanki. Protokół ten opisuje solidny, powtarzalny proces przygotowania i analizy tkanki płucnej myszy, ze szczególnym uwzględnieniem wizualizowania i ilościowego profilowania włókien elastycznych. Zawiera zoptymalizowane metody przetwarzania tkanki i barwienia histologicznego w celu zachowania i wykrycia struktur elastyny. Ponadto protokół szczegółowo opisuje przepływ analizy obrazów umożliwiającej ilościową ocenę obfitości, organizacji i rozmieszczenia przestrzennego włókien elastycznych w płucach. Przepływ pracy obejmuje także estymację wektora barwnika w QuPath, dekonwolucję kolorów w Fiji/ImageJ oraz analizę obrazów opartą na TWOMBLI, umożliwiającą ilościową ocenę obfitości, rozgałęziania i złożoności sieci włókien elastycznych. W protokole zawarte są strategie pozyskiwania obrazów, wybierania obszarów zainteresowania, optymalizacji parametrów i kontroli jakości, aby zapewnić powtarzalność i zminimalizować uzależnienie od użytkownika. Korzystając z tego procesu, z powodzeniem zidentyfikowaliśmy zmiany w organizacji i architekturze sieci włókien elastycznych w płucach myszy z otyłością, co wykazuje, że metoda ta nadaje się do wykrywania przemian związanych z chorobą w macierzy zewnątrzkomórkowej. Razem, te podejścia zapewniają kompleksową ramę do badania przemian włókien elastycznych i ich wkładu w architekturę tkanki w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Metoda ta ułatwia badanie zmian strukturalnych wywołanych przez fibroblasty i wspiera mechanizmy związane z przemianami w macierzy zewnątrzkomórkowej leżącymi u podstaw choroby płuc.

Wprowadzenie

Włókna elastyczne są podstawowymi składnikami zewnątrzkomórkowej matrycy płuc (ECM), składającymi się głównie z elastyny i powiązanych białek mikrofibrylarnych, które łączą się w wysoce zorganizowane, odporne sieci¹. W płucach włókna elastyczne są ułożone wzdłuż przegród pęcherzyków i struktur okołooskrzelowych, gdzie zapewniają elastyczność i odprężanie wymagane do normalnej mechaniki oddychania^1,2. Jako jeden z najbardziej obficie występujących składników strukturalnych ECM w tkankach takich jak płuca, aorta i macica, ich integralność jest krytyczna dla utrzymania elastyczności tkanek^1,2. Zakłócenie organizacji włókien elastycznych obserwowano w różnych chorobach płuc, w tym w fibrozie, rozedmie i przewlekłych schorzeniach zapalnych, gdzie zmieniona architektura włókien przyczynia się do upośledzenia funkcji płuc i ich właściwości mechanicznych^2,3.

Matrisome płuc został niedawno scharakteryzowany, ujawniając podstawowe białka ECM, takie jak kolageny i lamininy, wraz ze składnikami związanymi z matrisomem, w tym cytokinami, regulatorami ECM i związanymi z ECM białkami (np. ligandy integrin, galektyny)^4,5. Poza zapewnieniem wsparcia strukturalnego, te składniki aktywnie regulują funkcję tkanki i tworzą specjalistyczne nisze, które wspierają komórki rezydentne i migrujące^6,7. Warto zauważyć, że ostatnie badania wykazały, że warunki metaboliczne, takie jak otyłość, są związane ze znaczącymi zmianami w organizacji włókien elastycznych, łącząc ogólnoustrojowe zaburzenia metaboliczne ze zmianami w architekturę ECM płuc i funkcją fibroblastów³. Te odkrycia podkreślają znaczenie rozumienia remodelacji włókien elastycznych jako dynamicznego i istotnego z punktu widzenia choroby procesu.

Konwencjonalna ocena włókien elastycznych często opiera się na jakościowej ewaluacji histologicznej, półilościowych systemach punktacji lub pomiarach obfitości elastyny, które dostarczają ograniczonej informacji dotyczącej organizacji włókien, łączności i złożoności sieci^8,9. Podczas gdy te podejścia są użyteczne do wykrywania ogólnych zmian w zawartości elastyny, mogą nie uchwycić subtelnych zmian architektonicznych związanych z remodelacją tkanki. Ilościowe analizy obrazu mają potencjał do pokonania tych ograniczeń poprzez umożliwienie obiektywnej i możliwej do powtórzenia charakteryzacji sieci włókien elastycznych i ułatwienie porównań między warunkami eksperymentalnymi i badaniami. W celu zajęcia się tym, opisany tutaj protokół umożliwia zintegrowaną analizę organizacji ECM płuc ze szczególnym skupieniem na architekturze włókien elastycznych. Oprócz uznanych podejść do charakteryzacji ECM^4,5, ten przepływ pracy obejmuje barwienie Elasticą i optimizowaną dla architektury tkanki płuc linię analizy obrazów opartą na TWOMBLI¹⁰. Łącząc barwienie Elasticą z ilościową analizą sieci, ten przepływ pracy wykracza poza konwencjonalną ocenę histologiczną i umożliwia szczegółową charakteryzację obfitości włókien, fragmentacji, organizacji przestrzennej i złożoności strukturalnej. Protokół jest szczególnie dobrze przystosowany do badań dotyczących fibrozy, rozedmy, remodelacji płuc związanej z otyłością, zapalnych chorób płuc, starzenia się i innych stanów charakteryzujących się remodelacją matrycy pozakomórkowej w płucach.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach opisane tutaj zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzeniem Komitetu Etykiety Zwierząt w Nadrenii Północnej-Westfalii, Niemcy (AZ: 81-02.04.2021.A221).

UWAGA: Podczas całej procedury należy nosić odpowiednią odzież ochronną (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, okulary ochronne).

1. Pobieranie próbek i przygotowanie tkanki płucnej myszy

UWAGA: Myszy zostały uśpione przedawkowaniem izofluranu zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi przed pobraniem tkanki.

1. Ostrożnie otworzyć jamę piersiową za pomocą nacięcia środkowego, następnie przeciąć przeponę wzdłuż jej przyczepu i delikatnie ujawnić płuca.
2. Usunąć całe płuco przez przecięcie płatów prawego i lewego razem, dbając o zachowanie całokształtu wszystkich płatów.
3. Umieścić płaty płuc pojedynczo w 5 mL probówce zawierającej 2 mL 10% neutralnego buforowanego formalinu i inkubować przez 15–20 h w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Fiksacja zachowuje architekturę tkanki dla kolejnych analiz histologicznych i włókien elastycznych. Ponieważ głównym celem tego procesu było wizualizowanie i ilościowa ocena organizacji włókien elastycznych, a nie morfometryczna analiza pęcherzyków, płuca nie zostały inflacji-fiksowane przed przetwarzaniem tkanki.
   OSTRZEŻENIE: Neutralny buforowany formalin zawiera formaldehyd, który jest toksyczny, rakotwórczy i może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. Obsługiwać formalin w certyfikowanym koczu chemicznym i nosić odpowiednią odzież ochronną, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.
4. Zatopić fiksowane tkanki płuc w parafinie zgodnie ze standardowym protokołem osadzania histologicznego¹¹.
   UWAGA: Upewnić się, że doszło do całkowitego odwodnienia i infiltrowaniu parafiny, aby zachować morfologię tkanki dla kolejnych barwień. Aby zminimalizować różnorodność między próbkami i zapewnić kompatybilność w warunkach eksperymentalnych, zawsze należy używać tych samych płatów płuc dla każdej analizy. Zaleca się używanie lewego płata do histologii.
5. Wyciąć tkankę płucną FFEP na 5–7 μm cienkie sekcje za pomocą mikrotonu i nałożyć je na standardowe szkielety szklane. Piec szkielety w temperaturze 60 °C przez 1 h przed przejściem do dalszych zastosowań. Szkielety można przechowywać w temperaturze pokojowej w wolnym od kurzu środowisku przez kilka tygodni lub w temperaturze 4 °C na dłużej.
   UWAGA: Unikać narażenia na wilgoć podczas przechowywania, ponieważ wilgotność może powodować utlenianie się parafiny i kompromitację jakości barwienia. Przechowywać szkielety w szczelnym plastikowym pudełku ze szkłami z suszarką, jeśli wymagane jest długotrwałe przechowywanie.
   Punkt przerwy: Przechowywać szkielety w temperaturze pokojowej lub 4 °C do barwienia.

2. Barwienie włókien elastycznych

1. Wykonać barwienie Elastica (rezorcyno-fuchsynowe) na 5–7 μm osadzonych w parafinie sekcjach tkanki płucnej, aby uwidocznić włókna elastyczne wewnątrz struktur pęcherzykowych i naczyniowych.
   UWAGA: Barwić tylko tyle szkieletów, ile można obsłużyć jednocześnie, aby zapewnić spójną intensywność barwienia i powtarzalność wśród próbek.
   1. Odparafinować szkielety poprzez zanurzenie szkieletów w xylinie (zmieszane izomery) dwa razy po 5 min każdy.
      OSTRZEŻENIE: Xylin jest toksyczny i łatwopalny. Obsługiwać w kocu chemicznym i nosić odpowiednią odzież ochronną.
   2. Rehydratować szkielety w malejącej serii etanolu aż do 80% etanolu.
      1. Inkubować szkielet przez 3 min w temperaturze pokojowej w komorze barwnikowej wypełnionej 100% etanolem.
      2. Przenieść szkielet do świeżego 100% etanolu i inkubować 3 min w temperaturze pokojowej.
      3. Przenieść szkielet do 95% etanolu i inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej.
      4. Przenieść szkielet do 80% etanolu i inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej.
   3. Przenieść szkielet do nowej komory barwnikowej zawierającej roztwór resorcyn-fuchsynowy i inkubować przez 20–30 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Roztwór barwnika resorcyn-fuchsynowego można wielokrotnie wykorzystywać i jest stabilny w temperaturze pokojowej.
      OSTRZEŻENIE: Roztwór barwnika resorcyn-fuchsynowego zawiera potencjalnie niebezpieczne chemikalia, w tym stężone kwasy i barwniki, które mogą powodować podrażnienie skóry i oczu. Obsługiwać roztwór w dobrze wentylowanym obszarze lub kocu chemicznym i nosić odpowiednią odzież ochronną zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego.
   4. Umieścić szkielet w komorze barwnikowej pod bieżącą wodą destylowaną i myć przez 1 min.
   5. Różnicować w 95–96% etanolu:

Wyniki

Niniejszy protokół dostarcza parametrów ilościowych sieci włókien elastycznych w różnych obszarach płuc i w różnych warunkach eksperymentalnych. Analiza TWOMBLI, opisana wcześniej, pozwala na wyznaczenie takich parametrów jak długość włókien, gęstość rozgałęzień, lakunarność oraz wymiar fraktalny w celu oceny macierzy zewnątrzkomórkowej¹⁰. Opierając się na tym modelu, nasze podejście umożliwia kompleksową charakterystykę organizacji włókien elastycznych, co pozwala na ocenę zmian w obfitości, łączności, jednolitości i złożoności strukturalnej włókien zarówno w fizjologicznych, jak i patologicznych tkankach płuc.

W zdrowej tkance płucnej włókna elastyny tworzą długie, ciągłe i dobrze uporządkowane sieci wzdłuż przegród pęcherzyków płucnych i struktur okołubronchialnych. W przeciwieństwie do nich, płuca patologiczne lub zmienione metabolicznie, na przykład pochodzące od myszy otyłych, często wykazują zwiększone rozgałęzienia i większą złożoność sieci, co odzwierciedla zmiany w organizacji włókien elastyny³. Reprezentatywne wyniki, w tym maski binarne i parametry ilościowe, przedstawiono na Rysunku 1A, B. Wyniki te mogą być zintegrowane z analizami histologicznymi i molekularnymi w celu oceny integralności ECM oraz stopnia przebudowy³. Lakunarność oraz wypełnianie luk zostały zilustrowane na przykładzie zdrowej tkanki płucnej, aby zwizualizować różnice w organizacji ECM (Rysunek 1C). W połączeniu z innymi miarami ilościowymi parametry te oddają złożoność sieci i ujawniają zmiany w architekturze tkanki wynikające z reorganizacji ECM, dostarczając informacji o odrębnych wzorcach przebudowy strukturalnej w obrębie sieci włókien elastyny.

Dokładna interpretacja tych wyników ilościowych w krytyczny sposób zależy od wysokiej jakości akwizycji i przetwarzania obrazów. Nieoptymalne warunki obrazowania lub przetwarzania, w tym słaba ostrość, niespójne oświetlenie lub niedokładna estymacja wektora barwienia, mogą prowadzić do powstania pofragmentowanych lub zaszumionych masek, a w konsekwencji do niewiarygodnych wyników ilościowych (Rysunek 1D). Dlatego też staranna inspekcja wizualna surowych obrazów i wyników segmentacji jest niezbędna do zapewnienia jakości danych przed ich interpretacją. Nieoptymalne maski można zazwyczaj rozpoznać po nadmiernej fragmentacji ciągłych włókien, nieciągłej lub niepełnej segmentacji, włączeniu szumu tła jako struktur włóknistych lub słabym pokryciu pierwotnego wzoru barwienia przez wygenerowaną maskę, co wskazuje na konieczność ponownej oceny akwizycji obrazu, estymacji wektora barwienia lub parametrów segmentacji. Aby zilustrować te cechy, celowo przeanalizowano przekroje z barwieniem kontrastowym, które utrudnia identyfikację włókien elastycznych i prowadzi do nieoptymalnej segmentacji. Przykład takiej maski niskiej jakości przedstawiono na Rysunku 1E. Aby dodatkowo ocenić solidność i powtarzalność schematu postępowania, zbiory obrazów zostały niezależnie przeanalizowane przez dwóch badaczy przy użyciu tych samych zoptymalizowanych parametrów analizy (Rysunek 2A). Dodatkowo do oceny zmienności biologicznej włączono próbki pochodzące od niezależnych zwierząt (Rysunek 2B). Porównywalne wyniki ilościowe uzyskano u różnych operatorów i w powtórzeniach biologicznych, co potwierdza powtarzalność i niezależność od użytkownika proponowanego potoku analizy obrazu. Wspólnie analizy te wykazują, że opisany schemat postępowania umożliwia rzetelną ocenę organizacji włókien elastycznych i ułatwia porównania między stanami fizjologicznymi a patologicznymi.

Rycina 1. Schemat analizy barwienia elastyką. (A) Reprezentatywny obraz surowy, odizolowany sygnał włókien elastycznych uzyskany poprzez dekonwolucję obrazu, maska binarna wygenerowana za pomocą TWOMBLI oraz nałożenie oryginalnych włókien elastycznych na odpowiadającą im maskę, co demonstruje dokładną segmentację. (B) Reprezentatywne parametry ilościowe wygenerowane przez analizę TWOMBLI. (C) Przykłady analiz lakunarności i wypełniania luk w zdrowej tkance płuc myszy, ilustrujące różnice w organizacji macierzy pozakomórkowej. (D) Ilustracja pofragmentowanych i zaszumionych masek wynikających z nieoptymalnej akwizycji lub przetwarzania obrazu. (E) Przekrój tkanki barwiony hematoksyliną i eozyną, wykazujący upośledzoną identyfikację włókien elastycznych i nieoptymalne generowanie maski. Wskazano obszary wykazujące słabą zgodność między oryginalnym wzorem barwienia a wygenerowaną maską. Pasek skali A, D = 100 µm, E = 50 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Powtarzalność i solidność schematu analizy włókien elastycznych. (A) Zbiory obrazów zostały niezależnie przeanalizowane przez dwóch badaczy przy użyciu parametrów analizy TWOMBLI w celu oceny powtarzalności międzyoperatorowej. Przedstawiono ilościowe wskaźniki uzyskane za pomocą TWOMBLI. A i B oznaczają dwóch niezależnych operatorów. (B) Przeanalizowano próbki pobrane od niezależnych zwierząt w celu oceny zmienności biologicznej. Przedstawiono ilościowe wskaźniki uzyskane za pomocą TWOMBLI, które wykazują porównywalne wyniki w powtórzeniach biologicznych i potwierdzają solidność potoku analizy. M1, M2 i M3 oznaczają poszczególne zdrowe zwierzęta. n = 3, analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z następującym po niej testem porównań wielokrotnych Dunnetta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Parametry	Wartości
Nasycenie kontrastu	0.75
Minimalna szerokość linii	5
Maksymalna szerokość linii	10
Okno minimalnej krzywizny	20
Okno maksymalnej krzywizny	80
Minimalna długość gałęzi	10
Maksymalny wyświetlacz HDM	175
Minimalna średnica szczeliny	0

Tabela 1: Podsumowanie parametrów ilościowych uzyskanych za pomocą TWOMBLI. Przegląd parametrów generowanych przez TWOMBLI oraz ich interpretacji w celu oceny architektury włókien elastycznych w tkance płucnej. Metryki obejmują pomiary liczebności włókien, rozgałęzień, orientacji, łączności oraz organizacji sieci.

Plik uzupełniający 1: Obiektywne pęcherzyki ROI Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Obiektywny obszar ROI okołubronchialny Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

To protokoll zapewnia solidny, powtarzalny proces badania architektury pozakomórkowej matrycy płucnej (ECM) u myszy, ze szczególnym skupieniem na remodelacji włókien elastycznych wywołanej przez fibroblasty. Włókna elastyczne są niezbędne dla utrzymania rozciągliwości i sprężystości płuc, a ich uszkodzenie jest charakterystyczne dla wielu chorób płuc, w tym dla zwłóknienia, uszkodzenia płuc, starzenia się i zaburzeń metabolicznych². Pomimo ich centralnej roli funkcjonalnej, ilościowa ocena organizacji i składu włókien elastycznych pozostawała ograniczona. Proces badawczy wypełnia tę lukę, umożliwiając systematyczną i ilościową charakterystykę architektoniczną sieci włókien elastycznych.

Główną zaletą tej metody jest integracja ilościowego przepływu obrazowania z analizą histologiczną struktury. Podczas gdy konwencjonalne podejścia często oceniają skład ECM lub cechy histologiczne oddzielnie, ten protokół umożliwia obiektywne ilościowe określenie organizacji włókien elastycznych, w tym długości włókien, ich rozgałęzienia i złożoność sieci. Umożliwia to bezpośrednie porównanie między warunkami fizjologicznymi a patologicznymi i dostarcza wglądu w remodelację ECM wywołaną przez fibroblasty³.

Jednakże kilka aspektów technicznych jest kluczowych dla zapewnienia spójności eksperymentu i jakości danych. Barwienie resorcyną-fuksyną jest wrażliwe na zmienne takie jak czas fiksacji, grubość przekroju i spójność odczynników, co sprawia, że standaryzacja jest niezbędna dla powtarzalności. Ilościowe wyniki z TWOMBLI zależą od jakości obrazu, rozdzielczości i spójnego doboru regionu zainteresowania, a zatem muszą być interpretowane równolegle z oceną histologiczną i zweryfikowane na wielu próbkach. Ponadto gęstość i morfologia włókien różnią się między regionami pęcherzykowymi i okołooskrzelowymi, co wymaga optymalizacji specyficznej dla regionu. To podejście uchwytuje globalną organizację sieci włókien elastycznych w dwóch wymiarach i nie rozwiązuje cech ultrastrukturalnych, które wymagają technik wyższej rozdzielczości, takich jak mikroskopia elektronowa. Trójwymiarowe metody obrazowania, w tym mikroskopię konfokalną lub wielofotonową, mogą dodatkowo poprawić analizę geometrii i połączeń włókien.

Kilka kroków w procesie badawczym jest szczególnie kluczowych dla zapewnienia niezawodnych i powtarzalnych wyników. Fiksacja tkanki, jakość przekrojów i spójne barwienie resorcyną-fuksyną znacząco wpływają na wizualizacje włókien elastycznych i dlatego powinny być starannie standaryzowane.  Słaba intensywność barwienia, nierównomierne barwienie lub wysokie tło mogą wynikać z zmiennej jakości odczynników, niekonsekwentnych warunków barwienia lub nieodpowiedniej konserwacji tkanki. Ponadto zaleca się włączenie zdrowych i chorych tkanek płuc, kontroli technicznych barwienia oraz próbek referencyjnych przetworzonych w różnych partiach eksperymentalnych, aby monitorować spójność barwienia i solidność analityczną. Tkanki bogate we włókna elastyczne mogą ponadto służyć jako dodatnie kontrole, aby zweryfikować procedury akwizycji i segmentacji obrazów. Dokładna estymacja wektora barwnika podczas dekonwolucji obrazu jest kolejnym kluczowy krokiem, ponieważ niewłaściwy dobór wektora może prowadzić do niekompletnego wyodrębnienia włókien i fragmentarycznych masek. W zależności od pytania eksperymentalnego, proces badawczy może być zmodyfikowany przez dostosowanie wielkości i liczby ROI, adaptację parametrów przetwarzania obrazu lub integrację trójwymiarowych podejść do obrazowania, aby dalsze badać organizację włókien elastycznych.

Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda stanowi wszechstronną platformę do badania remodelacji ECM zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Ponieważ integralność włókien elastycznych jest bezpośrednio związana z rozciągliwością i funkcją mechaniczną płuc, to podejście jest szczególnie ważne dla zrozumienia, jak zmiany strukturalne w ECM przekładają się na zmiany w funkcji płuc. Jest dobrze przystosowany do badania zmian strukturalnych wywołanych przez fibroblasty i zapewnia nowe możliwości lepszego zrozumienia remodelacji ECM i jej wkładu w progresję choroby i funkcję tkanki. Podejście to może również być rozszerzone na inne tkanki, w tym tkanki układu krążenia, skórę, macicę, zaburzenia tkanki łącznej, zwłknione narządy oraz ludzkie próbki, lub połączone z zaawansowanymi technikami obrazowania przestrzennego i wysokiej rozdzielczości, aby jeszcze bardziej poszerzyć jego zastosowanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	wersja 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	wersja 11
Qupath		https://qupath.github.io	wersja 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172